銀耳菌種提取方法與流程

本發明涉及銀耳培育領域，特別地，涉及一種銀耳菌種提取方法。
背景技術：
：銀耳含豐富的膠質、多種維生素和多種氨基酸及肝糖，具有極高的食用價值。栽培銀耳要獲得高產、優質的菌種是關鍵。傳統的制種分離一直沒能很好的解決菌種穩定性的問題，每次出現母本菌種異常，通常都會導致整批生產不良甚至絕收，給農戶或者企業造成重大損失。并且銀耳菌種基質分離過于繁鎖，不易獲取，并且質量不穩定。如銀耳菌種制作普遍使用基質分離法提取純銀耳菌種，此方法每次分離都要30～45天風干。因為風干時間不足分離出菌種帶有香灰菌絲，風干時間過長又影響銀耳菌種的活性，減少銀耳木屑種轉接代數，因此每次轉接試管的數量都要很多。技術實現要素：本發明提供了一種銀耳菌種提取方法，以解決現有的菌種操作復雜、質量不穩定的技術問題。本發明采用的技術方案如下：一種銀耳菌種提取方法，包括以下步驟：選取耳片消毒、漂洗、擦干后，置于55～65％的濕度條件下4～5小時風干，對耳片上的香灰菌絲滅活。在風干的耳片生長點切取薄耳片，并接種到培養基中，培養至接種點出現2～4毫米的濃白菌絲。將濃白菌絲轉管培養，至形成白毛團，得到銀耳菌種。進一步地，耳片風干的條件為：將耳片置于超凈工作臺，在柔風條件下放置4～5小時。進一步地，培養基包括土豆、葡萄糖、瓊脂和水，培養基由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂24～26g加入木屑培養基香灰菌絲煮水提取液定容1000ml，殺菌、冷卻得到。進一步地，培養基由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂25g加入木屑培養基香灰菌絲煮水提取液定容1000ml，殺菌、冷卻得到。進一步地，薄耳片的大小為0.2mm×0.05mm，薄耳片的厚度為0.1～1毫米。進一步地，薄耳片接種到試管內的培養基中，每根試管接種2～4塊。進一步地，薄耳片在22～25℃下培育15～17天，得到濃白菌絲。進一步地，將濃白菌絲分成2mm×3mm大小進行轉管，培養7～12天得到白毛團。進一步地，耳片通過73～78％酒精消毒，并用73～78％酒精漂洗4～6S，再用無菌水漂洗兩次，每次4～6S。本發明具有以下有益效果：上述銀耳菌種提取方法，通過控制濕度對耳片的香灰菌絲滅活，同時以組織分離法進行銀耳菌種提取，僅需進行一次轉管，提純時間短，操作簡便；同時菌種性狀遺傳親本，質量穩定。除了上面所描述的目的、特征和優點之外，本發明還有其它的目的、特征和優點。下面將參照圖，對本發明作進一步詳細的說明。附圖說明構成本申請的一部分的附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：圖1是本發明優選實施例的薄耳片接種到培養基第5天的圖；圖2是本發明優選實施例的薄耳片接種到培養基第10天的圖圖3是本發明優選實施例的薄耳片接種到培養基第15天的圖；圖4是本發明優選實施例的濃白菌絲轉管后培養第6天的圖。具體實施方式以下結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明，但是本發明可以由權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。本發明的優選實施例提供了一種銀耳菌種提取方法，包括以下步驟：選取耳片消毒、漂洗、擦干后，置于55～65％的濕度條件下4～5小時風干，對耳片上的香灰菌絲滅活。在風干的耳片生長點切取薄耳片，并接種到培養基中，培養至接種點出現2～4毫米的濃白菌絲。將濃白菌絲轉管培養，至形成白毛團，得到銀耳菌種。挑選朵形圓正，葉片展開均勻，白色，生長快，直徑3～5cm銀耳做為分離種源，從中挑選3～5片生命力強的耳片進行銀耳菌種提取。可對耳片進行常規消毒和漂洗，并擦干。擦干可采用無菌紗布。香灰菌絲為銀耳的伴生菌絲，為獲得純的銀耳菌種，需對其進行滅活。香灰菌絲需在較高的濕度條件下生存，當在55～65％的濕度條件下放置4～5小時風干后，香灰菌絲會干死，而銀耳菌種并不會受影響。耳片外表已風干，取下耳片在生長點切小塊，盡可能地切薄點。利用薄的耳片全面吸附在培養基上，吸收培育基營養，刺激菌絲萌發。用無菌接種鉤把薄耳片快速放入試管中，把切口面緊貼在培養基表面。其中培養基可為培養銀耳菌種常用的培養基，如PAD培養基。參照圖1，圖1為薄耳片接種至培養基第5天的實物圖。試管菌種通常培育15～17天，接種點中間為膠狀體，四周長有濃白菌絲2～4mm時轉管。該方法提取試管包括長出銀耳菌絲與不長銀耳菌絲兩種情況。參照圖2和圖3。圖2和圖3清楚表示了薄耳片萌發銀耳菌絲的過程。培養第15天時，大部分薄耳片萌發銀耳菌絲，小部分薄耳片僅自身生長，長大長厚，而并未萌發銀耳菌絲。統計長有銀耳菌絲試驗管90.25％以上，因此只需從生長濃白菌絲的試管中提取菌絲轉管即可。而傳統基質塊提純方法菌種生長情況復雜有些試管只長香灰菌絲，有些試管長香灰菌絲與銀耳菌絲，有此試管只長銀耳菌絲，有些試管長有雜菌，有些試管不生長任何菌絲。因此需要在大量試管中挑選出濃白純銀耳菌絲，并且純度不容易保證。可從生長濃白菌絲的試管中挑選銀耳菌絲生長濃密，粗壯，生長快的進行轉管，切取膠質塊周圍菌絲體2mm×3mm左右轉接到培養容器，如試管或三角瓶內，菌絲第二天長出小毛團，參照圖4，轉管第6天，銀耳菌絲繼續生長。轉管7～12天后可使用，此時得到白毛團(純銀耳菌種)圓正，飽滿，濃密，潔白。本發明具有以下有益效果：上述銀耳菌種提取方法，通過控制濕度對耳片的香灰菌絲滅活，同時以組織分離法進行銀耳菌種提取，僅需進行一次轉管，提純時間短，操作簡便；同時菌種性狀遺傳親本，質量穩定。可選地，耳片風干的條件為：將耳片置于超凈工作臺，在柔風條件下放置4～5小時。超凈工作臺中不易感染雜菌，在柔風的條件下，耳片風干速度合適，且可有效的對香灰菌絲滅活。可選地，培養基中包括土豆、葡萄糖、瓊脂和水，培養基由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂24～26g加入木屑培養基香灰菌絲煮水提取液定容1000ml，殺菌、冷卻得到。培養基為PAD培養基，其組分和配制方法與一般的PAD培養基基本相同。區別在于，本發明中采用的水為木屑培養基香灰菌絲的煮水提取液。即在培養銀耳的木屑培養基上培養香灰菌絲至布滿整個培養基，將香灰菌絲連同木屑培養基共同煮水，作為配制PAD培養基定容用水。在上述量的PAD培養基中，木屑培養基香灰菌絲用量為2瓶，瓶子大小為750ml，即每瓶木屑培養基(質量百分數計，木屑68％，麥皮30％，糖1％，石膏1％，)香灰菌絲的質量為320g左右，將其加入2000ML水煮30分鐘得到提取液。定容后可在121℃滅菌30分鐘，擺斜面，冷卻后3天使用。銀耳菌絲必須混合銀耳菌絲才能萌發，申請人發現木屑培養基香灰菌絲煮水得到提取液可為銀耳菌絲提供生長的營養成分。因此操作更為方便。可選地，培養基由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂25g加入木屑培養基香灰菌絲煮水提取液定容1000ml，殺菌、冷卻得到。可選地，薄耳片的大小為0.2mm×0.05mm，薄耳片的厚度為0.1～1毫米。該大小和厚度的薄耳片可最大限度吸收培育基營養，刺激菌絲萌發。可選地，薄耳片接種到試管內的培養基中，每根試管幾種2～4塊。該條件下，薄耳片的分布密度合適，生長速度較快。可選地，薄耳片在22～25℃下培育15～17天，得到濃白菌絲。在該條件下，菌絲萌發和生長速度快，節省了制種時間。可選地，將濃白菌絲分成2mm×3mm大小進行轉管，培養7～12天得到白毛團。在該條件下，濃白菌絲生長速度快，節省了制種時間。可選地，耳片通過73～78％酒精消毒，并用73～78％酒精漂洗4～6S，再用無菌水漂洗兩次，每次4～6S。采用73～78％酒精消毒可殺死其他雜菌，保證銀耳菌種的純度。優選為75％的酒精。用73～78％酒精漂洗4～6S，再用無菌水漂洗兩次，每次4～6S，清除多余的酒精。實施例11、制作生物PDA培養基PDA為土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂25g，另加木屑培養基香灰菌絲2瓶煮水提取液定容1000ml，121℃滅菌30分鐘，擺斜面，冷卻后3天使用。2、銀耳種源處理A挑選朵形圓正，葉片展開均勻，白色，生長快，直徑3～5cm銀耳做為分離種源。B挑選3片生命力強的耳片，經過73％酒精消毒放入超凈工作臺。C用75％酒精漂洗4S，再用無菌水漂洗兩次，每次4S。D取出用無菌紗布吸干耳片表面水份。E用掛鉤把耳片懸掛在超凈工作臺內，開啟柔風4H后，把耳片表面香灰菌絲干死。3、接種A耳片外表已風干，取下耳片在生長點切成0.2mmX0.05mm大小，厚度為1毫米。B用無菌接種鉤把薄耳片快速放入試管中，把切口面緊貼在培養基表面。每根試管接3塊。4、培育試管菌種放在22℃下培育17天，接種點中間為膠狀體，四周長有濃白菌絲2～4mm時轉管。5、轉管挑選濃白菌絲生長濃密，粗壯，生長快進行轉管，切取膠質塊周圍菌絲體2mmX3mm大小轉接到試管或三角瓶內，菌絲第二天長出小毛團，7天得到白毛團，即純銀耳菌種。實施例2實施例2和實施例1的區別在于薄耳片的厚度為0.8毫米。培育步驟中的溫度為24℃，培育時間為16天。轉管步驟中的培育時間為9天。實施例3實施例2和實施例1的區別在于薄耳片的厚度為0.5毫米。培育步驟中的溫度為25℃，培育時間為15天。轉管步驟中的培育時間為7天。對比例1PDA為土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，所用水為普通無菌水。121℃滅菌30分鐘，擺斜面，冷卻后3天使用。挑選朵形圓正，葉片展開均勻，白色，生長快的銀耳，去掉銀耳子實體，用接種鏟鏟出銀耳基質塊，用解剖刀將基質塊切去周圍松軟的香灰菌絲，露出白色硬化的銀耳菌絲團塊，將基質塊切成2-3厘米的正方體型，放在室溫下的小風機風口處吹干35-45天。將干燥的基質塊放入75％酒精中浸泡30秒，并用無菌紗布吸去表層多余酒精，在超凈工作臺中用無菌解剖刀將基質塊切開，再用接種針挑取中間部位的0.1-0.2立方毫米基質塊接種到PDA培養基上面。然后在室溫22-25攝氏度條件下培養5-6天，即可有潔白的銀耳菌絲萌發。當銀耳純菌絲萌發后在試管中PDA培養基上生長開時。觀察時光中菌體生長情況。有些試管只長香灰菌絲，有些試管長香灰菌絲與銀耳菌絲，有此試管只長銀耳菌絲，有些試管長有雜菌，有些試管不生長任何菌絲。從只長銀耳菌絲的試管中取菌絲尖端重新接種到新的試管中的培養基上面，如此反復操作2次或以上，完成對新分離的銀耳菌絲純化。對比例2PDA為土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，，所用水為普通無菌水。每三角瓶裝15ml，121℃滅菌30分鐘。燒杯4只，以及不銹鋼鉤、接種針、剪刀、鑷子、無菌水、無菌紗布、酒精燈、0.l％的升汞溶液，連同裝有馬鈴薯瓊脂培養基的三角瓶、種耳等放入超凈工作臺消毒30分鐘。先將3只燒杯用酒精消毒后，各倒入無菌水若干，另只燒杯倒入0.1％的升汞溶液，用剪刀剪數片肉厚、片大的耳瓣，在升汞溶液中浸5-10秒鐘，迅速依次放人3只無菌水燒杯中，各浸洗1分鐘，再用無菌紗布將水吸干，用鋼鉤迅速掛于三角瓶內，塞上棉塞。為防雜菌感染，耳片距培養基約3厘米左右。置于恒溫箱，溫度保持在23-25℃，培養24小時，可在培養基表層看到霧狀的孢子卵。這時可在超凈工作臺，取出鋼鉤及耳片，塞好棉塞，繼續培養2-3天后，培養基表面可看到白色糊狀，邊緣光滑，中間凸起的菌落，這就是銀耳孢子。若無雜菌可采取多次劃線法或稀釋法，獲得純芽孢后再進行轉管擴大。實施例1～3、對比例1、對比例2的區別如下表所示。項目本發明提純基質塊提純孢子提純提純轉管次數(次)1≥1≥3提取操作難度簡易一般高穩定情況遺傳親本遺傳不穩定易變異提取純度高一般海選提純時間(天)22-2945-60≥35應用馬上使用馬上使用通過試產穩定帶有雜菌機率很小一般高本發明的銀耳菌種提取方法，操作方便，遺傳形狀穩定，銀耳菌種純度高，提純時間短，并且雜菌機率機率很小。通過控制濕度對耳片的香灰菌絲滅活，同時以組織分離法進行銀耳菌種提取，僅需進行一次轉管，提純時間短，操作簡便；同時菌種性狀遺傳親本，質量穩定。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3