新型的殺蟲蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物基因工程和分子育種技術領域。具體而言，本發明涉及經人工設 計和改造的殺蟲蛋白多肽或其片段，所述多肽或其片段具有針對昆蟲害蟲的殺蟲活性。本 發明還提供了編碼所述殺蟲蛋白多肽或其片段的核酸、殺蟲組合物、DNA構建體以及包括所 述核酸的轉化的微生物和植物。這些組合物在用于控制害蟲特別是植物害蟲的方法中有 用。本發明還涉及借助所述核酸或DNA構建體來改良植物抗逆性的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最為重要的糧食作物之一，也是我國的重要經濟作物，全球有近一 半的人以稻米為主食[Khush, 2005],主要分布在亞洲，水稻在歐洲、美洲、非洲和大洋洲也 均有種植。然而，水稻也是受蟲害危害最為嚴重的糧食作物之一，據不完全統計，全球每年 因鱗翅目等水稻害蟲的危害造成稻米的損失已超過千萬噸[Herdt，1991 ;朱楨等，1999]。 農藥的使用在防治蟲害上雖能起到作用，但也給人類帶來了嚴重的殘毒污染。農藥在環境 中殘留，可能污染大氣和水資源，破壞土壤性狀；而且，在殺死害蟲的同時，不少益蟲也被消 滅，這嚴重破壞了生態平衡；另外，農藥的長期使用還可能引起害蟲產生抗藥性；因此選育 抗蟲水稻品種、提高水稻自身抗性被認為是一種更為環保有效的防治方法。但由于水稻品 種本身抗蟲資源貧乏，常規育種選育新品種的周期也較長，因此一直沒有較好的克服抗蟲 水稻新品種選育這個難題。近年來隨著細胞生物學和分子生物學的飛速發展，科學家們成 功地利用生物基因工程技術將外源抗蟲基因通過轉化整合到水稻基因組，使水稻自身產生 抗蟲蛋白而達到抗蟲的效果，并能夠穩定遺傳[Tuetal, 1998和2000;唐微和楊宙等， 2007]。該技術打破了物種界限，實現了基因的直接選擇和有效聚合，大大提高了育種效率。
[0003] 蘇云金芽孢桿菌是目前世界上應用面積最廣、研究最 為深入的殺蟲微生物。在蘇云金芽孢桿菌產胞期間，能夠形成并分泌一些由殺蟲晶體蛋白 (insecticidal crystal proteins, ICPs或Cry)組成的伴孢晶體，對鱗翅目（c/yJ)、鱗 翅目和雙翅目（c/T//)、鞘翅目fczr///)以及雙翅目等昆蟲，以及動植物線蟲等節 肢動物都有特異性的毒殺活性（Schn印f et al，1998;李長友等，2007)。但是長期單一 的種植轉Bt基因植物，也可能導致害蟲產生抗性。近幾十年來人們已經陸續發現不同的害 蟲對ICPs及轉ICPs基因植物表現出不同水平的抗性[McGaugher et al，1985 ;Van，1990; Gould，1992; Lee, 1995; Tabashnik et al, 1997;倪萬潮和郭三堆，1998 ;High et al, 2004; Griffitts JS and Aroian RV，2005]。
[0004] 近年來，人們發現Bt在營養生長期可以分泌一類新型殺蟲蛋白即蘇云金芽孢桿 菌營養期殺蟲蛋白（Vegetative Insecticidal Protein,簡稱VIP)，它不形成晶體，在氨基 酸序列的進化上與ICPs沒有任何同源性，殺蟲機理與ICPs也不相同，也不存在結構相似性 [Estruch et al, 1996;Yu et al, 1997; Estruch et al, 1998; Lee et al,2003; Estela et al，2004;Rang et al，2005],對鱗翅目和鞘翅目等多種農業害蟲具有一定的殺蟲活 性[Estruch et al, 1996; Warren et al, 1998]，對某些害蟲的殺蟲活性達到納克級水平
[劉榮梅等，2004];另外，對小地老虎等對ICPs不敏感的害蟲也具有毒性[Estruchet al，1996;Yuetal，1997]。這對于治理對ICPs不敏感或產生抗性的農業害蟲提供了一種 新的選擇。
[0005]VIP是蘇云金芽孢桿菌在營養生長對數中期開始分泌的一類胞外毒素蛋白 [Schn印fetal，1998]，在自然界中廣泛存在于Bt菌中，截止到2008年，共分離發現8類 37種[Crickmore，2008]。已有的研究表明，這些VIPs蛋白在遺傳上相對保守，在一般條件 下，它們至少有75%存在于上清培養液中，且相比較于ICPs具有熱不穩定性，在95°C條件 下處理20min便會失去活性[Estruchetal, 1996]。
[0006] 在命名系統上，VIPs可根據其蛋白質序列同源性區分為以下三個大類，即VIP1、 VIP2和VIP3[Crickmoreetal，2008]。VIP1和VIP2共同構成二元毒素對鞘翅目螢葉甲 科昆蟲具有殺蟲特異性[Warrenetal，1998] ;VIP3對鱗翅目科、屬、種中的許多害蟲具有 較廣譜的殺蟲活性，其殺蟲機理研究的也比較深入[Estruchetal, 1998]。到2008年，已 有五十七個基因被鑒定分離出來[Crickmore, 2008]。
[0007] VIP1和VIP2作為二元毒素，在殺蟲機理上是獨自起作用的[Barthetal，2002 和2004]。基因位于基因的上游，其產物能獨立行使它們各自的功能[Barth etal，2004]，但只有當兩種蛋白同時存在并協同作用時，才能發揮毒素蛋白最大的殺蟲 毒力[Warrenetal，1998]。研究表明，VIP1能與昆蟲幼蟲中腸上皮細胞上的受體特異 性結合，并在細胞膜上形成通道，為VIP2進入祀標昆蟲細胞的細胞質提供途徑[Barthet al，2004]。含有NAD結合位點的VIP2則具有ADP-核糖基轉移酶活性，可以將核糖基轉移 到肌動蛋白上，同時伴隨煙酰胺的釋放，導致肌動蛋白單體的多聚化受阻，影響了細胞骨架 的構成，從而導致昆蟲細胞死亡（Hanetal, 1999)。
[0008]VIP3的殺蟲機理主要體現在毒素對昆蟲中腸細胞的破壞[Whalon& Wingerd，2003]。全長88ku的VIP3A被鱗翅目昆蟲吞食后，在其中腸胰蛋白酶作用下水解 活化，活化的VIP3A蛋白能與敏感幼蟲中腸的BBMVs上的80ku和100ku的未知受體分子結 合，并在中腸上皮細胞上形成離子通道型穿孔，誘發昆蟲細胞凋亡，細胞核溶解，最終導致 昆蟲死亡[Leeetal，2003]。并且VIP3A蛋白只要當pH低于7.5時即可溶解，其C'端也 不被切除，同時，這2種受體也不同于已知的任何Cry受體[Leeetal，2003];另外，在沒有 任何受體的情況下，VIP3A也能在人工雙脂質膜（BLMs)上形成通道[Warrenetal，1998; Leeetal，2003]。細胞病理學試驗表明：飼喂小地老虎和草地貪夜蛾等敏感昆蟲VIP3A(a) 蛋白72h后，中腸上皮杯狀細胞和柱狀細胞與基膜完全脫落，昆蟲死亡[Yu，etal，1997]。 Vip3A引起的癥狀與ICPs的相似，但在時間上推遲了（Estruchetal，1996)。由此可見， VIP3A的受體和作用方式與ICPs明顯不同，因此研究和利用VIP3A，對于拓寬殺蟲譜、提高 殺蟲毒力、防止昆蟲產生抗性具有重要意義。
[0009]ICP蛋白的分子質量一般為130~160ku，僅溶于pH>10的高堿性溶液，以原毒素 的形式存在，本身不具有毒性，被昆蟲幼蟲吞食后在其中腸的堿性和還原性環境下能夠溶 解并剪切成65~75ku的活性多肽；而VIP3A在弱堿性條件下甚至pH略低于7. 5時也可被 胰蛋白酶剪切成62ku大小的活性多肽（Leeetal，2003)。另外，ICP蛋白是分泌于胞內的 晶體蛋白，VIP蛋白則是胞外分泌蛋白；在分泌過程中，全長為100ku的VIP1A蛋白在形成 80ku的成熟毒素之前其N'端信號肽會被切除，而全長為88ku的VIP3A蛋白在分泌過程中 N'端信號肽則往往因無酶切位點存在一般不被切除[Schn印fetal，1998]。在殺蟲譜方 面，VIP蛋白比Cry蛋白寬，對于小地老虎等對ICP蛋白不敏感的農業害蟲也具有殺蟲活性 [Estruchetal, 1996]〇
[0010] 目前在蘇云金芽孢桿菌的自然菌株中尚未分離到能高抗水稻螟蟲的K/a?基因。 因此，人工合成、改造和創新抗水稻螟蟲的K/a?基因資源對于解決基因使用所面臨的 抗蟲持久性問題[McGaughey，1985;Van，1990;Gould，1992;Lee，1995;Tabashniket al，1997;倪萬潮和郭三堆，1998;Highetal，2004]具有深遠意義。
[0011] 發明概述 為解決上述問題，本申請的發明人研制出一個高抗昆蟲害蟲特別是抗鱗翅目害蟲的K/a別基因，尤其是具備迄今業已鑒定分離的所有其它K/a?基因所不具備的高抗水稻鱗翅 目害蟲如二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等的能力，命名為,提供了借助農桿菌介 導法轉化的質粒載體系統及