玉米根蟲和其他昆蟲害蟲的管理的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年9月20日提交的美國臨時申請第61/703,396號；2013年3 月14日提交的美國臨時申請第61/781，057號；2012年9月20日提交的美國臨時申請第 61/703, 414號；2013年3月14日提交的美國臨時申請第61/781，124號；以及2013年3月 14日提交的美國臨時申請第61/782, 116號的權益，所述臨時申請的全部內容以引用方式 并入本文。
[0003]序列表的引用
[0004] 序列表作為于2013年9月20日創建的名為"BB2191PCT_Sequence_Listing"的 文本文件于2013年9月20日提交，大小為167, 238字節，根據37C.F.R. § 1. 52 (e) (5)以 引用方式將其并入本文。
技術領域
[0005]
技術領域涉及包括具有提高的對一種或更多種昆蟲害蟲植食性（herbivory)的 易感性的植物的誘蟲作物和/或庇護作物，以及它們作為昆蟲害蟲管理計劃的一部分的用 途。
【背景技術】
[0006] 昆蟲、線蟲和相關的節肢動物每年在美國估計破壞15%的農作物，在發展中國家 破壞的比例更高。這種損害有些是在植物病原體、昆蟲和其他此類土生（soilborne)害 蟲在種子種植后攻擊種子時在土壤中發生的。例如在玉米的生產中，這種損害的其余部分 中有很多是由根蟲（以取食或者以別的方式損害植物根的昆蟲害蟲）、由切根蟲、歐洲玉米 螟（ECB)以及由取食或者損害植物的地上部分的其他害蟲引起的。有關害蟲對農作物的攻 擊的類型和機制的一般描述由例如以下文獻提供：Metcalf，1962年，《破壞性昆蟲和有益昆 蟲：它們的習性和防控（第四版）》(DestructiveandUsefulInsects:TheirHabitsand Control)FourthEdition)，（更早的版本由C.L.Metcalf和W.P.Flint編著），麥格勞-希 爾圖書公司（McGraw-HillBookCompany)，紐約，三藩市、多倫多、倫敦；以及Agrios，1988 年，《植物病理學（第三版）》（PlantPathology，3rdEd.)，學術出版社（AcademicPress)。
[0007] 在北美，傳統上，輪作和使用殺蟲劑是針對以下害蟲的主要管理策略：玉米根蟲 [西部玉米根蟲（DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)、北部玉米根蟲（Diabrotica barberiSmith和DiabroticabarberiLawrence)以及南部玉米根蟲（Diabrotica undecimpunctatahowardiBarber)]。但是，西部玉米根蟲（WCR)的生物變型（biotype)適 應而優先在大豆植物上產卵、北部玉米根蟲（NCR)的生物變型適應而導致卵的滯育延長、 玉米根蟲對土壤殺蟲劑和葉面殺蟲劑的逆抗性以及人們對連作玉米的不斷增加的需求，已 導致了近年來這種昆蟲害蟲的分布區顯著擴大。能防護根蟲的轉基因殺蟲性雜交玉米（Bt) 的市場供應提供了一種有效的替代方案，結果導致用于防控WCR的轉基因玉米的種植面積 快速增加。針對Bt殺蟲蛋白的廣泛使用，需要考慮昆蟲抗性管理方法。對于其他昆蟲害蟲 如歐洲玉米螟的防控計劃，存在類似的問題和關注。
[0008] 對于另外的防控方法存在著需求，所述另外的防控方法可與其他方法或者過程聯 合使用，以便得到成本效益性好且具有可持續性的昆蟲害蟲管理方案。對于降低昆蟲害蟲 發展對Bt毒素的抗性的可能性的方法也存在著需求。
【發明內容】
[0009] 本文提供了由于Crwl和/或Crw2的內源表達的降低而對昆蟲害蟲植食性的易感 性提高的植物。還提供了制備這種植物的方法。所述植物可為玉蜀黍（maize)、大豆、向日 葵、高粱、卡諾拉油菜（kanola)、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米或者甘蔗。玉蜀黍尤其值 得關注。昆蟲害蟲可為鞘翅目或者鱗翅目害蟲。玉米（corn)根蟲、歐洲玉米螟、日本金龜 子、秋幕毛蟲和香蒲毛蟲特別值得關注。
[0010] 還提供了包括這種植物的誘蟲作物。誘蟲作物可由選自以下的植物構成：玉蜀黍、 大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米和甘鹿。玉蜀黍特別值 得關注。
[0011] 提供了使用誘蟲作物來防控一種或更多種昆蟲害蟲的方法。
[0012] 還提供了包含這種植物的庇護作物。庇護作物可由選自以下的植物構成：玉蜀黍、 大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米和甘鹿。玉蜀黍特別值 得關注。
[0013] 本文提供了使用庇護作物來減少昆蟲害蟲發展對殺蟲劑或者對抗蟲轉基因植物 所提供的毒素的抗性的方法。
[0014] 附圖和序列表的說明
[0015] 由以下的"【具體實施方式】"及構成本申請的一部分的附圖和序列表可以更完全地 理解本公開。
[0016] 圖1顯示從葉取食選擇測定法獲得的結果，在該測定法中，將西部玉米根蟲（WCR) 甲蟲放在具有來自玉蜀黍crwl-Ac突變株的葉子和來自其野生型親緣株的葉子的盒子中。 結果代表9個生物樣品的平均值。
[0017] 圖2顯示玉蜀黍Crwl基因、crwl-Ac突變株系中的突變的位置以及公共的多樣性 株系C0109和NC316中的插入的位置的示意圖。
[0018] 圖3繪出了Crwl突變植株（MT)和野生型（WT)植株響應機械創傷（"機械創傷"） 和秋粘蟲毛蟲（FallArmywormcaterpillar)反合（"反合（Regurgitant)"）的茉莉酸 (JA)的定量。Crwl突變植株積累較高水平的JA，但僅響應所施加的應激。
[0019] 圖4繪出了來自Crwl突變植株（MT)和野生型植株（WT)的幼葉和成葉的對香豆 酸和阿魏酸水平的差異。
[0020] 圖5繪出了Crwl突變植株（MT)和野生型植株（WT)的葉木質素含量的差異。
[0021] 圖6A-6C顯示來自野生型親緣株的Crwl的cDNA序列與crwl-Ac突變等位基因的 比對，該突變等位基因是切除原始等位基因中存在的自主Ac轉座子而得到的。外顯子1中 的8bp插入（加框顯示）導致預測的肽鏈在插入位點處過早終止。
[0022] 圖7A-7C顯示來自野生型親緣株的Crwl的cDNA序列與crwl-C0109等位基因的 比對。該CrWl-C0109等位基因與其野生型親緣株相比，在外顯子2中添加了Ibp的插入和 兩個其他的bp變化（參見圖7A中的箭頭，其指示插入和bp變化的位置。）在外顯子2中 插入Ibp導致CRwl肽的過早終止。
[0023] 圖8A-8C顯示來自野生型親緣株的Crwl的cDNA序列與crwl-NC316等位基因的 比對。該crwl-NC316等位基因具有Ibp插入（參見圖8A中的箭頭）并在第二外顯子中具 有45bp插入。該Ibp插入的存在導致在45bp插入的位點處出現過早終止密碼子。
[0024] 圖 9A-9L顯示SEQIDNO:3、10、11、12、13、14、15,16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26和27的多肽的氨基酸序列的多序列比對。當某個位置處的所有殘基匹配共有序列的 殘基時，則顯示該殘基；否則顯示另外，精確匹配共有序列的殘基加框顯示。
[0025] 圖10顯示圖9A-9L中所示的多肽的每對氨基酸序列的序列同一性百分數和趨異 值（divergencevalue)〇
[0026] 圖11A-11G顯示ZmCrw2與crw2_Mutag突變等位基因之間的比對。
[0027] 圖12A-12F顯示ZmCrw2與crw2-EMS突變等位基因之間的比對。
[0028] 圖13顯示玉蜀黍同型半乳糖醛酸聚糖I(Homogalacturonanl，HGAl)基因（也稱 糖基轉移酶AER61或者Crw2)的結構。顯示了兩個增變基因（mutator)插入和EMS等位基 因的位置。
[0029] 圖 14A-14J顯示ZmCrw2 蛋白（SEQIDNO:29)與其同系物（SEQIDNO:34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、49 和 50)的比對。
[0030] 圖15顯示圖14A至14J中所示的多肽的每對氨基酸序列的序列同一性百分數和 趨異值。
[0031] 圖16(A)顯示10天齡的籽苗中crw2_Mutag突變等位基因的基因表達。總RNA樣 品是從葉子、莖桿和根組織收集，RT-PCR分析是使用基因特異性引物進行。crw2-Mutag突 變株在三個組織中顯示出差異表達，并且具有比野生型親緣株中的轉錄物長145bp的轉錄 物。圖16 (B)顯示crw2-TUSC突變株與其野生型親緣株比較的RT-PCR分析。
[0032] 圖17顯示匯編自Lynx數據庫的ZmCrw2基因在不同植物組織中的表達。
[0033] 圖18顯示與crwl-Ac突變株及其野生型親緣株相比較，來自crw2_EMS突變株 的葉圓片的TBO染色模式。葉子位置數字在每張小圖的下方表示，并且每個數字后的 "A"或"B"分別代表葉子的頂端部分或者基部部分。crw2-EMS突變株的葉圓片在整個 發育過程中呈現出均勻的深色染色，相比之下，正常的野生型葉圓片顯示深色染色直到過 渡（transition)(葉子數字7)，然后是較淺的染色。crw2-EMS突變株TBO染色模式類似 crwl-Ac突變株的TBO染色模式。
[0034] 圖19顯示在WCR甲蟲取食后的不同時間點，與其野生型比較的Crwl突變株的 Crw2轉錄物水平。在WCR取食45分鐘內，野生型植株中Crw2轉錄物的水平快速上調（A， 上小圖）。這種上調在Crwl突變株中在WCR取食時沒有觀察到（A，下小圖）。具有相同的 上樣方案的18SrRNA對照在B中表示。
[0035] 圖20 (A)顯示在成體階段，Crw2突變株（"MT"）與野生型（"WT"）相比，具有較低 水平的細胞壁結合的對香豆酸（PCA)和阿魏酸（FA)以及（B)較低水平的木質素（p< 0. 05 ; 非配對t檢驗）。
[0036] 本申請隨附的序列說明和序列表符合美國聯邦法規37C.F.R. § 1. 8211. 825中設 定的關于專利申請中的核苷酸和/或氨基酸序列公開的指導規則。
[0037] 該序列表含有遵照NucleicAcidsRes.(《核酸研宄》）13 :3021 3030(1985)和 BiochemicalJ.(《生物化學雜志》）219 (No. 2) :345 373(1984)中描述的IUPACIUBMB標 準進行定義的核苷酸序列字符的單字母代碼和氨基酸的三字母代碼，所述文獻以引用方式 并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式符合37C.F.R. § 1. 822中設定的規 則。
[0038] SEQIDNO:1是野生型玉米（Zeamays)基因組Crwl的核苷酸序列。
[0039] SEQIDNO:2是野生型玉米Crwl(ZmCrwl)cDNA的編碼區的核苷酸序列。
[0040] SEQIDNO:3是野生型玉米CRWl(ZmCRWl)蛋白的氨基酸序列。
[0041] SEQIDNO:4是突變crwl-Ac等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0042] SEQIDNO:5是突變crwl-Ac等位基因編碼的多肽的氨基酸序列。
[0043] SEQIDNO:6是來自玉蜀黍近交系C0109的CrwlcDNA的核苷酸序列。
[0044] SEQIDNO:7是SEQIDNO:6編碼的多肽的氨基酸序列。
[0045] SEQIDNO:8是來自玉蜀黍近交系NC316的CrwlcDNA的核苷酸序列。
[0046] SEQIDNO:9是SEQIDNO:8編碼的多肽的氨基酸序列。
[0047] SEQIDNO: 10是來自水稻（Oryzasativa)的次生壁NAC轉錄因子2的氨基酸序 列（UniProt條目G3M8D2)。
[0048] SEQIDNO: 11是來自水稻的推定NAM蛋白（0sNAC7)的氨基酸序列（標識符 0s06g04090.I;UniProt條目Q9SNM6)。
[0049] SEQIDNO:12是來自高粱（Sorghumbicolor)的推定的未表征的蛋白的氨基酸 序列（標識符Sb07g001550.I;UniProt條目C5YM23)。
[0050] SEQIDNO:13是來自高粱的推定NAM蛋白的氨基酸序列（標識符Sbl0g002120. 1 ; UniProt條目Q5NKS7)。
[0051] SEQIDNO:14是來自中國栽培大豆（Glycinemax)的未表征的蛋白的氨基酸序 列（標識符Glymal6g02200.I;UniProt條目I1MKD6)。
[0052] SEQIDN0:15是來自中國栽培大豆的未表征的蛋白的氨基酸序列（標識符 Glyma07g05660.I;UniProt條目I1KHQ4)。
[0053] SEQIDNO:16是來自擬南芥（Arabidopsisthaliana)的含NAC結構域的蛋白43 的氨基酸序列（標識符At2g46770.I;UniProt條目Q84WP6)。
[0054] SEQIDNO:17是來自擬南芥的含NAC結構域的蛋白12的氨基酸序列（Atl g32770.I;UniProt條目Q9LPI7)。
[0055] SEQIDNO: 18是來自擬南芥的含NAC結構域的蛋白66的氨基酸序列（標識符 At3g61910.I;UniProt條目Q9M274)。
[0056] SEQIDNO: 19是來自玉米的次生壁NAC轉錄因子2的氨基酸序列（UniProt條目 B4FPS5KSEQIDN0:20是來自玉米的推定NAM蛋白的氨基酸序列（UniProt條目Q5NKQ3)。
[0057] SEQIDNO:21 是來自二糖短柄草（Brachypodiumdistachyon)的含NAC結構域 的蛋白43樣的氨基酸序列（NCBIGINo. 357139497,本文中稱為BdCRWl)。
[0058] SEQIDNO:22是來自葡萄（Vitisvinifera)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序 列（UniProt條目F6HU82)。
[0059] SEQIDNO:23是來自中國栽培大豆的含NAC結構域的蛋白43樣的氨基酸序列 (NCBIGINo.35652248〇,本文中稱為GmCRWl)。
[0060] SEQIDNO:24是來自陸地棉（Gossypiumhirsutum)的含NAC結構域的蛋白的氨 基酸序列（UniProt條目G4V2G0)。
[0061] SEQIDNO:25是來自蘋果（Pyrusmalus)的NAC結構域類轉錄因子（NAC12)的 氨基酸序列（UniProt條目D9ZJ90)。
[0062] SEQIDNO:26是來自大麥（Hordeumvulgare)的預測的蛋白的氨基酸序列 (UniProt條目F2DV83)。
[0063] SEQIDNO:27是來自擬南芥的NAM樣蛋白的氨基酸序列（NCBIGINo. 3510262 ; UniProt條目Q84WP6)。
[0064] SEQIDNO:28是野生型玉米Crw2 (ZmCrw2)cDNA的編碼區的核苷酸序列。
[0065] SEQIDN0:29是野生型玉米CRW2(ZmCRW2)蛋白（也稱糖基轉移酶）的氨基酸序 列（UniProt條目B6TY42 ;455個氨基酸）。
[0066] SEQIDNO:30是突變的crw2_Mutag等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0067] SEQIDNO:31是突變的crw2_Mutag等位基因編碼的多肽的氨基酸序列。
[0068] SEQIDNO:32是突變的crw2-EMS等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0069] SEQIDNO:33是突變的crw2-EMS等位基因編碼的多肽的氨基酸序列。
[0070] SEQIDNO:34是玉米推定的未表征的蛋白的氨基酸序列（UniProt條目C0PDR7 ; 488個氨基酸）。
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