粉雜1號粉蕉的組培快繁方法與流程

本發明屬于植物組織培養領域，具體涉及粉雜1號粉蕉的組培快繁方法。

背景技術：

‘粉雜1號’粉蕉，是新選育的抗枯萎病的粉蕉品種，由廣東省農業科學院果樹研究所、中山市農業局研究出品，為廣粉1號粉蕉的偶然實生苗。

目前來說，雖然香蕉組培快繁技術已普遍應用，但粉雜1號粉蕉由于其基因型為四倍體香蕉ABBB類型，用常用的三倍體香蕉（AAA類型）組培快繁方法去培養粉雜1號，其繁殖速度慢、效率低，生根苗移植成活低，一般來說可獲得的增殖倍數僅為1.3倍，一個吸芽一年才繁殖幾百株苗，且小苗假植成活率有時不到20%。如何提高‘粉雜1號’增殖系數而又遺傳穩定不變異，極具現實意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供粉雜1號粉蕉的組培快繁方法。

本發明所采取的技術方案是：

粉雜1號粉蕉的組培快繁方法，包括下列步驟：

1)篩選母株：挑選假莖綠色、粗壯、高度為3.2～4.5m，果穗較大，果指連體果較少，果形正常，品質好的植株為母株；

2)外植體吸芽的處理：對吸芽噴淋多菌靈和鏈霉素的混合藥液，1周后取吸芽為外植體進行接種；

3)分化培養：分化培養溫度控制在27℃～33℃，分化培養12～20天進行繼代，繼代總數控制在12～16代；

4)生根培養和煉苗；用生根培養基接種分化芽，第一周在室內弱光或無光條件下，促根長苗；第二周利用溫室煉苗，溫度控制在26-30℃，自然光遮蔭照射，光照強度控制在4000-5000lux；兩周后，光照強度調至8000-10000lux，到出苗為止。

優選的，步驟1）中，新植蕉母株高度為3.2～3.5m，宿根蕉母株高度為3.8～4.5m。如果超過或者低于這個高度，有可能出現與種性不符的劣變現象。

步驟1）中將母株的要求標準化，是為了挑選符合種性、品質優良的植株。如果挑選假莖黃色、瘦弱、果穗較小，果指連體果較多，果形不正常，品質不好的植株為母株，有可能出現與種性不符的劣變現象。

優選的，步驟2）中，當吸芽長至30～50cm高時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液和150ppm濃度的鏈霉素的混合藥液，1周后取吸芽為外植體進行接種。

具體使用時，1000公斤的混合藥液中含有50%多菌靈1公斤，農用鏈霉素150克，每芽灌藥液0.5公斤。

多菌靈和鏈霉素的混合藥液主要是殺滅吸芽內分生組織的內生細菌。

發明人經過篩選，最終優選出上述兩種藥以及配比濃度，所獲混合藥液對細菌效果最好，而且價格相對低廉。

優選的，步驟3）中，分化培養時所用的分化培養基是在MS培養基的基礎上添加適量細胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生長素IBA和NAA，控制增殖倍數為2.5～2.8倍。

具體的，分化培養所用的培養基是在MS培養基的基礎上添加 3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30 ，以及適量IBA和NAA，在上述范圍內調整激素的濃度，控制控制分化芽體的大小及高度，使得增殖率控制在2.5～2.8倍。

增殖倍數控制在2.5-2.8倍下獲得的分化芽最佳。如果增值倍數太低，則影響效率和成本；如果增殖倍數太高，芽太多，芽體小，分化芽葉鞘松散泡化，芽體質量差，實際上也影響整個過程的苗的繁殖速度，也有可能發展成為畸形芽。

優選的，步驟3）中，分化培養溫度控制在29℃～33℃。

香蕉的組培快繁中分化培養溫度一般為25～28℃，本發明優選粉雜1號粉蕉組培快繁中分化培養溫度為29℃～33℃，高于以往香蕉的培養溫度。培養溫度低于29℃時分化芽容易向上生長，增殖率較低；培養溫度在33℃以上時，前期分化芽生長較快，后期分化芽葉鞘松散，芽體質量差。在29℃～33℃下培養，分化芽嫩白粗壯，芽體較結實，高度和粗細適中。

優選的，步驟3）中，分化培養15～18天進行繼代，繼代總數控制在13～15代。

香蕉的組培快繁中一般分化培養20～30天進行繼代，而本發明中分化培養天數控制在15～18天進行繼代，不超期繼代轉接，以防止分化芽老化，造成大芽開葉和出根不再分化增殖；繼代數13～15代以內。

優選的，步驟3）中繼代轉接分化芽時，切斷截去分化芽部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點分生組織而不分離小球莖，去除頂端生長優勢，促使側芽分化叢生。

因為粉蕉低代數分化芽粗大，向上生長勢強，容易形成單芽、開葉和出根不再分化。因此利用繼代轉接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，去除頂端生長優勢。同時，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點分生組織而不分離小球莖，促使側芽分化叢生。

優選的，步驟4）中生根培養所用的培養基是在MS培養基的基礎上添加30g/L蔗糖、0.1～0.2mg/L的IBA和0.5～0.8mg/L的NAA。此配方有利于獲得多而小的根系，提高假植成活率。

蔗糖的含量在培養基中為定值，生根時濃度高會難生根，因為滲透壓太大。

優選的，步驟4）中，用生根培養基接種分化芽，第一周在室內弱光或無光條件下，促根長苗，溫度控制在25℃-28℃；第二周利用溫室煉苗，溫度控制在26℃-30℃，自然光遮蔭照射，光照強度控制在4000-5000lux；2周后，光照強度調至8000-10000lux。即煉苗中后期光線比香蕉苗的要強。

本發明的有益效果是：

本發明組培快繁方法是專門針對‘粉雜1號’粉蕉這個四倍體香蕉品種，區別于現有技術中常用的的三倍體香蕉的組培快繁方法。利用本發明的方法，可以解決‘粉雜1號’粉蕉繁殖速度慢、效率低，生根苗移植成活低而且遺傳不穩定，容易變異等的問題。

采用本發明的技術繁殖的粉雜1號生根苗，根系較多，較粗壯且白色，分化增殖倍數為2.5-2.8倍，小苗假莖淺黃綠色，葉片深綠色，假植成活率可高達95%以上，生長較快且整齊，每個外植體一年時間內可繁殖約5000-8000株小苗，定植后種性穩定，很少出現變異株，蕉農反映良好。

本發明將母株的選擇范圍標準化，目的是為了挑選符合種性、品質優良的植株。利用本發明標準的母株進行組培快繁，才能保證優良的種性。

本發明使用多菌靈和鏈霉素的混合藥液，可以殺滅吸芽內分生組織的內生細菌，效果好，同時價格相對低廉。

本發明的分化培養基是在MS培養基的基礎上添加適量細胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生長素IBA和NAA，控制增殖倍數為2.5～2.8倍。增殖倍數控制在2.5～2.8倍下獲得的分化芽最佳。如果增值倍數太低，則影響效率和成本；如果增殖倍數太高，芽太多，芽體小，分化芽葉鞘松散泡化，芽體質量差，實際上也影響整個過程的苗的繁殖速度，也有可能發展成為畸形芽。

本發明優選粉雜1號粉蕉組培快繁中分化培養溫度為29℃～33℃，高于普通的香蕉組培快繁分化培養的溫度。當培養溫度低于29℃時分化芽容易向上生長，增殖率較低，培養溫度在33℃以上時，前期分化芽生長較快，后期分化芽葉鞘松散，芽體質量差。在29℃～33℃下培養，分化芽嫩白粗壯，芽體較結實，高度和粗細適中。

本發明分化培養天數控制在15～18天進行繼代，不超期繼代轉接，以防止分化芽老化，造成大芽開葉和出根不再分化增殖；繼代數13～15代以內。

本發明還公開了繼代轉接分切技術，去除頂端生長優勢，促使側芽分化叢生。

本發明的生根培養基適當降低了IBA濃度，增加了NAA濃度，有利于根系多而小些，提高假植成活率。

本發明煉苗培養中后期光線比香蕉苗的要強，有利于促進苗的假莖生長為黃綠色，葉片綠色，生命力強。

附圖說明

圖1為粉雜1號組培增殖培養；

圖2為粉雜1號大棚假植杯苗。

具體實施方式

中英文縮略詞：

6-BA為6-芐基腺呤，TDZ為N-芐苯基-N'-1,2,3-噻二唑-5-脲，KT-30為N-（2-氯-4-吡啶基）-N-苯基脲，IBA為吲哚丁酸，NAA為奈乙酸。

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1

實施地點：廣東省農業科學院果樹研究所母本園，時間：2012年10月-11月。

（1）母株的篩選：選擇假莖綠色、粗壯、高度為3.2～3.5m，果穗較大，果指連體果較少，果形正常，品質好的新植蕉植株，種于大棚或隔離種植園中，作為母本園，供取芽之用。

（2）外植體吸芽的處理：當吸芽長至30-50cm時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液和150ppm農用鏈霉素的混合藥液。具體的，1000公斤的混合藥液中含有50%多菌靈1公斤，農用鏈霉素150克，每芽灌混合藥液0.5公斤；1周后取吸芽為外植體進行接種。

（3）分化培養：分化培養利用玻璃瓶或聚丙烯薄膜袋為包裝容器，溫度控制在29℃～33℃。

粉蕉組培增殖倍數與溫度有極大相關性。控制分化芽增殖培養溫度在31±2℃。培養溫度低于29℃時分化芽容易向上生長，增殖率較低，培養溫度在33℃以上時，前期分化芽生長較快，后期分化芽葉鞘松散，芽體質量差。

分化培養15-18天進行繼代。粉蕉低代數分化芽粗大，向上生長勢強，容易形成單芽、開葉和出根不再分化。繼代轉接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點分生組織而不分離小球莖，以去除頂端生長優勢，促使側芽分化叢生。繼代總數控制在13～15代。

分化培養所用的培養基，包括下列組分：在常規香牙蕉（AAA類型）培養基的基礎上添加適量細胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生長素IBA和NAA，調整上述激素的濃度，控制分化芽體的大小及高度，使得增殖倍數控制在2.5-2.8倍，所獲分化芽生長結實質優。

（4）生根培養和煉苗：所用生根培養基在香蕉生根培養基的基礎上適當降低IBA濃度，增加NAA濃度，促進生長的根系多而小，提高假植成活率。具體的，生根培養基包括下列組分：MS+蔗糖30g/L+IBA0.1mg/L+NAA0.6mg/L。生根培養用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，每袋接種8株大小一致的較粗壯分化芽。

用生根培養基接種分化芽，第一周在室內弱光或無光條件下，促根長苗；第二周利用溫室煉苗，溫度控制在26-30℃，自然光遮蔭照射，光照強度控制在4000-5000lux；兩周后，光照強度調至8000-10000lux，其他條件同第二周。四周后組培苗莖干充實葉片濃綠（見圖1），移植成活率較高，可達95%以上。

采用本技術，本單位每年快繁粉雜1號粉蕉40-80萬株苗，種植后深受蕉農好評。

實施例2

實施地點：廣東省農業科學院果樹研究所母本園，時間：2013年10月開始。

（1）母株的篩選：選擇假莖綠色、粗壯、高度為3.4m的新植蕉和4.1m的宿根蕉，果穗較大，果指連體果較少，果形正常，品質好的植株，作為母本樹，供取芽之用。

（2）外植體吸芽的處理：當吸芽長至30-50cm時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液加150ppm農用鏈霉素的混合藥液，每芽灌混合藥液0.5公斤；1周后取吸芽為外植體進行接種。

（3）分化培養：分化培養利用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，溫度控制在29℃～33℃。分化培養15天進行繼代，繼代轉接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點分生組織而不分離小球莖，以去除頂端生長優勢，促使側芽分化叢生。繼代總數控制在15代。

分化培養所用的培養基，包括下列組分：在MS培養基的基礎上添加細胞分裂素3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30以及適量生長素IBA和NAA，調整上述激素的濃度（主要調整細胞分裂素的濃度），控制分化芽體的大小及高度，使得增殖率控制在2.6倍。

（4）生根培養：所用生根培養基包括下列組分：MS+蔗糖30g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L。生根培養用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，每袋接種8株大小一致的較粗壯分化芽。

用生根培養基接種分化芽后在室內弱光或無光條件下促根假莖拉高培養，溫度控制在25℃-28℃；第二周開始在溫室煉苗，自然光遮蔭照射，光照強度控制在4000-5000lux；2周后光照強度調至8000-10000lux，到出苗為止。4周后組培苗莖干充實葉片濃綠，移植成活率達96%以上。

所得到的粉雜1號生根苗，根系較多，較粗壯且白色，小苗假莖淺黃綠色，葉片深綠色，假植成杯苗（圖2）的成活率高，達到95%以上，生長較快且整齊，每個外植體（吸芽）一年可繼代培養13-15代，總共可繁殖約5000-8000株小苗，定植后種性穩定，很少出現變異株，蕉農反映良好。

實施例3

實施地點：廣東省農業科學院果樹研究所母本園，時間：2014年10月開始。

（1）母株的篩選：選擇假莖綠色、粗壯、高度為4.0m，果穗較大，果指連體果較少，果形正常的宿根蕉植株，作為母本樹，供取芽之用。

（2）外植體吸芽的處理：當吸芽長至40cm時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液加150ppm農用鏈霉素的混合藥液，每芽灌混合藥液0.5公斤；1周后取吸芽為外植體進行接種。

（3）分化培養：分化培養利用玻璃瓶為包裝容器，溫度控制在29℃～33℃。分化培養17天進行繼代，繼代轉接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點分生組織而不分離小球莖，以去除頂端生長優勢，促使側芽分化叢生。繼代總數控制在13代。

分化培養所用的培養基是在MS培養基的基礎上添加 3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30 ，以及適量IBA和NAA，在上述范圍內調整激素的濃度，控制控制分化芽體的大小及高度，使得增殖率控制在2.8倍。

（4）生根培養和煉苗：所用生根培養基包括下列組分：MS+蔗糖30g/L+IBA0.2mg/L+NAA0.7mg/L。生根培養用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，每袋接種8株大小一致的較粗壯分化芽。

在室內弱光或無光促根長促苗，溫度控制在25℃-28℃；一周后利用溫室煉苗，溫度控制在26℃-30℃，自然光遮蔽下培養一周，光照強度控制在4000-5000lux；兩周后，光照強度調至8000-10000lux。4周后組培苗莖干充實葉片濃綠，移植成活率較高。

用這種技術繁殖的粉雜1號生根苗，根系較多，較粗壯且白色，小苗假莖淺黃綠色，葉片深綠色，假植成活率高，達到96%，生長較快且整齊，每個外植體一年時間內可繁殖約6000～7000株小苗，共繁殖了近80萬株，定植后種性穩定，產量高，果形好，變異株約1%，蕉農反映良好。

對比例1

其他方法同實施例1，不同之處在于：

利用香牙蕉如巴西蕉的分化培養基MS+6-BA 3～4mg/L+IBA0.2mg/L替代本發明的分化培養基，進行粉雜1號粉蕉的培養，結果是分化芽增殖率低，芽體向上直長，長時間培養粉雜1號粉蕉組培苗僅長根長葉而不分化。

對比例2

其他方法同實施例1，不同之處在于：

利用香蕉生根培養基配方MS+蔗糖20g/L+IBA1mg/L+NAA0.2mg/L替代本發明的生根培養基來進行粉雜1號粉蕉的促根，結果是根少而粗，小苗假植成活率較低，有時僅達20%。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。