高抗草甘膦的epsp合酶及其編碼序列的制作方法

專利名稱：：高抗草甘膦的epsp合酶及其編碼序列的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物學領域，具體地說，本發明涉及從采用免培養技術構建的群落水平DNA庫中分離的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白產物。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發明的多肽是一種具有抗草甘膦抗性的酶。
背景技術：
：草甘膦(Glyphosate)為內吸傳導型、廣譜滅生性除草劑，其作用機制是通過抑制植物體內5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，干擾植物體內芳香族氨基酸的生物合成，導致植物死亡。應用化學誘變細菌產生的突變體，抗藥性機理研究確證了基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。近年來包括美國和中國在內的國家，草甘膦產量急劇增加還與系列轉基因抗草甘膦品種的選育和大面積的推廣有直接的關系。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因『"及其抗草甘膦轉基因植物等方面已申請了100余份專利，獲得轉基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉基因作物已進入商品化生產。我國在轉基因抗草甘膦作物方面的研究己取得一定進展，但目前尚無轉抗草甘膦基因作物進入商品化階段的報道。同時，由于沒有配套出口轉基因抗除草劑種子的優勢和抗草甘膦基因專利，與國外大公司在市場銷售競爭中處于極為不利的地位。因此，本領域迫切需要開發新的抗草甘膦的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶。
發明內容本發明的目的是提供一種新的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(簡稱為"EPSP合酶")以及其片段、類似物和衍生物。本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物抗草甘膦抗性方面的用途。在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的EPSP合酶多肽，它包含具有SEQIDN0:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經過一個或多個(較佳地1-20個，更佳地1-10個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:1中1-1287位的序列;(b)具有SEQIDNO:1中1-1290位的序歹廿。在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。在本發明的第四方面，提供了制備具有活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有活性的多肽。在本發明的第五方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。在本發明的第六方面，提供了一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了本發明的EPSPS的核苷酸序列(SEQIDN0:1)。圖2顯示了本發明的EPSPS的氨基酸序列(SEQIDN0:2)。圖3顯示了本發明的EPSPS與II類EPSPS的比對結果。其中星號代表相同的氨基酸；句號標記保守的氨基酸；冒號標記十分保守的氨基酸；陰影標記的區域表示與草甘膦抗性和維持PEP綁定相關的重要區域。圖4顯示了本發明RDEPSPS與部分I類和II類EPSPS的系統發育比較圖。圖5顯示了RDEPSPS的草甘膦耐受實驗結果。圖6顯示了本發明EPSPS的SDS-PAGE電泳結果，其中泳道如下泳道1:M;泳道2:未誘導RDEPSPS蛋白泳道3:IPTG誘導的RDEPSPS。具體實施方式本發明人經過廣泛而深入的研究，從采用免培養技術構建的群落水平DNA庫中分離獲得了一種新的EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。在此基礎上完成了本發明。在本發明中，術語"EPSPS"、"EPSP合酶"、"EPSP合成酶""EPSP多肽"或"5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶"可互換使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQIDN0:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的EPSP合酶或多肽"是指EPSP多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化EPSP合酶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括EPSP合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的天然EPSP合酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語"EPSP多肽"指具有EPSP合酶活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術語還包括具有與EPSP合酶相同功能的、SEQIDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為l-50個，較佳地1-30個，更佳地l-20個，最佳地l-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為IO個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與EPSPSDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EPSP多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約IOO個連續氨基酸。發明還提供EPSP合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然EPSP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。在本發明中，"EPSP合酶保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表l進行氨基酸替換而產生。表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDN0:1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發明中是指編碼具有SEQIDN0:2的蛋白質，但與SEQIDNO:l所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼EPSP合成酶的多聚核苷酸。本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。本發明的EPSPS核苷酸全長序列或其片段通常可以用人工合成、PCR擴增法、或重組法的方法獲得。例如首先根據SEQIDNO:l的序列進行全序列合成。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全長序列或其片段作為模板，擴增而得有關序列。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或EPSP合酶編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science，1984;224:1431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的EPSP多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼EPSP多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，EPSP合酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含EPSP合酶編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導m脂A合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌;真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl^法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得抗草甘膦抗性提高的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。另一方面，本發明還包括對EPSP合酶DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與EPSP合酶基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影響EPSP合酶功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的EPSP合酶基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的EPSP合酶基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達EPSP合酶或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發明的各類抗體可以利用.EPSP合酶基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EPSP合酶基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如KCoh')中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。抗EPSP合酶的抗體可用于檢測樣品中的EPSP合酶。多克隆抗體的生產可用EPSP合酶或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。本發明還涉及定量和定位檢測EPSP合酶水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。一種檢測檢測樣品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與EPSP合酶特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在EPSP合酶。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(niicroarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于基因的表達分析。用EPSP合酶特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測EPSP合酶的轉錄產物。在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從采用免培養技術構建的群落水平DNA庫中分離的并人工全合成的。其序列如SEQIDN0:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1290個堿基，其開放讀框位于1-1287位，編碼全長為429個氨基酸的EPSP合酶(SEQIDN0:2)。本發明的該EPSP合酶被簡稱為"RDEPSPS"。本發明的EPSP合酶具有如下主要特點.-A)草甘膦抗性功能明確，且顯示了高于以前報道的抗草甘膦能力；B)結構新，在核酸水平上與已見報道的EPSP合酶編碼基因無明顯同源性，在氨基酸水平上與其他EPSP合酶的同源性也較低。本發明的EPSP合酶為改變植物的抗草甘膦抗性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景。可以通過將EPSP合酶的編碼基因導入，改變現有優良農作物品種的抗草甘膦抗性，可獲得抗草甘膦的小麥、水稻或其它農作物品種，解決農業生產中存在的實際問題。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:髙抗草甘膦的DNA片段克隆1、草甘膦極端污染環境中土壤樣品的采集自然環境中特別是在長期使用草甘膦等除草劑地區的土壤中，存在種類繁多的能耐受草甘膦或其它除草劑的細菌菌株。從被50%左右草甘膦污染達十年以上的土壤中(河北某化工有限公司草甘膦生產工廠開放式分裝點)采集樣品。2、采用免培養方法從草甘膦極端污染土壤樣品中分離群落水平總DNA稱取草甘膦污染土壤樣品2克，加入0.6g細玻璃珠(cKO.llmm)，4000轉/分振蕩2次。加入3002%SDS+12%苯酚Tris緩沖液(pH8.0)溶液冰上1小時，加入等量苯酚Tris緩沖液,pH8.0(約700ml)，充分混勻，經4°C，13,000rpm離心5分鐘。上層溶液加入0.1倍體積的3MNaAcpH5.2，混勻后加入0.6倍體積異丙醇混勻。DNA沉淀溶于200lUlxTE(粗DNA)。稱100mg氯化銫置于一個新的1.5mlEpp.離心管中，加入100ul粗DNA輕輕混勻，室溫黑暗條件下靜置1-3小時。室溫，13，000rpm，離心20分鐘。上清液中加入400u1無菌去離子水和300u1異丙醇，室溫靜置30分鐘。室溫，13，000rpm，離心20分鐘。沉淀溶于100u1lxTE和40ul8M醋酸鉀(KAc)，室溫靜置15分鐘。4°C，13,000rpm離心15分鐘。上清液加入0.6倍體積異丙醇混勻。室溫靜置30分鐘。室溫，15，000rpm離心20分鐘。DNA沉淀溶于100ullxTE。采用Wizardspincolumnclean-up分離試劑盒純化DNA樣品。純化DNA溶于總體積為100lU的10mMTris-EDTA(pH8.0)緩沖液中。3、群落水平總DNA粘粒文庫的構建土壤細菌DNA用Sm/3AI在10|nl反應體系進行部分酶切試切，Saw3AI酶按1:100稀釋，37°C，分別酶切10min，20min,30min,40min，50min,60min后加入10Xloadingbufferlpl終止反應，電泳檢測最適酶切反應時間。而后選擇相同的體系酶切30min進行大量酶切。經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收26kbDNA片段備用。質粒載體pACYC184(購自NEB公司)用5amHI完全酶切后用SAP堿性磷酸脂酶進行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的土壤細菌DNA(200ng)和末端去磷酸化的質粒載體pACYC184(150ng)用2U的T4ligase在4°C下連接16h。上述連接產物轉入EER2799(購自NEB公司)電擊感受態細胞，涂布LB+Cnf+Knf。然后將LB板上生長的克隆影印到M9+CInr+Kmr+5(Mm草甘膦的平板，37。C培養48h。將平板上生長的菌經LB平板劃線培養后，將這些菌落再接種到含不同草甘膦濃度的M9平板上(IOO，150mm草甘膦)。將這些重組菌中的質粒抽提后重新轉化ER2799后涂布M9+Cnf+Knf平板驗證(ER2799+pACYC184為對照)，同時進行重組質粒酶切驗證。4、篩選草甘膦抗性轉化子將轉染細菌涂布含Cm(氯霉素)、Kra(卡那霉素)的LB平板上，37。C培養20h后，約有5000個菌落生長，將這些菌落影印到含Cnf、Knf和50mM草甘膦的M9平板上培養48h后，有三個菌落生長。將這三個菌落接種到含100raM、150mM的草甘膦的M9平板上培養，發現只有1個克隆能在含150mM的草甘膦的M9平板上生長，其所含的質粒被命名為pACYCRD。從該克隆抽提的質粒pACYCRD轉入AER2799或大腸桿菌JM109中，將轉化子用無菌牙簽點于含20mM草甘膦的MOPS固體培養基上檢驗抗性，結果證明這個克隆所產生的轉化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性確實是由于轉入pACYCRD引起的。5、草甘膦耐受實驗將大腸桿菌ER2799(含攜帶有新克隆的pACYCRD質粒)接種到含0200mm草甘膦的M9液體培養基(Cmr十Knf)中，經過37'C、72h的搖床培養后，測定培養物的OD,。同時以含無插入片段的質粒的大腸桿菌ER2799為陰性對照，以含插入已知草甘膦抗性基因HTG7ar^的大腸桿菌ER2799(含pACYCHTG7，該質粒攜帶有已知的草甘膦抗性基因HTG7ar^)作為陽性對照。結果將ER2799(攜帶pACYCRD質粒)接種到含0200mm草甘膦的M9液體培養基(Cnf+Kmr)中，經過37'C、72h的搖床培養后，發現陰性對照在M9中幾乎不能生長；陽性ER2799(pACYCHGT7)能在僅含有50mm草甘膦的M9液體培養基中生長良好；而ER2799(pACYCRD)則在含有200mm草甘膦的M9液體培養基中還能生長(圖5)。這一結果說明pACYCRD上攜帶的外源片段具有非常強的草甘膦耐受活性。實施例2:高抗草甘膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合成酶功能驗證1、高抗草甘膦的DNA片段的序列分析對實施例1中所亞克隆的高抗草甘膦DNA片段進行全核苷酸序列測定。分析結果表明，插入的片段大小為2482bp，其中包含了一個1290bp的閱讀框，其序列如SEQIDN0:1和圖1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1290個堿基，其開放讀框位于1-1287位，編碼全長為429個氨基酸的EPSP合成酶(SEQIDNO:2和圖2)。將所亞克隆的高抗草甘膦編碼序列與已報道的EPSP合酶編碼基因(flj)比較，在核苷酸水平幾乎沒有任何同源性。氨基酸序列同源性分析結果表明，本發明的EPSP合酶與蠟樣芽孢桿菌的EPSPS的氨基酸同一性為72%。多基因序列比對表明RDDEPSPS與I型的同一性低于30%;而與II的EPSPS的同一性高于50%(圖3)。該結果說明RDEPSPS屬于II類EPSPS。RDEPSPS與部分I類和II類EPSPS的系統發育比較結果如圖4所示。2、高抗草甘膦的DNA片段的EPSP合酶功能驗證序列分析結果顯示抗性克隆中含有EPSP合酶的ORF，為了證實其具有EPSP合酶活性，本實驗以常規的大腸桿菌EPSP合酶缺陷型菌株ER2799為受體菌株，采用CaCl2法將草甘膦抗性亞克隆pACYCRD轉入，用無菌牙簽將轉化子菌落點于MOPS固體培養基上，受體菌株ER2799、含有空載體質粒的ER2799為陰性對照，如抗草甘膦亞克隆含有可表達的EPSP合酶基因，互補了受體菌的缺陷，則能夠利用限制性培養基的無機物合成氨基酸并生長，否則就不能生長。試驗結果表明，草甘膦抗性亞克隆中所含的DNA片段均能在功能上互補EPSP合酶缺陷型菌株，因此，可以確定亞克隆pACYCRD中含有完整功能的EPSP合酶基因。實施例3:髙抗草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成根據已完成的含1290bp編碼區的核苷酸序列，首先分8個區段分別根據正鏈和副鏈序列，分別合成出長度約150-200bp、具有粘性末端的單鏈寡核苷酸片段。將正鏈和副鏈各一一對應的8個互補的單鏈寡核苷酸片段分別退火，形成8個帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段。混合雙鏈寡核苷酸片段，經T4DNA連接酶催化組裝成一個完整的EPSP合酶基因。該合成的DNA片段含有SEQIDNO:l中1-1287位的核苷酸序列，并且合成基因的上下游兩端含Ndel和HindIII位點。將上述人工合成的5'和3'端酶切位點為Ndel和HindIII位點EPSPS基因，用于表達高抗草甘膦的EPSP合酶以及構建相應的基因植物表達載體。實施例4:高抗草甘膦的EPSPS表達上述人工合成的5'和3'端酶切位點為Ndel和HindIII位點EPSPS基因，用Ndel和HindIII酶切后，連入相同酶切的載體pET28a(購自N0VAGEN公司)得到重組質粒pETRD并將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)。將轉化子先在LB+Kar^培養基中37°C，200rpm培養至OD,值約0.5，加入IPTG(終濃度為0.75mrool/L)后轉入37。C誘導蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測。經SDS-PAGE電泳檢測，含有pETRD的BL21(DE3)在37。C經IPTG誘導4h后表達量即達到最高值。目的蛋白為可溶性蛋白；大小約45kD，與預測值相符(見圖6)。實施例5:EPSPS的酶活測定和動力學參數的測定(a)測定方法無機磷標準曲線lOmM無機磷標準液按1:10稀釋，分別取0、1、2、3…20pl于1.5mlEppendorf離心管中,加入milli-Q純水至100^1混勻，加入MAT溶液0.8ml混勻，計時三分鐘后加入34%SC溶液100)Lil迅速混勻，室溫靜置20min后測定OD,值。重復三次。以無機磷濃度為橫坐標，OD,值為縱坐標作圖得到無機磷標準曲線。酶活測定酶粗提物蛋白定量采用考馬斯亮藍G-250染色法(Bradford,1976)。在冰上于1.5mlE卯endorf離心管中加入以下溶液10mMPEP溶液2^1，10mMS3P溶液2pl，0.5MHEPES溶液2pl，lmM(NH4)6M07024'4H20溶液2|il和railli-Q純水12^il混勻，于28"C溫浴5min后各管樣品間隔2S加入1^1粗酶液并計時，2min后再間隔2S依次加入200|ulMAT溶液，顯色3min后再間隔2S依次加入20|ul34%SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測定ODee。值。對照除不加酶液外，其余同樣品管。樣品管與對照管的OD,值相減后，對照無機磷標準曲線即可求得反應釋放出的無機磷摩爾量，再除以反應時間和酶蛋白量就得到該酶的酶活力(U/mg)。半抑制劑量(IC50)測定上述反應液中添加O、10-3、10-2、IO-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力數據以草甘膦濃度為X軸，采用對數坐標，以反應速度V(U/mg)為Y軸作圖。Km(PEP)測定將S3P溶液濃度恒定于lmM，在不同PEP濃度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、l.O函)下按上述反應體系測定酶反應速度，所測數值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作圖。Ki(glyphosate)測定在不同草甘膦濃度(O、10、50、100-)下測定PEP濃度為66.7、100、200、500nM時EPSPS的酶反應速度。采用雙對數作圖，得到l/V-l/[S]直線，再將各直線的斜率作為縱坐標，草甘膦濃度作為橫坐標得到一條新的直線，該直線與X軸的交點即為Ki(glyphosate)值。(b)結果RDEPSPS的酶活性為15.57U/mg。RDEPSPS的動力學參數測定如下表所示動力學參數IC50(glyphosate;mM)A;(PEP;mM)A(glyphosate;mM)RDEPSPS15.075±0.0120.0343±0.0320.146±0.002根據RDEPSPS的動力學參數可知，RDEPSPS不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，這些特性將為將RDEPSPS用于轉基因作物的培育提供可能。實施例6:髙抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體的構建高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體構建的具體方法如下A.pBI121(購自ClonTech公司)和pCAMBIA2301(購自ClonTech公司)用HindIII和EcoRI雙酶切，將pBI121帶有p35S-GUS-Nos-ter的片段連入pCAMBIA2301，形成中間載體p35S-2301-GUS;B.用Xbal和Sacl雙切p35S-2301-GUS和上述人工合成的EPSPS基因，用EPSPS置換p35S-2301-GUS相應酶切位點的GUS，從而獲得高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體。再將其轉入農桿菌中，用于轉化模式植物煙草。實施例7:利用葉盤法轉化構建抗草甘膦的轉基因煙草(1)用無菌牙簽挑取YPE選擇平板上的實施例5中制備的陽性克隆，接種于2MLYPE液體(Sm+,Kan+)，28。C，200rpm振蕩培養24-36小時；(2)室溫下4，000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌體的OD,在0.5左右；(4)取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌液；把經浸染的葉片放于MS培養基上，28t:暗培養48小時；(6)將葉片轉到愈傷培養基(MS+6-BA1.0mg/l+NAAO.lmg/l+Kan50mg/l+羧節青霉素250mg/l)上，25-28。C光照下培養，7-15天可見愈傷組織的形成；(7)約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養基(1/2MS+NAA0.5mg/l+Kan25mg/l)上進行生根培養，2-7天左右生根；(8)待根系發達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著著的固體培養基，移入土壤中，剛開始幾天用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，轉移至在含10mM的草甘膦的固體培養基中篩逸草甘膦抗性的植株。(9)抗性植株經Southern、Northern雜交以及Westhemblot驗證為轉基因的抗性植株。(10)在溫室中經草甘膦抗性梯度實驗證明，轉基因植物能在含20mM和30mM草甘膦的培養基上良好生長。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。<110〉中國農業科學院生物技術研究所<120>高抗草甘膦的EPSP合酶及其編碼序列〈130>070601<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>1290<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉CDS<222〉(1)..(1287)<223〉EPSP合酶編碼序列<柳〉atgagtMetSer1ggaGly3幼LysCC3Pro5ttaLeuLysThraatAsncttLeu10teatctSerSercttc犯LeuGinGly15g犯Glu48￡LtttctlieSerattliecccPro20gggGlygatAsp鄉tegSerlie25tctSerescag8HisArggetgtgAlaVal30MetUcPhe96ggagcgGlyAlaatgMet35gcaAlag肌GlugggGlyLysactThr40acgThrlieaMcatAsnHistttttaPheLeu45AlaggtGly144gaagatGluAsp50tgcCystta_Leu敏SerThratelie55tctSertgtCysUtPheg肌aagGluLys60atgggcMetGlygtaValtegSer192lie乙ys65Argg犯GluggcGlyGlu70tatTyrgttValgaaGlugtgValg肌ggtGluGly75a朋ggtLysGlyateliegaaGlu80240ggat"UGlyLeuagtSerg犯GlucctPro85actThrtecSeratelieLeugatAsp90gtaggaaatteaValGlyAsnSerGly95Thr288actactcgtttaatgctggggattcttgecggtgtgccatttcatacgThrThrArgLeuMetLeuGlylieLeuAlaGlyValProPheHisThr100105110336tctctaattggagatgagtegattgccaagcgtccaatgagecgtgtt384SerLeulieGlyAspGluSerlieAlaLysArgProMetSerArgVal115120125acggtgccgctgcgctctatgggtgcaaagattgatgggcgtgagcat432ThrValProLeuArgSerMetGlyAlaLyslieA印GlyArgGluHis130135140ggccaatatacgcctttatctactagaggaggagcattaaaagcaatt480GlyGin丁yrThrProLeuSerThrArgGlyGlyAlaLeuLysAlalie145150155160cattaccattctcctgtagcaagtgcacaagtaaaateggcgatttta528HisTyrHisSerProValAlaSerAlaGinValLysSerAlalieLeu165170175cttgcgggacttcatgccgaaggcacaacaaaagtaaccgagcctttt576LeuAlaGlyLeuHisAlaGluGlyThrThrLysValThrGluProPhe180185190acateacgcgaccataccgagcgtatgcttcgcgcatttggagtagac624ThrSerArgAspHisThrGluArgMetLeuArgAlaPheGlyValAsp195200205gtagaggtagatggaacgactgtaagtattgaagggggacaatecctg672ValGluValAspGlyThrThrValSerlieGluGlyGlyGinSerLeu210215220cgcggaacggatgtgtacgtccctggagacatttctteagetgcattc720ArgGlyThrAspValTyrValProGlyAsplieSerSerAlaAlaPhe225230235240tttcttgttgcaggagccattgttccaaacagecgaategttttgaaa768PheLeuValAlaGlyAlalieValProAsnSerArglieValLeuLys245250255aacgtcggaetcaatcctacaagaacaggtattattgatgtgcttcag816AsnValGlyLeuAsnProThrArgThrGlylielieAspValLeuGin260265270caaatgggtgcacgccttacaatttecaatgaacgtattcaaaatgga864GinMetGlyAlaArgLeuThrlieSerAsnGluArglieGinAsnGly275280285gagcctattggcgatttgacgattgaaacgtctcagttgaaagggatt912GluProlieGlyAspLeuThrlieGluThrSerGinLeuLysGlylie290295300gaaattgggggcgatttaattcctcgtttaattgatgaaattccggta960GlulieGlyGlyAspLeulieProArgUulieAspGlulieProVal305310315320ategetlieAlacttLeuttgLeugcgAla325actThrC3gGingC3AlaactThrgggGly330333Lys3CgThrgtgValattlie3aaLys335g3tAsp1008gcggaaAlaGlug3￡lGluetaLeu340LysgtaValILysg犯Glu￡LCgThr345aacAsncgcArgateliegatAspacgThr350gttValAla1056accgagThrGluetaLeu355ageSer卿LysctgLeuggtGlygccAla360tctSergttValacgThrccaProThr365getAlaAspggcGly1104etcateLeulie370a/ttlieGluggcGly犯gLysacgThr375gccAlactgLeucgaArgageSerggtGly380g肌GlugtaValgacAspageSer1152"UcggaTyrGly385gatAspcatHiscgaArgattlie390GlyatgMetatgMetcttLeugcgAla395gtcValgcaAlaAlagccAlaattlie4001200gcaacgAlaThrggaGlygagGluVal405acgThretaLeuaat八sn卿ArgagtSer410AspgccAlalieHisgtcVal415tecSer1248taccctTyrProactThrtttPhe420tttPheg犯GluAspcttLeuAsp425GluetaLeu鄉Serc朋Gint犯1290<210〉2<211〉429<212〉PRT<213〉人工序列<400>2MetSerGlyLysProLeuLysThrAsnLeuSerSerLeuGinGlyGlu151015lieSerlieProGlyAspLysSerlieSerHisArgAlaValMetPhe202530GlyAlaMetAlaGluGlyLysThrThrlieAsnHisPheLeuAlaGly354045GluAspCysLeuSerThrlieSerCysPheGluLysMetGlyValSer505560lieLysArgGluGlyGluTyrValGluValGluGlyLysGlylieGlu65707580GlyLeuSerGluProThrSerlieLeuAspValGlyAsnSerGlyThr859095ThrThrArgLeuMetGlylieAlaGlyValProPheHisThrSerLeulie115ThrValPro130GlyGinTyr145HisTyrHisLeuAlaGlyThrSerValGlu210ArgGly225PheLeuAsnValGinMetGluPro290Glulie305lieAlaAlaGluThrGluteulie370TyrGly385AlaThrArg195ValThrValGlyGly275lieGlyLeuGluLeu355lieAspGlyTyrProThr訓GlyLeuThrSerLeu180AspAspAspAlaLeu260AlaGlyGlyLeuLeu340SerGluHisGluPhe420AspArgProPro165HisHisGlyValGly245AsnArgAspAspAla325LysLysGlyArgVal405PheGluSerLeu150ValAlaThrThrTyr230AlaProLeuLeuL_eu310ThrValLeu!Lyslie390ThrGluSerMet135SerAlaGluGluThr215VallieThrThrThr295lieGinLysGlyThr375GlyLeuAsplie120GlyThrSerGlyArg200ValProValArglie280lieProAlaGluAla360AlaMetAsnLeu105AlaAlaArgAlaThr185MetSerGlyProThr265SerGluArgThrThr345SerLeuMetArgAsp425LysLysGlyGin170ThrLeulieAspAsn250GlyAsnThrLeuGly330AsnValArgLeuSer410GluArglieGly155ValLysArgGlulie235SerlieGluSerlie315LysArgThrSerAla395AspLeuProAsp140AlatysValAlaGly220SerArglieArgGin300AspThrlieProGly380ValAlaSerMet125GlyLeuSerThrPhe205GlySerlieAsplie285LeuGluValAspThr365GluAlalieGin110SerArgLysAlaGlu190GlyGinAlaValVal270GinLyslielieThr350AlaValAlaHisArgValGluHisAlalie160lieLeu175ProPheValAspSerLeuAhPhe240LeuLys255LeuGinAsnGlyGlylieProVal320LysAsp335ValAlaAspGlyAspSerAlalie400ValSer41權利要求1.一種分離的EPSP合酶多肽，其特征在于，它包含具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。3.—種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求l和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:1中1-1287位的序列；(b)具有SEQIDNO:1中1-1290位的序列。6.—種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。7.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。8.—種具有EPSP合酶活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有EPSP合酶活性的多肽。9.一種能與權利要求1所述的EPSP合酶特異性結合的抗體。10.—種改變植物抗草甘膦抗性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。全文摘要本發明提供了一種新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(簡稱為“EPSP合酶”)，編碼EPSP合酶的多核苷酸和經重組技術產生這種EPSP合酶的方法。本發明還公開了編碼這種EPSP合酶的多核苷酸的用途。文檔編號C12N9/00GK101285057SQ200710039338公開日2008年10月15日申請日期2007年4月11日優先權日2007年4月11日發明者平淑珍,維張,敏林,丹金,偉陸,明陳申請人:中國農業科學院生物技術研究所