一種珙桐高效誘導叢生芽的組培快繁方法與流程

本發明涉及一種植物組培繁殖技術，具體為一種珙桐高效誘導叢生芽的組培快繁方法。

背景技術：

珙桐為落葉喬木。可生長到15～25米高，葉子廣卵形，邊緣有鋸齒。色花奇美，是1000萬年前新生代第三紀留下的孑遺植物，在第四紀冰川時期，大部分地區的珙桐相繼滅絕，只有在中國南方的一些地區幸存下來，成為了植物界今天的“活化石”，被譽為“中國的鴿子樹”，又稱“鴿子花樹”、“水梨子”，野生種只生長在中國四川省和湖北省周邊地區。珙桐已被列為國家一級重點保護野生植物，為中國特有的單屬植物，屬孑遺植物，也是全世界著名的觀賞植物。

目前，珙桐的繁殖技術主要以播種育苗為主，但此方式存在以下不足：成苗周期長，出苗時間為3-10年；出苗率低、不整齊、易變異，對保存母株的優良性狀有一定影響；同時需大量人力、物力及土地資源，生產成本高；綜上所述，尋找出苗快捷，生產成本低的珙桐組培快繁方式，推動產業化生產具有必要性。

西南師范大學鄒麗娟在《植物研究》發表的《瀕危植物珙桐的組織培養與植株再生》公開了一種采用珙桐側芽直接誘導叢生芽的快繁方法，但此方法存在外植體采集時間受限、誘導時間長的缺點，并且其增值率和增殖倍數都有一定的提升空間；四川農業大學夏晗發表的《珙桐初代培養研究》和湖北民族大學羅世榮發表的《珙桐芽體組織培養研究》中都提到以珙桐側芽為外植體進行芽誘導，但是都僅僅只能促使單芽萌發，不能誘導叢生芽。

技術實現要素：

本發明的目的提供一種珙桐高效誘導叢生芽的組培快繁方法，其操作簡便，誘導速度快，增殖系數高。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：一種珙桐高效誘導叢生芽的組培快繁方法，包括以下步驟：

1)選擇生長健壯、無病蟲害、性狀優良、側芽形成且未展葉時的珙桐枝條為母株，加入GA3溶液中進行浸泡，至珙桐側芽生長到3cm以上；

2)剪取側芽，進行消毒，然后接種于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培養基內；培養18-22d后芽點萌發生長，形成叢生芽。

對珙桐枝條進行采集及處理的時間為當年的9月至次年的3月。

優選的，對珙桐枝條進行采集及處理的時間為3月份。此時為側芽即將自然萌動時，萌發率，芽長生長快。

步驟1)中珙桐枝條是截取當年生從上往下至第5個側芽的枝條。

步驟1)中浸泡時采用100mg/L的GA3溶液，每5天換一次溶液。

步驟2)中剪取的側芽含有1-2mm木質部。

步驟2)中消毒時，先流水沖洗1h，采用質量濃度0.4％洗衣粉浸泡4-6min，然后采用體積濃度75％酒精浸泡20s，無菌水沖洗2次，再用質量濃度0.1％Hgcl₂浸泡3-5min，最后無菌水沖洗4次即可。

培養的環境為溫度25±1℃、濕度75±2％、光照12-14h/d、光強1800-2200lx。

步驟1)中的浸泡過程在室外進行處理，GA3溶液高度4-6cm；浸泡部位為枝條基部。

所述的Wpm為木本植物培養基，其中大量元素10倍為：Ca(NO3)·4H2O 5.56g/L、NH4NO3 3.50g/L、K2SO3 9.9g/L、MgSO4·7H2O 3.20g/L、KH2PO4 1.70g/L、CaCl20.725g/L；微量元素100倍為：MnSO4·4H2O 2.23g/L、ZnSO4·7H20 0.86g/L、H3BO3 0.62g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、Na2MoO4·2H2O 0.025g/L；鐵鹽100倍為：FeSO4·7H2O 2.78g/L、Na2-EDTA 3.72g/L；有機100倍為：鹽酸硫胺素VB1 0.1g/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.05g/L、煙酸VB5 0.05g/L、甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L。

由于珙桐側芽存在長短枝現象，導致室內培養時芽不伸長，不分化，浪費人力物力，也影響研究結果。本發明采取室外激素預處理方法，通過GA3進行浸泡預處理，能簡單有效甄別長短枝芽問題，還能一定程度上促進短枝芽萌發伸長，對珙桐側芽萌發有明顯促進作用，對芽伸長也有明顯的促進作用。

現行珙桐側芽誘導時都是采取剝芽后再誘導萌發伸長，而GA3溶液預處理，可減少實驗室剝芽環節，直接進行叢生芽誘導工序，從而減少了實驗過程中人力和物力的消耗，提高了工作效率，節約了生產成本。

接種培養時采用的培養基能直接讓側芽誘導叢生芽，誘導時間縮短至20天，平均增值倍率為5.2。此培養基中是以KT為主要影響因素，同時降低瓊脂、蔗糖含量至3.5g、20g，并添加少量AC，能明顯促進珙桐側芽誘導叢生芽。

由于采用GA3預處理，打破休眠，促進生長；經過多次試驗表明，KT對珙桐生長分化具有較強的促進作用；降低瓊脂、蔗糖濃度能加強培養基內養分流動，促進其生長分化；實現直接誘導。采用本發明提供的珙桐叢生芽誘導技術，方法簡便，誘導周期短，繁殖系數高，對此國家一級珍稀瀕危植物保護具有一定的促進作用。

附圖說明

圖1為實施例2中珙桐帶側芽枝條室外激素浸泡處理的照片。

圖2為實施例2中處理后側芽接種7d時生長情況。

圖3為實施例2中處理后側芽接種15d時生長情況。

圖4為實施例2中處理后側芽接種30d時生長情況。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡明本發明。

實施例1：

1)選擇生長健壯、無病蟲害、性狀優良、側芽形成且未展葉時的珙桐枝條為母株，加入GA3溶液中進行浸泡，至珙桐側芽生長到3cm以上；

2)剪取側芽，進行消毒，然后接種于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培養基內；培養18-22d后芽點萌發生長，形成叢生芽。

實施例2：

1)選擇生長健壯、無病蟲害、性狀優良、側芽形成且未展葉時的珙桐枝條為母株，加入100mg/L的GA3溶液中進行浸泡，每5天更換浸泡溶液，至珙桐側芽生長到3cm以上；如圖1所示；

2)剪取側芽，剪取時基部帶1-2mm木質部，進行消毒，具體是先流水沖洗1h，0.4％洗衣粉浸泡4-6min，后在操作臺進行75％酒精浸泡20s，無菌水沖洗2次，0.1％Hgcl₂浸泡3-5min，無菌水沖洗4次，完成消毒工序；然后接種于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培養基內；培養環境為溫度25±1℃、濕度75±2％、光照12-14h/d、光強1800-2200lx的恒定溫濕度的培養室內；培養5-7d后側芽基部開始膨脹，側芽繼續伸長，培養10-14d后側芽基部產生3-7個芽點，18-22d后芽點芽點萌發生長，形成叢生芽，叢生芽誘導率達92％，平均增值倍數為5.2，如圖2-4所示。

所述的Wpm為木本植物培養基，其中大量元素10倍為：Ca(NO3)·4H2O 5.56g/L、NH4NO3 3.50g/L、K2SO3 9.9g/L、MgSO4·7H2O 3.20g/L、KH2PO4 1.70g/L、CaCl20.725g/L；微量元素100倍為：MnSO4·4H2O 2.23g/L、ZnSO4·7H20 0.86g/L、H3BO3 0.62g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、Na2MoO4·2H2O 0.025g/L；鐵鹽100倍為：FeSO4·7H2O 2.78g/L、Na2-EDTA 3.72g/L；有機100倍為：鹽酸硫胺素VB1 0.1g/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.05g/L、煙酸VB5 0.05g/L、甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L。

GA3溶液濃度的優化：

選擇生長健壯、無病蟲害等性狀優良的珙桐為母株，當側芽形成且未展葉時截取當年生從上往下至第5個側芽的枝條為實驗材料，每10個枝條為一捆用橡皮筋箍緊，用清水、10mg/LGA3、100mg/L GA3、500mg/L GA3四種處理進行浸泡，5d換一次溶液，10d后進行統計萌發生長情況見表1。

表1

由表一可得GA3對珙桐側芽萌發有明顯促進作用，對芽伸長也有明顯的促進作用，最佳處理為100mg/LGA3溶液處理。

對珙桐誘導叢生芽的組培快繁技術的操作時間的優化：

側芽形成、膨大到展葉的時間周期為當年9月至次年3月，為了找出最佳采集時間，在9、10、11、12、1、2、3月的10號分別按上述方法采集珙桐帶側芽枝條，用100mg/LGA3溶液浸泡處理，5d換一次溶液，10d后對側芽萌發生長情況進行統計見表2。

表2

由表2可知在側芽形成到展葉的7個月中使用GA3室外處理都能有效促使側芽萌發及伸長，其中最佳采集和處理時間為3月側芽即將自然萌動時，萌發率達100％，平均芽長為3.9cm。

上述的實施例僅為本發明的優選技術方案，而不應視為對于本發明的限制，本發明的保護范圍應以權利要求記載的技術方案，包括權利要求記載的技術方案中技術特征的等同替換方案為保護范圍。即在此范圍內的等同替換改進，也在本發明的保護范圍之內。