本發明屬于植物種子保存及萌發技術領域，具體地，涉及一種促進低溫(-18℃至-20℃)保存后尼泊爾野桐種子萌發的方法。
背景技術：
尼泊爾野桐(mallotusnepalensismüll.arg.)是大戟科(euphorbiaceae)野桐屬(mallotuslour.)落葉灌木或小喬木樹種。分布于西藏云南海拔1700到2500米的山坡或溝谷中，國外主要分布在不丹、印度東北、緬甸及尼泊爾，國內研究報道較少，國外有報道其提取物具有溫和抑制中樞神經的作用。未見尼泊爾野桐種子儲藏方面的研究報道。
將正常型種子干燥后低溫(-18℃至-20℃)保藏可以極大的延長其壽命，這在國際上已經形成共識，并且基于這一理論建立了多個農作物及野生植物種子庫；但一些植物的種子在干燥和/或冷藏后萌發特性會發生變化，如本發明所涉及的尼泊爾野桐種子，低溫(-18℃至-20℃)保存一段時間后則幾乎完全不能萌發。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術中在低溫(-18℃至-20℃)保存一段時間后的尼泊爾野桐種子幾乎完全不能萌發的技術難題，提供一種簡便高效萌發低溫保存后尼泊爾野桐種子的方法。為實現該物種的長期有效保存及利用提供技術支持。
為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：
一種促進低溫保存后尼泊爾野桐種子萌發的方法，包括如下步驟：
(1)將在-18℃至-20℃冷藏保存后的種子連同其密閉容器取出，在溫度為15℃、相對濕度15％的環境中放置24小時回溫；
(2)將回溫后的種子從密閉容器中取出，放置在溫度為45℃-55℃的培養箱中，熱處理6小時后取出；
(3)將步驟(2)處理后的種子放置在室溫下，待種子溫度恢復到室溫后播種于含200毫克/升赤霉素的1％瓊脂培養基中，放置于20℃下萌發，光照強度為1000勒克斯，光周期為12小時光照/12小時黑暗。
根據所述的一種促進低溫保存后尼泊爾野桐種子萌發的方法，其中所述步驟(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的種子是采集成熟飽滿的種子，先將種子置于溫度為15℃、相對濕度15％的環境中直到種子的平衡相對濕度達到15％(此時種子的含水量通常低于10％)，然后再將種子放入密閉容器中，保存于-18℃至-20℃。
本發明為一種促進低溫保存后尼泊爾野桐種子萌發的方法，更具體的步驟是：
采集成熟飽滿的種子，將種子置于溫度為15℃、相對濕度15％的環境中，至種子的平衡相對濕度達到15％時，將種子放入密閉容器，保存于-18℃至-20℃中，以上為國際通用的正常型種子保存方法。種子保存一段時間后，根據需要，將裝有種子的密閉容器取出，在溫度為15℃、相對濕度15％的環境中放置24小時回溫；隨后將種子從容器中取出，放置在培養箱溫度為45℃-55℃的培養箱中，熱處理6小時后取出，待種子溫度恢復到室溫后播種于含200毫克/升赤霉素的1％瓊脂培養基上，將培養基放置于20℃下萌發，光照強度為1000勒克斯，光周期為12小時光照/12小時黑暗。
具體實施方式
下面用本發明實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本發明。
實施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2014年10月，安徽黃山徽州區富溪鄉新田村采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1步驟采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2015年9月14日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏處理1年后將裝有種子的密閉容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中24小時回溫后打開裝有種子的容器，隨機取出實驗所需種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和熱處理組；熱處理溫度設置45、55和60℃三個梯度，時間設置6個小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養箱，培養箱溫度設定為45、55和60℃。處理6小時后每個溫度隨機取出60粒種子用于萌發實驗。
1.2.4萌發：將熱處理后的種子取出，放置在室溫下，待種子溫度恢復到室溫后將種子播種于含有200毫克每升赤霉素的1％瓊脂培養基上，將培養基裝入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培養箱中，光照強度為1000勒克斯，光周期為12小時光照/12小時黑暗。每間隔2-3天檢查一次萌發，胚根伸長超過5mm即認為種子萌發，將萌發種子取出，并記錄萌發數量；實驗開始4周后連續2周無萌發即結束實驗。
1.2.5數據分析：利用spss16.0軟件對萌發數據進行分析，采用one-wayanova進行方差分析，并用s-n-k法對不同溫度處理的萌發率做多重比較。
2.結果
2.1不同溫度熱處理對采自安徽黃山冷藏后的尼泊爾野桐種子萌發的影響：
表1不同溫度熱處理對冷藏后安徽黃山尼泊爾野桐種子萌發率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤,不同字母表示不同處理間的萌發率具有顯著差異
由表1可以看出，-20℃下冷藏1年后未經熱處理的種子均完全沒有萌發，45℃處理6小時后萌發率達到28.3％，55℃和60℃處理6小時后萌發率均為35％；45、55及60℃處理之間無顯著差異。綜合考慮能耗與效果，在下面的實施例2中，將采用45-55℃處理6小時的方法。
實施例2：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2012年9月4日云南省文山州文山縣采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2013年8月6日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏3年2個月后將裝有種子的容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中24小時回溫后打開裝有種子的容器，隨機取出實驗所需種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和熱處理組；熱處理溫度設置45和55℃二個梯度，處理時間均為6小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養箱，培養箱溫度設定為45和55℃。處理6小時后取出60粒種子用于萌發實驗。
1.2.4萌發：將熱處理后的種子取出，放置在室溫下，待種子溫度恢復到室溫后將種子播種于含有200毫克每升赤霉素的1％瓊脂培養基上，將培養基裝入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培養箱中，光照強度為1000勒克斯，光周期為12小時光照/12小時黑暗。每間隔2-3天檢查一次萌發，胚根伸長超過5mm即認為種子萌發，將萌發種子取出，并記錄萌發數量；實驗開始4周后連續2周無萌發即結束實驗。
1.2.6數據分析：利用spss16.0軟件對萌發數據進行分析，采用one-wayanova進行方差分析，并用s-n-k法對不同處理的萌發率做多重比較。
2.結果
2.1不同溫度熱處理對采自云南文山冷藏后尼泊爾野桐種子萌發的影響。
表2不同溫度熱處理對冷藏后云南文山尼泊爾野桐種子萌發率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的萌發率具有顯著差異
由表2可以看出，-20℃下冷藏3年2個月的尼泊爾野桐種子，未經熱處理的萌發率為0；經45℃熱處理后，萌發率提高到6.7％，但是未達到有顯著差異的水平，55攝氏度處理后萌發率為20％，與對照及45℃處理的均有顯著差異。該份種子與實施例1中的種子在45℃熱處理的效果略有不同，55℃的效果類似，可能與這兩份種子產地不同有關。
3、本發明的積極效果如下：
與現有技術相比，本發明顯著提高了不同產地(安徽及云南)，干燥后低溫(-18℃至-20℃)下儲存不同時間(1年及3年2個月)的尼泊爾野桐種子的萌發。較好的解決了尼泊爾野桐種子低溫保藏后不能萌發的問題。且處理方法簡便易行，根據產地不同45℃的效果有所不同，但55℃均有顯著效果，而且無任何危險性及毒副作用。