本發明屬于植物種質資源保存技術領域，具體地，涉及一種提高低溫(-18℃至-20℃)保存后白楸種子胚乳活力的方法。
背景技術：
白楸(mallotuspaniculatus(lam.)muell.arg.)是大戟科(euphorbiaceae)野桐屬(mallotuslour.)灌木或喬木樹種。主要分布于云南、貴州、廣西、廣東、海南、福建和臺灣等省。以根入藥，味微苦、澀，性平，具有消熱利濕、止痛、解毒等功效，廣西民間常用于治療痢疾、子宮脫垂、中耳炎等；其樹皮纖維可制麻繩和麻布袋，從果實提煉出來的油則可作工業用途。目前未見其種子萌發方面及種子儲藏特性方面的報道。
將正常型種子干燥后低溫(-18℃至-20℃)保藏可以極大的延長其壽命，這在國際上已經形成共識，并且基于這一理論建立了多個農作物及野生植物種子庫；但一些植物的種子在冷藏后胚乳的活力會發生變化，而胚乳也是一種重要的種質資源，并且是天然的三倍體育種材料。因此提高及改善低溫冷藏后種子胚乳的活力對于長期高效保存及合理利用植物種質資源有著重要的意義。
目前對種子進行活力檢測的方法主要有萌發及氯化三苯基四氮唑(ttc)染色法(也叫tz染色法)。在保存實踐中本發明發現冷藏后白楸種子幾乎不能萌發，對其進行ttc染色后發現，胚可以被染成紅色，而胚乳不能染色；參考該屬另外幾種植物(如白背葉、尼泊爾野桐)種子的情況，本發明判斷可能是由于胚乳在冷藏過程中發生某種變化而導致的活力下降，進而影響種子的整體活力及萌發率；為此發明了本發明的方法，用以提高胚乳的活力。胚乳活力的評價辦法以ttc染色為主，輔以種子萌發率為參考，以保證實驗結果的嚴謹性及可信度。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術中在低溫(-18℃至-20℃)保存一段時間后的白楸種子胚乳活力大幅下降甚至幾乎完全喪失的技術難題，提供一種簡便高效提高低溫保存后白楸種子胚乳活力的方法。為實現該物種的長期有效保存，特別是胚乳這種天然的三倍體種質資源的長期有效保存及高效利用提供技術支持。
為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：
一種提高低溫保存后白楸種子胚乳活力的方法，包括如下步驟：
(1)將在-18℃至-20℃冷藏保存后的種子連同其密閉容器取出，在溫度為15℃、相對濕度15％的環境中放置24小時回溫；
(2)將回溫后的種子從密閉容器中取出，放置在溫度為60℃的培養箱中，熱處理6小時后取出；
(3)將步驟(2)處理后的種子取出，待種子溫度恢復到室溫后放置于1％的瓊脂培養基上，放置于20℃培養間24小時；
(4)將上述步驟(3)處理后的種子切破種皮及胚乳；
(5)將上述步驟(4)處理后的種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時；
(6)將上述步驟(5)處理后的種子切開觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
根據所述的一種提高低溫保存后白楸種子胚乳活力的方法，其中所述步驟(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的種子是采集成熟飽滿的種子，先將種子置于溫度為15℃、相對濕度15％的環境中直到種子的平衡相對濕度達到15％(此時種子的含水量通常低于10％)，然后再將種子放入密閉容器中，保存于-18℃至-20℃。
本發明為一種提高低溫保存后白楸種子胚乳活力的方法，更具體的步驟是：
采集成熟飽滿的種子，將種子置于溫度為15℃、相對濕度15％的環境中，至種子的平衡相對濕度達到15％時，將種子放入密閉容器，保存于-18℃至-20℃中，以上為國際通用的正常型種子保存方法。種子保存一段時間后，將裝有種子的密閉容器取出，在溫度為15℃、相對濕度15％的環境中；隨后將種子從容器中取出，放置在溫度為60℃的培養箱中，熱處理6小時后取出，待種子溫度恢復到室溫后放置于1％的瓊脂培養基上，放置于20℃培養間24小時；處理后的種子切破種皮及胚乳，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時；取出種子切開觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
具體實施方式
下面用本發明實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本發明。
實施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2014年1月，云南省普洱市思茅區大開河村采集成熟的新鮮白楸(mallotuspaniculatus)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1步驟采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2014年12月3日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏處理2年2個月后將裝有種子的密閉容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中回溫24小時后打開裝有種子的容器，隨機取出實驗所需種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和冷藏后熱處理組；熱處理溫度設置為45、60及70℃，時間為6個小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養箱，培養箱溫度設定為45、60及70℃。處理6小時后隨機取出60粒種子用于檢測胚乳活力。同時隨機取出60粒做萌發實驗，以萌發率佐證熱處理對胚乳活力的影響。
1.2.4ttc染色：待熱處理后的種子溫度恢復到室溫，將種子放置于1％的瓊脂培養基上，放置于20℃培養間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，并將種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時，染色完成后取出種子，用吸水紙吸干表面殘余溶液，將種子切開，觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.5萌發：對對照組及冷藏后熱處理的種子進行萌發實驗，以佐證胚乳活力變化。將種子播種于含有200毫克每升赤霉素的1％瓊脂培養基上，將培養基裝入透明自封袋中防止水分散失，然后置于20℃的光照培養箱中，光照強度為1000勒克斯，光周期為12小時光照/12小時黑暗。每間隔2-3天檢查一次萌發，胚根伸長超過5mm即認為種子萌發，將萌發種子取出，并記錄萌發數量；實驗開始4周后連續2周無萌發即結束實驗。
1.2.6數據分析：利用spss16.0軟件對胚乳染色比例數據進行分析，采用one-wayanova進行方差分析，并用s-n-k法對不同處理時間的染色比例做多重比較。
2.結果
2.1熱處理方法對采自云南普洱冷藏后的白楸種子胚乳活力的影響：
表1不同溫度熱處理對冷藏后普洱白楸種子胚乳染色率(％)及種子萌發率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的萌發率具有顯著差異
由表1可以看出，-20℃下冷藏2年2個月后未經熱處理的種子胚乳染色率為0，對應的種子萌發率為0；45℃處理6小時后胚乳染色率仍舊沒有得到提高，萌發率依舊為0；隨著溫度的上升到60℃，胚乳活力顯著上升，染色率達到65.0％，同時萌發率也上升到26.7％；70℃與60℃相比胚乳活力有顯著下降，萌發率也下降為0。
綜合考慮效果及能耗，我們認為60℃處理6小時可以有效的提高胚乳活力，并在以下實施例2中采用60℃處理6小時的方法。
實施例2：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2007年12月7日云南省文山州麻栗坡縣南溫河鎮八宋村采集成熟的新鮮白楸(mallotuspaniculatus)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2009年9月22日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏7年5個月后將裝有種子的容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中回溫24小時后打開裝有種子的容器，隨機取出實驗所需種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和熱處理組；熱處理溫度設置60℃，處理6小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養箱，培養箱溫度設定為60℃。處理6小時后取出60粒種子用于ttc染色實驗。
1.2.4ttc染色：待熱處理后的種子溫度恢復到室溫，將種子放置于1％的瓊脂培養基上，放置于20℃培養間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，并將種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時，染色完成后取出種子，用吸水紙吸干表面殘余溶液，將種子切開，觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.6數據分析：利用spss16.0軟件對胚乳染色率數據進行分析，采用paired-samplesttest進行方差分析。
2.結果
2.1熱處理方法對云南文山冷藏后白楸種子胚乳活力的影響。
表2熱處理對冷藏后云南文山白楸種子胚乳染色率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的萌發率具有顯著差異
由表2可以看出，-20℃下冷藏7年5個月的白楸種子，未經熱處理的種子胚乳染色率為0；經60℃熱處理后，胚乳染色率提高到33.3％，說明熱處理有效提高的-20℃冷藏后的種子胚乳活力。
3、本發明的積極效果如下：
與現有技術相比，本發明顯著提高了不同產地(云南普洱及文山)，干燥后低溫(-18℃至-20℃)下儲存不同時間(2年及7年5個月)的白楸種子胚乳的活力。較好的解決了白楸種子低溫保藏后胚乳活力降低的問題。且處理方法簡便易行，60℃處理6個小時即有顯著效果，而且無任何危險性及毒副作用。本發明有利于實現該物種在種子庫條件下的長期保存，且對于胚乳這一天然三倍體種質資源的長期有效保存和合理利用提供了技術支持。