一種高粱體細胞懸浮培養方法及應用與流程

本發明屬于植物細胞培養技術領域，具體涉及一種高粱體細胞懸浮培養方法及應用。

背景技術：

高粱品種資源創新不足是目前高粱育種中面臨的最大問題，創造具有豐富遺傳基礎的資源材料是高粱育種工作者研究的重點之一。實踐證明，育種新技術的開發應用對高粱育種材料的創新是非常重要的。生物技術是世界新技術革命的主要內容之一，為培育高產、多抗、優良的農作物新品種提供了科學的手段。

近年來,植物細胞和組織培養作為植物生物技術的組成部分被應用于作物育種后,取得了一系列重大進展與突破,在作物品種改良上發揮了很大的作用。與植物組織培養相比,植物細胞培養屬技術層次更高的培養技術,它是指以離體的單細胞或細胞團為外植體，在無菌條件下進行培養，增殖形成新的細胞團，經再分化形成完整植株的技術。細胞培養具有群體數量大、誘變率高、易于篩選等優點,不僅可以應用于原生質體分離、培養與雜交，基因轉移和生產次生代謝物等，還可以在細胞水平上短期篩選出預期突變體，為作物品種改良提供了一種新途徑。很多植物的體細胞懸浮培養已獲得成功，其在作物育種方面的應用也很廣泛。

在禾谷類作物中，對水稻、玉米、小麥、大麥等作物的細胞懸浮培養研究較多，并已得到原生質體再生植株，其中對水稻的研究比較深入，不僅進行了遺傳轉化和突變體的篩選，還培育出了新品種。但是，目前尚沒有一種比較成熟的高粱體細胞懸浮培養方法，影響了高粱育種工作的開展。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種高粱體細胞懸浮培養方法及應用，愈傷誘導率高，建立的細胞懸浮系不褐化，容易觀察，且懸浮細胞系中游離細胞體積小，細胞質濃厚，細胞分裂生長旺盛，在高粱育種方面具有良好的應用前景。

本發明提供的一種高粱體細胞懸浮培養方法，具體包括以下步驟：

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇浸泡1-3min，再用無菌水沖洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10-20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗，得到無菌高粱種子；

步驟2，制備高粱愈傷組織；

步驟3，高粱體細胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養基中，接種比例為2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培養，每隔7天繼代一次；每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42-45天后獲得高粱體細胞懸浮系；

所述液體培養基為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D和30g的蔗糖，pH為5.8。

優選的，步驟1中，高粱種子先用70％乙醇浸泡1min后，再用無菌水沖洗2-3次；HgCl₂水溶液浸泡15min后，用無菌水沖洗5-6次。

優選的，步驟2中，制備高粱愈傷組織，具體包括：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養基中，于25±1℃培養，每天光照12h；培養到高粱無菌苗苗長為3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導培養基中，在25±1℃下培養愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態良好的愈傷組織進行繼代培養，繼代培養溫度為25±1℃，自然光照，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養基為：每升MS培養基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養的培養基與誘導培養基相同，均為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8。

優選的，步驟2中，所述繼代培養的次數為2-3次，每次間隔18-25天。

優選的，步驟3中，接種比例為2.5g:100mL。

本發明還提供了一種高粱體細胞懸浮培養方法在高粱育種中的應用。

與現有技術相比，本發明的方法具備以下有益效果：

(1)高粱無菌苗葉片為外植體誘導愈傷，誘導率高，誘導出的愈傷經過2-3次繼代后，可以得到較多的Ⅲ型胚性愈傷，這樣的愈傷適合用于懸浮培養的起始材料，并在后續的培養中容易建立細胞懸浮系，并且懸浮液不褐化。而從高粱幼穗培養得到的愈傷進行懸浮培養時，懸浮液很容易褐化，很難在倒置顯微鏡下跟蹤觀察及計數。

(2)本發明建立的穩定優良的懸浮細胞系，細胞密度大(為6.45×10⁵-5.08×10⁶個/mL)，游離細胞體積小，細胞質濃厚，近圓形細胞(圓形細胞、橢圓形細胞、腎形細胞)比例達70％以上，活細胞率達60％以上，細胞分裂生長旺盛。

附圖說明

圖1為三種類型愈傷組織結構圖；

圖1中，a為Ⅰ型高粱愈傷組織；b為Ⅱ型高粱愈傷組織；圖1中c和d均為Ⅲ型高粱愈傷組織；

圖2為制備細胞懸浮系時，不同培養時期的細胞顯微視圖；

圖2中，a圖為Ⅲ型愈傷組織培養一周后的細胞形態16×4倍放大圖，b圖為Ⅲ型愈傷組織培養一周后的細胞形態16×25倍放大圖，c圖為Ⅲ型愈傷組織第3次繼代培養后的細胞形態16×10倍放大圖，d圖為Ⅲ型愈傷組織第4次繼代培養后的細胞形態16×10倍放大圖，e圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養后的細胞形態16×4倍放大圖，f圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養后經伊文斯藍染色后的細胞形態16×25倍放大圖。

具體實施方式

下面對發明的具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本發明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

本發明提供的一種高粱體細胞懸浮培養方法，將高粱無菌苗葉片培養獲得愈傷組織進行培養獲得高粱體細胞懸浮系，具體包括以下步驟：

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇(體積分數)浸泡滅菌1-3min，再用無菌水沖洗2-3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌10-20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗5-6次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進行攪拌處理。

需要說明的是，上述浸泡過程中浸泡液(70％乙醇或者HgCl₂水溶液)漫過種子上表面即可，以達到節約實際用量的目的。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養，每天光照12h；培養到高粱無菌苗苗長為3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導培養基中，在25±1℃下培養愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態良好的愈傷組織進行繼代培養，連續繼代培養2-3次，每次間隔18-25天，培養條件同愈傷培養(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養基為：每升MS培養基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養的培養基與誘導培養基相同，均為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養基的比例)為2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培養，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42-45天后獲得高粱體細胞懸浮系；

所述液體培養基為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

需要說明的是，步驟3中，新液體培養基是指新配置且尚未使用的液體培養基；舊液體培養基指的是繼代培養高粱愈傷組織以后的培養基；以上一代培養后的留下的液體為舊液體培養基，然后加入新的培養基，混合后作為下一代的培養基，這個與本領域技術人員的常規理解是相同的。

優選的，本發明高粱體細胞懸浮培養方法，還包括以下實施例。

實施例1

步驟1，高粱種子的處理(所述高粱種子的基因型為R111)：

高粱種子先用70％乙醇(體積分數)浸泡滅菌1min，再用無菌水沖洗2次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌15min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗5次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進行攪拌處理。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養，每天光照12h；培養到高粱無菌苗苗長3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導培養基中，在25±1℃下培養愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態良好的愈傷組織進行繼代培養，連續繼代培養2次，每次間隔18天，培養條件同愈傷培養(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養基為：每升MS培養基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養的培養基與誘導培養基相同，均為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織，用鑷子夾碎成小顆粒狀，接種于液體培養基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養基的比例)為2.5g:100mL，每個處理接種兩瓶，置于100r/min的搖床上進行震蕩培養，25±1℃、自然光下培養，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42-45天后獲得高粱體細胞懸浮系；

所述液體培養基為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH為5.8。

實施例2

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇(體積分數)浸泡滅菌3min，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌10min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗6次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進行攪拌處理。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養，每天光照12h；培養到高粱無菌苗苗長3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導培養基中，在25±1℃下培養愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態良好的愈傷組織進行繼代培養，連續繼代培養2次，每次間隔25天，培養條件同愈傷培養(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養基為：每升MS培養基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養的培養基與誘導培養基相同，均為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養基的比例)為2g:100mL，每個處理接種兩瓶，置于100r/min的搖床上進行震蕩培養，25±1℃、自然光下培養，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42-45天后獲得高粱體細胞懸浮系；

所述液體培養基為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

實施例3

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇(體積分數)浸泡滅菌2min，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗5次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進行攪拌處理。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養，每天光照12h；培養到高粱無菌苗苗長3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導培養基中，在25±1℃下培養愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態良好的愈傷組織進行繼代培養，連續繼代培養2次，每次間隔22天，培養條件同愈傷組織培養(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養基為：每升MS培養基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養的培養基與誘導培養基相同，均為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養基的比例)為3g:100mL，每個處理接種兩瓶，置于100r/min的搖床上進行震蕩培養，25±1℃、自然光下培養，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42-45天后獲得高粱體細胞懸浮系；

所述液體培養基為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

下面以實施例1的方法為例，對高粱體細胞懸浮系構建過程中的愈傷組織生長狀況、細胞密度等進行說明，具體包括：

以基因型R111的高粱種子滅菌后制備高粱愈傷組織，R111幼苗苗葉的愈傷誘導率為80-85％，有三種類型愈傷組織，如圖1所示，圖1中a為Ⅰ型高粱愈傷組織結構圖，為白色或淺褐色半透明愈傷，柔軟，含水量很高，水漬狀，分泌粘液；圖1中b為Ⅱ型高粱愈傷組織結構圖，愈傷白色或淺綠色，含水量較Ⅰ型少，形狀不規則，結構松散；圖1中c和d均為Ⅲ型高粱愈傷組織結構圖，愈傷白色或淺綠色，干燥，表面顆粒狀，結構較疏松。Ⅲ型高粱愈傷組織的顆粒狀愈傷脫分化程度和胚性高，適于作細胞懸浮培養。經過2-3次的繼代，可以得到許多Ⅲ型顆粒狀的愈傷組織。繼代時應注意將不同類型的愈傷分離開，并保持其原有極性，這樣有利于快速獲得Ⅲ型顆粒狀的愈傷組織。

以上述Ⅲ型愈傷組織為材料，制備細胞懸浮系，不同培養時期的細胞顯微視圖如圖2所示，a圖為Ⅲ型愈傷組織培養一周后的細胞形態16×4倍放大圖，b圖為Ⅲ型愈傷組織培養一周后的細胞形態16×25倍放大圖，該時期的懸浮細胞系由游離單細胞和多細胞團組成，大小形狀極不均一，多屬薄壁細胞，破碎和質壁分離普遍存在，活細胞率較低，細胞內容物少，分裂能力弱，細胞團由幾個到幾十個不等的細胞組成。

圖2中c圖為Ⅲ型愈傷組織第3次繼代培養后的細胞形態16×10倍放大圖，d圖為Ⅲ型愈傷組織第4次繼代培養后的細胞形態16×10倍放大圖，經過連續3-4次的繼代培養，細胞形狀開始轉為近圓形細胞，細胞數量也逐漸增加。

圖2中e圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養后的細胞形態16×4倍放大圖，f圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養后經伊文斯藍染色后的細胞形態16×25倍放大圖，該時期游離細胞體積小，細胞質濃厚，血球計數板檢測顯示細胞密度為6.45×10⁵-5.08×10⁶個/mL，伊文斯藍檢測顯示活細胞率為60.87-75％，近圓形細胞(圓形細胞、橢圓形細胞、腎形細胞)率為77.13-83.96％，細胞分裂生長旺盛，至此建立起一個良好的液體細胞懸浮系，可以用于高粱育種的研究。

所述活細胞率的檢測方法為：取懸浮細胞液一滴于載玻片中間，滴一滴0.05％伊文斯藍染色液染色，置于倒置顯微鏡下觀察，活細胞無色或僅有液泡呈淡淡的藍色，死細胞核被染成藍色或整個原生質呈藍色。顯微鏡下計數10個視野的懸浮細胞，計算活細胞的比例，活細胞率計算公式為：活細胞率(％)＝(活細胞總數/懸浮細胞總數)×100％。

所述近圓細胞為圓形細胞、橢圓形細胞或者腎形細胞，檢測方法為計數完活細胞后，同時計數近圓形細胞，近圓細胞率的計算公式為：近圓細胞率(％)＝(近圓細胞總數/懸浮細胞總數)×100％；

所述細胞密度的測定方法為：取1ml懸浮細胞液，將其稀釋3-5倍后，取1ml稀釋的懸浮細胞液加入1ml伊文斯藍染色液染色，滴于血球計數板上，蓋玻片壓片后，于顯微鏡下計數，取四周大格為計數區，計算細胞密度，細胞密度的計算公式為：細胞密度(個/mL)＝四周大格的細胞數/4×10000×稀釋倍數×10×2。

盡管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。