提高羅漢果苷ⅡE含量的方法與流程

本發明涉及植物生物
技術領域：
。更具體地說，本發明涉及一種提高羅漢果苷ⅡE含量的方法。
背景技術：
：羅漢果(Siraitiagrosvenorii)為中國特有的珍貴藥用和甜料植物。其果實性涼、味甘，具有清熱潤肺，利咽開音，滑腸通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V為世界上最強的非糖甜味物質之一，是蔗糖甜度的300-400倍，廣泛應用于食品、保健品和藥品中，是糖尿病人、肥胖者和高血壓患者的理想糖替代品。研究發現，甜苷V是由苷ⅡE等低苷轉化而來，特別是在果實發育后期，苷ⅡE等低苷被完全消耗殆盡轉化成甜苷V，苷ⅡE也是羅漢果中重要的活性成分，然而，苷ⅡE只存在占果重不足15％的果肉內，且含量極低，嚴重制約了羅漢果產業的健康發展。茉莉酸甲酯作為植物信號誘導子能夠安全有效地激發植物次生代謝物的產生和積累。因此，優選合適的茉莉酸甲酯施用時間和濃度，可以最大限度地提高藥用植物活性成分的含量。現有技術中未見有提高羅漢果苷ⅡE含量的報道。技術實現要素：本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。本發明還有一個目的是提供一種通過茉莉酸甲酯處理羅漢果組培苗或其果實來誘導羅漢果苷ⅡE代謝關鍵酶基因高表達，從而提高羅漢果苷ⅡE含量的方法。本發明還有一個目的是提供一種通過對羅漢果組培苗根系處理進一步誘導促進羅漢果苷ⅡE代謝關鍵酶基因高表達來提高羅漢果苷ⅡE含量的方法。本發明還有一個目的是通過在移栽羅漢果組培苗時使用育苗杯來提高羅漢果幼苗的成活率，進而能提高羅漢果產量和羅漢果苷ⅡE提取量的方法。為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導處理培養基中誘導處理培養28-35天，其中，誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度為50-400μmol/L。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，所述誘導處理培養基中還包括基礎培養基，其配方為：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+3.5g/L瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，所述誘導處理培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，誘導處理培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為50-400μmol/L，滅菌并冷卻至24-26℃。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，所述誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度為300-350μmol/L。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將經誘導處理培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后5-10天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液為茉莉酸甲酯用體積分數為2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯濃度為50-400μmol/L得到。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，所述誘導液中茉莉酸甲酯的濃度為100-150μmol/L。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，所述誘導處理培養之后，將羅漢果組培苗距離根部1cm以上部位劃傷3-5個1mm深的傷口，并將含有0.01mg/L蜂毒、5mg/L酸溶性β-葡聚糖和3mg/L木醋液，余量為水的誘導劑滴涂于傷口處，每株羅漢果組培苗滴涂0.05mL，然后將蘆薈膠涂覆于傷口處形成厚度為1-1.5mm厚度的膜，再將羅漢果組培苗置于波長為280-315nm的中波紫外線下輻射處理0.5h后用于移栽。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將羅漢果組培苗移栽至田間的具體步驟為：在田間挖深度為8～14cm的種植坑，并在種植坑的底部鋪設聚乙烯醇薄膜，之后在種植坑內插入育苗杯，再在育苗杯內倒入殺菌后的育苗基質至與種植坑外的土層高度相同，將羅漢果組培苗種植于育苗基質中，并使羅漢果組培苗的葉片位于育苗杯外后，在育苗基質上依次鋪設1～2cm厚的保水劑層和1～3cm厚的填料層，再在填料層的表面鋪設一層紗布，使羅漢果組培苗穿過紗布，之后在紗布上鋪設粗石塊，移栽10～20d后，取出粗石塊和紗布，抽出育苗杯，將填料層填入抽出育苗杯后形成的環溝中，若填料層將環溝填滿后還有多余，則將多余的填料層埋入育苗基質中或進行回收，若填料層未能將環溝填滿，則用育苗基質填充環溝至與種植坑外的土層高度相同；其中，所述填料層由細河沙、蛭石、紅糖和牡蠣殼粉按體積比為10:5:5:1混合后制得；所述育苗杯包括：杯體，其為圓筒體形，所述杯體的側壁上沿其圓周方向間隔設置有多個出水孔，所述出水孔位于紗布的上方，粗石塊與所述出水孔不接觸；積液板，其為直徑上大下小的圓臺形，所述積液板的內部中空，且頂部和底部均敞開，所述積液板的頂部的直徑與所述杯體的內徑相等，所述積液板的頂部與所述杯體的內側壁固定連接，所述積液板與所述杯體一體成型，且位于所述出水孔的上方。優選的是，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，每次早、中噴灑所述誘導液后，對羅漢果植株進行全遮光處理30min。本發明的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法操作簡單，成本低，對環境友好，適于規模生產，具有較強的實用性和推廣價值，至少包括以下有益效果：1)本發明通過在羅漢果組培苗移栽前對其采用含有適宜濃度茉莉酸甲酯的誘導處理培養基進行誘導處理培養，以刺激并誘導羅漢果苷ⅡE代謝關鍵酶(如葡萄糖基轉移酶和細胞色素P450酶等)基因的高表達，從而促進羅漢果苷ⅡE的生物合成，提高其產量；2)本發明通過在羅漢果組培苗移栽后，于授粉后5-10天采用含有茉莉酸甲酯的誘導液噴灑羅漢果表面，在短期內進一步刺激并誘導羅漢果中羅漢果苷ⅡE代謝關鍵酶的表達，從而促進促進羅漢果苷ⅡE的生物合成；3)本發明在誘導處理培養之后移栽之前，將羅漢果組培苗根部劃傷后滴涂含有蜂毒、酸溶性β-葡聚糖和木醋液的誘導劑，并用蘆薈膠涂覆后置于中波紫外線下輻射處理，目的是劃傷有助于加速蜂毒和酸溶性β-葡聚糖進入羅漢果組培苗，促使蜂毒進行化學刺激，誘導羅漢果苷ⅡE的生物合成功能基因表達，打破羅漢果苷ⅡE合成過程中的限速步驟，在短時間內加速羅漢果苷ⅡE的合成與積累，酸溶性β-葡聚糖促進羅漢果根部細胞活化，促進細胞增殖，加速羅漢果苷ⅡE的積累，木醋液提供酸溶性β-葡聚糖以溶解環境，同時還起抑菌、促進羅漢果苗木茁壯生長的作用，而蘆薈膠起固封蜂毒促使其進入羅漢果組培苗根部，并起保濕抑菌促進羅漢果組織細胞再生，提高損傷處細胞活力，提高成活率的作用，另中波紫外線穿透性強，能刺激劃傷后的羅漢果組培苗為加強自身防御而加快該階段的生物合成，從而進一步促進漢果苷ⅡE的生物合成功能基因表達；4)本發明在羅漢果組培苗移栽時采用了育苗杯，將幼苗種植于育苗杯的中部，并使葉片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土傳病害的發生，為幼苗提供豐富的營養和適宜的生長環境，能提高幼苗的成活率，進而能提高羅漢果的產量和羅漢果苷ⅡE的提取量，也能對羅漢果幼苗的生長起導向作用，防止其長歪。在澆水過多或雨量較大時，育苗杯內過多的水經填料層和紗布過濾后從出水孔出來，能防止育苗杯內積水，這樣也不會有雜質堵塞出水孔。當土壤干旱時，可以只往育苗杯內澆水，無需對育苗杯外的土壤施水，節約了水資源。因積液板為漏斗形，這樣方便澆水，使澆的水都能流至位于中部的幼苗上。育苗杯可反復使用，節約了成本。本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。附圖說明圖1為本發明所述的育苗杯的剖面結構示意圖。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得；在本發明的描述中，術語“橫向”、“縱向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”、“內”、“外”等指示的方位或位置關系為基于附圖所示的方位或位置關系，僅是為了便于描述本發明和簡化描述，并不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本發明的限制。另，需要說明的是，本文所述的羅漢果組培苗為常規組培方法得到。6-BA為6-芐氨基腺嘌呤，IBA為吲哚丁酸。實施例1：一種提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導處理培養基中誘導處理培養28天，其中，誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度為50μmol/L。其中，所述誘導處理培養基中還包括基礎培養基，其配方為：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+3.5g/L瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭。其中，所述誘導處理培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。其中，誘導處理培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為50μmol/L，滅菌并冷卻至24-26℃。實施例2：一種提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導處理培養基中誘導處理培養35天，其中，誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度為400μmol/L。其中，所述誘導處理培養基中還包括基礎培養基，其配方為：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+3.5g/L瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭。其中，所述誘導處理培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。其中，誘導處理培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為400μmol/L，滅菌并冷卻至24-26℃。實施例3：一種提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導處理培養基中誘導處理培養30天，其中，誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度為300μmol/L。其中，所述誘導處理培養基中還包括基礎培養基，其配方為：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+3.5g/L瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭。其中，所述誘導處理培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。其中，誘導處理培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為300μmol/L，滅菌并冷卻至24-26℃。實施例4：在實施例3的基礎上，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將經誘導處理培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后5天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液為茉莉酸甲酯用體積分數為2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯濃度為50μmol/L得到。實施例5：在實施例3的基礎上，在實施例3的基礎上，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將經誘導處理培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后10天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液為茉莉酸甲酯用體積分數為2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯濃度為400μmol/L得到。實施例6：在實施例3的基礎上，在實施例3的基礎上，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將經誘導處理培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后8天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液為茉莉酸甲酯用體積分數為2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯濃度為150μmol/L得到。實施例7：在實施例6的基礎上，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，所述誘導處理培養之后，將羅漢果組培苗距離根部1cm以上部位劃傷3-5個1mm深的傷口，并將含有0.01mg/L蜂毒、5mg/L酸溶性β-葡聚糖和3mg/L木醋液，余量為水的誘導劑滴涂于傷口處，每株羅漢果組培苗滴涂0.05mL，然后將蘆薈膠涂覆于傷口處形成厚度為1-1.5mm厚度的膜，再將羅漢果組培苗置于波長為280-315nm的中波紫外線下輻射處理0.5h后用于移栽。實施例8：在實施例6的基礎上，所述的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，每次早、中噴灑所述誘導液后，對羅漢果植株進行全遮光處理30min。實施例9：在實施例6的基礎上，所述的提高羅漢果苷Ⅳ含量的方法中，如圖1所示，所述步驟二中將羅漢果組培苗移栽至田間的具體步驟為：在田間挖深度為8～14cm的種植坑，并在種植坑的底部鋪設聚乙烯醇薄膜，防止殺菌后的育苗基質與種植坑底部的土壤接觸，防止土傳病害的發生，聚乙烯醇薄膜可降解，不會污染環境，也不會阻礙幼苗的根部向下生長，之后在種植坑內插入育苗杯，再在育苗杯內倒入殺菌后的育苗基質150至與種植坑外的土層高度相同，為幼苗提供無菌的生長環境，育苗基質為栽培羅漢果時用到的任何一種基質，只是對其進行了殺菌，將羅漢果組培苗種植于育苗基質中，并使羅漢果組培苗的葉片位于育苗杯外后，在育苗基質上從下到上依次鋪設1～2cm厚的保水劑層130和1～3cm厚的填料層140，再在填料層的表面鋪設一層紗布120，使羅漢果組培苗穿過紗布120，之后在紗布120上鋪設粗石塊，即用粗石塊壓住紗布，移栽10～20d后，取出粗石塊和紗布，抽出育苗杯，將填料層填入抽出育苗杯后形成的環溝中，將填料層填入抽出育苗杯后形成的環溝中，若填料層將環溝填滿后還有多余，則將多余的填料層埋入育苗基質中或進行回收，若填料層未能將環溝填滿，則用育苗基質填充環溝至與種植坑外的土層高度相同。即若環溝較淺，則用填料層即可填滿，則無需再填充育苗基質，若填料層填滿環溝后還有剩余，則將剩余部分埋入育苗基質中或回收后再利用，若環溝較深，則先將填料層填充至環溝中，再用育苗基質填充環溝至與種植坑外的土層高度相同；填料層粒度較大，能使土壤疏松，透氣，透水，牡蠣殼粉具有多孔結構，能吸收育苗基質中的有效成分，如肥料，殺菌劑、殺蟲劑和水等，再緩慢釋放。其中，所述填料層由細河沙、蛭石、紅糖和牡蠣殼粉按體積比為10:5:5:1混合后制得；所述育苗杯100包括：杯體101，其為圓筒體形，所述杯體的側壁上沿其圓周方向間隔設置有多個出水孔102，所述出水孔位于紗布120的上方，粗石塊與所述出水孔不接觸；積液板103，其為直徑上大下小的圓臺形，所述積液板的內部中空，且頂部和底部均敞開，所述積液板的頂部的直徑與所述杯體的內徑相等，所述積液板的頂部與所述杯體的內側壁固定連接，所述積液板與所述杯體一體成型，且位于所述出水孔的上方。為了說明本發明的技術效果，本發明的申請人針對不同實施例得到的羅漢果果實，針對授粉噴施誘導液后的次日進行羅漢果苷ⅡE含量進行測定，具體方法以及結果如下。羅漢果苷ⅡE含量：采用高效液相色譜法，具體方法參考《廣西植物》2007年7月上發表的“HPLC法測定不同生長期羅漢果甙ⅡE，Ⅲ，V的含量”一文。對比例1：以實施例3的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度依次設定為：0、100、150、200、250、300、350、400μmol/L，對比在誘導培養時間為30天后按照實施例6的方法進行移栽處理，授粉8天后，每天早中晚于羅漢果表面噴灑清水至表面滴水，連續噴灑5天，次日進行羅漢果苷ⅡE含量進行測定，研究誘導處理培養基中茉莉酸甲酯的濃度對羅漢果苷ⅡE含量(質量百分數)的影響，結果見表1。表1誘導處理培養基中茉莉酸甲酯濃度對羅漢果苷ⅡE含量的影響茉莉酸甲酯的濃度μmol/L0100150200250300350400苷ⅡE含量/(mg/g)7.29.511.614.116.919.518.417.1注：上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的30棵羅漢果果樹上任選其中10棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。由表1可知，在誘導處理培養基中添加茉莉酸甲酯可以有效促進羅漢果苷ⅡE含量的增加，且以300-350μmol/L時為最適宜濃度。對比例2：以實施例6的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，將誘導液中茉莉酸甲酯的濃度依次設定為：0、50、100、150、200、250、300、400μmol/L，針對授粉噴施誘導液后的次日進行羅漢果苷ⅡE含量進行測定，對比研究誘導液中茉莉酸甲酯的濃度對羅漢果苷ⅡE含量的影響，結果見表2。表2誘導液中茉莉酸甲酯濃度對羅漢果苷ⅡE含量的影響茉莉酸甲酯的濃度μmol/L050100150200250300400苷ⅡE含量/(mg/g)19.521.223.424.223.122.020.920.7注：上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的30棵羅漢果果樹上任選其中10棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。由表2可知，在誘導液中添加茉莉酸甲酯，于羅漢果苗木待授粉后8天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑，可以進一步有效促進羅漢果苷ⅡE含量的增加，且以誘導液中茉莉酸甲酯濃度為100-150μmol/L時為最適宜濃度。對比例3：對比實施例3、實施例6、實施例7、實施例8的提高羅漢果苷ⅡE含量的方法，針對授粉噴施誘導液后的次日進行羅漢果苷ⅡE含量進行測定，結果見表3。需要說明的是：1)實施例3移栽后將誘導液替換為清水噴灑，其他栽培方法同實施例6；2)對照組設定為：在實施例3的基礎上，將誘導處理培養基中茉莉酸甲酯濃度設為0μmol/L，其他同實施例3。表3不同實施例對羅漢果苷ⅡE含量的影響實施例對照組實施例3實施例6實施例7實施例8苷ⅡE含量/(mg/g)7.219.524.228.925.5注：上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的30棵羅漢果果樹上任選其中10棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。實施例7是在實施例6的基礎上，于誘導處理培養之后對羅漢果組培苗進行根部處理，由表3可以看出，本發明的根部處理方法能顯著提高羅漢果果實中苷ⅡE含量。實施例8是在實施例6的基礎上，于每次早、中噴灑所述誘導液后，對羅漢果植株進行全遮光處理30min，由表3可以看出，適時適當的遮光處理對提高羅漢果果實中苷ⅡE含量有一定促進作用。為了說明本發明的移栽方法對羅漢果組培苗成活率的影響，本發明的發明人針對實施例6的方法進行常規移栽，以及采用實施例9進行移栽，分別移栽培養50株，于移栽一個月后檢查成活率，其中實施例6羅漢果組培苗的移栽成活率為80％，而實施例9羅漢果組培苗的移栽成活率為96％，說明使用實施例9的移栽方法能顯著提高羅漢果組培苗的成活率從而間接提高羅漢果苷ⅡE的提取量。盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例與附圖。當前第1頁1 2 3