識別NY?ESO?1抗原短肽的TCR的制作方法
本發明涉及能夠識別源自NY-ESO-1抗原短肽的TCR，本發明還涉及轉導上述TCR來獲得的NY-ESO-1特異性的T細胞，及他們在預防和治療NY-ESO-1相關疾病中的用途。
背景技術：
NY-ESO-1屬于腫瘤-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen,CTA)家族，能在睪丸、卵巢組織以及多種不同類型的腫瘤組織中表達，而在其他正常組織中不表達，是一種特異性較強的腫瘤抗原。NY-ESO-1是一種內源性抗原，在細胞內生成后被降解成小分子多肽，并與MHC(主組織相容性復合體)分子結合形成復合物，被呈遞到細胞表面。SLLMWITQC是衍生自NY-ESO-1抗原的短肽，是NY-ESO-1相關疾病治療的一種靶標。研究顯示，NY-ESO-1在多種腫瘤組織中均有表達，在神經母細胞瘤(Rodolfo M,et al.,Cancer Res,2003,63(20):6948-6955)、肉瘤(Jungbhth A A et al.,Int J Cancer,200l,94(2):252-256)、惡性黑色素瘤(Barrow C,et al.,Clin Cancer Res,2006,12(3Pt 1):764-771)中有非常高的表達，同時在前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、肝細胞癌、口腔鱗癌(Ries J,et al.,Anticancer RES,2009,29(12):5125-5130)、以及食管癌(Fujita S,Clin Cancer Res,2004,10(19):6551-6558)中也有較高的表達。對于上述疾病的治療，可以采用化療和放射性治療等方法，但都會對自身的正常細胞造成損害。
T細胞過繼免疫治療是將對靶細胞抗原具有特異性的反應性T細胞轉入病人體內，使其針對靶細胞發揮作用。T細胞受體(TCR)是T細胞表面的一種膜蛋白，其能夠識別相應的靶細胞表面的抗原短肽。在免疫系統中，通過抗原短肽特異性的TCR與短肽-主組織相容性復合體(pMHC復合物)的結合引發T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然后T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發生相互作用，引起一系列后續的細胞信號傳遞和其他生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發揮免疫效應。因此，本領域技術人員致力于分離出對NY-ESO-1抗原短肽具有特異性的TCR，以及將該TCR轉導T細胞來獲得對NY-ESO-1抗原短肽具有特異性的T細胞，從而使他們在細胞免疫治療中發揮作用。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種識別NY-ESO-1抗原短肽的T細胞受體。
本發明的第一方面，提供了一種T細胞受體(TCR)，所述TCR能夠與SLLMWITQC-HLA A0201復合物結合。
在另一優選例中，所述TCR包含TCR α鏈可變域和TCR β鏈可變域，所述TCR α鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為ATDANGKII(SEQ ID NO:12)；和/或所述TCR β鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為ASSLGSNEQY(SEQ ID NO:15)。
在另一優選例中，所述TCR α鏈可變域的3個互補決定區(CDR)為：
α CDR1- TSINN(SEQ ID NO:10)
α CDR2- IRSNERE(SEQ ID NO:11)
α CDR3- ATDANGKII(SEQ ID NO:12)；和/或
所述TCR β鏈可變域的3個互補決定區為：
β CDR1- SGHDY(SEQ ID NO:13)
β CDR2- FNNNVP(SEQ ID NO:14)
β CDR3- ASSLGSNEQY(SEQ ID NO:15)。
在另一優選例中，所述TCR包含TCR α鏈可變域和TCR β鏈可變域，所述TCR α鏈可變域為與SEQ ID NO:1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCR β鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
在另一優選例中，所述TCR包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。
在另一優選例中，所述TCR包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。
在另一優選例中，所述TCR為αβ異質二聚體，其包含TCR α鏈恒定區TRAC*01和TCR β鏈恒定區TRBC1*01或TRBC2*01。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO：3和/或所述TCR的β鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:7。
在另一優選例中，所述TCR是可溶的。
在另一優選例中，所述TCR為單鏈。
在另一優選例中，所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域通過肽連接序列連接而成。
在另一優選例中，所述TCR在α鏈可變區氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或α鏈J基因短肽氨基酸倒數第3位、倒數第5位或倒數第7位中具有一個或多個突變；和/或所述TCR在β鏈可變區氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或β鏈J基因短肽氨基酸倒數第2位、倒數第4位或倒數第6位中具有一個或多個突變，其中氨基酸位置編號按IMGT(國際免疫遺傳學信息系統)中列出的位置編號。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID NO:32和/或所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID NO:34。
在另一優選例中，所述TCR的氨基酸序列為SEQ ID NO:30。
在另一優選例中，所述TCR包括(a)除跨膜結構域以外的全部或部分TCR α鏈；以及(b)除跨膜結構域以外的全部或部分TCR β鏈；
并且(a)和(b)各自包含功能性可變結構域,或包含功能性可變結構域和所述TCR鏈恒定結構域的至少一部分。
在另一優選例中，半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域之間形成人工二硫鍵。
在另一優選例中，在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點：
TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57；
TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；
TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；
TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；
TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；
TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；
TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；和
TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:26和/或所述TCR的β鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:28。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈可變區與β鏈恒定區之間含有人工鏈間二硫鍵。
在另一優選例中，其特征在于，在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點：
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。
在另一優選例中，所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結合有偶聯物。
在另一優選例中，與所述T細胞受體結合的偶聯物為可檢測標記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質的組合。優選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。
本發明的第二方面，提供了一種多價TCR復合物，其包含至少兩個TCR分子，并且其中的至少一個TCR分子為本發明第一方面所述的TCR。
本發明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互補序列。
在另一優選例中，所述核酸分子包含編碼TCR α鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:33。
在另一優選例中，所述的核酸分子包含編碼TCR β鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO:35。
在另一優選例中，所述核酸分子包含編碼TCR α鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：4和/或包含編碼TCR β鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：8。
本發明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第三方面所述的核酸分子；優選地，所述的載體為病毒載體；更優選地，所述的載體為慢病毒載體。
本發明的第五方面，提供了一種分離的宿主細胞，所述的宿主細胞中含有本發明第四方面所述的載體或基因組中整合有外源的本發明第三方面所述的核酸分子。
本發明的第六方面，提供了一種細胞，所述細胞轉導本發明第三方面所述的核酸分子或本發明第四方面所述的載體；優選地，所述細胞為T細胞或干細胞。
本發明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學上可接受的載體以及本發明第一方面所述的TCR、本發明第二方面所述的TCR復合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞。
本發明的第八方面，提供了本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR復合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞的用途，用于制備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。
本發明的第九方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR復合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞、或本發明第七方面所述的藥物組合物；
優選地，所述的疾病為腫瘤，優選地所述腫瘤包括神經母細胞瘤、肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、肝細胞癌、口腔鱗癌、食管癌以及胃癌、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸癌、卵巢癌等。
應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCR α鏈可變域氨基酸序列、TCR α鏈可變域核苷酸序列、TCR α鏈氨基酸序列、TCR α鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCR α鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCR α鏈核苷酸序列。
圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCR β鏈可變域氨基酸序列、TCR β鏈可變域核苷酸序列、TCR β鏈氨基酸序列、TCR β鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCR β鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCR β鏈核苷酸序列。
圖3為單克隆細胞的CD8+及四聚體-PE雙陽性染色結果。
圖4a和圖4b分別為可溶性TCR α鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖5a和圖5b分別為可溶性TCR β鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖6為純化后得到的可溶性TCR的膠圖。最左側泳道為還原膠，中間泳道為分子量標記(marker)，最右側泳道為非還原膠。
圖7a和圖7b分別為單鏈TCR的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖8a和圖8b分別為單鏈TCR α鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖9a和圖9b分別為單鏈TCR β鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖10a和圖10b分別為單鏈TCR連接序列(linker)的氨基酸序列和核苷酸序列。
圖11為純化后得到的可溶性單鏈TCR的膠圖。
圖12為本發明可溶性TCR與SLLMWITQC-HLA A0201復合物結合的BIAcore動力學圖譜。
圖13為本發明可溶性單鏈TCR與SLLMWITQC--HLA A0201復合物結合的BIAcore動力學圖譜。
圖14顯示了轉導本發明TCR的細胞對表達相關抗原的靶細胞具有殺傷作用，而對不表達相關抗原的靶細胞基本沒有殺傷作用。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，找到了與NY-ESO-1抗原短肽SLLMWITQC(SEQ ID NO:9)能夠特異性結合的TCR，所述抗原短肽SLLMWITQC可與HLA A0201形成復合物并一起被呈遞到細胞表面。本發明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外，本發明還提供了轉導本發明TCR的細胞。
術語
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白質，可以是Ⅰ類或Ⅱ類MHC分子。因此，其對于抗原的呈遞具有特異性，不同的個體有不同的MHC，能呈遞一種蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC細胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復合體。
T細胞受體(TCR)，是呈遞在主組織相容性復合體(MHC)上的特異性抗原肽的唯一受體。在免疫系統中，通過抗原特異性的TCR與pMHC復合物的結合引發T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然后T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發生相互作用，這就引起了一系列后續的細胞信號傳遞和其他生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發揮免疫效應。
TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。在95％的T細胞中TCR異質二聚體由α和β鏈組成，而5％的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構成αβ異源二聚TCR的亞單位。廣義上講，α和β各鏈包含可變區、連接區和恒定區，β鏈通常還在可變區和連接區之間含有短的多變區，但該多變區常視作連接區的一部分。各可變區包含嵌合在框架結構(framework regions)中的3個CDR(互補決定區)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR區決定了TCR與pMHC復合物的結合，其中CDR3由可變區和連接區重組而成，被稱為超變區。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結構域”即可變域和恒定域，可變域由連接的可變區和連接區構成。TCR恒定域的序列可以在國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)的公開數據庫中找到，如TCR分子α鏈的恒定域序列為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β鏈還包含跨膜區和胞質區，胞質區很短。
在本發明中，術語“本發明多肽”、“本發明的TCR”、“本發明的T細胞受體”可互換使用。
天然鏈間二硫鍵與人工鏈間二硫鍵
在天然TCR的近膜區Cα與Cβ鏈間存在一組二硫鍵，本發明中稱為“天然鏈間二硫鍵”。在本發明中，將人工引入的，位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價二硫鍵稱為“人工鏈間二硫鍵”。
為方便描述二硫鍵的位置，本發明中TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置編號按從N端到C端依次的順序進行位置編號，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第60個氨基酸為P(脯氨酸)，則本發明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Pro60，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第61個氨基酸為Q(谷氨酰胺)，則本發明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Gln61，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸，其他以此類推。本發明中，可變區TRAV與TRBV的氨基酸序列的位置編號，按照IMGT中列出的位置編號。如TRAV中的某個氨基酸，IMGT中列出的位置編號為46，則本發明中將其描述為TRAV第46位氨基酸，其他以此類推。本發明中，其他氨基酸的序列位置編號有特殊說明的，則按特殊說明。
發明詳述
TCR分子
在抗原加工過程中，抗原在細胞內被降解，然后通過MHC分子攜帶至細胞表面。T細胞受體能夠識別抗原呈遞細胞表面的肽-MHC復合物。因此，本發明的第一方面提供了一種能夠結合SLLMWITQC-HLA A0201復合物的TCR分子。優選地，所述TCR分子是分離的或純化的。該TCR的α和β鏈各具有3個互補決定區(CDR)。
在本發明的一個優選地實施方式中，所述TCR的α鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：
α CDR1- TSINN(SEQ ID NO:10)
α CDR2- IRSNERE(SEQ ID NO:11)
α CDR3- ATDANGKII(SEQ ID NO:12)；和/或
所述TCR β鏈可變域的3個互補決定區為：
β CDR1- SGHDY(SEQ ID NO:13)
β CDR2- FNNNVP(SEQ ID NO:14)
β CDR3- ASSLGSNEQY(SEQ ID NO:15)。
可以將上述本發明的CDR區氨基酸序列嵌入到任何適合的框架結構中來制備嵌合TCR。只要框架結構與本發明的TCR的CDR區兼容，本領域技術人員根據本發明公開的CDR區就能夠設計或合成出具有相應功能的TCR分子。因此，本發明TCR分子是指包含上述α和/或β鏈CDR區序列及任何適合的框架結構的TCR分子。本發明TCR α鏈可變域為與SEQ ID NO:1具有至少90％，優選地95％，更優選地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本發明TCR β鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90％，優選地95％，更優選地98％序列相同性的氨基酸序列。
在本發明的一個優選例中，本發明的TCR分子是由α與β鏈構成的異質二聚體。具體地，一方面所述異質二聚TCR分子的α鏈包含可變域和恒定域，所述α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。優選地，所述TCR分子包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更優選地，所述TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:1。另一方面，所述異質二聚TCR分子的β鏈包含可變域和恒定域，所述β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。優選地，所述TCR分子包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更優選地，所述TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:5。
在本發明的一個優選例中，本發明的TCR分子是由α鏈的部分或全部和/或β鏈的部分或全部組成的單鏈TCR分子。有關單鏈TCR分子的描述可以參考文獻Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根據文獻中所述，本領域技術人員能夠容易地構建包含本發明CDRs區的單鏈TCR分子。具體地，所述單鏈TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，優選地按照從N端到C端的順序連接。
所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。優選地，所述單鏈TCR分子包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更優選地，所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:1。所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO：15)。優選地，所述單鏈TCR分子包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更優選地，所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:5。
在本發明的一個優選例中，本發明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本領域技術人員知曉或可以通過查閱相關書籍或IMGT(國際免疫遺傳學信息系統)的公開數據庫來獲得人的恒定域氨基酸序列。例如，本發明TCR分子α鏈的恒定域序列可以為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列可以為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中給出的氨基酸序列的第53位為Arg，在此表示為：TRAC*01外顯子1的Arg53，其他以此類推。優選地，本發明TCR分子α鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，和/或β鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO:7。
天然存在的TCR是一種膜蛋白，通過其跨膜區得以穩定。如同免疫球蛋白(抗體)作為抗原識別分子一樣，TCR也可以被開發應用于診斷和治療，這時需要獲得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜區。可溶性TCR有很廣泛的用途，它不僅可用于研究TCR與pMHC的相互作用，也可用作檢測感染的診斷工具或作為自身免疫病的標志物。類似地，可溶性TCR可以被用來將治療劑(如細胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)輸送到呈遞特異性抗原的細胞，另外，可溶性TCR還可與其他分子(如，抗-CD3抗體)結合來重新定向T細胞，從而使其靶向呈遞特定抗原的細胞。本發明也獲得了對NY-ESO-1抗原短肽具有特異性的可溶性TCR。
為獲得可溶性TCR，一方面，本發明TCR可以是在其α和β鏈恒定域的殘基之間引入人工二硫鍵的TCR。半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域間形成人工鏈間二硫鍵。半胱氨酸殘基可以取代在天然TCR中合適位點的其他氨基酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵。例如，取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基來形成二硫鍵。引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵的其他位點還可以是：TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；或TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱氨酸殘基取代了上述α與β鏈恒定域中任一組位點。可在本發明TCR恒定域的一個或多個C末端截短最多50個、或最多30個、或最多15個、或最多10個、或最多8個或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸殘基來達到缺失天然二硫鍵的目的，也可通過將形成天然二硫鍵的半胱氨酸殘基突變為另一氨基酸來達到上述目的。
如上所述，本發明的TCR可以包含在其α和β鏈恒定域的殘基間引入的人工二硫鍵。應注意，恒定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通過存在于TCR中的天然二硫鍵連接。
為獲得可溶性TCR，另一方面，本發明TCR還包括在其疏水芯區域發生突變的TCR，這些疏水芯區域的突變優選為能夠使本發明可溶性TCR的穩定性提高的突變，如在公開號為WO2014/206304的專利文獻中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水芯位置發生突變：(α和/或β鏈)可變區氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α鏈J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒數第3,5,7位,和/或β鏈J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒數第2,4,6位，其中氨基酸序列的位置編號按國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)中列出的位置編號。本領域技術人員知曉上述國際免疫遺傳學信息系統，并可根據該數據庫得到不同TCR的氨基酸殘基在IMGT中的位置編號。
本發明中疏水芯區域發生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的α與β鏈的可變域而構成的穩定性可溶單鏈TCR。應注意，本發明中柔性肽鏈可以是任何適合連接TCR α與β鏈可變域的肽鏈。如在本發明實施例4中構建的單鏈可溶性TCR，其α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:32，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO:33；β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:34，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO:35。
另外，對于穩定性而言，專利文獻201510260322.4還公開了在TCR的α鏈可變區與β鏈恒定區之間引入人工鏈間二硫鍵能夠使TCR的穩定性顯著提高。因此，本發明的高親和力TCR的α鏈可變區與β鏈恒定區之間還可以含有人工鏈間二硫鍵。具體地，在所述TCR的α鏈可變區與β鏈恒定區之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。優選地，這樣的TCR可以包含(ⅰ)除其跨膜結構域以外的全部或部分TCR α鏈，和(ⅱ)除其跨膜結構域以外的全部或部分TCR β鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，α鏈與β鏈形成異質二聚體。更優選地，這樣的TCR可以包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
本發明的TCR也可以多價復合體的形式提供。本發明的多價TCR復合體包含兩個、三個、四個或更多個本發明TCR相結合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚結構域來產生四聚體，或多個本發明TCR與另一分子結合而形成的復合物。本發明的TCR復合物可用于體外或體內追蹤或靶向呈遞特定抗原的細胞，也可用于產生具有此類應用的其他多價TCR復合物的中間體。
本發明的TCR可以單獨使用，也可與偶聯物以共價或其他方式結合，優選以共價方式結合。所述偶聯物包括可檢測標記物(為診斷目的，其中所述TCR用于檢測呈遞SLLMWITQC-HLA A0201復合物的細胞的存在)、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。
用于診斷目的的可檢測標記物包括但不限于：熒光或發光標記物、放射性標記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶。
可與本發明TCR結合或偶聯的治療劑包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌轉移評論(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌癥免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；3.細胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美國國家科學院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌癥免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌癥研究(Cancer Research)63，3202)；4.抗體Fc片段(Mosquera等，2005，免疫學雜志(The Journal Of Immunology)174，4381)；5.抗體scFv片段(Zhu等，1995，癌癥國際期刊(International Journal of Cancer)62,319)；6.金納米顆粒/納米棒(Lapotko等，2005，癌癥通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美國化學學會雜志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒顆粒(Peng等，2004，基因治療(Gene therapy)11，1234)；8.脂質體(Mamot等，2005，癌癥研究(Cancer research)65，11631)；9.納米磁粒；10.前藥激活酶(例如，DT-心肌黃酶(DTD)或聯苯基水解酶-樣蛋白質(BPHL))；11.化療劑(例如，順鉑)或任何形式的納米顆粒等。
另外，本發明的TCR還可以是包含衍生自超過一種物種序列的雜合TCR。例如，有研究顯示鼠科TCR在人T細胞中比人TCR能夠更有效地表達。因此，本發明TCR可包含人可變域和鼠的恒定域。這一方法的缺陷是可能引發免疫應答。因此，在其用于過繼性T細胞治療時應當有調節方案來進行免疫抑制，以允許表達鼠科的T細胞的植入。
應理解，本文中氨基酸名稱采用國際通用的單英文字母或三英文字母表示，氨基酸名稱的單英文字母與三英文字母的對應關系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
核酸分子
本發明的第二方面提供了編碼本發明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一個或多個CDR，α和/或β鏈的可變域，以及α鏈和/或β鏈。
編碼本發明第一方面TCR分子α鏈CDR區的核苷酸序列如下：
α CDR1- actagtataaacaat(SEQ ID NO:16)
α CDR2- atacgttcaaatgaaagagag(SEQ ID NO:17)
α CDR3- gctacggacgcaaacggcaagatcatc (SEQ ID NO:18)
編碼本發明第一方面TCR分子β鏈CDR區的核苷酸序列如下：
β CDR1- tcaggacacgactac(SEQ ID NO:19)
β CDR2- tttaacaacaacgttccg(SEQ ID NO:20)
β CDR3- gccagcagtttagggagcaacgagcagtac (SEQ ID NO:21)
因此，編碼本發明TCR α鏈的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，和/或編碼本發明TCR β鏈的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
本發明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的，該核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含內含子。優選地，本發明核酸分子的核苷酸序列不包含內含子但能夠編碼本發明多肽，例如編碼本發明TCR α鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2和/或編碼本發明TCR β鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6。或者，編碼本發明TCR α鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:33和/或編碼本發明TCR β鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:35。更優選地，本發明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:8。或者，本發明核酸分子的核苷酸序列為SEQ ID NO:31。
應理解，由于遺傳密碼的簡并，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此，編碼本發明TCR的核酸序列可以與本發明附圖中所示的核酸序列相同或是簡并的變異體。以本發明中的其中一個例子來說明，“簡并的變異體”是指編碼具有SEQ ID NO:1的蛋白序列，但與SEQ ID NO:2的序列有差別的核酸序列。
核苷酸序列可以是經密碼子優化的。不同的細胞在具體密碼子的利用上是不同的，可以根據細胞的類型，改變序列中的密碼子來增加表達量。哺乳動物細胞以及多種其他生物的密碼子選擇表是本領域技術人員公知的。
本發明的核酸分子全長序列或其片段通常可以用但不限于PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
載體
本發明還涉及包含本發明的核酸分子的載體，包括表達載體，即能夠在體內或體外表達的構建體。常用的載體包括細菌質粒、噬菌體和動植物病毒。
病毒遞送系統包括但不限于腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。
優選地，載體可以將本發明的核苷酸轉移至細胞中，例如T細胞中，使得該細胞表達NY-ESO-1抗原特異性的TCR。理想的情況下，該載體應當能夠在T細胞中持續高水平地表達。
細胞
本發明還涉及用本發明的載體或編碼序列經基因工程產生的宿主細胞。所述宿主細胞中含有本發明的載體或染色體中整合有本發明的核酸分子。宿主細胞選自：原核細胞和真核細胞，例如大腸桿菌、酵母細胞、CHO細胞等。
另外，本發明還包括表達本發明的TCR的分離的細胞，特別是T細胞。該T細胞可衍生自從受試者分離的T細胞，或者可以是從受試者中分離的混合細胞群，諸如外周血淋巴細胞(PBL)群的一部分。如，該細胞可以分離自外周血單核細胞(PBMC)，可以是CD4+輔助T細胞或CD8+細胞毒性T細胞。該細胞可在CD4+輔助T細胞/CD8+細胞毒性T細胞的混合群中。一般地，該細胞可以用抗體(如，抗-CD3或抗-CD28的抗體)活化，以便使它們能夠更容易接受轉染，例如用包含編碼本發明TCR分子的核苷酸序列的載體進行轉染。
備選地，本發明的細胞還可以是或衍生自干細胞，如造血干細胞(HSC)。將基因轉移至HSC不會導致在細胞表面表達TCR，因為干細胞表面不表達CD3分子。然而，當干細胞分化為遷移至胸腺的淋巴前體(lymphoid precursor)時，CD3分子的表達將啟動在胸腺細胞的表面表達該引入的TCR分子。
有許多方法適合于用編碼本發明TCR的DNA或RNA進行T細胞轉染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表達本發明TCR的T細胞可以用于過繼免疫治療。本領域技術人員能夠知曉進行過繼性治療的許多合適方法(如，Rosenberg等.，(2008)Nat Rev Cancer8(4)：299-308)。
NY-ESO-1抗原相關疾病
本發明還涉及在受試者中治療和/或預防與NY-ESO-1相關疾病的方法，其包括過繼性轉移NY-ESO-1特異性T細胞至該受試者的步驟。該NY-ESO-1特異性T細胞可識別SLLMWITQC-HLA A0201復合物。
本發明的NY-ESO-1特異性的T細胞可用于治療任何呈遞NY-ESO-1抗原短肽SLLMWITQC-HLA A0201復合物的NY-ESO-1相關疾病,包括但不限于腫瘤，優選地所述腫瘤包括神經母細胞瘤、肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、肝細胞癌、口腔鱗癌、食管癌以及胃癌、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸癌、卵巢癌等。
治療方法
可以通過分離患有與NY-ESO-1抗原相關疾病的病人或志愿者的T細胞，并將本發明的TCR導入上述T細胞中，隨后將這些基因工程修飾的細胞回輸到病人體內來進行治療。因此，本發明提供了一種治療NY-ESO-1相關疾病的方法，包括將分離的表達本發明TCR的T細胞，優選地，該T細胞來源于病人本身，輸入到病人體內。一般地，包括(1)分離病人的T細胞，(2)用本發明核酸分子或能夠編碼本發明TCR分子的核酸分子體外轉導T細胞，(3)將基因工程修飾的T細胞輸入到病人體內。分離、轉染及回輸的細胞的數量可以由醫師決定。
本發明的主要優點在于：
(1)本發明的TCR能夠與NY-ESO-1抗原短肽復合物SLLMWITQC-HLA A0201結合，同時轉導了本發明TCR的細胞能夠被特異性激活并且對靶細胞具有很強的殺傷作用。
下面的具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。
實施例1克隆NY-ESO-1抗原短肽特異性T細胞
利用合成短肽SLLMWITQC(SEQ ID NO.:9；北京賽百盛基因技術有限公司)刺激來自于基因型為HLA-A0201的健康志愿者的外周血淋巴細胞(PBL)。將SLLMWITQC短肽與帶有生物素標記的HLA-A0201復性,制備pHLA單倍體。這些單倍體與用PE標記的鏈霉親和素(BD公司)組合成PE標記的四聚體，分選該四聚體及抗-CD8-APC雙陽性細胞。擴增分選的細胞，并按上述方法進行二次分選，隨后用有限稀釋法進行單克隆。單克隆細胞用四聚體染色，篩選到的雙陽性克隆如圖3所示。
實施例2獲取NY-ESO-1抗原短肽特異性T細胞克隆的TCR基因與載體的構建
用Quick-RNATMMiniPrep(ZYMO research)抽提實施例1中篩選到的抗原短肽SLLMWITQC特異性、HLA-A0201限制性的T細胞克隆的總RNA。cDNA的合成采用clontech的SMART RACE cDNA擴增試劑盒，采用的引物是設計在人類TCR基因的C端保守區。將序列克隆至T載體(TAKARA)上進行測序。應注意，該序列為互補序列，不包含內含子。經測序，該雙陽性克隆表達的TCR的α鏈和β鏈序列結構分別如圖1和圖2所示，圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCR α鏈可變域氨基酸序列、TCR α鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈氨基酸序列、TCR α鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCR α鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCR α鏈核苷酸序列；圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCR β鏈可變域氨基酸序列、TCR β鏈可變域核苷酸序列、TCR β鏈氨基酸序列、TCR β鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCR β鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCR β鏈核苷酸序列。
經鑒定，α鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：
α CDR1- TSINN(SEQ ID NO:10)
α CDR2- IRSNERE(SEQ ID NO:11)
α CDR3- ATDANGKII(SEQ ID NO:12)
β鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：
β CDR1-SGHDY(SEQ ID NO:13)
β CDR2-FNNNVP(SEQ ID NO:14)
β CDR3-ASSLGSNEQY(SEQ ID NO:15)
通過重疊(overlap)PCR分別將TCR α鏈和β鏈的全長基因克隆至慢病毒表達載體pLenti(addgene)。具體為：用overlap PCR將TCR α鏈和TCR β鏈的全長基因進行連接得到TCR α-2A-TCR β片段。將慢病毒表達載體及TCR α-2A-TCR β酶切連接得到pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR質粒。作為對照用,同時也構建表達eGFP的慢病毒載體pLenti-eGFP。之后再用293T/17包裝假病毒。
實施例3 NY-ESO-1抗原短肽特異性可溶TCR的表達、重折疊和純化
為獲得可溶的TCR分子，本發明的TCR分子的α和β鏈可以分別只包含其可變域及部分恒定域，并且α和β鏈的恒定域中分別引入了一個半胱氨酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵，引入半胱氨酸殘基的位置分別為TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC2*01外顯子1的Ser57；其α鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖4a和圖4b所示，其β鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖5a和圖5b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗和加下劃線字母表示。通過《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標準方法將上述TCR α和β鏈的目的基因序列經合成后分別插入到表達載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點分別是NcoI和NotI。插入片段經過測序確認無誤。
將TCR α和β鏈的表達載體分別通過化學轉化法轉化進入表達細菌BL21(DE3),細菌用LB培養液生長，于OD600＝0.6時用終濃度0.5mM IPTG誘導，TCR的α和β鏈表達后形成的包涵體通過BugBuster Mix(Novagene)進行提取，并且經BugBuster溶液反復多次洗滌，包涵體最后溶解于6M鹽酸胍,10mM二硫蘇糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸(EDTA),20mM Tris(pH 8.1)中。
溶解后的TCR α和β鏈以1：1的質量比快速混合于5M尿素,0.4M精氨酸,20mM Tris(pH 8.1),3.7mM cystamine,6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中，終濃度為60mg/mL。混合后將溶液置于10倍體積的去離子水中透析(4℃)，12小時后將去離子水換成緩沖液(20mM Tris,pH 8.0)繼續于4℃透析12小時。透析完成后的溶液經0.45μM的濾膜過濾后，通過陰離子交換柱(HiTrap Q HP,5ml,GE Healthcare)純化。洗脫峰含有復性成功的α和β二聚體的TCR通過SDS-PAGE膠確認。TCR隨后通過凝膠過濾層析(HiPrep 16/60，Sephacryl S-100 HR，GE Healthcare)進一步純化。純化后的TCR純度經過SDS-PAGE測定大于90％，濃度由BCA法確定。本發明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE膠圖如圖6所示。
實施例4 NY-ESO-1抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的產生
根據專利文獻WO2014/206304中所述，利用定點突變的方法將實施例2中TCR α與β鏈的可變域構建成了一個以柔性短肽(linker)連接的穩定的可溶性單鏈TCR分子。該單鏈TCR分子的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖7a和圖7b所示。其α鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖8a和圖8b所示；其β鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖9a和圖9b所示；其linker序列的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖10a和圖10b所示。
將目的基因經Nco Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切，與經過Nco Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切的pET28a載體連接。連接產物轉化至E.coliDH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養過夜，挑取陽性克隆進行PCR篩選，對陽性重組子進行測序，確定序列正確后抽提重組質粒轉化至E.coli BL21(DE3),用于表達。
實施例5 NY-ESO-1抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的表達、復性和純化
將實施例4中制備的含有重組質粒pET28a-模板鏈的BL21(DE 3)菌落全部接種于含有卡那霉素的LB培養基中,37℃培養至OD600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃繼續培養4h。5000rpm離心15min收獲細胞沉淀物，用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解細胞沉淀物，6000rpm離心15min回收包涵體，再用Bugbuster(Merck)進行洗滌以除去細胞碎片和膜組分，6000rpm離心15min,收集包涵體。將包涵體溶解在緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素)中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量后進行分裝，于-80℃保存備用。
向5mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2.5mL緩沖液(6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA)，再加入DTT至終濃度為10mM,37℃處理30min。用注射器向125mL復性緩沖液(100mM Tris-HCl pH 8.1,0.4M L-精氨酸,5M尿素,2mM EDTA,6.5mMβ-mercapthoethylamine,1.87mM Cystamine)中滴加上述處理后的單鏈TCR，4℃攪拌10min，然后將復性液裝入截留量為4kDa的纖維素膜透析袋,透析袋置于1L預冷的水中，4℃緩慢攪拌過夜。17小時后，將透析液換成1L預冷的緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0)，4℃繼續透析8h，然后將透析液換成相同的新鮮緩沖液繼續透析過夜。17小時后，樣品經0.45μm濾膜過濾，真空脫氣后通過陰離子交換柱(HiTrap Q HP,GE Healthcare)，用20mM Tris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl線性梯度洗脫液純化蛋白，收集的洗脫組分進行SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮后進一步用凝膠過濾柱(Superdex 7510/300,GE Healthcare)進行純化，目標組分也進行SDS-PAGE分析。
用于BIAcore分析的洗脫組分進一步采用凝膠過濾法測試其純度。條件為：色譜柱Agilent Bio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流動相為150mM磷酸鹽緩沖液，流速0.5mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長214nm。
本發明獲得的可溶性單鏈TCR的SDS-PAGE膠圖如圖11所示。
實施例6 結合表征
BIAcore分析
本實施例證明了可溶性的本發明TCR分子能夠與SLLMWITQC-HLA A0201復合物特異性結合。
使用BIAcore T200實時分析系統檢測實施例3和實施例5中得到的TCR分子與SLLMWITQC-HLA A0201復合物的結合活性。將抗鏈霉親和素的抗體(GenScript)加入偶聯緩沖液(10mM醋酸鈉緩沖液，pH 4.77)，然后將抗體流過預先用EDC和NHS活化過的CM5芯片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應的活化表面，完成偶聯過程，偶聯水平約為15，000RU。
使低濃度的鏈霉親和素流過已包被抗體的芯片表面，然后將SLLMWITQC-HLA A0201復合物流過檢測通道，另一通道作為參比通道，再將0.05mM的生物素以10μL/min的流速流過芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結合位點。
上述SLLMWITQC-HLA A0201復合物的制備過程如下：
a.純化
收集100ml誘導表達重鏈或輕鏈的E.coli菌液，于4℃8000g離心10min后用10ml PBS洗滌菌體一次，之后用5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉孵育20min，之后于4℃，6000g離心15min，棄去上清，收集包涵體。
將上述包涵體重懸于5ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉孵育5min；加30ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的BugBuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復兩次，加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA試劑盒測濃度。
b.復性
將合成的短肽SLLMWITQC(北京賽百盛基因技術有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mM DTT來溶解，復性前加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA進一步變性。將SLLMWITQC肽以25mg/L(終濃度)加入復性緩沖液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM還原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復性在4℃進行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測能否復性成功。
c.復性后純化
用10體積的20mM Tris pH 8.0作透析來更換復性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質溶液，然后加載到HiTrap Q HP(GE通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。
d.生物素化
用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時將緩沖液置換為20mM Tris pH 8.0，然后加入生物素化試劑0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室溫孵育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化是否完全。
e.純化生物素化后的復合物
用Millipore超濾管將生物素化標記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過濾過的PBS預平衡HiPrepTM16/60 S200 HR柱(GE通用電氣公司)，加載1ml濃縮過的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時作為單峰洗脫出現。合并含有蛋白質的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法(Thermo)測定蛋白質濃度，加入蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。
利用BIAcore Evaluation軟件計算動力學參數，得到本發明可溶性的TCR分子以及本發明構建的可溶性單鏈TCR分子與SLLMWITQC-HLA A0201復合物結合的動力學圖譜分別如圖12和圖13所示。圖譜顯示，本發明得到的可溶性TCR分子以及可溶性單鏈TCR分子都能夠與SLLMWITQC-HLA A0201復合物結合。同時，還利用上述方法檢測了本發明可溶性的TCR分子與其他幾種無關抗原短肽與HLA復合物的結合活性，結果顯示本發明TCR分子與其他無關抗原均無結合。
實施例7 轉導本發明TCR的細胞的殺傷實驗
本實施例通過非放射性細胞毒性實驗，測定LDH的釋放，從而驗證轉導本發明TCR的細胞的殺傷功能。
本領域技術人員熟知利用LDH的釋放實驗檢測細胞功能的方法。本實施例LDH實驗用從健康志愿者的血液中分離到的PBL細胞經慢病毒轉染TCR作為效應細胞。靶細胞系為A375(3525)、MEL624(1605)、NCI-H1650(2)和MEL526(4)細胞。根據nanostring結果，其中，A375(3525)和MEL624(1605)表達NY-ESO-1抗原。NCI-H1650(2)和MEL526(4)基本不表達NY-ESO-1抗原，以此作為對照。
首先準備LDH平板。實驗第1天，按以下順序將試驗的各個組分加入平板：培養基調整效應細胞至2 X 106個細胞/毫升，培養基調整各靶細胞系至5 X 105個細胞/毫升。混合均勻后取100μL靶細胞系5 X 105個細胞/毫升(即50，000個細胞/孔)、100μL效應細胞2 X 106個細胞/毫升(即200,000個細胞/孔)加入對應孔中，并設置三個復孔。同時設置效應細胞自發孔，靶細胞自發孔，靶細胞最大孔，體積校正對照孔及培養基背景對照孔。溫育過夜(37℃，5％CO2)。實驗第2天，檢測顯色，終止反應后用酶標儀(Bioteck)在490nm記錄吸光值。實驗結果如圖14所示，轉導本發明TCR的細胞對表達相關抗原的靶細胞具有殺傷作用，而對不表達相關抗原的靶細胞基本沒有殺傷作用。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
-1435序列表
<110> 廣州市香雪制藥股份有限公司
<120> 識別NY-ESO-1抗原短肽的TCR
<130> P2016-1815
<150> CN201510751225.5
<151> 2015-11-04
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRα鏈可變域
<400> 1
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys
85 90 95
Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro Asn
100 105 110
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRα鏈可變域
<400> 2
agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 60
atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 120
agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 180
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gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggacgcaa acggcaagat catctttgga 300
aaagggacac gacttcatat tctccccaat 330
<210> 3
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRα鏈
<400> 3
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys
85 90 95
Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro Asn Ile Gln
100 105 110
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp
145 150 155 160
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
165 170 175
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
180 185 190
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
195 200 205
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
210 215 220
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
225 230 235 240
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 4
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRα鏈
<400> 4
agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 60
atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 120
agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 180
ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 240
gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggacgcaa acggcaagat catctttgga 300
aaagggacac gacttcatat tctccccaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 360
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ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc 750
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRβ鏈可變域
<400> 5
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
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Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu
85 90 95
Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
100 105 110
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRβ鏈可變域
<400> 6
gatgctggag ttatccagtc accccggcac gaggtgacag agatgggaca agaagtgact 60
ctgagatgta aaccaatttc aggacacgac taccttttct ggtacagaca gaccatgatg 120
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cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcaca 336
<210> 7
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRβ鏈
<400> 7
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
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Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu
85 90 95
Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
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Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
195 200 205
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
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Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
260 265 270
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
275 280 285
Ser Arg Gly
290
<210> 8
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> TCRβ鏈
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gatgctggag ttatccagtc accccggcac gaggtgacag agatgggaca agaagtgact 60
ctgagatgta aaccaatttc aggacacgac taccttttct ggtacagaca gaccatgatg 120
cggggactgg agttgctcat ttactttaac aacaacgttc cgatagatga ttcagggatg 180
cccgaggatc gattctcagc taagatgcct aatgcatcat tctccactct gaagatccag 240
ccctcagaac ccagggactc agctgtgtac ttctgtgcca gcagtttagg gagcaacgag 300
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aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 660
tggacccagg atagggccaa acctgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 720
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tatgagatct tgctagggaa ggccaccttg tatgccgtgc tggtcagtgc cctcgtgctg 840
atggccatgg tcaagagaaa ggattccaga ggc 873
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 抗原短肽
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Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
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<210> 10
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<213> 人工序列(artificial)
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<223> α CDR1
<400> 10
Thr Ser Ile Asn Asn
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> α CDR2
<400> 11
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> α CDR3
<400> 12
Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys Ile Ile
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> β CDR1
<400> 13
Ser Gly His Asp Tyr
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> β CDR2
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Phe Asn Asn Asn Val Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> β CDR3
<400> 15
Ala Ser Ser Leu Gly Ser Asn Glu Gln Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> α CDR1
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actagtataa acaat 15
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> α CDR2
<400> 17
atacgttcaa atgaaagaga g 21
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> α CDR3
<400> 18
gctacggacg caaacggcaa gatcatc 27
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> β CDR1
<400> 19
tcaggacacg actac 15
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> β CDR2
<400> 20
tttaacaaca acgttccg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> β CDR3
<400> 21
gccagcagtt tagggagcaa cgagcagtac 30
<210> 22
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 具有前導序列的TCRα鏈
<400> 22
Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser
20 25 30
Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser
35 40 45
Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val
50 55 60
His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile
85 90 95
Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp
100 105 110
Ala Asn Gly Lys Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu
115 120 125
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
130 135 140
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
145 150 155 160
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
165 170 175
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
195 200 205
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
210 215 220
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 23
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 具有前導序列的TCRα鏈
<400> 23
atggaaactc tcctgggagt gtctttggtg attctatggc ttcaactggc tagggtgaac 60
agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 120
atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 180
agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 240
ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 300
gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggacgcaa acggcaagat catctttgga 360
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ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 480
acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 540
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tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat 780
ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc 810
<210> 24
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 具有前導序列的TCRβ鏈
<400> 24
Met Asp Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
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Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Leu Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 25
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 具有前導序列的TCRβ鏈
<400> 25
atggactcct ggaccctctg ctgtgtgtcc ctttgcatcc tggtagcaaa gcacacagat 60
gctggagtta tccagtcacc ccggcacgag gtgacagaga tgggacaaga agtgactctg 120
agatgtaaac caatttcagg acacgactac cttttctggt acagacagac catgatgcgg 180
ggactggagt tgctcattta ctttaacaac aacgttccga tagatgattc agggatgccc 240
gaggatcgat tctcagctaa gatgcctaat gcatcattct ccactctgaa gatccagccc 300
tcagaaccca gggactcagc tgtgtacttc tgtgccagca gtttagggag caacgagcag 360
tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc acagaggacc tgaaaaacgt gttcccaccc 420
gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatctccc acacccaaaa ggccacactg 480
gtgtgcctgg ccacaggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg 540
aaggaggtgc acagtggggt cagcacagac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 600
aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 660
ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 720
acccaggata gggccaaacc tgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 780
gactgtggct tcacctccga gtcttaccag caaggggtcc tgtctgccac catcctctat 840
gagatcttgc tagggaaggc caccttgtat gccgtgctgg tcagtgccct cgtgctgatg 900
gccatggtca agagaaagga ttccagaggc 930
<210> 26
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 可溶性TCRα鏈
<400> 26
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys
85 90 95
Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro Asn Ile Gln
100 105 110
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
145 150 155 160
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
165 170 175
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
180 185 190
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 27
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 可溶性TCRα鏈
<400> 27
agccagcagg gcgaagaaga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 60
atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 120
agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 180
ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 240
gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggacgcaa acggcaagat catctttgga 300
aaagggacac gacttcatat tctccccaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 360
ctgagagact ctaagtcgag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 420
acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaatg tgtgctagac 480
atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 540
gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 600
gaaagttcc 609
<210> 28
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 可溶性TCRβ鏈
<400> 28
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu
85 90 95
Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
100 105 110
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu
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Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
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Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
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Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp
<210> 29
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 可溶性TCRβ鏈
<400> 29
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ctgagatgta aaccaatttc aggacacgac taccttttct ggtacagaca gaccatgatg 120
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ccctcagaac ccagggactc agctgtgtac ttctgtgcca gcagtttagg gagcaacgag 300
cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcacagagg acctgaaaaa cgtgttccca 360
cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 420
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gcagac 726
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<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 單鏈TCR
<400> 30
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
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50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Glu Ile Thr Ala Val Arg
65 70 75 80
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85 90 95
Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Arg His Glu
130 135 140
Ser Val Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser
145 150 155 160
Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Lys Arg Gly Leu
165 170 175
Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly
180 185 190
Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser
195 200 205
Thr Leu Lys Ile Gln Pro Val Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe
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Cys Ala Ser Ser Leu Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
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Arg Leu Thr Val Thr
245
<210> 31
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
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<223> 單鏈TCR
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ctgcgcgtta ccctggatac cagcaaaaaa tcttctagtc tggaaatcac cgcagtccgt 240
ccggcagata cggcaagcta tttttgtgca accgacgcta atggtaaaat tatcttcggc 300
aaaggtaccc gcctgcatat tctgccgggc ggtggctccg aaggtggcgg ttcagaaggc 360
ggtggctcgg aaggtggcgg tagcgaaggc ggtaccggtg atgcgggtgt cacgcagtct 420
ccgcgtcatg aaagtgtgga aatgggccaa gaagttacgc tgcgctgcaa accgatcagc 480
ggtcacgact acctgttttg gtaccgtcag accccgaaac gcggcctgga actgctgatc 540
tacttcaaca ataacgttcc gattgatgac tcgggtatgc cggaagatcg ttttagcgcg 600
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 單鏈TCRα鏈
<400> 32
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Glu Ile Thr Ala Val Arg
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<212> DNA
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aaaggtaccc gcctgcatat tctgccg 327
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 單鏈TCRβ鏈
<400> 34
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 單鏈TCRβ鏈
<400> 35
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ccggtcgaac cgcgtgactc cgcagtgtat ttttgtgctt cctcactggg cagtaacgaa 300
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<213> 人工序列(artificial)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<220>
<223> 單鏈TCR連接序列
<400> 37
ggcggtggct ccgaaggtgg cggttcagaa ggcggtggct cggaaggtgg cggtagcgaa 60
ggcggtaccg gt 72
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