專利名稱：編碼類黃酮途徑酶的遺傳序列及其應用的制作方法
總的來說，本發明涉及編碼類黃酮途徑代謝酶的遺傳序列及其應用。例如用于控制植物和其他有機體的著色作用。
花卉工業的目標就是致力于培育出新的不同的顯花植物品種。產生這種新品種的有效方法是通過對花卉顏色的控制，曾使用過傳統的培育技術成功地使大部分商業花卉品種顯示出各種各樣的顏色。但是，這種技術受到某種特定種屬基因庫的限制，鑒于此原因，對于一個花卉品種很少有全色譜的花色種類。的確，由于蘭色花卉來源有限，在荷蘭1988年通過拍賣系統出售的切花不到百分之五是蘭色花。在十二種銷路最好的花卉中，只有鳶尾和小蒼蘭屬提供蘭色品種，并且這些品種占整個花卉銷售量的不到百分之四。培育主要切花種屬例如玫瑰，菊花，荷蘭石竹和非洲菊的蘭色品種，將為切花和裝飾市場開拓廣闊前景。
花的顏色主要取決于兩種類型的色素類黃酮和類胡蘿卜素。類黃酮可產生從黃到紅到蘭范圍內的顏色。類胡蘿卜素帶來橘黃或黃色，并且通常是黃色或橘黃色花卉中的唯一色素。在花卉顏色中起主要作用的類黃酮分子是花色素苷，這種物質是花青素，翠雀素，3′-甲花翠素，芍藥色素，錦葵色素和天竺葵色素的糖基化衍生物，并且位于液泡中。不同的花色素苷可以帶來明顯不同的顏色。花卉的顏色還會受到與無色類黃酮的共同色素沉著。金屬絡合作用，糖基化，酰化，甲基化及液泡pH的影響(Forkmann，1991)。
已經完善地建立了類黃酮色素的生物合成途徑(以后稱之為“類黃酮”途徑)，如
圖1所示(Ebel和Hahlbrock，1988;Hahlbrock和Grisebach，1979，WieringanddeVlaming，1984;Schrametal，1984;Stafford，1990)。該途徑中第一個指定的步驟包括三分子的丙二酰基輔酶A與一分子的對一香豆酰CoA的縮合反應。該反應受苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)的催化。此反應的產物，2′，4，4′，6′-四羥苯基苯乙烯酮，通常很快被苯基苯乙烯酮黃烷酮異構酶(CHI)異構化而產生柚配質，柚配質接著被黃烷酮3-羥化酶(F3H)在中心環的3位上羥基化而產生二氫莰非醇(DHK)。
二氫莰非醇的B環可以在3′或同時在3′和5′位被羥基化而分別產生二氫五羥黃酮(DHQ)和二氫楊梅黃酮(DHM)。在此途徑中的兩個關鍵性酶是類黃酮3′-羥化酶(以后稱之為3′-羥化酶)和類黃酮3′，5′-羥化酶(以后稱之為3′，5′-羥化酶)。3′-羥化酶作用于DHK產生DHQ，并且作用于柚配質產生圣草酚。3′，5′-羥化酶是一種廣譜酶，可以催化柚配質和DHK的3′和5′位的羥基化，以及圣草酚和DHQ的5′位羥基化(StotzandForkmann，1982)，在這兩種情況分別產生五羥黃烷酮和DHM。B環的羥基化方式在決定花瓣顏色方面起著重要作用。
在微粒體提取物中類黃酮的3′-羥基化需要NADPH和氧氣以及柚配質或DHK的糖苷配基。已對縐葉歐芹細胞培養物酶進行細致的研究(Hagmann et al.，1983)。由于它受一氧化碳，細胞色素C和NADP+的抑制，說明這種酶是一種細胞色素P450-依賴性酶。在玉米中也證實了這種相似的酶活性(Larson and Bussard，1986)。3′，5′-羥化酶也是細胞色素P450類的酶。細胞色素P450酶廣泛存在于自然界中，并且已在脊椎動物，昆蟲，酵母，真菌，細菌和一種植物中進行表征。已經確定了至少154種細胞色素P450基因的序列，這些基因歸屬于27個不同的基因族(Nebertetal，1991)。在一個族內，P450蛋白序列的一致性一般大于40%，而在相同的亞族中序列的一致性大于46%(Nebertetal，1991)。有關植物細胞色素P450的資料是有限的。
對植物中與類黃酮途徑有關的3′或3′，5′-羥化酶活性或其他酶的控制，提供了一種控制花瓣顏色的方法，從而使單一品種表現出廣譜的花色。根據本發明，已經識別和克隆了編碼類黃酮途徑酶如3′，5′-羥化酶的遺傳序列。這些重組序列可以允許對DHK代謝進行調節，以及調節其他底物如DHQ柚配質和圣草酚的代謝，從而確定花色素苷的羥化方式，以提供一種控制花瓣顏色的手段。但是，本發明可以從花卉延伸到水果、蔬菜植物以及例如裝飾植物的葉子。
因此，本發明的一方面提供了一種核酸分離物，包括一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或其部分分子的編碼序列或它的互補序列。
為了方便，而且只是為了用于縮寫表示，這里所說的“DHK羥化酶”包括作用于一種或幾種下列物質DHK，DHQ，柚配質，圣草酚的類黃酮途徑羥化酶。
優選的DHK羥化酶是3′，5′-羥化酶。但是，用于克隆編碼這種酶的遺傳序列的方法，也可以用于分離編碼如3′-羥化酶的其他遺傳序列。因此，本文所指的3′，5′-羥化酶的分離和克隆應當包括其他的類黃酮羥化酶如3′-羥化酶。
術語“核酸分離物”是指處于非自然存在狀態的遺傳序列。一般地說，這是指從其自然狀態分離出，或通過在其自然環境中不必使用的方法而形成。更具體地說，它包括體外形成或保存的核酸分子，重組或合成分子，和異源核酸結合的核酸。它也可以延伸到與其他核酸序列相關的至少部分純化之后的自然存在的序列。
本文所說“遺傳序列”是指直接對DHK羥化酶，如，3′，5′-羥化酶的一個氨基酸序列進行編碼或通過堿基互補序列進行編碼的核苷酸堿基連續序列。這種核酸或其互補形式可以編碼全長度的酶，或其衍生物，或其一部分。“衍生物”是指相對于自然存在的酶而言的任何單一或多個氨基酸的取代、缺失、和/或插入。鑒于此，該核酸包括編碼3′，5′-羥化酶的自然產生的核苷酸序列或包含有相對于所說自然產生的序列而言的一個或多個核苷酸的取代、缺失和/或插入。本文所指的核酸序列還包括寡聚核苷酸，它可用作基因探針，或者用作能夠調節植物內相應基因表達的“反意”分子。因此，當核酸或其互補形式編碼3′，5′-羥化酶的一部分時，這種核酸分子可以用作寡聚核苷酸探針、聚合物酶鏈反應或各種誘變技術中的引物。
本發明中DHK羥化酶尤其是3′，5′-羥化酶的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基的末端融合以及序列內插入一個或多個氨基酸。插入性氨基酸序列變異是指向蛋白質的預定位點導入一個或多個氨基酸殘基，當然通過合適地篩選所得產物也可以進行隨意插入。缺失變異特征是從序列中去除掉一個或多個氨基酸。取代氨基酸變異是指序列中至少去掉了一個殘基并且在該位點插入一個不同的殘基。典型的取代是根據下表1進行的取代
表1用于氨基酸取代的合適殘基原始殘基典型取代AlaSerArgLysAsnGln;HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn;GlnIleLeu;ValLeuIle;ValLysArg;Gln;GluMetLeu;IlePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheValIle;Leu如果3′，5′-羥化酶發生氨基酸取代，其氨基酸一般用具有類似特性的其他氨基酸取代，如類似的疏水性、親水性、電負性、大側鏈等等。典型的氨基酸取代是一個殘基的取代。氨基酸插入通常是按照大約1-10個氨基酸殘基的次序插入，而缺失大約是1-20個殘基。優選的缺失或插入是以相鄰的成對進行，也就是缺失兩個殘基或插入兩個殘基。
可以利用本領域中公知的肽合成技術，如固相肽合成(Merrifield，1964)及其類似方法，或通過重組DNA操作法而容易地制備上述氨基酸變異體。在具有已知或部分已知序列的DNA預定位點進行取代突變的技術是公知的，它包括如，M13誘變。通過對DNA序列進行操作產生表現為取代、插入或缺失變異的變異蛋白，在如Sambrooketal(1989)的著作中有詳細描述。
本發明中3′，5′-羥化酶的其他代表性重組或合成突變體和衍生物包括取代、缺失和/或加上一個或多個與該酶相關的分子如糖類、脂類和/或蛋白或多肽。
術語“類似物”和“衍生物”也可延伸到3′，5′-羥化酶的任何功能性化學等同物，并也可延伸到上述的任何氨基酸衍生物。
本發明的核酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，單股或雙股和線性或共價相連的環狀分子。優選的核酸分子是cDNA。本發明也可延伸到其他的核酸分子，這些分子能在低等，優選中等，最好是在高度嚴格條件下與本發明所指的核酸分子雜交。用另一種術語表達則是，本發明延伸至具有圖9或10中的某一核苷酸序列的核酸分子，或者延伸到在核苷酸或氨基酸序列水，上具有至少33%，較好是至少45%，優選至少55%，更優選是至少65-70%，甚至最好是大于85%的相似性的一種分子，而且其中該核酸編碼或互補于編碼具有3′，5′-羥化酶活性的酶的序列。但是，應當注意的是核苷酸或氨基酸序列可以具有低于上述給定的百分率的相似性，并且仍能編碼DHK羥化酶，這種分子由于保留同源區仍然被認為屬于本發明的范圍之內。本發明還延伸到寡聚核苷酸引物形式的核酸分子，這種引物能夠在低等，優選中等，最好是高度嚴格條件下與上述的部分核酸分子進行雜交。
這里所說的核酸分子可以單獨存在，或者與一種載體分子最好是表達載體以結合形式存在。這種載體分子可在真核和/或原核細胞中復制和/或表達。優選地是，這種載體分子或其一部分能夠整合到植物基因組中。該核酸分子還可以含有一個能夠控制植物細胞內核酸分子表達的啟動子序列。可以通過許多的方式如通過電擊穿或土壤桿菌介導轉移(AgrobacteriumMediatedtransfer)將該核酸分子和啟動子導入到細胞中。
使用來源于牽牛花的核酸序列可以典型地實施本發明，因為它代表了迄今最方便和優選的材料來源，但是，本領域中的普通技術人員會很快地意識到可以從任何的其他來源如其他植物或某種微生物中分離相似的序列。有關金魚草，馬鞭草和矮牽牛的花以及玉米種子的糊粉層及幼苗中的3′-羥化酶遺傳學特性是已知的(HellerandForkmann，1988)。在金魚草中基因eos控制3′-羥化酶(ForkmannandStotz，1981)，而在牽牛花(Stotzetal，1985)和玉米糊粉層(LarsonandRussard，1986)中的相似酶分別由Htl和Pr控制。例如，對馬鞭草雜交種的化學遺傳學研究表明，在這種植物中花色素苷B環中3′和5′位的羥化都是由一種基因控制的(Beale，1990)。可進行3′，5′-羥化反應的酶活性只存在于能產生翠翟素的植物的花卉提取物中(StotzandForkmann，1982)。在翠菊屬(Callistephus)和山黧豆屬(Lathyrus)的花卉提取物中也表現出了在3′和5′位發生羥化反應的NADPH-依賴性微粒體酶活性(Forkmann，1991)。和馬鞭草雜交種一樣，發現使黃烷酮和二氫黃酮醇發生3′，5′-羥化反應的酶活性只存在于那些花卉中含有3′，4′，5′-羥化類黃酮化合物(或其甲基化衍生物)的植物品種的花卉提取物中。因此，3′，4′，5′-羥化類黃酮的形成顯然依賴于類黃酮3′，5′-羥化酶活性。
已經在許多裝飾植物包括翠菊(Callistephus(R))、牽牛花(Hf1，Hf2)和馬鞭草(P)中利用不能夠產生翠雀素的相應突變體識別出了編碼3′，5′-羥化酶的基團。而且，已經證實了各自的酶活性(Forkmann，1991)。這種3′，5′-羥化酶也被認為是一種微粒體細胞色素p450酶(HellerandForkmann，1988)。但是，沒有公開出版物報道從這些或其他植物種類中克隆出3′，5′-羥化酶基因。
其他能夠產生3′，4′，5′-羥化類黃酮或其衍生物的植物種類包括繡球花屬(Takeda，etal，1985)，翠雀屬(Asenetal，1975)，Lisianthus(Asenetol，1986)，西紅柿(VonWettstein-Knowles，1968)和土豆(HarborneandSimmonds，1962)。這些或其他能夠產生3′，4′，5′-羥化類黃酮的植物品種也是分離3′，5′-羥化酶基因的合適來源。不管基來源如何，所有這些直接或間接編碼類黃酮途徑酶(如，3′，5′-羥化酶)的核酸序列都屬于本發明的范圍之內。
同樣，本文所描述的基因克隆方法也可以用于從其他產生3′，4′，5′-羥化類黃酮的植物中分離3′，5′-羥化酶基因。可以用本文公開的克隆和寡聚核苷酸以相同的技術檢測、分離和克隆相似的遺傳序列，只是對實驗步驟需要進行微小的修改。所有這些小的變動都在本發明范圍之內。這些酶如3′，5′-羥化酶的其他合適來源的例子包括，但不局限于，馬鞭草，飛燕草，葡萄，鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭和茄子。
根據本發明，可以將編碼一種DHK羥化酶如3′，5′-羥化酶的核酸序列導入到一種轉基因植物中并進行表達，從而提供了一種轉化DHK和/或其他合適的底物的手段，如果它是在植物細胞內合成的，最終將轉化成花色素如翠雀素、3′-甲花翠素或錦葵色素的花色素苷衍生物。這些花色素苷的產生將帶來各種深淺不同的蘭色或近蘭色。核酸在植物內的表達可以是結構型的，誘導型的或發育中進行的。
因此，本發明的另一方面提供了一種制備能夠表達重組DHK羥化酶或其活性突變體或衍生物的轉基因植物的方法，所說的方法包括向一種合適植物的細胞中導入一種核酸分子，該分子包含有一種編碼所說DHK羥化酶的核苷酸序列，這種方法的實驗條件應當允許最終表達所說的核酸分子，從細胞中再產生一種轉基因植物并且使所說的轉基因植物生長一段時間，這種條件以能夠允許核酸的表達。
在一個優選實施方案中，本發明設計了一種產生顯示有變化的花簇特性的轉基因開花植物的方法，所說的方法包括在允許最終表達所說的核酸序列的條件下，向一種合適的植物細胞中導入本發明的核酸序列，從細胞中再產生轉基因植物，并使所說的轉基因植物生長一段時間，而且該條件足以允許將該核酸序列表達為DHK羥化酶。
優選的DHK羥化酶是3′，5′-羥化酶，是在發育中可被調節的，變化的花簇包括依據受體植物的生理狀況而產生蘭色或紅色花卉或其他濃淡的顏色。“合適的植物”是指一種能夠產生適用于3′，5′-羥化酶的底物植物，并且該植物具有合適的生理特性和產生所期望顏色而需要的基因型。這種植物可以包括但不局限玫瑰，矮牽牛花，石竹，菊花和非洲菊。在特定植物種類中最好選擇一種“高pH系”，它被定義為一種具有比平均值較高的花瓣液泡pH。重組3′，5′-羥化酶或其突變體和衍生物的來源如本文前面所述，并包括矮牽牛花、馬鞭草、飛燕草、葡萄、鳶尾、小蒼蘭、繡球花、仙客來、馬鈴薯或茄子來源的酶。
本領域中的熟練技術人員很快會意識到適用于該方法的改動方案，如增加或減少自然存在于靶植物中的酶的表達。這將會產生不同深淺濃淡的顏色如不同濃淡的蘭色或紅色。
為了降低靶酶，如3′，5′-羥化酶的活性，可以將編碼這種酶的核酸序列或其各個部分以反義方向使用。雖然目的并不是為了將本發明局限于任何特定理論，不過這種反意核酸序列有可能與自然產生的編碼該酶的全部mRNA或其部分形成一個二倍體，從而防止mRNA翻譯成活性酶。或者，也可以使用核糖酶使靶核酸序列失活。
因此，本發明延伸到一種產生能夠表達重組二氫莰非醇(DHK)羥化酶的轉基因植物的方法，或者該植物能控制某種核酸的轉錄，這種核酸基本上與可被翻譯成DHK羥化酶的全部或部分mRNA分子互補，所說的方法包括在允許最終表達所說的核酸分離物的條件下，向一種合適的植物中導入根據權利要求1或6的核酸分離物，從細胞中再產生一種轉基因植物，并使所說的轉基因植物生長一段時間，而且該條件足以允許表達該核酸分離物。在這個方案中，合適的受體植物延伸到特別是鳶尾、郁金香，百合，Lisianthus，小蒼蘭，飛燕草，檸檬，天竺葵。
因此，上述制備轉基因植物的方法延伸到將一種基因或編碼一個反意義mRNA的DNA片段或寡聚核苷酸導入到整個或一部分或某區域的編碼或互補于編碼3′，5′-羥化酶序列的一個核苷酸序列。
因此，本發明延伸到含有全部或部分本發明核酸序列，或其反義形式和/或其任何同源或相關形式的全部轉基因植物，尤其是那些表現有不同花朵特性的轉基因植物。因此，該轉基因植物含有一種穩定導入的核酸分子，該分子包含有一種編碼或互補于編碼DHK羥化酶的序列的核苷酸序列，該植物尤其是那些攜帶有上述的導入的核酸分子的高pH植物系。本發明還延伸到這些轉基因植物的種子，這些種子，尤其是如果是彩色的，可以用作植物的特有標志。
本發明的另一方面是指重組形式的DHK羥化酶，尤其是重組3′，5′-羥化酶。這種重組形式的酶將為制備一種如活性更強的酶的研究提供材料來源，而且可用于發展體外系統以生產顏料化合物。
本發明的另一方面是設計一種克隆某種核酸分子的方法，該分子包含有一種來自于植物的細胞色素p450分子或其類似分子的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列，所說的方法包括使用一種或幾種寡聚核苷酸引物，通過聚合物酶鏈反應，對來源于所說植物細胞的某種合適的核酸分子制備物中的細胞色素p450核苷酸序列或互補序列進行擴增，所說的引物具有一種來源于已知微粒體細胞色素p450分子的一種或幾種共同序列的核苷酸序列。
在相關實施例中，克隆細胞色素p450核酸分子或其互補序列的方法包括從一種合適的cDNA庫中選擇一種能夠與一種或幾種寡聚核苷酸引物雜交的克隆，所說的引物與已知細胞色素p450分子的一種或幾種共同序列相對應。
優選的一種共同序列是來源于細胞色素p450分子的血紅素結合區(hacm-bindingdomain)，更優選的是F(G，S)XGXRXCXG(其中X是任何氨基酸)或者是PCFACRRICPG。在最優選的實施方案中，所要克隆的核苷酸序列可以編碼或互補于一種編碼DHK羥化酶，尤其是3′，5′-羥化酶的序列。甚至更優選的是，該3′，5′-羥化酶如前所述，尤其是具有一種由圖9或10中描述的氨基酸序列，或基本上由圖中的核苷酸序列編碼的氨基酸或者與上述定義的酶具有類似性。
本發明將通過下面的非限制性圖表和實施例作進一步描述。
圖1(A)和(B)圖解說明類黃酮色素的生物合成途徑。該代謝途徑第一部分所涉及的酶類代表的含義如下PAL＝苯丙氨酸氨裂解酶;C4H＝肉桂酸鹽4-羥化酶;4CL＝4-coumarateCoA裂解酶;CHS＝苯基苯乙烯酮合成酶;CHI＝苯基苯乙烯酮黃烷酮異構酶;F3H＝黃烷酮3-羥化酶;DFR＝二氫黃酮醇4-還原酶;UFGT＝UDP-葡萄糖類黃酮-3-氧-糖基轉移酶。代謝途徑后面步驟相當于在P.hybrida花中發生的轉化，包括1＝向花色素-3-葡糖苷和翠雀素-3-葡糖苷的葡糖基殘基上加上一個鼠李糖的加成作用;2＝乙酰化作用和5-氧-糖基化作用;3＝3′甲基化作用;4＝5′甲基化作用;5＝3′5′甲基化作用。
圖2(A)顯示P.hybrida cv V23(Hf1/Hf1，Hf2/Hf2)的花瓣提取物中3′，5′-羥化酶活性以及P.hybrida cv R51(hf1/hf1，hf2/.hf2)中3′，5′-羥化酶活性的喪失。通過3H-4′，5，7-三羥黃烷酮向3′-和3′，5′-羥化衍生物圣草酚及四羥黃烷酮的轉變來檢測3′，5′-羥化酶的活性。圖的左手側所示為底物4′，5，7-三羥黃烷酮及其3′羥化酶反應產物圣草酚和3′，5′羥化酶反應產物四羥黃烷酮的生物化學結構。底物及其羥化產物在TLC平板上的位置示于圖的右手側，該圖從左至右顯示了由P.hybridacvV23和P.hybridacvR51花的花瓣提取物產生的反應產物和當從反應混合物中省去NADPH時柚苷配基不發生羥基化的對照物的放射自顯影圖。
圖2(B)顯示在不同發育階段的P.hybridacvOldGloryBlue(OGB)花的花瓣提取物中的3′，5′-羥化酶活性。從左至右的TLC平板放射自顯影圖表示(1)第一階段花[花蕾未著色，閉合(長度＜25mm)]4′，5，7-三羥黃烷酮向3′，5′-羥化衍生物四羥黃烷酮進行有限的轉化;(2)第二階段花[花蕾已著色，閉合(長度為25-35mm)]增加了向羥黃烷酮的轉化，表明存在較高的3′，5′-羥化酶水平;(3)第3階段花[花蕾深紫色，并出現花冠(長度＞35mm)]最大3′，5′-羥化酶活性;(4)第4階段花[花蕾開放，深紫色，花藥開裂前(長度＞50mm)]最大3′，5′-羥化酶活性;(5)第5階段花[花朵完全開放。全部花藥開裂]不存在可檢測的3′，5′-羥化酶活性水平。
圖3(A)圖解說明一種編碼細胞色素P450的mRNA分子。深色區表示編碼血紅素結合區序列的相對位置。用單個字母代碼表明上述結合部位最保守區域的共同氨基酸序列。那些百分之百存在于位于SWISS-PROT數據庫的細胞色素P450序列中的氨基酸被框起來，X表示具有低水平序列保守性的位置。
圖3(B)顯示用于PCR擴增來自cDNA庫＃1的細胞色素P450分子pCGP450和pCGP454的寡核苷酸的位置。寡核苷酸1和3包括的順序位于保守的血紅素結合區，而寡核苷酸2和4分別對應于pBluescript(stratagene)-20和反向引物序列。寡核苷酸1和2用來合成插入pCGP450的cDNA;寡核苷酸3和4用于合成插入pCGP454的cDNA。對所延伸的cDNA分子的表示與圖3A一致，載體順序用淺色區表示。
圖4(A)圖解說明用于探測cDNA庫＃1以鑒別包括pCGP174和pCGP175的細胞色素P450同系物的DNA片段。P450得到的細胞色素P，450cDNA克隆，帶有由深色盒表示的血紅素結合區(Haem);片段1以pCGP142DNA為模板，用寡核苷酸5和6經PCR得到的一段900bp片段;片段2從pCGP147的SalI-EcoRI酶解片段中分離到的1.3kb片段;片段3以pCGP168 DNA為模板，用寡核苷酸4和7經PCR得到的一段750bp片段;片段4從pCGP160的PstI-EcoRV酶解片段中分離到的一個670bp片段;片段5以pCGP454DNA為模板，用寡核苷酸3和4經PCR提到的一段150bp片段。所有的純化片段都按下文材料與方法部分所述用32P-dCTP進行標記。
圖4(B)-(H)顯示來自(ⅰ)pCGP142，(ⅱ)pCGP147，(ⅲ)pCGP158，(ⅳ)pCGP160和(ⅴ)pCGP454的cDNA插入物的部分核苷酸順序以及相應的推定的氨基酸轉譯產物。用以探測cDNA庫井1以分離pCGP174和pCGP175的區域已用帶箭頭的直線畫出。
圖5(A)和(B)分別圖示質粒pCGP174和pCGP175。cDNA插入物以空心盒表示，其中帶有以深色區顯示的編碼推定的血紅素結合部位的區域。位于兩個cDNA插入物的5′端都有一個EcoRI位點，在3′端有一個XhoI位點。
圖6(A)是用pCGP174 cDNA插入物的3′區探測RNA印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有從下列矮牽牛屬植物組織中分離的總RNA的20μg樣本1-5取自花的5個不同發育階段(見材料與方法部分所述)花的OGB瓣片組織;T取自第3-4階段花的OGB合瓣花冠組織;L取自6周老OGB幼苗的葉組織;IL取自6周老OGB幼苗并用葡萄糖/強光處理過的葉組織;V23取自第3-4階段花的V23瓣片組織;R51取自第3-4階段花的R51花冠組織;VR取自V23×R51F1雜種第3-4階段花的花瓣瓣片組織Sw63取自Sw63的第3-4階段花的花瓣瓣片組織;Th7取自Th7的第3-4階段花的花瓣瓣片組織。
花的花瓣瓣片組織。
圖6(B)表示V23×R51(V/R)F2植株的RFLP分析放射自顯影圖。用pCGP174的3′區探測XbaI酶解的基因組DNA。在那些于花(+)的合瓣花冠組織中具有3′，5′-羥化酶活性的所有F2植株中都檢測到了能與探針進行堅固雜交的V23片段。對于不同植株都標明了有強雜交帶的RFLP命名(RFLR＃1)。V類似V23的RFLP，R類似R51的RFLP，H雜合子(VR)。
圖7(A)是用pCGP175cDNA插入物的3′區探測RNA印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有從下列組織中分離到的總RNA的20μg樣本1-5取自花的5個不同發育階段(見材料與方法部分所述)花的OGB瓣片組織;T取自第3-4階段花的合瓣花冠組織L取自6周齡OGB秧苗的葉組織;IL取自6周齡OGB秧苗并經葡萄糖/強光處理過的葉組織;V23取自第3-4階段花的V23瓣片組織;R51取自第3-4階段花的R51花冠組織;VR取自V23×R51F1雜種的第3-4階段花的花瓣瓣片組織;Sw63取自Sw63的第3-4階段花的花瓣瓣片組織Th7取自Th7的第3-4階段花的花瓣瓣片組織。
圖7(B)表示V23×R51(V/R)F2植株的RFLP分析的放射自顯影圖。用pCGP175的3′區探測XbaI酶解的基因組DNA。用pCGP175探針獲得的RFLP命名與用Chi-A探針所給定的PO命名一致。VV23樣RFLP;RR51樣RFLP;H雜合子(VR)RFLP。
圖8圖示pCGP602的限制性酶圖譜。cDNA插入物的部分長度用帶有立線端(與箭頭相對)的粗線表示。這些片段被亞克隆到M13-mp18和mp19中，并用所示的寡核苷酸引物順序進行測序以獲得重迭順序的信息。從每一亞克隆部分獲得的有關順序長度和方向的信息用帶有半個箭頭的直線表示。S1＝引物序列1;S2＝引物順序2;S3＝引物順序3;ATG表示甲硫氨酸起始密碼子，用堿基對表示的克隆的總長度也同時示出。
圖9(A)-(D)表示pCGP176和pCGP602中cDNA插入物的核苷酸順序的推定的氨基酸順序。得自pCGP602的插入物包括所示的完整順序。pCGP176插入物的5′端用箭頭表示。
圖10(A)-(C)表示pCGP175中cDNA插入物的核苷酸順序和推測的氨基酸順序。
圖11圖解pCGP618的構建。pCGP618的構建是通過將pCGP175cDNA插入物以有意義方向克隆到表達載體pYGA22m中酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(PGPD)后面實現的。來自pCGP175的cDNA插入物的EcoRI-KpnI片段與用EcoRI/KpnI酶解pYGA22m所得的大片段進行連接。E＝EcoRI，H＝HindⅢ，K＝KpnI，X＝XhoI，IR＝2μm質粒的反相重復，Trpl＝Trpl基因，Ap＝氨芐青霉素抗性標記。
圖12(A)顯示以3H-4′，5，7-三羥黃烷酮為底物進行的酵母提取物中3′，5′-羥化酶測定。放射自顯影圖反映了用質粒pCGP618轉化的酵母的提取物中3H-4′，5，7三羥黃烷酮向其3′，5′-羥化衍生物四羥黃烷酮的轉化(1和2)。在未被轉化的酵母(C)中未檢測到3′，5′-羥化酶活性。用OGB3′，5′-羥化酶進行的4′，5，7-三羥黃烷酮轉化為四羥黃烷酮也示于圖中(OGB C)。
圖12(B)顯示以3H-二氫五羥黃酮作底物進行的酵母提取物中3′，5′-羥化酶測定。放射自顯影圖反映了用質粒pCGP618轉化的酵母的提取物中3H-二氫五羥黃酮(DHQ)向3H-二氫六羥黃酮(DHM)的轉化(1和2)。在未被轉化的酵母(C)中未檢測到3′，5′-羥化酶活性。用OGB3′，5′-羥化酶進行的DHQ向DHM的轉化也示于圖中(OGB C)。
圖13顯示以3H-4′，5，7-三羥黃烷酮作底物進行的酵母提取物3′，5′-羥化酶測定，放射自顯影圖反映出用質粒pCGP618和pCGP620轉化的酵母的提取物中3H-4′，5，7-三羥黃烷酮向其3′，5′-羥化衍生物四羥黃烷酮的轉化(分別見1和2)。從pCGP620提取物獲得的反應產物還包括3′-羥化圣草酚以及一些初始4′，5，7-三羥黃烷酮底物，表明底物向其3′，5′-羥化終產物的轉化是不完全的。在未被轉化的酵母(C)中未檢測到3′，5′-羥化酶活性。
圖14圖解說明質粒pCGP90。得自pCGP602的cDNA插入物以有意義方向被克隆到如圖所示的表達載體pCGP293的Mac啟動子后面。
圖15顯示矮牽牛屬植物花瓣提取物中3′，5′-羥化酶測定。放射自顯影圖表明在Skr4×Sw63的花瓣瓣片組織(L)中存在低3′，5′-羥化酶活性水平(3H-4′，5，7-三羥黃烷酮向3H-四羥黃烷酮的轉化)。在兩株Skr4×Sw63/pCGP90轉基因植株(T/G1602和T/G1603)的瓣片組織(L)中檢測到明顯較高水平的酶活性。在非轉基因Skr4×Sw63雜交株或兩個pCGP90轉基因植株的花瓣合瓣花冠提取物中均未測到3′，5′-羥化酶活性。通過OGB花瓣組織的瓣片(L)和合瓣花冠(T)提取物進行的4′，5，7-三羥黃烷酮向四羥黃烷酮的轉化也示于圖中。
圖16是照相表示用32P標記的Hf1 cDNA探測RNA印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有從下列植物分離到的總RNA的20μg樣本(1)P.hybrida cv.OGB花瓣;(2)三色堇花瓣;(3)土豆莖;(4)茄子表皮;(5)Nicotianaalata花;(6)藿香花。用于檢測A和B的探針從一個660bpBalIDNA片段衍生而來。一個1.4kb的EcoRI/HindⅢ片段用于檢測C。所用的漂洗條件為(A)6×SSC，50℃;(B)2×SSC，50℃;(C)0.2×SSC，65℃。
圖17是照相表示用32P標記的Hf1 cDNA探測的Southern印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有10μg用EcoRI酶解的DNA。該DNA樣本分離自(1)茄子，(2)荷蘭鳶尾，(3)土豆，(4)紫羅蘭和(5)銀蓮花屬植物。漂選條件為(A)6×SSC，50℃;(B)2×SSC，65℃。
實施例1.材料與方法化學物質、酶類和放射性同位素圣草酚和二氫五羥黃酮得自Carl Roth KG，.4′，5，7-三羥黃烷酮購自Sigma。二氫六羥黃酮是根據Vercruysse的方法(Vercruysse et al，1985)從六羥黃酮(Extra Synthese，France)經化學合成而得。[3H]-4′，5，7-三羥黃烷酮(5.7Ci/mmole)和[3H]-二氫五羥黃酮(12.4Ci/mmole)得自Amersham。所用的酶類均為商售來源，并按制造商的說明使用。
細菌菌株所用的E.Coli菌株為DH5α supE44，△(lacZYA-ArgF)U169，φ801acZ△M15，hsdR17(r-k，m+k)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1.deoR.(Hanahan，1983 and BRL，1986).
XLl-Blue supE44，hsdR17(r-k，m+k)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，lac-，[F′ proAB，lacIq，lacZ△M15，Tn10(tetr)](Bullock et al，1987).
PLK-F′ recA，hsdR17(r-k，m+k)，mcrA-，mcrB+，lac+，supE44，galK2，galT22，metBl，[F′ proAB，lacIq，lacZ△M15，Tn10(tetr)](Stratagene).
棄掉進攻器官的根癌土壤桿菌菌株AGLO(Lazoetal，1991)得自R.Ludwig(DepartmentofBiology，UniversityofCalifornia，SantaCruz)。
克隆載體pBluescript和pBluescribe得自Stratagene。
E.Coli和根癌土壤桿菌的轉化根據Inoue(Inoueetal，1990)的方法轉化E.coli株DH5α細胞。
將AGLO細胞接種于50ml MG/L(GarfinKel and Nester，1980)培養基中，于28℃振蕩生長16小時制得感受態AGLO細胞。加5μg質粒pCGP90(
圖14)DNA到100μl感受態AGLO細胞中，使質粒pCGP90導入根癌土壤桿菌菌株AGLO中。然后獲取上述所得細胞的團丸，并懸浮于0.5ml含85%(V/V)100mM CaCl2/15%(V/V)甘油的溶液中。將DNA-土壤桿菌混合物置液氮中冷凍2分鐘，再置于37℃5分鐘使之解凍。將DNA/細菌混合物置于冰上10分鐘。然后加1ml MG/L培養基與細胞混合，再于28℃搖育16小時。用含100μg/ml慶大霉素的MG/L瓊脂板篩選攜帶pCGP90的根癌土壤桿菌細胞。對從慶大霉素抗性轉化體分離到的DNA進行Southern印跡分析來證實pCGP90的存在。
所用的矮牽牛屬植物雜交變種列于表2中。
表2植物材料植物變種特性來源/出處參考Old Glory Blue(OGB) F1Hybrid Ball Seed,USAV30An1,An2,An3,An4,An6,Koes et al.(1986)An8,An9,An10,An11,Ph1Ph2,Ph3,Ph4,Ph5,Hf1,Hf2,Ht1,Ht2,Rt,Mt1,Mt2,mf1,po,GfV23An1,An2,An3,An4,An6,Wallroth et al.(1986)An8,An9,An10,ph1,Hf1,Doodeman et al.(1984)Hf2,ht1,Rt,Po,B1,F1R51An1,An2,An3,An4,An6,Wallroth et al.(1986)An8,An9,An10,An11,van Tunen et al.(1990)Ph1,hf1,hf2,Ht1,rt,doodeman et al.(1984)Po,b1,f1Sw63An1,An2,An3,An4,An6,I.N.R.A.,Dijon,Cedex,An8,An9,An10,An11,FrancePh1,Ph2,Ph5,hf1,hf2,
ht1,ht2,rt,po,mf1,f1,GfTh7An1,An2,An3,An4,An6,"""An9,An10,An11,Hf1,Hf2,Ht1,Ht2,Ph1,Ph2,Ph5,Rt,po,mf1,mf2,Gf,F1Skr4An1,An2,An3,An4,An6,"""An11,hf1,hf2,ht1,Ph1,Ph2,Ph5,rt,Po,Mf1,Mf2,f1Skr4×Sw63 Skr4×Sw63 F1HybridRw14An1,An2,An4,Ph1,phz,I.N.R.A.,Dijon,CedexPh5,hf1,hf2,Ht1,Rt,Po,FranceBl,Lg1,Lu1,Vs1,Vs3,Vs5,la,Yg1,ws,Gf,Mt1,Mf2,f1Rp57An1,An2,An4,Ph1,ph2,"""Ph5,hf1,hf2,Ht1,Rt,Po,Mt,Mf,fl,Gf,Bl,Lg1,Lu1,Vs1,Vs3,Vs5,Yg1,Ws.
Rp57×Rw14 Rp57×Rw14 F1Hybrid
植物在特定生長室中于22-26℃生長，每天以光強10，000勒光照14小時，在如下所定義的發育階段采集OGB花第1階段花蕾未著色，閉合(長度＜25mm)。
第2階段花蕾著色，閉合(長度為25-35mm)。
第3階段花蕾深紫色，并出現花冠(長度＞35mm)。
第4階段深紫色開放的花朵，花藥開裂前期(長度＞50mm)。
第5階段花朵完全開放，伴有全部花藥開裂。
在花藥開裂前于色素累積達最大量的生長階段收集表2所述的其它變種的花。
用于測定3′，5′-羥化酶活性的植物提取物的制備用2-5倍體積的冰冷提取緩沖液(100mM磷酸鉀(pH7.5)，1mMEDTA，0.25M蔗糖，0.25M甘露糖醇，0.1%(V/V)BSA，100nM抑肽素，100nM亮肽素，0.1mg/mlPMSF，20mM2-巰基乙醇和10mg/mlpolyclarAT)將植物組織均化。所得組織勻漿用JA20轉頭(Beckman)以10，000rpm于4℃離心10分鐘，用得到的上清液的等份試樣進行3′，5′-羥化酶活性測定。
3′，5′-羥化酶測定用修改的Stotz和Forkmann(1982)方法檢測3′，5′-羥化酶酶活性，進行測定的反應混合物一般含有100μl植物提取物、5μl溶于測定緩沖液(100mM磷酸鉀(pH8.0)，1mM EDTA和20mM2-巰基乙醇)中的50mM NADPH，10μCi[3H]4′，5，7-三羥黃烷酮或5μCi[3H]二氫五羥黃酮，并用測定緩沖液將反應的終體積補足至210μl。于23℃培育2-16小時之后，用0.5ml乙酸乙酯抽提反應混合物。于真空中干燥乙酸乙酯相，然后再重懸于10μl乙酸乙酯中。將氚化的類黃酮分子用氯仿∶乙酸∶水(10∶9∶1，V/V)溶劑系統分散于纖維素薄層板(MerchArt5577，Germany)上。在色譜分析完畢之后，用溶于二乙基乙醚中7%(V/V)的2，5-二苯基噁唑向TLC板噴灑。用放射自顯影法將反應產物定位，通過與在反應產物旁平行實驗的非放射性4′，5，7-三羥黃烷酮、圣草酚、二氫五羥黃酮和二氫六羥黃酮標準物相比較對反應混合物進行鑒別，并在紫外光下觀察。
葡萄糖/強光誘導植物葉中翠雀素合成收集P.hybrida cv.OGB的葉子，并在無菌水中切成1cm2的葉片。將葉片漂浮于2%(M/V)的葡萄糖溶液中，并于光強24，000勒下暴露96小時。
＃1cDNA庫的構建取20g第3-4階段OGB花的瓣片于100ml含10mM釩核糖核酸復合物的PEB(200mM 7ris-HCl(pH8.6)，60mM kCl，30mM MgCl2，25mM EGTA)中均化。將勻漿通過無菌Miracloth(Calbiochem)過濾除去細胞碎片。濾液鋪于Ultra-ClearTMQuick-SealTM(Beckman)離心管中含25%(W/V)蔗糖，20單位lnhibit Ace(5-Prime 3-Prime)的6ml PEM和含50%(W/V)蔗糖、250單位lnhibit Ace的6ml PEM 形成的梯度密度頂部。上述離心管用70Ti轉頭以26，000rpm離心3.5小時。從25%(W/V)蔗糖/50%(W/V)蔗糖界面收集膜結合多核糖體，并加入4M異硫氰酸胍溶液。根據Turpen和Griffith(1986)描述的方法通過-5.7M CsCl緩沖物造丸，從變性的多核糖體中分離RNA。
應用Uni-ZAPTMXR載體試劑盒(Stratagene)以25μg多核糖體 RNA作模板在λZAP中構建定向的cDNA庫。含250，000空斑形成單位(pfu)的初級庫通過在NZY平板(Sambrook et al，1989)上過夜生長進行擴增，根據Sambrook等人所述方法(1989)用PSB(100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl(pH7.5)，0.01%(W/V)明膠)洗脫擴增的空斑材料。
＃2cDNA庫的構建用Turpen和Griffith的方法(1986)從P.hyhrida cv，OGB第3-4階段花的花瓣組織中分離總RNA。通過三輪oligo-dT纖維素色譜法從總RNA中篩選poly(A)+RNA(Aviv and Leder，1972)。
在20μl含1×SuperscriptTM反應緩沖液、10mM二硫蘇糖醇，500μMdATP、500μMdGTP、500μMdTTP、500μM5-甲基-dCTP、0.75μg寡核苷酸＃8和2μl SuperscriptTM反轉錄酶(BRL)的溶液中加入2ugpoly(A)+RNA進行反轉錄。反應混合物于37℃溫育50分鐘，于44℃溫育10分鐘，然后置于冰上。
第二部分反應混合物140μl加入到第一部分反應物中。前者由21mM Tris-HCl，104mM kCl、5.3mM MgCl2，171μM β-NAD，11.4mM(NH4)2So4，214μM dATP、642μM dCTP，214μM dGTP，214μMdTTP，4mM DTT，10μCi32P-dCTP(3000Ci/mMole)和15單位E.coliDNA連接酶，40單位DNA聚合酶(Boehringer)和0.8單位RNAseH組成。所得的終混合物于16℃溫育150分鐘。為了形成雙鏈cDNA鈍端，加入10單位T4DNA聚合酶，反應在16℃繼續進行15分鐘。中止反應，經酚/氯仿抽提，繼而氯仿抽提和乙醇沉淀以純化cDNA。
根據制造商說明的條件使cDNA與EcoRI接頭(Promega)連接，然后激酶處理。加熱(70℃，20分鐘)使酶變性，經酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化DNA。按照制造商說明的條件在100ul反應體積中用50單位XhoI(Boehringer)酶解cDNA。熱滅活酶(70℃，20分鐘)，將混合物通過已經STE緩沖液(Sambrooketal，1989)平衡的S400旋轉柱(Phamacia)。洗脫液用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。在4℃微離心30分鐘后，用70%(V/V)乙醇沖洗cDNA丸，空氣干燥，然后重懸于10μlTE緩沖液中(10mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA)。
用NA-45膜(Schleicher和Schuell)從已通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳的7.5ul樣本中分離分子太小范圍在1.3～2.5kb之間的cDNA。
在5ul含50mM Tris-HCl(pH7.0)，10mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，1mM ATP和2單位T4DNA連接酶的反應緩沖液中用經過1ug λZAPⅡ EcoRI/XhoI/CIAP處理的載體(Stratagene)連接已按分子大小分離的cDNA。反應在4℃下進行2天。
將反應物置室溫2小時后，連接反應混合物用Packagene系統(Promega)進行包裝。重組子的總數為270，000pfu。
150，000pfu量的被包裝的cDNA在轉染PLK-F′細胞后以每15cm直徑平板含10，000pfu的濃度置于平板上。平板于37℃培育8小時，然后于4℃過夜貯存。復制物置于Colony/Plaque ScreenTM濾膜上，按制造商的說明進行處理。
寡核苷酸的合成根據制造商提供的方法用AppliedBiosystemsPCR-MateDNA合成儀合成寡核苷酸。所合成的寡核苷酸5′-3′順序為寡核苷酸1GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG寡核苷酸2GGATGACTCAGTAAAACGACGGCCAGT寡核苷酸3CCIGG(A/G)CAIATIC(G/T)(C/T)(C/T)TICCIGCICC(A/G)AAIGG
寡核苷酸4GGATGACTCAAACAGCTATGACCATG寡核苷酸5GTTCAATTCGGAATGATG寡核苷酸6GCTGCACTTAATCCATAT寡核苷酸8GAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT寡核苷酸9ATGTCTCCTCCAGTG寡核苷酸10CTAGACTCCAATCAC寡核苷酸2和4包括GCN4接合位點(在其下畫線表示)，已證明該位點能便利于雙鏈的PCR產物的富積(Lewandkemp，1989)。
寡核苷酸3的命名依據如下從推測的鱷梨樹細胞色素P450的血紅素結合區得到的氨基酸順序(Bozaketal，1990)和由兩個矮牽牛屬植物細胞色素P450同系物pCGP142和pCGP147編碼的相應順序的排列為鱷梨樹PFGAGRRGCPGpCGP142PFGAGKRICPGpCGP147PFGSGRRICPG因此，三種植物細胞色素P450的血紅素結合區的共同氨基酸順序可以看成是PFGA(S)GR(K) RI(G)CPG所以，推測出的能編碼存在于三種細胞色素P450分子的血紅素結合區的氨基酸的核苷酸順序有可能的排列為5'-CCX TTT GGX GCX GGX AGX CGX ATX TGT CCX GGX-3'CAGCAAGGCTX表示所有4種核苷酸(A，C，T和G)都能存在的核苷酸位置。寡核苷酸3被設計成補充源于三種植物細胞色素P450的共同順序的一部分順序。當堿基簡并性大于3時，主要存在的是脫氧次黃苷(Ⅰ)。所得的寡核苷酸順序如上所示。
PCR反應根據制造商描述的方法用輔助性噬菌體R408(Stratagene)切割含有從擴增的λZAP＃1cDNA庫得到的矮牽牛屬植物cDNA插入物的pBluescript質粒噬菌體。用質粒噬菌體混合物轉染E.coliXL1-Blue，在含氨芐青霉素的培養基平板上生長出250，000個菌落。將細胞垂懸于LB中(Sambrooketal.，1989)，用堿裂解法(Sambrooketal.，1989)分離質粒DNA。通過在CsCl密度梯度中分帶進一步純化質粒DNA。該DNA用作PCR中的模板。
用于擴增花瓣細胞色素P450同系物的PCR反應含有下列成分5-100ng已切割的DNA，10mM Tris-Hcl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%(w/v)明膠，每種dNTP各0.2mM，各種引物0.4μM和1.25單位Taq聚合酶(Cetus)。反應混合物(50μl)在94℃、48℃和72℃各反應1分鐘，共循環30次。擴增的產物用Geneclean (Bio 101Inc.)進行凝膠純化，重復擴增步驟獲取足夠用于克隆的原料，然后用T4DNA聚合酶進行末端修復。用寡核苷酸1和2進行擴增和DNA被克隆入pBluescript中之前先用HindⅢ和XhoⅠ酶解。在寡核苷酸3和4間擴增產生的PCR產物按Holton和Graham(1991)的描述直接克隆到以ddT結尾的pBluescript載體中。
cDNA庫的篩選將復制的空斑吸出按下列條件進行雜交和洗滌用于檢測同系克隆時采用高強度條件(雜交50%(v/v)甲酰胺，6×SSC，1%(w/v)SDS，在42℃進行16小時;漂洗2×SSC，1%(w/v)SDS65°，15分鐘，2次，然后在0.2×SSC，1%(w/v)SDS，65℃，15分鐘，2次)，在檢測相關順序時采用低強度條件(雜交20%(v/v)甲酰胺，6×SSC，1%(w/v)SDS，42℃，16小時;漂洗6×SSC，1%(w/v)SDS，65℃，1小時)。
Northern分析從經液氮冷凍并用研缽研成精細粉末的組織中分離總RNA。將抽提緩沖液(4M異硫氰酸胍，50mMTris-HCl(pH8.0)，20mMEDTA，0.1%(v/v)Sarkosyl)加到組織中，用polytron以最大速度將混合物均化1分鐘。通過Miracloth(Calbiochem)過濾懸浮液，并用JA20轉頭以10，000rpm離心10分鐘。收集上清，并加入CsCl(終濃度0.2g/ml)。然后將樣本鋪在裝在10ml5.7MCsCl和50mMEDTA(pH7.0)緩沖物的38.5mlQuick-seal離心管(Beckman)上層，用Ti-70型轉頭以42，000rpm于23℃下離心12-16小時。所得團丸垂懸于TE/SDS(10mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA，0.1%(w/v)SDS)溶液中，用經10mMEDTA(pH7.5)飽和過的酚∶氯仿∶異戊醇抽提。在用乙醇進行沉淀之后，RNA團丸垂懸于TE/SDS中。
RNA樣本通過2.2M甲醛/1.2%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，所用電泳緩沖液含有40mM嗎啉丙烷磺酸(pH7.0)，5mM乙酸鈉，0.1mM EDTA(pH8.0)。按制造商的說明把電泳后的RNA轉移到Hybond-N濾膜(Amer-sham)，并用32P標記的cDNA片段(108cpm/μg，2×106cpm/ml)進行探測。在50%(v/v)甲酰胺，1M NaCl、1%(w/v)SDS和10%(w/v)硫酸葡聚糖中進行預雜交(1小時，42℃)和雜交(16小時，42℃)。在雜交步驟中，與32P標記的探針一起加入降解的鮭精DNA(100μg/ml)。
濾膜在2×SSC/1%(w/v)SDS中于65℃漂洗1-2小時，然后在0.2×SSC/1%(w/v)SDS中于65℃再漂洗0.5-1小時。在-70℃將濾膜暴露于帶增感屏的KodakxAR膠片48小時。
RFLP分析a.基團組DNA的分離基本上按Dellaporta等人(1983)描述的方法從葉組織中分離DNA。所制備的DNA進一步用CsCl浮力密度離心純化(Sambrooketal.，1989)。
b.Southern印跡基因組DNA(10μg)用60單位XhaI酶解16小時，然后用0.7%(w/v)瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳緩沖液為TAE(40mMTris-乙酸，50mMEDTA)。DNA在變性液(1.5MNaCl/0.5MNaOH)中變性處理1-1.5小時，在0.5MTris-HCl(pH7.5)/1.5MNaCl中中和2-3小時，然后用20×SSC將DNA轉移到HybondN(Amersham)濾膜上。
C.分離chi-A探針通過使用從OGB階段3花瓣RNA制備的cDNA模板和兩個寡聚核苷酸引物＃9，包括核苷酸6-20和＃10，與已公開的chi-A cDNA序列的核苷酸711-725(van Tunen et al.，1988)互補進行PCR合成chi-A的一個cDNA克隆(van Tunen et al.，1988)。將得到的PCR產物連接到pBluescribe M13-(Stratagene)的SmaI位點，并且測序，證明已克隆的片段與公開的序列相一致。
DNA探針的32P-標記使用一個寡聚物標記盒(Bresatec)用50μCi[α32P]-dCTP放射性標記DNA片段(50到100ng)。在Sephadex G-50(Fine)柱上色譜分析除去未摻入的[α-32P]-dCTP。
DNA序列分析基本上按照Sanger等人(1977)的方法，使用定序酶(USB，說明2.1)方法完成DNA定序。采用來自不同M13-mp18和mp19(Norrander等人，1983，Yanisch-Perron1985)的亞克隆的匯集的序列確定克隆pCGP602，pCGP176和pCGP175的全部序列，所述的亞克隆是使用標準克隆方法得到的(Sambrook等人，1989)。對于一些區域，必需合成特異的寡核苷酸引物以獲得重疊序列資料。為了上述目的，合成了下列6個引物;
5′CGTGCCAATGAGCTAGG3′引物序列15′GATGTTGGTTGTACTGAG3′引物序列25′GGAAACCAGATTTTCTTG3′引物序列35′TTTTTTTTTTTTTTTTT3′引物序列45′GTTTTCCCAGTCACGAC3′引物-405′AACAGCTATGACCATG3′反轉引物可以在圖8中見到pCGP602的限制圖譜，該圖中顯示了這些序列中其中幾個的位置。
使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)完成與Gen-bank，Swiss-PROT和EMBL數據庫相對應的同源性調查。
構建pCGP293從Ti雙重載體pCGN1559得到表達型雙重載體pCGP293(McBride和Summerfelt，1990)。用KpnI消化質粒pCGN1559，并按照標準方法(Sambrook等人，1989)用T4DNA聚合酶除去突出的3′末端。然后用XbaI進一步消化載體，并使用Klenow片段修復得到的5′突出末端。然后將該載體再連接得到pCGP67。從pCGP40中分離含Mac啟動子，mas終止區和各種克隆位點(Comai等人，1990)的1.97kb的PstI片段，并將其插入到pCGP67的PstI位點得到pCGP293。
通過除去作為來自pCGN7334的BamHI-SacI片段的GUS基因(Jef-ferson等人)，并用來自pBluescribeM13的包括多克隆位點的BamHI-SacI片段代替上述基因以構建質粒pCGP40。通過將含Mac-GUS-mas融合基因的片段插入到pCGN7329(Comai等人，1990)的XhoI位點構建質粒pCGN7334(從CalgeneInc.CA;USA得到)。
構建pCGP90通過以有意義方向在pCGP293的Mac啟動子(Comai等人，1990)后克隆來自pCGP602的cDNA插入片段而構建質粒pCGP90。從pCGP602分離含cDNA插入片段的BamHI-KpnI片段并與pCGP293的BamHI/KpnI消化片段連接。通過限制性分析從慶大霉素抗性轉化體分離的DNA以確定上述插入片段正確插入pCGP90中。
構建酵母表達型載體pYGA22m用EcoRI和BglⅡ消化M13-mp18，以產生一含多克隆位點的700bp片段。將上述片段與來自pYGA2269(Ashikari等人，1989)的9kbEcoRI-BglⅡ片段連接。所得的構建體稱作pYGA22m，含有插入到甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子下游的多克隆位點(
圖11)。
構建pCGP618將包含來自pCGP175的整個cDNA插入片段的1.8kbEcoRI-KpnI片段與來自pYGA22m的9kbEcoRI-KpnI片段連接。所得的質粒pCGP618包含以一有意義方向連接在甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子后的pCGP175cDNA片段(
圖11)。
構建pCGP620將包含來自pCGP176的全部cDNA插入片段的1.8kbEcoRI-KpnI片段與來自pYGA22m的9KbEcoRI-KpnI片段連接(如構建pCGP618一樣)。所得的質粒，pCGP620含有以一有意義方向連接在酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子后的pCGP176cDNA片段。
酵母轉化按照Ito等人(1983)方法用pCGP618和pCGP620轉化酵母菌株G-1315(Matα，trpl)(Ashikari等人，1989)。根據其將G-1315恢復到色氨酸原養型的能力選擇轉化體。
制備酵母提取物以檢測3′，5-羥化酶活性a.G-1315/pCGP618用在缺乏色氨酸培養基上生長的G-1315/pCGP618和G-1315回復突變型的單一分離物接種50mL的YNBC[1.2%(w/v)沒有氨基酸的酵母氮(Difco)，2%(w/v)葡萄糖和0.3%(w/v)酪蛋白氨基酸(Difco)]并于30℃振蕩培養2天。通過離心細胞形成團丸，按照Oeda等人(1985)的方法，所不同的是原生質球在用于檢測植物組織中3′，5′-羥化酶活性的提取緩沖液中破碎，獲得微球體部分。把微球體團丸懸浮于400μl緩沖液A(10mMTris-HCl(pH7.5)，0.65M山梨醇，0.1mMDTT，0.1mMEDTA)，并取100μL樣品檢測3′，5′-羥化酶活性。
b.G-1315/pCGP620將G-1315/pCGP620的單一分離物接種20mlYNBC，隨后在30℃培養2天。通過離心收集細胞，用TE沖洗一次，用緩沖液A沖洗一次，然后再懸浮于含酶解酶(0.1mg/mL)(Seikagakukogyo，Japan)的緩沖液B(10mMTris-HClCPH7.5)，1.2M山梨醇，0.1mMDTT，0.1mMEDTA)中。隨后在30℃培養1小時，通過離心細胞成團丸并再懸浮于400μl緩沖液A中。用玻璃珠(直徑＝0.4mm)把細胞懸浮液形成旋渦2分鐘，取100μl樣品檢測3′，5′-羥化酶活性。
矮牽牛花的轉化a.植物材料在1.25%(w/v)的次氯酸鈉中把碧冬茄(SKr4×Sw63和Rp57×Rw14)種子消毒10分鐘并用無菌水沖洗三次。把消毒后的種子在100mg/L赤霉酸(GA3)溶液中浸泡16到20小時。然后讓它們在用1%(v/v)蔗糖和0，8%(w/v)Difco Bacto瓊脂補充的10%(w/v)MS(Murashige和Skoog，1962)培養基上發芽2星期。在將幼苗移到Jiffy泥炭顆粒(Jiffy Pro-ducts Ltd，Norway)之前，先將幼苗轉移到用3%(w/v)蔗糖補充的MS培養基上生長3星期，在Jiffy泥炭顆粒上保持濕度和照明(135μE。鹵化汞光，22℃)2到3星期。然后將這些幼苗移到生長室中(68μE，冷白熒光，25℃)。為了共培養，收獲幼葉并在1.35%(w/v)的次氯酸鈉中消毒2分鐘，隨后用無菌水沖洗三次。然后把葉組織切成25mm2并在用0.05mg/L激動素和1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)補充的MS培養基上預培養24小時。
b.土壤桿菌和矮牽牛花的共培養把含雙重載體pCGP90(
圖14)的根癌土壤桿菌菌株AGLO(Lazo等人，1991)于4℃保持在含100mg/L慶大霉素的MG/L(Garfinkel和Nester，1980)瓊脂平板上。將單個菌落在含1%(w/v)Bacto-胨，0.5%(w/v)Bacto-酵母提取物和1%(w/v)NaCl液體培養基上生長過夜。第二天，通過用含3%(w/v)蔗糖(BPM)的液體MS培養基稀釋制備成最終濃度為5×108細胞/mL。在含AGLO/pCGP90的BPM中把葉園片浸5分鐘，然后把葉園片吸干并放在共培養基上4天。該共培養基包括用0.05mg/L激動素和1.0mg/L2，4-D補充的SH培養基(Schenk和Hildebrandt1972)，并含有鋪散在共培養基上的煙草細胞懸浮液喂養層，在煙草細胞懸浮液的上層放一張濾紙。
c.重獲轉基因矮牽牛花植物共培養后，把葉園片轉移到下列選擇培養基上SKr4×Sw63園片移到用3%(w/v)蔗糖，2mg/Lα-芐氨基嘌呤(BAP)，100mg/L卡那霉素，350mg/L頭胞噻肟，0.3%GelriteGellan樹膠(Schweizerhall)補充的新鮮MS培養基;Rp57×Rw14園片移到同樣的培養基上，但用0.5mg/LBAP和α-萘乙酸(NAA)代替2mg/LBAP.3星期后，將再生的分離塊轉移到新鮮培養基上。分離在卡那霉素選擇下存活的不定芽并轉移到含100mg/L卡那霉素和350mg/L頭胞噻肟的BPM上以誘發根。在23±2℃把全部培養物保持16小時光照周期(60μE。冷白熒光)。當根長到2-3cm長時，將轉基因矮牽牛花小植物轉移到8cm試管中經高壓消毒的51410/2盆栽混合土。4星期后，將植物再種到使用同樣盆栽混合土的15cm盆中，并保持于23℃，14小時光照周期300μE，鹵化汞光)。
煙草轉化a.植物材料把紅花煙草(cv.Xanthi)原料植物保持在用1mg/L吲哚丁酸(IBA)補充并用0.25%(w/v)的Gelrite固化的MS培養基上。把葉組織切成25mm2并放在含1mg/L BAP和0.5mg/L吲哚乙酸(IAA)的MS培養基上培養24小時。
b.土壤桿菌和煙草組織的共培養按照前述對矮牽牛花的描述完成共培養。
c.重獲轉基因煙草植物共培養后，將葉圓片轉移到用1mg/LBAP，0.5mg/LIAA，100mg/L卡那霉素和350mg/L頭胞噻肟選擇培養基)補充的MS培養基上。2-3星期后，將再生的分離塊轉移到新鮮的選擇培養基上。分離出在卡那霉素選擇下存活的不定芽并將其轉移至含1mg/L′IBA，100mg/L卡那霉素和350mg/L頭胞噻肟的MS培養基以誘導根。當根長到2-3cm長時，將轉基因煙草小苗移植到如對矮牽牛花描述的土壤中。
花色素分析在HPLC分析前將存在于花瓣提取物中的花色素苷酸水解，從花色素核心除去糖基成分。通過HPLC分析花色素核心分子確定花色素苷色素B環上的羥基化方式。上述分析所用的HPLC系統是一個帶多波長檢測器(MWD)的Hewlett-Packard1050。在250mm×4mmID的SpherisorbS5ODS2柱上完成反相層析分離。
a.提取花色素苷和類黃酮用含1%(v/v)6M含水鹽酸的5ml甲醇從花瓣片(Ca.50mg)中提取花色素。用水稀釋提取物(1∶9)并在注射到HPLC系統前進行過濾(MillexHV，0.45μ)。
b.花色素苷水解在室溫下，使用干氮氣流，在PierceReactivials中把上述a中得到的粗甲醇提取物(100μL)蒸發至干燥。殘余物溶解于200μL2MHCl中，蓋上小瓶并在100℃加熱30分鐘。用水稀釋水解混合物(1∶9)并在HPLC分析前過濾(MillexHV，0.45μ)。
c.層析使用下列系統經過梯度洗脫可實現分離花色素
溶劑A(三乙胺∶conC.H3PO4∶H2O)(3∶2，5∶1000)溶劑B乙腈梯度條件5%B到40%B超過20分鐘流速1ml/min溫度35℃檢測在280，350，和546nm用同步數據獲得MWD。
參考已知的標準鑒定花色素的峰值。
2.克隆并分析3′，5′-羥化酶3′，5′-羥化酶的定性a.發育調節分析在上述定義的不同發育階段從花中收獲的碧冬茄cvOGB花瓣提取物中3′，5′-羥化酶活性。
已發現在花冠的成熟期間，OGB花瓣中的3′，5′-羥化酶活性受發育過程調節(圖2B)。該發育圖譜對應于類黃酮生物合成中其他基因的表達。3′，5′-羥化酶活性和苯基苯乙烯酮合酶(CHS)，苯基苯乙烯酮黃烷酮異構酶(CHI)，二羥黃烷醇還原酶(DFR)基因的表達在花發育的3到4階段達到峰值。
b.在葉組織中誘導3′，5′-羥化酶活性在葉組織中不能正常表達類黃酮色素生物合成途徑中的基因。但是，通過在強光下，于2%(W/V)蔗糖溶液中培養可在OGB葉中誘導飛燕草色素的合成。在這些條件下，可在OGB葉組織中檢測到3′，5′-羥化酶活性。已表明在蔗糖/強光處理96小時后，發生最大誘導酶活性。在這些條件下，也可將數個其它色素生物合成基因的表達誘導至與在花瓣形成期觀察到的水平相比。從這些結果得出結論在蔗糖/強光處理過的葉組織中可誘導Hf1和/或Hf2基因。
c.說明3′，5′-羥化酶屬于酶的細胞色素P450類的證據在OGB花瓣中3′，5′-羥化酶活性顯示出與微粒體部分有關并依賴于NADPH的存在。可以通過用一氧化碳處理微粒體和利用兩種特異地使細胞色素P450酶失活的抑制劑tetcyclasis和1-氨基芐三嗪(Taton等人，1988;Matthew等人，1985，Rademacher等人，1987)抑制上述活性。
構建富集細胞色素P450序列的cDNA文庫在膜結合的多核糖體上發生細胞色素P450mRNA轉譯(Takemori和Kominami，1989)。因此，為了富集細胞色素P450序列(包括3′，5′-羥化酶序列)，使用從第3-4花期的OGB花瓣分離的膜結合的多核糖體RNA構建一個cDNA文庫。從3-4期花分離花瓣RNA，是因為已經表明在該發育階段3′，5′-羥化酶活性最大(看上述及圖2B)，因此，可確保在該文庫中最大限度地提供3′，5′-羥化酶序列。所得的文庫，稱作cDNA文庫＃1，含250，000初級重組體。
利用PCR擴增矮牽牛花花瓣細胞色素P450cDNA已經對來自象脊椎動物，真菌，昆蟲，細菌和植物的有機體中許多細胞色素P450進行測序(Nebert等人，1991，Bozak等人，1990)。所有這些酶的一個特征是存在若干小區域的保守序列，特別是涉及血色素結合的半胱氨酸殘基周圍。在迄今定序過的幾乎全部微粒體細胞色素P450的血色素結合區域存在氨基酸序列F(G，S)XGXRXCXG，其中，X可以是任何氨基酸(圖3)。使用FASTA程序(Pearson和Lipman，1988)，將上述共同序列與NBRF蛋白基礎數據相比，以確定對于基礎數據中全部微粒體細胞色素P450中這一區域周圍，氨基酸出現的頻率。這種分析表明，對于血色素結合區域周圍每一位置，最共同的氨基酸序列是FMPFGAGXRXCLG設計一個與編碼劃線部分序列和相似序列的基因雜交的寡核苷酸。該寡核苷酸，稱作oligol，表示如下5′-GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG-3′劃線部分是包括一個HindⅢ識別位點的附加序列;該位點有利于PCR產物的直接克隆。脫氧肌苷(Ⅰ)內合物對于密碼子使用具有不同的可能性，其中，兩個以上的密碼子可編碼同樣的氨基酸。脫氧肌苷堿基對具有與A，T，G和C相似的能力。(Martin等人，1985;Ohtsuka等人，1985)。
用從在材料和方法中描述的cDNA＃1文庫得到的質粒DNA作為模板，使用oligos1和2(圖3)擴增360bp細胞色素P450相關序列。Oligo2相應于-20引物(Strategene)在5′末端加一個GCN4結合位點(Lew和Kemp，1989)。將PCR片段克隆到pBluescript中，所得的質粒稱作pCGP450。pCGP450的5′區編碼一個與先前定序的細胞色素P450分子具顯著同源性的多肽序列。
從矮牽牛花花瓣的cDNA文庫分離細胞色素P450的同源物用質粒pCGP450篩選cDNA＃1(60，000噬菌斑)的有關克隆。在高和低強度條件下用兩次連續雜交檢測pCGP450的同胞克隆和第二組細胞色素P450cDNA。篩選每一同胞組的cDNA克隆樣品以用于隨后的分析。pCGP450的同胞稱作pCGP142，相應的第二組稱作pCGP147。在低強度下，用包括僅有的pCGP147編碼序列的SalI-EcoRI片段從cDNA文庫＃1中再探測16，000個噬菌斑。給全部20個與探針雜交的克隆定序，進一步鑒定了兩個細胞色素P450同源物pCGP158和pCGP160(圖4A)。
通過PCR分離其他的花瓣細胞色素P450同源物用來自矮牽牛花pCGP142，pCGP147的推測的血紅素結合區周圍的序列信息和先前定序的鱷梨細胞色素P450序列(O′keefe和Leto，1989;BozaKetal，1990)，按照材料和方法中的描述，設計一個覆蓋至少由三個細胞色素P450克隆中的兩個編碼的氨基酸序列的第二簡并寡核苷酸(oligo3)。用cDNA文庫＃1作模板并用oligo4作第二引物(圖3B)進行PCR，將該寡聚核苷酸用于擴增相關的序列。按在材料和方法中描述的方法分離大小范圍在250-500bp的反應產物并將其克隆到由Holton和Graham(1991)描述的加ddT-尾的pBluescript載體中。將已克隆的PCR片段定序并表明該片段編碼第5種細胞色素P450同源物。選擇稱作pCGP454的克隆作進一步分析。
從cDNA文庫＃1進一步分離細胞色素P450同源物用包括細胞色素P450同源物pCGP142，pCGP147，pCGP158和pCGP160的編碼序列和來自pCGP454的cDNA插入片段(圖4B到4H)的32p-標記的DNA片段混合探針，從cDNA文庫＃1的50，000個重組體中篩選相關序列。在低嚴緊度的雜交和沖洗條件下，探測到總共152個雜交克隆。通過序列分析來自雜交克隆的DNA鑒定了其它的13個不同的細胞色素p450同源物。在這些克隆中分辨出兩種緊密相關同胞組。在DNA水平上，這兩組中每一組的編碼區表現出94%的同源性或相似性。選擇一個同胞組的兩個代表，pCGP147(圖5A)和pCGP176以及另一同胞組的一個代表pCGP175(圖5B)作進一步研究Northern和RFLP分析細胞色素P450同源物用Northern和RFLP分析區別有編碼3′，5′-羥化酶cDNA分子特征的細胞色素P450同源物。在碧冬茄中有兩個遺傳位點Hf1和Hf2控制3′，5′-羥化酶活性(de Vlaming等人，1984;Wiering，1974)。Hf1在碧冬茄花的瓣片和合瓣花冠中表達，并產生比僅在瓣片中表達的Hf2高很多的3′，5′-羥化酶活性水平。矮牽牛花的3′，5′-羥化酶活性也是隨發育和空間調節的。在正常生長條件下，僅在花瓣組織中可檢測到這種酶，在花發育的3-4期左右達到最高水平，然后在全開的花中下降(周期5;見圖2B)。在某種逆境條件下，如上述的蔗糖/強光處理，也可在葉組織中誘導酶活性。因此，期望能編碼3′，5′-羥化酶的cDNA克隆在RNA印跡上有一個相應于酶活性圖譜的表達概況。也希望把編碼碧冬茄3′，5′-羥化酶的cDNA克隆繪制到Hf1或Hf2位點。已經把Hf1繪制在碧冬茄基因組的第一條染色體上并與ph1位點相連(Cornu，1984，Cornu等人，1990)，同時Hf2緊密連接在第五條染色體上的PO(Wallroth等人，1986)。將從近親系V23(Hf1/Hf1，Hf2/Hf2)和R51(hf1/hf1，hf2/hf2)雜交得到的植物F2群體中分離的DNA進行RFLP分析，以獲得各種細胞色素P450同源物的連鎖資料。規定在花冠中有3′，5′-羥化酶活性的F2植物是Hf1/-基因型。另外，基于與影響花瓣液泡的pH的ph1基因連鎖也可以給F2群體植物提供Hf1/Hf1基因型(Wiering和de Vlaming，1984)。
V23親本系(Hf1/Hf1)也有導致花瓣勻漿pH約6.2的ph1/ph1基因型。由于ph1/植物的花瓣勻漿pH為5.3，所以通過分析花瓣勻漿的pH，可以區別在R51×V23F2組群中的ph1/ph1(Hf1/Hf1)。
利用Hf2和po位點之間的連鎖可以區別需選擇的Hf2克隆。已經表明Po位點相應于編碼苯基苯乙烯酮黃烷酮異構酶的碧冬茄Chi-A基因，(Van Tunen等人，1991)。因此，在RFLP分析中可以用Chi-A的cDNA克隆，以規定在F2組群中的個體具有Po或Po基因型。由于V23有基因型Hf2/Hf2，Po/Po，因此，由類似V23和類似R51的RFLP共分離圖譜和由Chi-A探針檢測的Po和Po圖譜可以確定與Hf2位點的連鎖。
用對應于細胞色素P450同源物的3′未轉譯區的cDNA片段，探測從V23×R51 F2組群的個體植物中分離出的染色體DNA的RNA印跡和Southern印跡。通過這種分析，表明對應于cDNA克隆pCGP174和pCGP175的基因以平行于3′，5′-羥化酶活性的方式進行表達。進一步地說，相應于pCGP174的基因與Hf1位點緊密連接，pCGP175與Hf2位點連接。
a.pCGP174來自克隆pCGP174(圖5A)的330bpHindⅢ-KpnI3′片段與RNA和DNA印跡具有雜交圖譜，圖譜顯示該克隆相應于Hf1位點(圖6)。在瓣片和合瓣花冠組織中表達該基因，且該基因有一個平行于3′，5′-羥化酶活性的發育概況，在第3期的花瓣中達到峰值。在葉中未檢測到它的表達，但在該組織中，通過蔗糖/強光處理可誘導其表達。進一步說，在hf1/hf1突變系R51或Sw63的花瓣組織中，沒有探測到這種基因的表達。相反，在Hf1/Hf1系的V23和Th7以及V23×R51雜種中(圖.6A)可檢測到相當高水平的表達。
在用XbaI消化的染色體DNA的Sourthern印跡上，來自pCGP的330即HindⅢ-KpnI3′片段探測到兩個在V23×R51組群中單獨分離的RFLP，RFLP＃1相當于強雜交DNA帶，RFLP＃2相當于弱雜交帶(見圖6B)。具有ph1/ph1基因型的12株植物中有11株具有類似V23的RFLP＃1圖譜，并且在合瓣花冠中有3′，5′-羥化酶活性的49株植物中49株具有或者類似于V23或者類似于VR的RFLP＃1圖譜。另外，對于全部32株植物，V23，VR和R51的chi-A(PO)具有完全共分離的RFLP圖譜，包括相應的RFLP＃2圖譜。
該資料提供了有力的證據;pCGP174編碼3′，5′-羥化酶并相當于Hf1位點(RFLP＃1)并且3′探到與Hf2位點(RFLP＃2)交叉雜交。
b.pCGP175來自克隆pCGP175(圖5B)的320bpHindⅢ/xhoI3′片段在RNA和DNA印跡上有雜交圖譜，說明該克隆對應于Hf2位點(圖7)。Northern分析表明基因以與pCGP174相似的方式受發育調節，在第3期的OGB花瓣瓣片中，得到最大程度的表達，但在OGB的花冠組織中未檢測到其表達。該基因在V23(Hf2/Hf2)，Th7(Hf2/Hf2)和V23×R51雜交體(圖7A)的花瓣組織中也表達。
在Southern印跡上，來自pCGP175的320bpHindⅢ/×hoI片段與同pCGP1743′探針弱雜交(RFLP＃2)的V23和R51染色體DNA由XbaI消化產生的相同基因組片段雜交。通過pCGP1753′探針檢測，有類似V23-，VR-和R51-的RFLP圖譜完全共分離，相應于Chi-A(Po)的RFLP圖譜。
隨后的酵母表達實驗(見下面)證實pCGP175和pCGP174的一個同胞(pCGP176)兩者都編碼3′，5′-羥化酶。另外，pCGP174全長模板在hf1/hf1，hf2/hf2矮牽牛花突變體中的表達，導致3′，5′-羥化酶活性提高并產生高于在非轉基因植物中存在的正常低基礎水平的3′，5′羥化花色素苷。與RFLP結果歸在一起，從這些數據中得出結論，pCGP174相當于Hf1位點，pCGP175相當于Hf2位點。
分離全長的Hf1cDNA克隆并序列分析從初步的序列分析表明，pCGP174并不代表一個相應轉錄的全長克隆，但pCGP175包括一個假設起始密碼子并且認為它是一個全長的cDNA。序列分析也表明，pCGP176是一個較長的pCGP174變體并包括從5′末端起的ATG密碼為17bp。但是，單獨地通過這種分析不可能有把握地預言pCGP176是否包含該基因的全部編碼區。因此，篩選cDNA文庫＃2以得到pCGP174/pCGP176同胞組群的較長克隆。從來自cDNA文庫＃2的約1.5×105個重組體中篩選出與來自pCGP174的0.33KbHindⅢ-KpnI3′片段雜交的克隆。選擇兩個雜交克隆，稱作pCGP601和pCGP602作進一步分析。
pCGP601和pCGP602兩者都包括假設的轉譯起始密碼子，但是pCGP602編碼一個較長的5′非轉譯區。
圖8是pCGP602的限制酶圖譜，顯示對該克隆進行序列分析所采用的方法以及獲得重疊序列信息所使用的寡聚核苷酸引物。
在圖9中顯示同胞克隆pCGP176和pCGP602的核苷酸序列和推導出的氨基酸序列。同樣，
圖10表示pCGP175的核苷酸序列和推導出的轉譯產物。
使用由LFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)產生的序列，發現由矮牽牛花3′，5′-羥化酶基因編碼的氨基酸序列有94%的位置等同。核苷酸序列是94%等同。根據細胞色素P450的分類示意圖，該序列安置了兩個同一族/亞族的基因。由于3′，5′-羥化酶氨基酸序列與先前鑒定的細胞素P450總科成員相比具有低于40%的等同，所以相應的基因屬于從其他P450基因分離的新P450科。
在酵母中表達pCGP175以一有意義的方向，將來自pCGP175的cDNA插入片段連接在酵母載體pYGA22m的甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的后面。將所得的稱作pCGP618(
圖11)的構建體轉化到酵母菌株G-1315(AshiKari等人，1989)中。讓一個單獨的轉化體在50mL的YNBC中于30℃生長2天。從這一培養物制備的微粒體部分顯示有3′，5′-羥化酶活性，而從非轉化酵母制備的等同部分沒有活性(
圖12)。由此可得出結論，從pCGP175分離的cDNA插入片段編碼3′，5′-羥化酶。
在酵母中表達pCGP176cDNA以一有意義的方向，把來自pCGP176的cDNA插入片段連接到酵母載體pYGA22m的甘油醛-3-磷酸脫氫酶后面。把所得的稱作pCGP620的構建體轉化到酵母菌株G-1315中。從該轉化酵母制備的提取物有3′，5′-羥化酶活性，而從非轉化酵母制備的等同部分沒有活性(
圖13)。由此得出結論，來自pCGP176的cDNA插入片段編碼3′，5′-羥化酶。
Hf1cDNA的表達a.在hf1/hf1，hf2/hf2碧冬茄F1雜交體SKr4×SW63中表達把pCGP602cDNA插入片段連接在Ti雙重載體pCGp293啟動子Mac的后面。把所得的稱作pCGP90的構建體，使用土壤桿菌介導的基因轉移方法導入F1矮牽牛花雜交體SKr4×SW63中。SKr4×SW63的葉圓片與AGLO/pCGPP90共培養，并通過Sourthern分析卡那霉素選擇后得植物證實，CGP602cDNA插入片段整合到SKr4×SW63基因組中。
轉基因植物比非轉基因的SKr4×SW63雜交體有顯著高水平的3′，5′-羥化酶活性(
圖15)和3′，5′-羥化的花色素苷(表3A)。雖然SKr4×SW63的Hf1和Hf2是純合隱性的，但這些突變不完全阻斷酶產生，在SKr4×SW63花瓣提取物中(
圖15)可檢測到低水平的3′，5′-羥化酶活性。另外，在酸水解的SKr4×SW63花瓣提取物中檢測到低水平(100μg/gm)的二甲翠雀素(表3A)。Hf1cDNA的導入明顯地提高了花瓣瓣片組織中3′，5′-羥化酶的水平(
圖15)并且來自突變植物花瓣的酸水解提取物中二甲翠雀素的水平是非轉基因對照植物中的4倍(表3A)。
b.在紅花煙草栽培種xanthi中表達煙草(紅花煙草cvxanthi)花產生如基底花色素一樣的花色素。用pCGP90轉化煙草導致在花中除花色素以外積累顯著高含量的翠雀素(顯示于表3A)。
表3A色素分析在酸水解的花瓣提取物中花色素水平植物二甲翠雀素花色素翠雀素(μg/gm花瓣)(μg/gm花瓣)(μg/gm花瓣)矮牽牛花SKr4×SW63100nd'ndSKr4×SW63/pCGP90410ndnd煙草非共培養對照nd272nd轉基因煙草nd22936
1未檢測到c.在hf1/hf1，hf2/hf2碧冬茄F1雜交體Rp57×Rw14中表達用pCGP90和相同于SKr4×SW63所用的方法轉化矮牽牛品系Rp57×Rw14。轉基因花產生顯著的在非轉基因植物檢測不到的3′-甲花翠素和二甲翠雀素(表3B)。3′-甲花翠素和二甲翠雀素都是翠雀素的甲基化衍生物。
表3B高PH系Rp57×RW14的色素分析在酸水解花瓣提取物中存在的花色素百分比植物花色素甲基花青素3-'甲花翠素二甲翠雀素(%)(%)(%)(%)矮牽牛花Rp57×RW145.095.000Rp57×RW14/pCGp90045.27.847.0導入的Hf1cDNA在SKr4×SW63雜交體中的表達對花的顏色有明顯的影響。未轉基因花的心皮和雄蕊組織是白色的，而在轉基因植物中，這些同樣的組織是蘭/紫色。另外，在SKr4×SW63雜交體中表達Hf1cDNA使通常為很淡的粉紅色的花冠具有深粉紅色/紫羅蘭色。對于煙草的情況，產生的翠雀素衍生物產生輕微蘭色的成熟中的花。在Rp57×RW14雜交體中表達Hf1cDNA對花色也有明顯的影響。非轉基因的Rp57×RW14花是粉紅色的，其主要存在的花色素是甲基花青素(見表3B)。用Hf1cDNA轉化導致花色明顯變蘭。
可依據來自RoyalHorticulturalSociety′sCoLourChart的數據描述觀察到的顏色改變。通常，可把改變描述成從60C/D-65C/D的淡到居中的粉紅色，到由許多而不是全部的70到85之間的顏色面積表示的深蘭/紫色。雖然不希望限制可達到的可能顏色改變，可以把一些在SKr4×SW63雜交體中觀察到的顏色近近似地描述成從65B(未轉化)到70B和到74B(兩者是轉化的)的變化。同樣，在Rp57×RW14中的幾個雜交體可以描述成從64C到72B到77B和到82B的改變。應該記住其他生物化學和生理學條件也影響個體結果并且所得的特殊顏色的例子不應被解釋為限制可能的范圍。
在其他植物種中檢測假設的3′，5′-羥化酶基因序列3′，4′，5′-羥化的類黃酮的存在與3′，5′-羥化酶活性和其3′，5′-羥化酶基因的存在有關。可以預料來自其它物種的這些基因在低嚴緊度的條件下可與矮牽牛花3′，5′-羥化酶基因雜交。從一些產生翠雀素的植物分離出RNA(
圖16)和/或DNA(
圖17)，用32P-標記的Hf1 cDNA在不同嚴緊度的條件下探測并洗滌。在每個樣品中檢測雜交帶。因此，使用矮牽牛花3′，5′-羥化酶基因作為探針從其它產生翠雀素的植物中分離3′，5′-羥化酶基因應是可能的。
本領域專業人員懂得本文描述的發明除那些特別描述外可以進行改變和修飾。可以理解本發明包括全部上述變異和修飾。本發明也包括在本說明書中單獨地或共同地涉及或說明的全部步驟，特征，組合物和化合物，以及任何將全部任意兩個或更多的所述步驟或特征的結合。
權利要求
1.一種核酸分離物，包含一種核苷酸序列，該序列編碼或互補于一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或部分的序列。
2.根據權利要求1的核酸分離物，其中所說的核酸是DNA或cDNA。
3.根據權利要求1或2的核酸分離物，其中的酶是一種3′，5′-羥化酶。
4.根據權利要求3的核酸分離物，其中的酶來源于牽牛花，馬鞭草，飛燕草，葡萄，鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
5.根據權利要求4的核酸分離物，其中的酶是來源于牽牛花。
6.根據權利要求5的核酸分離物，該分離物具有一個核苷酸序列，它包含有基本上全部或部分圖9或10中所示的核苷酸序列，或者與其至少具有40%的相似性。
7.根據權利要求1、4、5或6的核酸分離物，所說的分離物是存在于轉基因植物中。
8.根據權利要求7的核酸分離物，其中的轉基因植物是玫瑰、牽牛花、菊花，荷蘭石竹，非洲菊，天竺葵、或alstroemeria
9.根據權利要求8的核酸分離物，其中的轉基因植物是玫瑰或牽牛花。
10.根據權利要求1、4、5或6的核酸分離物，它存在于一種能夠將所說核酸分離物轉移到植物細胞或組織中的載體分子中。
11.根據權利要求10的核酸分離物，其中所說的轉移需要與土壤農桿菌一起培養。
12.根據權利要求10或11的核酸分離物，其中的載體和核酸分離物是
圖11中所示的pCGP90。
13.一種重組二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或其部分。
14.根據權利要求13的重組酶，其中所說的酶是一種3′，5′-羥化酶。
15.根據權利要求13或14的重組酶，其中所說的酶來源于牽牛花、馬鞭草、飛燕草、葡萄、鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
16.根據權利要求15的重組酶，其中的酶來源于牽牛花。
17.根據權利要求16的重組酶，它所具有的氨基酸序列包含有基本上全部或部分圖9或10中所示的氨基酸序列或具有與其至少40%的同源性。
18.根據權利要求13、15、16或17的重組酶，它存在于一種轉基因植物中。
19.根據權利要求18的重組酶，其中所說的轉基因植物是玫瑰、牽牛花、菊花、荷蘭石竹或非洲菊。
20.根據權利要求19或20的重組酶，其中的轉基因植物是玫瑰或牽牛花。
21.一種產生轉基因植物的方法，該植物能夠表達一種重組二氫莰非醇(DHK)羥化酶，或控制一種基本上互補于全部或部分mRNA分子的核酸序列的轉錄，該mRNA分子可被翻譯成DHK羥化酶，所說的方法包括向一種合適的植物細胞中導入權利要求1或6的核酸分離物，導入條件允許最終表達所說的核酸分離物，從細胞中再產生一種轉基因植物，和使所說的轉基因植物生長一段時間，并且導入條件足以允許核酸分離物的表達。
22.根據權利要求21的方法，其中重組酶是3′，5′-羥化酶。
23.根據權利要求21或22的方法，其中核酸分離物的表達是隨發育調節的。
24.根據權利要求23的方法，其中的重組酶來源于牽牛花、馬鞭草、飛燕草、葡萄、鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
25.根據權利要求26的方法，其中的重組酶來源于牽牛花。
26.根據權利要求25的方法，其中的核酸分離物或酶具有一種基本如圖9或10所示的核苷酸或氨基酸序列，或者與其具有至少40%的相似性。
27.根據權利要求21、24、25或26的方法，其中的轉基因植物是玫瑰、牽牛花、菊花、荷蘭石竹、非洲菊或煙草。
28.根據權利要求27的方法，其中的轉基因植物是玫瑰或牽牛花。
29.一種帶有穩定導入的核酸分子的轉基因植物，含有一種核苷酸序列編碼或互補于一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶核苷酸序列。
30.根據權利要求29的轉基因植物，其中的酶是一種3′，5′-羥化酶。
31.根據權利要求30的轉基因植物，其中的酶來源于牽牛花，馬鞭草，飛燕草，葡萄，鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
32.根據權利要求31的轉基因植物，其中的酶來源于牽牛花。
33.根據權利要求32的轉基因植物，其中的酶具有一種基本上如圖9或10中所示的氨基酸序列，或與其具有至少40%的相似性。
34.根據權利要求29至33的任何一種轉基因植物，其中所說的植物是玫瑰、牽牛花、菊花、荷蘭石竹、非洲菊、鳶尾，郁金香，百合，lisianthus，小蒼蘭，飛燕草，limunium，天竺葵。
35.根據權利要求34的轉基因植物，其中的轉基因植物是玫瑰或牽牛花。
36.一種克隆核酸分子的方法，該分子含有一種編碼來源于植物的細胞色素P450分子或類似分子的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列，所說的方法包括用一種或幾種寡聚核苷酸引物通過一種或幾種聚合酶鏈反應對來源于所說植物細胞的合適核酸分子制備物中的細胞色素P450核苷酸序列或互補序列進行放大，所說引物具有一種來源于一種或幾種已知微粒體細胞色素P450分子的一致序列的核苷酸序列。
37.根據權利要求36的方法，其中的一致序列是來源于細胞色素P450分子的血紅素結合區。
38.根據權利要求37的方法，其中的一致序列是F(G，S)XGXRXCXG，其中X是任何氨基酸。
39.根據權利要求37的方法，其中的一致序列是FMPFGAGXRXCLG，其中X是任何氨基酸。
40.根據權利要求36、37、38或39的方法，其中的細胞色素P450分子或類似分子是一種DHK羥化酶。
41.根據權利要求40的方法，其中的DHK羥化酶是3′，5′-羥化酶。
42.根據權利要求40的方法，其中克隆的酶具有一種圖9或10中的氨基酸序列或基本是由圖9或10中的核苷酸序列所編碼，或者具有與其40%的相似性。
全文摘要
本發明涉及一種核酸分離物，它含有一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或部分的核苷酸序列或其互補序列。本發明還涉及到帶有和表達上述核酸物質的轉基因植物。
文檔編號A01H5/02GK1071456SQ92109770
公開日1993年4月28日 申請日期1992年7月11日 優先權日1991年7月11日
發明者T·A·霍爾頓, E·C·科尼什, F·科瓦契奇, Y·特納克, D·R·萊斯特 申請人:同際花卉開發有限公司