液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑及其采血管的制作方法

本發明屬于液體活檢技術領域，具體涉及一種液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑及其采血管。

背景技術：

液體活檢，既有極高的科研價值，又具備助力推進精準醫療臨床實踐的巨大潛能。它可用于癌癥早期篩查、診斷、監控、治療方案指導和療效評估等眾多領域，液體活檢的優勢使其成為最具發展潛力的腫瘤診療手段。游離核酸作為新型的醫療診斷標志物，與腫瘤學、產前遺傳學診斷的發展有著非常密切的聯系，循環腫瘤主要來源于實體腫瘤的原發病灶從腫瘤組織中脫落進入到血液循環中，并最終稱為腫瘤的早期診斷、個性化治療、療效檢測的標志性檢測物質。惡性腫瘤的高度異質性使不同個體之間存在藥效的差異，腫瘤不斷進化，在不同階段表現出不一樣的生物學特征，給臨床診治造成了很大困擾。侵襲與轉移能力高的腫瘤細胞擴散至循環血后，在特定的階段及環境中種植于身體某些部位，不斷增殖形成轉移瘤，且表現出與原發腫瘤不一樣的生物學特征。在抗腫瘤治療中，轉移瘤克隆進化持續發生，抗腫瘤治療失敗繼而重演。相關研究表明游離dna與腫瘤細胞dna具有一致性，能全面的反應腫瘤細胞中遺傳信息的變化，利用液體活檢技術能克服常規腫瘤組織活檢所無法突破的腫瘤異質性問題。通過循環腫瘤核酸檢測，能幫助實時動態監測腫瘤原發灶及轉移復發灶基因組信息，協助早期診斷、療效監測和預后判斷，也有助于靶向治療適應證的評估。在遺傳診斷領域，通過采集孕婦外周血，并提取血液中游離脫氧核糖核酸(cfdna)并進一步分離出游離的胎兒脫氧核糖核酸(cffdna)，結合下一代測序技術(ngs)，結合相關生物信息分析，對胎兒的遺傳信息進行分析達到無創產前診斷的目的。

然而由于相關標記物在血液中的含量極低并且其在常溫情況下降解速度快等特點加大了相關標記物獲取的困難，并且相關血樣在保存及運輸的過程中都受到外界條件如地理、時間、空間、溫度等條件的擾動，對血樣造成了一定的破壞，加大了液體活檢實施的困難。由此可見，液體活檢的實施的關鍵在于相關生物樣品的獲取與保存的實現。

常規血樣進行保存的穩定劑一般采用咪唑烷基脲等防腐劑，該類物質雖然能起到防腐功效，但會釋放出甲醛等有害成分，容易攻擊游離核酸，引起游離核糖核酸(cfrna)交連成雙鍵結構無法檢測，游離脫氧核糖核酸(cfdna)化學鍵被破壞，雙鏈結構無法打開，無法進行擴增、診斷，不能夠制成醫學用采血管，無醫學上的使用價值。

再者，在進行于癌癥相關的液體活檢測應用中，關鍵在于保證血樣中游離脫氧核糖核酸(cfdna)、循環腫瘤dna(cfdna)及野生型基因組的完整性，而現有液體活檢中對血樣進行保存的穩定劑，一般難以保證游離核酸不降解，在進行下游分析時，難以提供足量游離核酸用于分析；同時血樣保存的常規穩定劑中自由基的存在，加速了核酸降解，而且能夠殺死血液中的白細胞及癌細胞，無法滿足液體活檢的需求。

技術實現要素：

為了解決現有血樣保存穩定劑難以滿足液體活檢中游離脫氧核糖核酸(cfdna)、循環腫瘤dna(cfdna)及野生型基因組的完整性及容易產生甲醛等有害成分等問題，本發明的目的在于提供一種符合醫學標準的不含有甲醛等有害物質且能夠用于液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞保存的穩定劑及其采血管。

本發明的目的通過以下技術方案得以實現：

本發明提供一種液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑，以重量份計，該穩定劑包括20-100份的防腐劑、5-50份的抗氧化劑、1-35份的抗凝劑、5-20份的ph穩定劑、5-20份的酶抑制劑、0.1-10份的細胞凋亡抑制劑、5-25份的自由基捕獲劑和1-10份的代謝抑制劑。

上述穩定劑中，優選地，所述防腐劑可以包括利福平、魚精蛋白、殼聚糖、果膠分解物、三氯叔丁醇、羧甲纖維素、聚山梨酯、山梨酸、羥苯乙酯和石墨烯納米抗菌材料等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述防腐劑為由利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯所組成的組合物，其中利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯質量比為(1-2)：(3-5)：(2-10)：(5-10)。

上述穩定劑中，優選地，所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：利用水熱法培養石墨烯納米材料，并將1g石墨烯納米材料溶于50ml超純水中并超聲分散，得到分散液；然后向分散液中加入20g-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化銨，超聲震蕩48h、水浴5h、攪拌反應10h、過濾、洗滌、干燥得到石墨烯納米抗菌材料。

上述石墨烯納米抗菌材料制備方法中，水熱法培養、超聲分散、超聲震蕩、水浴、攪拌、過濾、洗滌、干燥等工藝條件均為本領域技術人員根據實際操作進行合理調整。

上述穩定劑中，優選地，所述抗氧化劑可以包括維生素c、蝦青素、類胡蘿卜素、特丁基對苯二酚、二丁基羥基甲苯、二叔丁基羥基甲苯和2,3,6,7,10,11-六羥基三苯等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述抗氧化劑為由維生素c、蝦青素、類胡蘿卜素和特丁基對苯二酚所組成的組合物，其中：維生素c、蝦青素、類胡蘿卜素和特丁基對苯二酚質量比為(1-5)：(2-5)：(3-10)：(1-5)。

上述穩定劑中，優選地，所述抗凝劑可以包括草酸鉀、肝素、氯化鈉、二乙胺四乙酸鉀鹽和枸櫞酸鈉等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述抗凝劑為二乙胺四乙酸鉀鹽。

上述穩定劑中，優選地，所述ph穩定劑可以包括tris-hcl緩沖液和/或檸檬酸。

上述穩定劑中，優選地，所述酶抑制劑可以包括二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦、巰基乙醇和亞硫酸氫鈉等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述細胞凋亡抑制劑可以包括q-vd-oph。

上述穩定劑中，優選地，所述自由基捕獲劑的制備方法包括以下步驟：

以多元胺作為引發劑，加入有機溶劑、催化劑和開環材料，進行開環聚合，得到產物a；

將產物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進一步提純，得到產物b；

將產物b溶于有機溶劑中，加入催化劑和開環材料，進行開環聚合，并采用乙醚和反向硅膠柱依次提純產物，得到兩親性多臂星形聚合物；

將納米材料溶于超純水中超聲，然后加入氨水及硅化劑進行硅基化修飾，分離得到產物c，將產物c用氨基酸進行包被，得到產物d；

取產物d、兩親性多臂星形聚合物，加入n-羥基琥珀酰亞胺進行端基修飾反應，得到自由基捕獲劑。

上述自由基捕獲劑的制備方法中，各物質用量、開環聚合反應條件、產物提純條件等均為本領域技術人員根據實際操作進行合理調整。

上述穩定劑中，優選地，所述開環材料包括己內酯、丙交酯、乙烯亞胺、環氧乙烷、谷氨酸和賴氨酸中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述催化劑可以包括辛酸亞錫和/或氯化鋅。

上述穩定劑中，優選地，所述多元胺可以包括三乙烯四胺、乙二胺、二乙烯三胺和四亞乙基五胺等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述有機溶劑可以包括二氯甲烷或二甲基亞砜。

上述穩定劑中，優選地，所述氨基酸可以包括賴氨酸、絲氨酸和異亮氨酸等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述兩親性多臂星形聚合物結構式包括-n-(plga-pcl-)n、-n-(pga-pcl)n-、-n-(pei-pcl)n-和-n-(dphal-plga)n-中的一種或多種的組合；其中，n取值2,4,6或8，dphal為多聚賴氨酸。

上述穩定劑中，優選地，所述納米材料可以包括羥基磷灰石納米顆粒、中孔硅納米顆粒和金納米顆粒等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述納米材料粒徑為20nm-1000nm。

上述穩定劑中，優選地，所述代謝抑制劑可以包括氨基葡萄糖鹽酸鹽、甘油醛、金精三羧酸、腺嘌呤、腺苷和磷酸二氫鈉等中的一種或多種的組合。

上述穩定劑中，優選地，所述代謝抑制劑為氨基葡萄糖鹽酸鹽、甘油醛和金精三羧酸的組合。

本發明還提供一種真空采血管，其管中裝載有上述的穩定劑。

上述穩定劑中，防腐劑選用石墨烯納米抗菌材料等，能夠解決現有血樣穩定劑在保存過程中釋放出甲醛等有害成分，從而保護游離核酸。

上述穩定劑中，制備的自由基捕獲劑中，納米材料能夠與核酸進行可逆性的結合，捕獲自由基。在效果上可以在2ml的血液中提取足量的游離核酸進行下游分析。對于cfdna的保存可以長達18天，cfrna的保存可以長達9天(37℃情況)，做到真正的常溫保存，滿足液體活檢的需要。制備的兩親性多臂星形聚合物利用其氮上的活潑氫進行多臂化處理，增強納米材料的生物活性，并且修飾后的納米材料不會影響環境的滲透壓，避免了血細胞的破裂。

本發明提供的液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑及其采血管，能夠運用一步法進行相關樣品的快速分離，能夠有效保存胎兒游離核酸，防止循環腫瘤核酸交聯性損傷并保證野生型基因的完整性，防止細胞裂解及其血液基因組核酸的釋放，實現癌癥患者的血樣中的循環腫瘤細胞、淋巴細胞以及循環腫瘤核酸的常溫保存與運輸。

附圖說明

圖1為本發明實施例4中單離心體系和雙離心體系對應β-actin拷貝數結果數據圖；

圖2為本發明實施例5中室溫條件下熒光pcr擴增β-actin及sry進行擴增測定cfdna和cffdna濃度對比實驗圖；

圖3為本發明實施例5中35℃條件下熒光pcr擴增β-actin及sry進行擴增測定cfdna和cffdna濃度對比實驗圖；

圖4為本發明實施例6中健康自愿者血樣中cfdna突變率分布圖；

圖5為本發明實施例6中直腸癌患者血樣中cfdna突變率分布圖。

具體實施方式

為了對本發明的技術特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現對本發明的技術方案進行以下詳細說明，但不能理解為對本發明的可實施范圍的限定。

實施例1

本實施例提供一種液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑，以重量份計，該穩定劑包括50mg的防腐劑(石墨烯納米抗菌材料)、25mg的二叔丁基羥基甲苯、10mg的二乙胺四乙酸二鉀、15mg的巰基乙醇、2mg的細胞凋亡抑制劑q-vd-oph、20mg的自由基捕獲劑和10mg的金精三羧酸，通過改變ph穩定劑檸檬酸的含量，使穩定劑最終ph值在4-5之間。

本實施例的穩定劑中，所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：利用水熱法培養石墨烯納米材料，并將1g石墨烯納米材料溶于50ml超純水中并超聲分散，得到分散液；然后向分散液中加入20-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化銨超聲震蕩48小時、水浴5小、攪拌反應10小時、過濾洗滌、干燥得到石墨烯納米抗菌材料。

本實施例的穩定劑中，所述自由基捕獲劑的制備方法為：

以乙二胺作為引發劑，溶于50ml二氯甲烷中以辛酸亞錫為催化劑、引發賴氨酸發生開的開環聚合，得到產物a；其中乙二胺與賴氧酸的摩爾比為1:20；

將產物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進一步提純，得到產物b；

將產物b溶于50ml二氯甲烷中，以氯化鋅為催化劑、引發丙交酯發生開環聚合，并提純產物，得到兩親性多臂星形聚合物-n-(dphal-plga)2-，其中產物b與丙交酯的摩爾比為1:20。

將納米材料1g羥基磷灰石納米顆粒(粒徑為50nm)溶于超純水中超聲，然后加入50ml氨水及80-100g氨丙基三乙氧基硅烷進行硅基化修飾，分離得到產物c，將產物c用賴氨酸進行包被，得到產物d。

取產物d、兩親性多臂星形聚合物-n-(dphal-plga)2-，加入過量的n-羥基琥珀酰亞胺進行端基修飾反應，得到自由基捕獲劑。

本實施例還提供一種真空采血管，其裝載有本實施例制備的穩定劑。

實施例2

本實施例提供一種液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑，以重量份計，該穩定劑包括35mg的石墨烯納米抗菌材料20mg的特丁基對苯二酚、35mg的二乙胺四乙酸二鉀、10mg的二硫蘇糖醇、5mg的細胞凋亡抑制劑q-vd-oph、25mg的自由基捕獲劑和5mg的氨基葡萄糖鹽酸鹽，通過改變ph穩定劑檸檬酸的含量，使穩定劑最終ph值在4-5之間。

本實施例的穩定劑中，所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：利用水熱法培養石墨烯納米材料，并將1g石墨烯納米材料溶于50ml超純水中并超聲分散，得到到分散液；然后向分散液中加入20-50g十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化銨超聲震蕩48小時、水浴5小、攪拌反應10小時、過濾洗滌、干燥得到石墨烯納米抗菌材料。

本實施例的穩定劑中，所述自由基捕獲劑的制備方法為：

以二乙烯三胺作為引發劑，溶解到50ml二氯甲烷溶液中、在酸性條件下引發乙烯亞胺的聚合開環反應，得到產物a，其中，二乙烯三胺與乙烯亞胺的摩爾比為1:3；

將產物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進一步提純，得到產物b；

將產物b溶于50ml二氯甲烷中，加入辛酸亞錫作為催發劑、引發己內酯的聚合開環反應，并提純產物，得到兩親性多臂星形聚合物-n-(pei-pcl)6-，其中，產物b與己內酯摩爾比為1:60。

將2g納米金材料(粒徑為100nm)溶于超純水中超聲，然后加入50ml氨水及35g硅化劑進行硅基化修飾，分離得到產物c，將產物c用10g賴氨酸進行包被，得到產物d；

取產物d、兩親性多臂星形聚合物-n-(pei-pcl)6-，加入過量的n-羥基琥珀酰亞胺進行端基修飾反應，得到自由基捕獲劑。

本實施例還提供一種真空采血管，其裝載有本實施例制備的穩定劑。

實施例3

本實施例提供一種液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑，以重量份計，該穩定劑包括25mg的防腐劑(由利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯所組成的組合物，其中：利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯質量比為1:5:2:5)、25mg的2,3,6,7,10,11-六羥基三苯、25mg的二乙胺四乙酸二鉀、15mg的亞硫酸氫鈉、10mg的細胞凋亡抑制劑q-vd-oph、25mg的自由基捕獲劑和5mg的氨基葡萄糖鹽酸鹽，通過改變ph穩定劑檸檬酸的含量，使穩定劑最終ph值在4-5之間。

本實施例的穩定劑中，所述自由基捕獲劑的制備方法為：

以乙二胺作為引發劑，溶解到50ml二氯甲烷溶液中、以辛酸亞錫為催化劑、引發谷氨酸的聚合開環反應，得到產物a，其中，乙二胺與谷氨酸的摩爾比為1:10；

將產物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進一步提純，得到產物b；

將產物b溶于50ml二氯甲烷中，加入辛酸亞錫作為催發劑、引發己內酯的聚合開環反應，并提純產物，得到兩親性多臂星形聚合物-n-(pga-pcl)2-，其中，產物b與己內酯摩爾比為1:60。

將2g納米材料中孔硅納米顆粒(粒徑為50nm)溶于超純水中超聲，然后加入50ml氨水及35g硅化劑進行硅基化修飾，分離得到產物c，將產物c用10g異亮氨酸進行包被，得到產物d；

取產物d、兩親性多臂星形聚合物-n-(pga-pcl)2-，加入過量的n-羥基琥珀酰亞胺進行端基修飾反應，得到自由基捕獲劑。

本實施例還提供一種真空采血管，其裝載有本實施例制備的穩定劑。

實施例4游離核酸快速分離實驗

本實施例1的采血管除了利用的雙離心體系之外，還可利用單離心體系進行快速分離，操作更加便捷。通過收集分為3組樣品即為一組單離心體系(即，1600×g為15分鐘)和兩組雙離心體系(即，300×g為20分鐘隨后由5000×10分鐘或1600×g為10分鐘，其次為16000×g10分鐘)，分別并利用本實施例1采血管采取并保存血液樣品在25度溫度下靜置保存0天，7天和14天。并提取游離dna。并利用ddpcr測定β-actin的拷貝數，其結果如圖1所示，其結果證明快速分離法與二步分離法沒有明顯的差別。因此本實施例提供的采血管利用單離心體系進行快速分離，相比二步分離法操作更加便捷。

實施例5胎兒游離dna(cell-freefetaldna,cffdna)的存儲和運輸對比試驗

對22名經羊水穿刺診斷表明其具有胎兒y染色體異常的孕婦志愿者進行采血取樣，每名孕婦采取20ml血樣，分別用二支5ml普通k2edta抗凝管及二支本實施例1的采血管進行取樣。將各組第一支血樣立即處理，將第二血進行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封。將二組樣品均放置于搖床上，置于室溫條件下，其轉速為100轉/分鐘，放置7天，用以模擬血樣的運輸過程。使用兩步法進行樣品的分離并利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，進而利用rochelightcycler480對β-actin及sry進行擴增，用以測定其cfdna及cffdna的濃度，其結果如圖2所示。

由圖2實驗結果可知：本實施例通過實時熒光pcr擴增β-actin基因片段來表征cfdna濃度，并通過擴增sry基因片段用來表征cffdna。如圖2所示，在加入大量的干冰的情況下k2edta抗凝管中的sry濃度經過7天運輸，其中位數為25.9copys/ml(p＜0.01)；在不加干冰的情況下，本采血管可以穩定胎兒游離dna其濃度為33.4copys/ml。此外，我們還可明顯的觀察到，在采用k2edta抗凝管運輸的過程中，血液中總游離核酸含量產生了明顯的增加，這是由于其血液發生了溶血現象，引起血細胞破裂，導致其含量上升。而經本采血管保存的血樣沒有發生上述問題，說明本采血管中的穩定劑能夠有效保存胎兒游離核酸。

用相同的方法對18名志愿者進行采血取樣，每名孕婦采取20ml血樣，分別用二支5ml普通k2edta抗凝管及二支本實施例采血管進行取樣。將各組第一支血樣立即處理，將第二血進行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰密封，將二組樣品均放置于35℃條件下3天。利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，并利用rochelightcycler480對β-actin及sry進行擴增，用以測定其cfdna及cffdna的濃度，其結果如圖3所示。

由圖3實驗結果可知：在室溫高于30℃的情況下，樣品中的sry濃度經過沒有明顯的變化。然而，在采用k2edta抗凝管保存的過程中，血液中總游離核酸含量產生了明顯的增加，血液發生了較為明顯的溶血現象。

實施例6循環腫瘤dna(ctdna)突變檢測對比試驗

血漿基因分型在臨床測試中具有不可估量的應用潛力，這種癌癥常規基因標志的快速與無創篩查可以避免傳統侵入性的活組織檢查。與癌征相關的液體活檢測應用的關鍵是保證所采取的血樣中的游離脫氧核糖核酸(cfdna)、循環腫瘤dna(ctdna)及野生型基因組的完整性，但很多細胞穩定劑中含有可引起游離dna交聯性損傷，在使用pcr擴增檢測時會導致野生型dna突變率的增加，針對這一現象本案例對本產品在突變率及野生型基因組的完整性的應用進行詳細的評估。

抽取30個健康志愿者的靜脈血保存分別保存至普通k2edta抗凝管、本實施例1采血管并加入一定量的突變核酸片段有以模擬典型癌征病人的血液特征。將所采集的樣品進行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封、靜置保存；對本采血管采取到的血液不做作任何特殊處理，直接放入搖床中，其轉速為100轉/分鐘，用以模型運輸過對血樣造成的影響。所有樣品均置于室溫條件下。采用二步離心法進行離心，利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，k2edta抗凝管利用beaming技術檢測技術，檢測其k2edta抗凝管2h以及本采血管中的血樣在2h、3d、5d及7d的血樣中游離核酸變異情況，檢測結果如圖4所示。

由圖4實驗結果可知：本采血管在采集的過程中對血液中的核酸分布情況沒有影響，與傳統的采集方法相比，經統計學分析表明本方法與標準方法所采到的血液樣品沒有顯著差別(見圖4第一組及第二組數據)。另外本采血管可以用于常溫運輸與保存血液中循環腫瘤核酸樣品，其模擬血樣在2h、3d、5d及7d的血樣中循環腫瘤核酸均未發現變異情況。這說明本采血管中的穩定劑具有穩定血液細胞，防止cfdna交聯性損傷，保證野生型基因的完整性作用。

為了進一步驗證上述結論，我們進一步抽取1名患有直腸癌患者的靜脈血10ml，分別用二支5ml本采血管進行取樣，并做如下處理：將其中一個樣本室溫下靜置保存2h；另一個樣品直接放入搖床中，其轉速為100轉/分鐘，運行5天，用以模型運輸過對血樣造成的影響。，采用二步法進行樣品的分離，并利用qiamp試劑盒提取樣品中的ctdna，利用beaming技術分析自愿者血樣中游離核酸的突變率，檢測結果如圖5所示。

由圖5實驗結果可知：直腸癌患者血液中的ctdna在2h和3d內突變率未見明顯增加，由些可見，本采血管中穩定劑可保存循環腫瘤dna的完整性，可以運用于癌癥的診斷。

實施例7癌癥患者血樣的常溫保存對比實驗

循環腫瘤dna(ctdna)被越來越多地用于生物醫學和臨床研究遺傳試驗標記物。然而，血液收集引起的血細胞破裂，會導致污染的血漿中的dna的增加，進而影響ctdna的分析與診斷。本申請提供的穩定劑可以防止血細胞破裂達數周之久，并擁有保存循環腫瘤dna的能力，便于血液采集及分析樣品制備，提高結果的準確度。

本實施方法選取經診斷患有乳腺癌并且均發現pik3ca基因突變的志愿者6名，每名病人收集4支血樣各5ml，分別用二支普通k2edta抗凝管及二支本申請實施例1的采血管進行取樣及保存。將各組第一支血樣立即處理，將第二血進行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封。將二組樣品均放置于搖床上，置于室溫條件下，其轉速為100轉/分鐘，放置7天，用以模擬血樣的運輸過程。使用兩步法進行樣品的分離并利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，進而利用ddpcr對e545k及h1047r位點進行檢測進而對pik3ca基因突變進行識別以及對其野生型等位基因進行別識，其結果如下表1所示。

表1

由表1實驗結果可知，通過對比野生型pik3ca基因和檢測兩pik3ca基因的二個突變位點，研究發現，儲存在本申請采血管中的血樣7天沒有發現明顯的細胞破解現象，而保存在抗凝管中的基因組基因的量明顯增加，說明大量的血細胞發生破裂。由于可見，本申請采血管中的穩定劑能夠防止細胞裂解及其血液基因組dna的釋放，實現癌癥患者的血樣的常溫保存。

實施例8游離核糖核酸(cfrna)的保存

本實施方法選取身體健康的志愿者8名，每名志愿者收集8支血樣各5ml，分別用4支普通k2edta抗凝管及4支實施例1采血管進行取樣及保存。將各組其中一支血樣立即處理，將第余下血樣進行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封。將二組樣品均放置于搖床上，置于室溫條件下，其轉速為100轉/分鐘，分別放置1天、3天、7天，用以模擬血樣的運輸過程。使用兩步法進行樣品的分離并利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸。將提取到的rna采用rt-qpcr檢測18srrna，其上下游引物序列分別為：

上游引物(如seqidno：1所示)5’-cgaatgtctgccctatcaac-3’；

下游引物(如seqidno：2所示)5’-gtttctcaggcccctctcc-3’。

其結果如下表2所示。

表2

由上表2實驗數據可知，本發明采血管中穩定劑可以在長達7天的時間里穩定血液中的cfrna，而在相同的條件下，即使加入的大量的干冰，k2edta抗凝管也無法順利保存及穩定血液中的cfrna。

綜上所述，本發明提供的液體活檢血液中循環腫瘤核酸和細胞的穩定劑及其采血管，能夠運用一步法進行相關樣品的快速分離，能夠有效保存胎兒游離核酸，防止循環腫瘤核酸交聯性損傷并保證野生型基因的完整性，防止細胞裂解及其血液基因組核酸的釋放，實現癌癥患者的血樣中的循環腫瘤細胞、淋巴細胞以及循環腫瘤核酸的常溫保存與運輸。

序列表

<110>云南仁橋醫療科技有限公司

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