一種多室油菜種質資源的選育方法與流程

本發明屬于作物遺傳育種
技術領域：
，涉及一種多室油菜種質資源的選育方法。
背景技術：
：在油菜遺傳育種中，遺傳資源的多樣性是選育油菜新品種的物質基礎，油菜育種突破性成就的取得往往與其關鍵性基因資源的發現、研究和利用密切相關。因此，種質資源的創新對油菜育種具有重要的現實意義。長期以來，高產育種一直是油菜遺傳育種最重要最基本的研究內容之一，也是油菜育種的熱點研究方向之一。在油菜育種實踐中，以提高油菜產量為目的的育種手段主要包括提高油菜品種的角粒數、角果數、千粒重，以及雜種優勢的利用等方面；以提高油菜產量為目的的栽培措施主要包括適當的水肥、種植密度、以及病蟲草害的防治等方面，以達到生產應用上的高產穩產的目的。在油菜角粒數育種方面，常以提高油菜角果中籽粒的絕對數量為出發點，選育平均角粒數高的油菜材料。常規的油菜角果一般為兩室，即只有兩排種子。而相對于普通的兩室油菜而言，多室油菜是指角果為三室或多于三室的油菜，是具有多室多粒性狀的一類特殊的油菜種質資源。多室角果(三室或更多室)由于具有三排或三排以上的種子，可達到增加油菜每角粒數的目的。因此，多室油菜具有一定的增產潛力。但是甘藍型三室油菜的選育目前未見報道。技術實現要素：針對現有技術存在的不足，本發明提出一種多室油菜種植資源的選育方法，本發明可快速累積和穩定油菜多室性狀，選育綜合性狀優良的多室材料。為解決上述問題，本發明采用的技術方案是：一種多室油菜種質資源的選育方法，包括以下步驟：步驟一，初始多室油菜多代自交，獲得多室油菜群體；步驟二，將步驟一得到的多室油菜群體兩兩之間進行雜交配制雜交組合，油菜成熟期收獲各組合的雜種F1代種子，對雜種F1代種子進行秋播；步驟三，當雜種F1代種子生長到油菜蕾苔期至初花期時，先取油菜花蕾進行游離孢子培養，再依次經胚培養、幼苗培養和田間移栽，獲得雙單倍體植株群體；步驟四，雙單倍體植株群體各單株油菜進行套袋自交，收獲自交后代各單株的種子進行播種；步驟五，重復步驟二～四，直至育成平均多室角率大于60％的不同性狀的多室油菜種質資源。步驟一所述多代自交為3～5代，初始多室油菜多代自交包括以下步驟：1.1將不同年份收集的油菜初始多室角果脫粒得到油菜種子，進行播種種植；1.2在油菜花期時選單株油菜進行套袋自交，在成熟期時收集每個單株油菜自交后代種子并播種，再在成熟期時統計每個單株油菜自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率；1.3選自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率滿足條件A的油菜依次重復步驟1.1和1.2，進行多代自交選育；以初始多室油菜第一次自交選育為第1代，第1～2代時，條件A包括：多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％，第3～5代時，條件A為：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％；多室株率＝(油菜植株群體中具有多室角果的植株數量÷油菜植株群體的植株總數)×100％，多室角率＝(單株油菜多室角數總和÷單株油菜角果總數之和)×100％，平均多室角率＝(所有單株油菜多室角率之和÷油菜植株群體的植株總數)×100％。步驟二中，所述兩兩之間進行雜交配制雜交組合包括兩兩之間進行人工剝蕾、授粉雜交，配制正反交雜交組合。步驟三中，所述游離孢子培養包括對油菜花蕾經過擠壓或研磨，使小孢子從花蕾中釋放出，然后再在培養基中進行孢子培養獲得胚狀體；所述胚培養包括將上述胚狀體轉入B5固體培養基上，進一步誘導胚狀體分化成苗；所述雙單倍體植株群體包括在孢子培養的培養基中加入秋水仙堿，在誘導胚狀體產生的同時，對小孢子染色體組進行加倍，獲得加倍的雙單倍體植株群體。所述培養基為NLN液體淺層培養基。步驟四中，所述雙單倍體植株群體各單株油菜套袋自交選育包括：當所述雙單倍體植株群體生長到初花期時，對雙單倍體植株群體中所有單株油菜逐個進行套袋自交，油菜成熟期時統計多室株率和單株多室角率，收獲各單株的種子進行播種。與現有技術相比，本發明具有以下技術效果：(1)本發明首次成功選育公開了甘藍型三室油菜種質資源，采用本發明所提供的多室油菜種植資源的選育方法成功獲得株率100％，角率大于90％的三室油菜材料。(2)采用本發明的方法可創建一批不同類型性狀的油菜多室材料，拓寬并豐富了油菜種質資源。(3)本發明采用游離小孢子培養技術和秋水仙堿加倍技術，可快速累積和聚合多室性狀基因，純化油菜多室材料，構建多室材料的DH系純合自交群體，加速多室油菜的選育過程。(4)本發明采用“雜交→小孢子培養→自交”三者有序結合且進行二次重復的選育方法進行油菜多室材料的選育，加速了多室油菜的選育過程。(5)本發明克服了油菜花期多室性狀不明顯和不易辨認的難點，從多室株率和多室角率兩方面的指標入手進行選育，加速了多室油菜的選育過程。實驗證明，采用本發明的方法，發明人首次在世界上選育了甘藍型三棱角(三室)油菜。迄今為止，采用本發明的方法已經創建了一批甘藍型油菜三棱角(三室)材料，如：高、中、低桿材料、長角材料、雙低材料、含油量45％左右的材料，而且目前已經選育出三棱角(三室)株率為100％且角率大于90％的性狀較優的長角三棱角(三室)油菜新材料。由此可見，本發明是一種行之有效的選育多室油菜的方法途徑，具有重要的應用價值。附圖說明圖1為本發明的技術路線結構圖。圖2為三棱角(三室)油菜材料04ds55(編號為不同三室油菜材料植株編號)的游離小孢子培養和DH系繁殖圖。其中：A.04ds55經小孢子培養獲得的胚狀體；B.04ds55胚狀體誘導獲得的試管苗。圖3為三棱角(三室)材料與普通角(兩室)材料的角果形態和解剖結構比較圖。其中：A.主花序角果比較；B.角果形態比較；C.角果橫截面形態比較。其中，左：普通角果(兩室)；右：三棱角角果(三室)。圖4為選育的甘藍型三棱角(三室)油菜成熟期角果和植株群體圖。其中：A.三棱角油菜材料12ds145(左)、12ds147(中)、12ds146(右)三室角果形態特征比較；B.選育的三棱角油菜11ds242結角期的植株群體。以下結合附圖進一步對本發明做詳細介紹。具體實施方式本發明探索了一種新的有效的獲得多室油菜種質資源的方法，對于提高油菜產量，進行油菜多室種質資源的創新和多室油菜的選育，提高油菜產量具有重要意義。此種方法具有普適性，不局限于油菜的品種，并且理論上可以獲得四室等更高室種質資源材料。而關于本發明獲得的甘藍型三室油菜種質資源及該多室油菜資源的創新選育方法，國內外至今未見報道。本發明從增加油菜角果的果室數來達到增加油菜角粒數的目的，創建油菜多室材料，以最終達到培育多室油菜品種和提高油菜產量的目的。三棱角(三室)油菜是發明人近年來發現并自主選育的一種新的甘藍型油菜種質資源，是多室油菜的一種重要類型，具有多室、多粒和抗裂角性強的特性。其角果呈三棱柱狀、三室，角果皮為三瓣、角果橫截面為近三角形。三室油菜的研究，對豐富和充實油菜花器官的發育和角果的形態建成理論、油菜的生殖生理、起源進化以及探討三棱角油菜的遺傳特性和分子機理具有重要的理論意義；三棱角油菜種質資源的開發利用，對豐富和充實油菜種質資源、開發利用多室油菜以及油菜的高產育種具有重要的現實意義。甘藍型油菜的角果數一般少則幾百，多則上千，作者早期收集多室角果時，油菜材料中的多室角果出現頻率極低，只有個別植株上偶爾出現1個多室角果，選育過程中，油菜植株上的普通兩室角果與三棱角三室角果共存，即存在角果嵌合現象，并且，本三室性狀是一種隱性性狀，屬于一種數量性狀，受多基因控制，增加了選育難度，同時，本三室性狀是伴隨著雌蕊和子房的發育和分化而發育形成的，雖然在角果期清晰易辨，但是在油菜蕾苔期至花期由于子房很小，不易辨認，不易操作。由于以上原因，使得本三室油菜雜交和選育難度增大。因此，通過自交、雜交結合油菜小孢子培養，以及三室株率和角率等篩選指標進行本三室油菜的選育，以加速其選育進程。本發明所述重復步驟二～四的方法，是指采用“雜交→小孢子培養→自交”的有機結合且二次重復的方法進行油菜多室材料的選育，進一步有效累積且聚合了油菜多室性狀，加速了多室油菜的選育進程。本發明步驟1.3中多代自交選育是一個動態的選育過程，沒有固定不變的標準。早期選育以多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％的標準來進行選育。之后隨著選育進程的推進，以上標準也在相應提高。目前的選育指標是：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％。本發明所用油菜材料來自于不同年份收集的甘藍型油菜三室角果，稱為初始三室角果，所述按常規方法進行播種和田間管理是發明人在所在單位—陜西省雜交油菜研究中心試驗田進行常規的播種(秋播)和田間管理。本發明油菜三棱角(三室)角果的發現與收集：早期(1995～1998年)在油菜結角期、成熟期以及油菜夏收脫粒過程中，常在油菜試驗田發現一些油菜材料中，在個別植株上的角果中會出現個別多室角果，包括三棱角(三室)角果，于是，在不同年份收集這些角果并脫粒保存種子。實施例1：本實施例提供一種多室油菜種質資源的選育方法，具體步驟如下：(1)初始多室油菜多代自交，獲得多室油菜群體：1997年開始將在不同年份收集的多室角果種子進行編號和播種。次年油菜初花期選3～5株進行套袋自交。油菜成熟期統計自交和開放授粉下普通兩室角果和多室角果的數量，計算各材料的株率和角率，秋季選取多室角果株率和角率高的材料進行播種，如此反復，進行多代自交選育(一般為3～5代)，以提高各多室材料的株率和角率；(2)雜交：油菜多室材料間的有性雜交——油菜初始多室材料經多代(3-5代)自交選育，2001年油菜花期，對選育的較高株率和角率的不同油菜多室材料之間進行兩兩雜交，角果成熟期收獲各雜交組合F1代種子用于秋播。兩兩之間進行雜交配制雜交組合是指采取油菜遺傳育種中常規的油菜雜交方法，對經過多代自交選育所得到的株率和角率較高的各多室材料，兩兩之間進行人工剝蕾、授粉雜交，配制正反交雜交組合；(3)游離小孢子培養：自2002年開始，在油菜蕾苔期至初花期，取各雜種F1代的花蕾進行小孢子培養，對所選油菜花蕾經過擠壓或研磨，使小孢子從花蕾中釋放出來，然后再在NLN液體淺層培養基(Lichter,1982)上進行培養，從而誘導胚狀體發生的過程。通過小孢子培養得到胚狀體，胚狀體培養得到試管苗，試管苗進一步移栽到田間獲得DH系植株群體。(4)自交：油菜多室材料DH系群體(雙單倍體植株群體)各單株套袋自交：在油菜初花期，對獲得的油菜多室材料的DH系植株群體各單株分別進行套袋自交。在油菜成熟期，統計DH系群體中各自交單株兩室角果和多室角果的數量，計算各單株的多室角率，收獲各單株的自交種子用于秋播。(5)重復步驟(2)～(4)“雜交→游離小孢子培養→自交”過程，進一步選育株率和角率高且性狀優良的油菜多室新材料，最終育成一批角率大于60％的不同性狀的多室油菜種質資源。實施例2：如圖1至圖4所示，本實施例提供一種甘藍型三室油菜種質資源的選育方法，本實施例按照實施例1的選育方法，通過收集的甘藍型三室油菜種子，成功選育了一批甘藍型三室油菜，采用步驟如下：按照實施例1的方法，先在不同年份收集甘藍型油菜初始三室角果共計17份，通過多代自交，以及結合三室角率和株率作為選育指標，使所選育三室材料的角率和株率得以逐步提高，2001年油菜花期，在所選取的三室株率和角率較高的油菜三室材料之間進行兩兩雜交，共配制7個雜交組合。從2002年開始，在油菜蕾苔期至初花期，取各雜交組合F1代的花蕾進行游離小孢子培養，獲得了來源于4個雜交組合的DH系植株群體(圖2)。2003年在油菜初花期，對獲得的三室材料的DH系植株群體各單株分別進行套袋自交。在油菜成熟期，統計各自交單株兩室角果和三室角果的數量，計算各單株的三室角率，收獲各群體單株的種子分別為106份、55份、41份、16份，再重復“雜交→小孢子培養→自交”過程，最終育成株率為100％、角率大于90％的甘藍型油菜三室材料(圖3)。以下是對按照實施例1的選育方法選育出的甘藍型三室油菜的說明，甘藍型油菜三棱角(三室)材料的角果特征如圖3和表1所示。由圖3和表1可知，三棱角(三室)角果明顯比普通角(兩室)角果粗大，其平均角粒數明顯比普通角(兩室)角果多，而且其角果橫截面為近三角形，使其角果由于獨特的三棱柱狀結構因而具有較強的抗裂角特性。表1三棱角果(三室)與普通角果(兩室)特征比較角果類型普通角果三棱角果角果外形偏平柱狀三棱柱狀角果長度/cm7.0477.095角果截面周長/cm1.2381.533千粒重/g4.1293.497角粒數15.26319.683角果橫截面近橢圓形，兩室近三角形，三室角果皮兩瓣三瓣隔膜橫截面“1”狀“Y”狀迄今為止，發明人已成功獲得了一批高稈(株高165～175cm)、莖稈高度中等(株高介于高稈和矮稈之間)、矮稈(株高40～50cm)、長角(角果長度6.5～8.29cm)、早熟(比一般材料早熟3～5天)、雙低(芥酸含量＜5％，硫苷含量＜30μmol/g)、含油量40％～45％(本發明油菜樣品含油量分析方法采用近紅外光譜法，所用儀器為德國布魯克MATRIX_I型近紅外光譜儀)的三棱角(三室)油菜種質資源(如圖4)。由圖4(A)可知，三棱角油菜材料12ds147的三棱角角果明顯長于12ds145和12ds146的三棱角角果，屬于長角角果。當前第1頁1 2 3