利用懸浮培養葡萄細胞生產¹³C標記反式白藜蘆醇的方法

專利名稱：利用懸浮培養葡萄細胞生產¹³C標記反式白藜蘆醇的方法
技術領域：
本發明涉及植物細胞培養技術，具體地說是一種通過添加1V標記前體生產1V標記反式白藜蘆醇的方法。
背景技術：
反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)是一種類黃酮類多酚化合物，化學名為3，5,4'-三羥基-反-二苯代乙烯)。天然的白藜蘆醇存在于葡萄皮、花生及傳統中藥虎杖等植物體中，它屬于一種植物抗毒素，在惡劣環境或是植物受到霉菌感染時產生(M. Jang,L. Cai, G. Udeani, K. Slowing, C. Thomas, C. Beecher, H. Fong, N. Farnsworth, A. Kinghorn,R. Mehta, Cancer chemopreventive activity of resveratrol, anatural productderived from grapes, Science, 1997，275 :218)。大量研究表明，反式白藜蘆醇能夠阻止低密度脂蛋白的氧化，具有抗菌、抗脂質過氧化、防治心臟病、抗癌、抗血小板凝集與血管松弛、降低血脂和抗誘變等多種藥理作用，被確認為抗腫瘤劑和治療心血管疾病的有效成分(Donnez, D.，et al.，Bioproduction of resveratrol and stilbene derivativesby plant cells and microorganisms. Trends in biotechnology,2009.27 (12)p. 706-713.)。隨著反式白藜蘆醇藥理作用的闡明和研究，反式白藜蘆醇正成為人們研究和開發的熱點，在1990年到2000年的十年間共報道有170多篇白藜蘆醇的研究工作，而在2000年到2002年的兩年時間里白藜蘆醇的研究文獻驟然上升到238篇(P. Jeandet,A. C. Douillet-Breuil, R. Bessis, S. Debord, M. Sbaghi, M. Adrian, Phytoalexins fromthe Vitaceae :Biosynthesis, Phytoalexin Gene Expression in Transgenic Plants,Antifungal Activity, and Metabolism, Journal of Agriculture and Food Chemistry,2002,50 :2731-2741)。而同位素11標記反式白藜蘆醇作為研究反式白藜蘆醇在人和動物中代謝吸收的一個重要工具，其重要性越來越受到人們的關注。目前，市場上并沒有專門供應"C標記反式白藜蘆醇的公司，國外一些反式白藜蘆醇藥代動力學研究機構中的"C標記反式白藜蘆醇的應用也主要來源于化學合成。但是，化學合成除了造價昂貴之外，其生產過程毒性較大也成為制約了這種方式生產的1V標記反式白藜蘆醇在臨床研究中的應用。葡萄細胞培養作為生產"C標記反式白藜蘆醇的替代方法已受到關注(Krisa，S.，et al.，Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures :methyl jasmonateinduction and 13C biolabeling. J. Nat. Prod, 1999. 62 (12) :p. 1688-1690 ；Aumont, V.,et al. ， Production of highly C_13_labeled polyphenols in Vitis vinifera cellbioreactor cultures. Journal of Biotechnology,2004. 109(3) :p.287—294)。目前國際上通過誘導劑及吸附劑聯合誘導調控同時添加"C標記前體來高產量生產13C標記反式白藜蘆醇的方法還未見報道
發明內容
本發明的目的是提供一種利用葡萄(Vitis vinifera)懸浮細胞培養體系，以一種或多種誘導劑聯合誘導并與吸附劑添加相結合，同時添加1Y標記前體的聯合調控手段來生產"C標記反式白藜蘆醇的方法。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為將葡萄細胞置于液體培養基中懸浮培養，細胞接種量為50 200g/L濕重，在細胞接種時每升培養基中加入50 200g的無菌吸附劑；在細胞指數生長初期，于每升培養基中加入濃度分別為5 1000 μ M的誘導劑，同時添加"C標記前體。所述誘導劑為非生物誘導劑，所述前體為"C標記苯丙氨酸或酪氨酸。所述非生物誘導劑為硝酸銀、水楊酸或茉莉酸及其衍生物，所述前體為"C標記苯
丙氨酸或酪氨酸。葡萄細胞的培養條件為培養溫度為20 30°C，暗培養；培養周期為5 20天， 每隔5 10天傳代一次；所述細胞指數生長初期是指細胞接種于培養基后的第2 6天， 即兩種誘導子及前體的添加時間。所述吸附劑為經處理對白藜蘆醇有較強吸附能力并對細胞無毒的多孔材料，如各種大孔吸附樹脂。葡萄細胞的液體培養基組成為于B5基礎培養基中添加0. 1 0. 4mg/L激動素， 0. 05 0.3萘乙酸，0. 1 lg/L酶解酪蛋白及10 40g/L蔗糖，pH值為5. 5 6. 5。本發明方法原理在添加多種誘導劑的同時添加特定種類和濃度的吸附劑能顯著提高反式白藜蘆醇產量，同時添加1V標記前體可使得部分同位素標記前體轉化為％標記反式白藜蘆醇，其主要原理有以下四方面1、誘導劑能有效刺激植物細胞次生代謝能力， 促進白藜蘆醇生物合成生產；2、多種誘導劑能產生協同效應共同促進白藜蘆醇生物合成生產；3、通過特定吸附劑的加入使細胞中的白藜蘆醇苷以白藜蘆醇的形式外泌到細胞外，從而合成了價格昂貴的白藜蘆醇并解除了產物的反饋抑制，避免了白藜蘆醇苷存在于胞內對細胞生長的傷害及對進一步生產的阻礙，同時也避免了白藜蘆醇苷在胞內的降解；4、由于標記前體為反式白藜蘆醇生物合成步驟中必須的底物，因此1V標記前體的添加可以使得生產的部分反式白藜蘆醇被標記。本發明具有如下優點1、聯合應用兩種或多種誘導劑和吸附劑同時添加1V標記前體來在葡萄細胞中生產13C標記反式白藜蘆醇，獲得的產量遠遠超過目前國內外文獻報道的最高值。Krisa等人的報道中稱總芪的產量達770 μ mol/L (主要產物為白藜蘆醇苷，折合"C標記白藜蘆醇的產量為 300mg/L) (Krisa, S. , et al. , Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures :methyl jasmonate induction and 13C biolabeling. J. Nat. Prod, 1999. 62(12) :p. 1688-1690)。之后，Aumont 等人在 2L 生物反應器中獲得 360mg/L 的 13C 標記白藜蘆醇苷(折合210mg/L13C標記白藜蘆醇)，本發明中生產"C標記反式白藜蘆醇 (白藜蘆醇分為正式和反式，反式白藜蘆醇為其活性構型)產量可達1000 1200mg/L.2、本發明使得反式白藜蘆醇95%以上外泌，被吸附到吸附劑上。大大簡化了提取分離純化的操作，降低了成本，為進一步工業化生產提供了很大的可能性(在國內的文獻中反式白藜蘆醇的生產大都通過對生產得到反式白藜蘆醇苷進行酶解而獲得)。3、％標記前體的添加使得生產的反式白藜蘆醇被標記，標記率最高可達到30% 40%，這種生產方法代替了常規的化學合成的生產方法，生產過程無毒，大大降低了生產的成本和對環境的污染。


圖1顯示反式白藜蘆醇的"(標記位置；圖2為13C標記反式白藜蘆醇的二維核磁的譜圖；圖3為不同樹脂促進反式白藜蘆醇生產的效果比較。
具體實施例方式以下將通過實施例對本發明的有關內容作進一步說明。一種利用葡萄細胞誘導產生白藜蘆醇的方法，包括以下步驟(1)葡萄細胞的培養本實驗細胞株為市購獲得，也可通過對葡萄(Vitis vinifera)的種子按照常規方法誘導獲得(Cormier, F. , et al. , Development of process strategies foranthocyanin-based food colorant using Vitis vinifera cell cultures. Plant cellcultures secondary metabolism toward industrial application, ed.F. Dicosmo andM. Misawa. 1996，New York :CRC Press)。采用常用培養基 B5 培養基(Gamborg, 0. L.，R. A. Miller,and K. Ojima,Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells. Experimental Cell Research, 1968. 50(1) 151),添力口 0. 1 0. 4mg/L激動素，0. 05 0. 3萘乙酸，0. 1 lg/L酶解酪蛋白及10 40g/L蔗糖，pH值為5. 5 6. 5。每隔7天傳代一次，使用旋轉式搖床時轉速為60 200rpm，培養溫度為20 30°C，暗培養。(2)1 標記反式白藜蘆醇的聯合誘導生產；將步驟(1)所獲得的葡萄細胞置于含上述培養基中培養，細胞接種量為50 200g/L濕重。培養條件為培養溫度為20 30°C，暗培養。培養周期為5 20天。在細胞接種時每升培養基中加入50 200g的無菌吸附劑，在細胞指數生長初期同時添加一種或多種誘導劑和13C標記前體，于每升培養基中加入誘導子濃度為5 1000 μ Μ,前體濃度為0. 1 2mMo從由獲得的培養物分離得到的吸附劑部分中提取反式白藜蘆醇。反式白藜蘆醇最高產量可達1000 1200mg/L。(3)1 標記反式白藜蘆醇含量的測定取Ig吸附劑，加入20ml的甲醇，搖床上過夜提取；取提取液14，OOOg離心，備做HPLC0HPLC采用AgilentllOO高效液相色譜儀，檢測波長為307nm。色譜柱采用購買的美國菲羅門公司生產的Luna柱(100mmX 4. 6mm, 5 μ m),流動相分別為20 %的乙腈和85 %的乙腈。流速O.^il/min，進樣量10yL。用提前制作的標準曲線來計算反式白藜蘆醇含量。0)1 標記反式白藜蘆醇的純化吸附劑的甲醇提取物旋轉蒸發后溶于5mL的甲醇中，然后用反相C18柱分離純化，包含反式白藜蘆醇的部分濃縮后用硅膠柱進一步純化，最后在SEP-PAKCw半制備柱中純化后過濾得到白色粉末即為反式白藜蘆醇純品。
(5) 13C標記反式白藜蘆醇的鑒定及13C標記率的測定1V標記反式白藜蘆醇的標記位置通過二維核磁(Varian INOVA 400 MNMR)來確定，1V 標記率通過 EA-IRMS (Flash EA 1112HT, Finnigan MAT DeltaV advantage)測定。實施例1培養條件IOOml搖瓶懸浮培養，采用B5培養基，另添加0. 2mg/L激動素和0. Img/ L萘乙酸，0. 25g酶解酪蛋白和30g/L蔗糖，pH為6. 0。將過濾得到的2g提前培養的濕葡萄細胞接種到含有20ml上述培養基的搖瓶中，旋轉式搖床轉速100rpm，25°C培養。第0天添加200g/L的HP2MGL，第4天添加茉莉酸和水楊酸至終濃度分別為10 μ M 和500 μ M同時添加ImM的[1_13C]_L_苯丙氨酸。繼續培養至第10天收獲。1V標記反式白藜蘆醇在第10天產量達到最大(1144. lmg/L)，此時反式白藜蘆醇的標記率為20.8%， 1V標記反式白藜蘆醇在第5天標記率最大達到35. 7%，此時"C標記反式白藜蘆醇產量為 746. 2mg/L。
權利要求
1.利用懸浮培養葡萄細胞生產1V標記反式白藜蘆醇的方法，其利用懸浮培養葡萄細胞經過誘導，添加吸附劑和添加1V標記前體產生1V標記反式白藜蘆醇，其特征在于將葡萄細胞置于液體培養基中培養，細胞接種量為50 200g/L濕重，在細胞接種時每升培養基中加入50-200g的無菌吸附劑；在細胞指數生長初期，于每升培養基中加入濃度分別為5 1000 μ M的單一誘導劑或誘導劑組合，同時添加1 IOmM1V標記前體；所述誘導劑為非生物誘導劑或真菌誘導子。
2.按照權利要求1所述方法，其特征在于所述非生物誘導劑為硝酸銀、水楊酸或茉莉酸及其衍生物。
3.按照權利要求1所述方法，其特征在于所述葡萄細胞的培養條件為培養溫度為20 30°C，暗培養；培養周期為5 20天，每隔5 14天傳代一次。
4.按照權利要求1所述方法，其特征在于所述細胞指數生長初期是指細胞接種于培養基后的第4 10天，即誘導劑的添加時間。
5.按照權利要求1所述方法，其特征在于所述吸附劑為大孔吸附樹脂或對白藜蘆醇及其他植物酚類和黃酮類化合物有優良吸附作用的樹脂。
6.按照權利要求1所述方法，其特征在于所述"C標記前體為"C標記苯丙氨酸或酪氨酸。
7.按照權利要求1所述方法，其特征在于所述葡萄細胞的培養基組成為，于B5基礎培養基中添加0. 1 1.0mg/La-萘乙酸，0. 2 lmg/L激動素，0. 2 2g/L酶解酪蛋白及10 60g/L蔗糖，pH值為5. 5 6. 5。
全文摘要
本發明涉及植物細胞培養技術，具體地說是一種利用葡萄懸浮培養細胞生產13C標記反式白藜蘆醇的方法，將葡萄細胞置于液體培養基中培養，細胞接種量為50～200g/L濕重，在細胞接種時每升培養基中加入50～200g的無菌吸附劑；在細胞指數生長初期，于每升培養基中加入濃度分別為5～1000μM的單一誘導劑或誘導劑組合，同時添加濃度為1～10mM的13C標記前體；所述誘導劑為非生物誘導劑或真菌誘導子。本發明中，因絕大部分13C標記反式白藜蘆醇外泌到胞外且被吸附到吸附劑上，因而大大簡化了提取分離純化的操作，從而降低了成本，易于實現工業化生產。同位素標記反式白藜蘆醇在心腦血管疾病和癌癥的治療研究中被廣泛應用，因此該技術有重要的應用前景。
文檔編號C12P7/22GK102382862SQ20101026885
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者岳向國, 張衛 申請人:中國科學院大連化學物理研究所