用于破除細菌生物被膜的消毒劑的制作方法

本發明涉及一種消毒劑。更具體地說，本發明涉及一種用于破除細菌生物被膜的消毒劑。

背景技術：

細菌不可逆的附著于惰性或活性實體的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基質，將菌體群落包裹其中而形成的細菌聚集體膜狀物。生物被膜將導致產品污染。產品污染來源于生物被膜上脫落的細菌，這些細菌可以重新附著在產品生產過程中的其它設備上或是直接進入食品中。致病性微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要隱患。美國約80％的持續的細菌感染與細菌生物被膜有關(美國國立衛生研究院報告)。

研究表明，相對于處理食品或者環境中的游離細菌來說，細菌形成生物被膜后難以消除，必須通過高濃度消毒劑處理才能將生物被膜內的細菌殺死，而長期高濃度使用特定的消毒劑，不僅對環境和人體有害，并且使得細菌細胞產生了對常見消毒劑的抗性，更加難以處理，并且高度濃度的消毒劑，如酸等，會腐蝕食品加工企業的地面等，提高企業的生產成本。

技術實現要素：

本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種用于破除細菌生物被膜的消毒劑，其能夠有效破除細菌生物被膜且成分簡單，消毒成分濃度低，能夠提高消毒劑的使用效果，降低消毒劑的使用量，減少對環境和人體的危害。

為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種用于破除細菌生物被膜的消毒劑，包括：按重量份計的以下組分：0.5-3重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。

優選的是，所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括按重量份計的以下組分：0.5-1重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。

優選的是，所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括按重量份計的以下組分：1重量份的苯乳酸、1重量份的乳酸以及100重量份的去離子水。本發明所使用的乳酸和苯乳酸均選用市售的sigma試劑。

優選的是，所述細菌生物被膜包括由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌形成的生物被膜。

優選的是，所述革蘭氏陽性菌包括：李斯特菌或耐藥性的腸球菌。

優選的是，所述革蘭氏陰性菌包括：沙門氏菌或假單胞菌。

本發明至少包括以下有益效果：本發明基于意想不到的發現，即低濃度的苯乳酸(3-苯基乳酸)與乳酸具有協同作用，能夠增強乳酸對細菌生物被膜的破壞能力。本發明通過研究分析，發現1重量份的乳酸中添加0.5-3重量份的苯乳酸可以大大加強其對生物被膜的消除能力。本發明所述消毒劑不僅能夠破除由革蘭氏陽性菌形成的生物被膜，同時對由革蘭氏陰性菌形成的生物被膜也具有較強的破除能力，尤其是醫療和食品行業中常見的沙門氏菌和假單胞菌等形成的生物被膜。因此，本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑僅僅使用低劑量的苯乳酸添加到低劑量的乳酸中即可以破除細菌生物被膜，可以增加消毒液的殺菌效果，從而降低乳酸的使用濃度。本發明所述消毒劑組成成分簡單，消毒成分濃度更低，生產成本更低，大大減少對環境和人體的危害。

本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

附圖說明

圖1為本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑處理成熟早期的李斯特菌生物被膜后的失活程度效果圖；

圖2為本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑處理成熟后期的李斯特菌生物被膜的失活程度效果圖。

具體實施方式

下面結合圖例和實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不排除一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

本發明提供一種用于破除細菌生物被膜的消毒劑，包括按重量份計的以下組分：0.5-3重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。按照該比例可以配置所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑的原液，在使用過程中加入100ml去離子水中進行使用。也可以在100ml去離子水中直接添加0.5-3g苯乳酸和1g乳酸來制備可以直接使用的消毒劑。所述乳酸的使用量可以一定范圍任意選擇，例如1-3g乳酸。由于在實際生產中發現，雖然乳酸和苯乳酸作為有效的殺菌劑，可以極大程度地消滅游離的革蘭氏陽性菌，但是對于已經形成生物被膜的細菌，作用很有限。如果想有效破除生物被膜現有技術中選擇加大乳酸使用量，或者利用大量復合消毒劑進行長時間消毒處理。但在消毒過程中，往往會因為大量的酸性物質對被消毒品造成破壞或污染。本發明基于在研究中意想不到的發現，即苯乳酸與乳酸復配可以大大增強消毒作用，尤其是在低劑量范圍內的效果更加明顯。通過研究分析以及大量實驗結果證明，按照本發明的方法在1重量份的乳酸中加入0.5-3重量份的苯乳酸，能夠最大程度地增強乳酸對生物被膜中細菌細胞壁的破壞作用，增強其破除生物被膜的作用。

在其中一個實施例中，所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括按重量份計的以下組分：0.5-1重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。在試驗中發現，苯乳酸的添加量在最接近乳酸含量時其效果最優。

在其中一個實施例中，所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括按重量份計的以下組分：1重量份的苯乳酸、1重量份的乳酸以及100重量份的去離子水。在生產過程中，可以選擇同等重量份的苯乳酸和乳酸進行混合制備，其生產方法簡單，使用去離子水更有利于發揮二者的協同作用。

在其中一個實施例中，所述細菌生物被膜包括由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌形成的生物被膜。本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑不僅廣譜性殺菌效果，而且能夠破除由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌形成的生物被膜。所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑的適用范圍大，應用廣泛。

在其中一個實施例中，所述革蘭氏陽性菌包括：李斯特菌或耐藥性的腸球菌。李斯特菌是一種重要的食源性病原菌，能夠在食品加工環境中存活，并且能夠在各種食品加工設備的表面形成生物被膜。李斯特菌形成的生物被膜難以消除，并且已經表現出了對常見消毒劑如氯、酸和季銨鹽等的抗性。本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑對李斯特菌生物被膜處理5min后，李斯特菌生物被膜內的細胞能夠降低4.01log CFU/ml。

在其中一個實施例中，所述革蘭氏陰性菌包括：沙門氏菌或假單胞菌。這兩種細菌形成的生物被膜能夠引起人畜疾病，導致傷口感染等狀況發生。本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑對沙門氏菌生物被膜處理5min后，沙門氏菌生物被膜內的細胞能夠降低3.87log CFU/ml。

實施例1

本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括1g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去離子水。

實施例2

本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括0.5g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去離子水。

實施例3

本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑包括3g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去離子水。

對比例1

消毒劑中包含3g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去離子水。

對比例2

消毒劑中包含3g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去離子水。

對比例3

選用復合消毒劑，其包含3％LVA和2％SDS。

本發明選用李斯特菌生物被膜對上述各實施例和對比例進行試驗，方法如下：

1，菌種的培養首先將單核細胞增生李斯特菌在腦心浸液肉湯(BHI)中37℃培養24小時恢復菌種的活力，然后將菌液進一步接種到BHI培養基中培養到對數生長期，獲得細菌總數約為10⁹CFU/mL的菌液，備用。

2，生物被膜的制備將菌數約10⁹CFU/mL的菌液使用新鮮的BHI液體培養基稀釋100倍，然后分別取1ml上述稀釋菌液加入到24孔聚苯乙烯板的每個孔中，將24孔板靜態培養。同時制備多個含有菌液的24孔板，置于15℃培養4天或7天。在制備生物被膜期間，為了保持菌的活力，每隔24小時將每個孔中的菌上清液取出，輕輕加入新的BHI液體培養基。培養完畢后，輕輕吸掉上清菌液，然后使用PBS溶液洗滌3次，24孔板底部即形成生長到成熟期的李斯特菌生物被膜。

3.選用各消毒劑對生物被膜的處理

生物被膜培養結束后，棄去上清液，使用0.01M磷酸鹽緩沖緩進行漂洗三次，將24孔板空氣干燥5分鐘，然后使用不同消毒劑進行消毒處理，無菌水為陰性對照。每個孔中分別加入2ml試劑，處理時間5分鐘。處理結束后，將每個空中充滿了2毫升N/E中和肉湯(Becton Dickinson)，靜止10分鐘后，吸凈液體，然后每個孔中加入1ml PBS，使用一個無菌的棉簽徹底刮去表面的生物被膜，將含有生物被膜樣品的PBS溶液和棉簽都加入到含有9mlPBS溶液的試管中，漩渦震蕩1分鐘使得生物被膜破裂，釋放游離細胞，然后將溶液進行梯度稀釋，最后取合適梯度的稀釋液100μl涂布在BHI平板中。在37℃培養48小時計數。存活細胞數記錄見表1。

失活的程度表示為消毒處理的細胞存活率的log10(log N/N₀)。N是指經過消毒處理的樣品中的細菌數，N₀是指不經過處理的陰性對照中的細菌數(陰性對照生物被膜)。失活的程度見圖1和圖2。從圖1和圖2中可以看出，本發明所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑對李斯特菌生物被膜的消滅能力最強。

表1各消毒劑處理不同成熟度的李斯特菌生物被膜5min后的殘留菌數

表1中，可以明顯看出實施例1所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑破除生物被膜的效果最優，存活的菌數最少，尤其是成熟度早期生物被膜內的細菌失活數高達4.26logCFU/ml。

采用上述方法，分別制備耐藥性的腸球菌、沙門氏菌或假單胞菌的生物被膜，并使用各實施例和對比例制備的消毒劑對其進行處理，結果見表2，表3和表4。

表2各消毒劑處理不同成熟度的沙門氏菌生物被膜5min后的殘留菌數

從表2中，可以明顯看出實施例1所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑破除沙門氏菌生物被膜的效果最優，存活的菌數最少，尤其是成熟度早期生物被膜內的細菌失活數高達4.53log CFU/ml。

表3各消毒劑處理不同成熟度的腸球菌生物被膜5min后的殘留菌數

從表3中，可以明顯看出實施例1所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑破除腸球菌生物被膜的效果最優，存活的菌數最少，尤其是成熟度早期生物被膜內的細菌失活數高達4.04log CFU/ml。

表4各消毒劑處理不同成熟度假單胞菌生物被膜5min后的殘留菌數

從表4中，可以明顯看出實施例1所述用于破除細菌生物被膜的消毒劑破除假單胞菌生物被膜的效果最優，存活的菌數最少，尤其是成熟度早期生物被膜內的細菌失活數高達4.29log CFU/ml。

盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例和實施例。