一種獲得光溫敏核不育水稻的方法與流程

本申請是申請日為2015年11月13日申請號為201510782583.2名稱為“一種光溫敏核不育水稻的創制方法”發明專利申請的分案申請。

本發明屬于農業和生物技術領域，涉及一種獲得光溫敏雄性不育水稻的方法。

背景技術：

雄性不育系在雜交制種、提高農業產量中占據巨大優勢，控制作物的雄性生殖發育對作物育種和農業生產至關重要。一般將雄性不育分為細胞質雄性不育(cms)和細胞核雄性不育(gms)兩種。三系雜交體系即依賴于cms。我國在1973年首次實現雜交水稻三系配套，目前共獲得上百個三系雜交水稻組合，常年種植面積1,500多萬公頃。然而，三系雜交自身的缺陷限制了其在實踐中的廣泛應用。首先，只有約5％的水稻品種具有恢復基因，可用于雜交育種試驗，此雜種優勢受到嚴重限制。其次，由于細胞質雄性不育細胞質單一，一旦細胞質不育喪失或某種毀滅性病蟲害發生，會造成巨大損失。

隨著細胞核雄性不育中光溫敏條件性雄性不育的發現，兩系法雜交水稻應運而生。相對于三系雜交法，光溫敏不育系兼有不育系和保持系兩種狀態。與三系法相比，兩系法不受恢保關系的限制，即細胞核不育可以與大量常規品種雜交，配組自由，更容易獲得性狀優良的雜交優勢，從根本上解決三系中雄性不育細胞質單一化的問題。近年來，兩系雜交水稻在中國農業生產中的應用越來越廣泛。

早在1973年石明松在中國湖北從晚粳品種(oryzasativassp.japonica)農墾58中選育出光敏感不育系。隨后，以農墾58s(nk58s)為父本，與秈稻雜交獲得的培矮64s(pa64s)也在兩系雜交中得到廣泛應用(楊仕華等，雜交水稻，2009，24：5-9)，只是培矮64s的育性對溫度更加敏感(羅孝和等，雜交水稻，1992，7：27–29)。水稻光溫敏不育系受單基因隱性位點控制；研究表明，農墾58s與培矮64s的不育性狀均受同一個遺傳位點控制，一個突變的小rna(smallrna)osa-smr5864m，即可導致pms2以及p/tms2-1(農墾58s和培矮64s)突變體的不育表型(丁寄花等，procnatlacadsciusa，2012，109：2654–2659；周海等，cellresearch，2012，22：649–660)。水稻溫敏核不育系安農s-1是1987年由鄧華風在秈稻中發現并育成的第一個秈型溫敏不育系，生產上已經用它培育了一批優良的雜交組合(賈建航等，植物學報，2003，45，614–620)。研究發現安農s-1的不育性狀由另一個位點tms5控制，該位點的突變導致一個rnasez家族蛋白的功能缺失。在不同溫度下，該蛋白通過對ubl40mrna積累程度的調控，影響細胞內泛素平衡，控制水稻溫敏雄性不育(周海等，naturecommunications，2014，5：4884)。

在農業生產上，光溫敏不育系是指其雄性不育或可育的性狀受控于外界溫度光周期條件，即不育系在高溫或者長日照條件下表現雄性不育，可用于雜交制種；而在低溫或者短日照條件下表現可育，可用于自身繁殖，因而免去了保持系，這樣可以與農業生產上的環境條件保持一致。

與三系法相比，兩系法具有不受恢保關系的限制，即核不育可以與各種常規品種雜交，配組自由，克服了三系育種中受恢復系中恢復基因的限制的缺陷，因而更容易獲得性狀優良的雜交優勢，也從根本上解決了三系法中雄性不育細胞質單一的問題。據農業部全國農作物主要品種推廣情況的統計資料，1993年到2009年共有121個兩系組合年推廣面積達到或者超過6700公頃，累計推廣面積達到2097.4萬公頃。

雖然發現的光溫敏不育系中，通過省級和國家級審定的兩系雜交水稻的組合已有200多種，但是大部分光溫敏不育系均由農墾58s、安農s-1等少數幾個光溫敏品種轉育而來，即控制核不育的遺傳位點較為單一。因此，目前生產上主推的光溫敏不育系組合的遺傳背景較窄，有待進一步加強新資源的開發。

由于全球氣候變化異常，近年來盛夏的低溫潮對兩系制種的安全性造成了很大的威脅。如2009年7月江淮地區的持續低溫使兩系水稻的制種純度大幅下降，直接影響了農民和制種單位的經濟效益。因此，生產上急需起點溫度更低的光溫敏品種。

技術實現要素：

為了解決目前存在的上述問題，本發明提供了一種獲得光溫敏雄性不育水稻的方法。

本發明提供的一種獲得光溫敏雄性不育水稻的方法，步驟包括將m1代種子誘變，在長日照和高溫條件下種植并收種，獲得m2代水稻種子；長日照、高溫條件下，種植m2代水稻種子，并選出m2代中不育表型的植株；其特征在于，去除所說的m2代不育表型的植株的主穗，在短日照和低溫條件下種植，使其重新生長抽穗結實，獲得光溫敏雄性不育水稻植株。

作為本發明的優選實施方式之一，所說的m2代不育表型的植株剪去主穗后，植株在短日照和/或冷灌條件下生長發育。

作為本發明的優選實施方式之一，其中所說的短日照為日照時間短于12h/天。

作為本發明的優選實施方式之一，所說的低溫為平均溫度低于25℃，優選低于23℃，更優選低于21℃。

作為本發明的優選實施方式之一，所說的長日照為日照時間多于12h/天；所說的高溫條件為平均溫度高于或等于26℃，如28、30℃，優選為平均溫度在26-28℃之間。

作為本發明的優選實施方式之一，所說的步驟還包括對所說的剪去主穗的m2代不育表型的植株在生長過程中促蘗。

作為本發明的一個優選實施例，所說的誘變可以為物理誘變劑誘變、化學誘變劑誘變中的任意一種或幾種組合。

作為本發明的一個優選實施例，所述物理誘變劑可以為紫外線、x-射線、γ-射線、快中子、激光、微波以及離子束等中的任意一種或幾種，優選為x-射線、γ-射線、激光中的一種或幾種組合。

作為本發明的一個優選實施例，所述化學誘變劑可以為烷化劑、天然堿基類似物、氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等中的任意一種或幾種組合，優選為烷化劑、氯化鋰、堿基類似物中的任意一種或幾種組合，更優選為烷化劑。

作為本發明的一個優選實施例，所述烷化劑為甲基磺酸乙酯(ems)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鹽酸氮芥(chlormethinehydrochloride)、環磷酰胺(cyclophosphamide)等中的任意一種或幾種組合成的誘變液，優選為甲基磺酸乙酯(ems)、二溴甘露醇(dibromomannitol)中的任意一種或兩種組合成的誘變液，更優選為甲基磺酸乙酯(ems)誘變液。

作為本發明的一個優選實施例，所述化學誘變劑中甲基磺酸乙酯的濃度為0.1-5％，如0.2％、3％等，優選為0.5–1.8％，如0.6％、0.7％等，更優選為0.8–1.2％，如1.0％、1.2％等。

作為本發明的一個優選實施例，采用所述甲基磺酸乙酯誘變液處理水稻種子1-48h，優選為處理6-36h，如10h、32h，更優選為8–12h，如12h。

作為本發明的一個優選實施例，所說的長日照、高溫條件下的生長均在自然環境下進行。

本發明提供的另一種技術方案為，采用本發明提供的方法獲得的光溫敏雄性不育植株用于水稻兩系法育種。

本發明提供的又一種技術方案為，采用本發明提供的方法獲得的光溫敏雄性不育植株用于創制基因庫。

本發明的有益之處在于：采用本發明所述方法可以快速獲得大量光溫敏不育系水稻植株，用于雜交育種，擴大了光溫敏不育系的遺傳背景。此外，該方法還可以用于創制基因庫、開發新型二系雜交水稻，在農業生產上具有十分重要的應用價值。

附圖說明

圖1為本發明提供的光溫敏核不育水稻創制方法流程圖；

圖2為ems誘變獲得的光溫敏核不育植株；

圖3為低溫條件下不育植株的育性恢復。

具體實施方式

選取實驗組和對照組，以中花11號水稻作為實驗組，以野生型水稻作為對照組，考察外力誘變對水稻種子育性的影響。

誘變水稻種子

實驗組：

5月中旬將2kg實驗組m1代水稻種子放入清水中浸泡4h，然后用體積濃度為1.0％的ems處理水稻種子12h，處理結束后，將m1代水稻種子與ems誘變液分離，并向經ems溶液處理過的m1代水稻種子中加入1m的naoh和20w/v％na2s2o3，以終止誘變反應。反應結束后，立即用清水沖洗水稻種子20次以上，隨后室溫下浸種48h，并于30℃培養箱中破胸催芽，種子發芽后移到大田秧板中培養。三周后，將活苗插秧入大田環境中進行培養。在夏季高溫條件下，苗秧成熟、分蘗、抽穗開花、灌漿，9月中旬分株收獲6000株m2代種子。

對照組：

5月中旬將1kg對照組水稻種子放入清水中，室溫下浸種48h，并于30℃培養箱中破胸催芽，種子發芽后移到大田秧板中培養。三周后，將活苗插秧入大田環境中進行培養。在夏季高溫條件下，苗秧成熟、分蘗、抽穗開花、灌漿，9月中旬分株收獲對照組結實可育的種子。

篩選雄性不育植株

在5月下旬浸泡m2代水稻種子48h，待種子長芽后將其直接拋秧在大田中。在夏季高溫條件下，苗秧成熟、分蘗、抽穗開花。在水稻孕穗后，取出部分小穗，于解剖鏡下取出花藥，用亞歷山大染色液浸染2h后，在明場顯微鏡下觀察不同組小穗的花粉量。并在8月底m2代植株灌漿后，觀察篩選不能結穗的水稻植株，并統計不育株系的結實率。

結果如圖2所示，實驗組的光溫敏不育株1-5完全沒有花粉，或者僅有綠色的敗育花粉，即5個水稻突變體皆表現為雄性不育表型；而對照組的花粉發育正常，即對照組表現為可育表型。

實驗組共獲得雄性不育株共536株，占m2代單株的9％左右；對照組未獲得雄性不育植株。

獲得光溫敏雄性不育植株

在同一世代中，將獲得的雄性不育株的成熟穗割蔸去除，統一移栽入規劃好的大田中繼續讓其生長，適時施肥促蘗，秋季的短日照可以促進水稻開花，雄性不育株在10月底進入孕穗期。在此期間，利用秋季自然環境下較低的平均氣溫(17-20℃)以及較短的日照長度，抽穗后用亞歷山大染液進行浸染觀察花粉，統計結實率，將其后續成功灌漿的種子收下，結果如圖3所示，5個不育植株抽出的穗子皆能夠恢復育性，統計獲得的536個不育單株的育性可知，其中共有72株恢復育性，占不育植株的13.4％左右，其中結實率高于50％的有30個單株。

不育植株的育性

采用以下兩種方法考察本發明提供的光溫敏不育植株的高溫不育性：

1)在利用自然光的玻璃溫室中，日夜溫度為28-35℃的條件下進行試驗；

2)在自然條件下，5月下旬種植水稻，7月底-8月初孕穗，9月初觀察育性表型。

采用以下兩種方法本發明提供的光溫敏不育植株的低溫可育性：

1)在玻璃溫室中培養水稻至孕穗期前，4月下旬(平均溫度23.5℃)移至自然條件下；

2)利用秋季自然條件篩選，7月底至8月初萌發這些株系，9月下旬進入孕穗期。

經過上述實驗，在72個株系中共獲得13個高溫完全不育，低溫恢復50％以上育性的植株。

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。