殺蟲蛋白的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種CrylA. 105蛋白質通過在植物 中表達來控制高粱條螟為害植物的用途。
【背景技術】
[0002] 高粱條螟Chilo sacchariphagus屬鱗翅目，螟蛾科。又名甘鹿條螟，或高粱鉆心 蟲。主要分布在東亞、南亞、東南亞及印度洋地區。國內分布極廣，東北、華北、華東和華南 大部份地區都有發生。可為害玉米、高粱、粟、麻、甘蔗等作物。在北方旱糧地區，主要為害 玉米、高粱和粟等作物，并常和玉米螟混合發生，造成枯心苗；同時也是南方甘蔗上的主要 害蟲。
[0003] 玉米是中國重要的糧食作物，隨著全球溫室效應的加強，近兩年溫度不斷上升，蟲 害發生種類及數量都有所提高。高粱條螟以幼蟲在初期為害心葉，后期則可蛀食莖桿、葉 鞘，阻礙養分輸送，使莖桿易受風折斷。對產量有嚴重影響，通常損失可達10% -40%。為 了防治高粱條螟，人們通常采用的主要防治方法有：農業防治、化學防治和物理防治。
[0004] 農業防治是把整個農田生態系多因素的綜合協調管理，調控作物、害蟲、環境因 素、創造一個有利于作物生長而不利于高粱條螟發生的農田生態環境。在越冬幼蟲化蛹與 羽化之前，將高粱或玉米秸桿處理完畢，以減少越冬蟲源。秸桿處理可采用粉碎、燒毀、慪 肥、鍘碎、泥封等不同方法。因農業防治必須服從作物布局和增產的要求，應用有一定的局 限性，不能作為應急措施，在高粱條螟爆發時就顯得無能為力。
[0005] 化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是高粱條螟綜合治理的重 要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是高粱條螟大發生的情況 下，是必不可少的應急措施。高粱條螟作為蛀莖害蟲，對其的防治時期把握非常重要，用藥 最佳時期是卵孵盛期至幼蟲蛀莖之前，否則高齡幼蟲蛀入莖桿之后，將很難達到防治的目 的。目前化學防治方法主要是藥液噴霧和施撒毒土。但化學防治也有其局限性，如使用不 當往往會導致農作物發生藥害、害蟲產生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環境，使農田生態系 統遭到破壞和農藥殘留對人、畜的安全構成威脅等不良后果。
[0006] 物理防治主要根據害蟲對環境條件中各種物理因素的反應，利用各種物理因素如 光、電、色、溫濕度等以及機械設備進行誘殺、輻射不育等方法來防治害蟲。目前應用最廣 泛的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠距離用波，引誘害蟲 靠近，對高粱條螟成蟲的具有一定的防治效果；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時清理高壓 電網上的污垢，否則會影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危 險；此外安裝燈的一次性投入較大。
[0007] 為了解決農業防治、化學防治和物理防治在實際應用中的局限性，科學家們經過 研宄發現將來自于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗 蟲轉基因植物以防治植物蟲害。
[0008] 上述殺蟲蛋白在易感的昆蟲宿主采食后具有毒性。在過去幾十年里，對蘇云金芽 孢桿菌殺蟲蛋白的結構和功能的研宄成為研宄熱點，盡管這些蛋白在特定結構和功能方面 存在差別，但總體上來說其存在著一定一般化模式，包括：被昆蟲采食，溶解在特定昆蟲宿 主的胃腸中部，昆蟲宿主部分消化酶對蛋白進行消化激活，與胃腸中部細胞結合，在昆蟲細 胞上形成一個孔并破壞細胞內部平衡。CrylAb、CrylAc、CrylFa以及Cry2Ab都是屬于此 類蛋白，且這些蛋白被證實導入植物中后，可使得植物產生抗蟲功能。CrylA. 105殺蟲蛋白 是眾多殺蟲蛋白中的一種，CrylA. 105蛋白是一個嵌合蛋白，它分別來自于CrylAb蛋白、 CrylAc蛋白和CrylFa蛋白。
[0009] CrylA. 105蛋白被易感昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿 性PH環境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段 和易感昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞 細胞膜內外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。
[0010] 已證明轉CrylA. 105基因的植株可以抵抗玉米螟等鱗翅目Lepidoptera害蟲的侵 害，然而，至今尚無關于通過產生表達CrylA. 105蛋白的轉基因植株來控制高粱條螟對植 物危害的報道。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過產生表達CrylA. 105 蛋白的轉基因植株來控制高粱條螟對植物危害的方法，且有效克服現有技術農業防治、化 學防治和物理防治等技術缺陷。
[0012] 為實現上述目的，本發明提供了一種控制高粱條螟害蟲的方法，包括將高粱條螟 害蟲至少與CrylA. 105蛋白接觸。
[0013] 進一步地，所述CrylA. 105蛋白存在于至少產生所述CrylA. 105蛋白的宿主細胞 中，所述高粱條螟害蟲通過攝食所述宿主細胞至少與所述CrylA. 105蛋白接觸。
[0014] 更進一步地，所述CrylA. 105蛋白存在于至少產生所述CrylA. 105蛋白的細菌或 轉基因植物中，所述高粱條螟害蟲通過攝食所述細菌或所述轉基因植物的組織至少與所述 CrylA. 105蛋白接觸，接觸后所述高粱條螟害蟲生長受到抑制和/或導致死亡，以實現對高 粱條螟危害植物的控制。
[0015] 在上述技術方案中，所述轉基因植物可以處于任意生育期；所述轉基因植物的組 織為根、葉片、莖桿、果實、雄穗、雌穗、花蕾、花藥或花絲；所述對高粱條螟危害植物的控制 不因種植地點和/或種植時間的改變而改變。
[0016] 所述植物來自玉米、高粱、甘蔗、粟、麻或薏米。
[0017] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylA. 105蛋白的多核苷酸的植 物。
[0018] 優選地，所述CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 所述CrylA. 105蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0019] 在上述技術方案的基礎上，所述植物還可以包括至少一種不同于編碼所述 CrylA. 105蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
[0020] 進一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶 抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0021] 優選地，所述第二種核苷酸編碼Cry2Ab蛋白。
[0022] 更進一步地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序 列，所述第二種核苷酸具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
[0023] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0024] 為實現上述目的，本發明還提供了一種Cry 1A. 105蛋白質控制高粱條螟害蟲的用 途。
[0025] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制高粱條螟害蟲的植物的方法，包 括向所述植物的基因組中引入編碼CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列。
[0026] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制高粱條螟害蟲的植物繁殖體的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，和/或取下由所述方法獲得的植 株上具有繁殖能力的組織進行培養，從而產生含有編碼CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的 植物繁殖體。
[0027] 為實現上述目的，本發明還提供了一種培養控制高粱條螟害蟲的植物的方法，包 括：
[0028] 種植至少一個植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼CrylA. 105蛋白 的多核苷酸序列；
[0029] 使所述植物繁殖體長成植株；
[0030] 使所述植株在人工接種高粱條螟害蟲和/或高粱條螟害蟲自然發生危害的條件 下生長，收獲與其他不具有編碼CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植 物損傷和/或具有增加的植物產量的植株。
[0031] 本發明中所述的"植物繁殖體"包括但不限于植物有性繁殖體和植物無性繁殖體。 所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無性繁殖體是指植物體的營養器官 或某種特殊組織，其可以在離體條件下產生新植株；所述營養器官或某種特殊組織包括但 不限于根、莖和葉，例如：以根為無性繁殖體的植物包括草莓和甘薯等；以莖為無性繁殖體 的植物包括甘蔗和馬鈴薯（塊莖）等；以葉為無性繁殖體的植物包括蘆薈和秋海棠等。
[0032] 本發明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞既可以是其體內表達 殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產生殺蟲蛋白的微生物。
[0033] 本發明術語"控制"和/或"防治"是指高粱條螟害蟲至少與CrylA. 105蛋白接觸， 接觸后高粱條螟害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。進一步地，高粱條螟害蟲通過攝食植 物組織至少與CrylA. 105蛋白接觸，接觸后全部或部分高粱條螟害蟲生長受到抑制和/或 導致死亡。抑制是指亞致死，即尚未致死但能引起生長發育、行為、生理、生化和組織等方面 的某種效應，如生長發育緩慢和/或停止。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方 法下培養以用于產物的消耗和/或生成。此外，含有編碼CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的 控制高粱條螟害蟲的植物和/或植物繁殖體，在人工接種高粱條螟害蟲和/或高粱條螟害 蟲自然發生危害的條件下，與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現 包括但不限于改善的莖桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產等。CrylA. 105蛋白對高 粱條螟的"控制"和/或"防治"作用是可以獨立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治" 高粱條螟害蟲的物質的存在而減弱和/或消失。具體地，轉基因植物（含有編碼CrylA. 105 蛋白的多核苷酸序列）的任何組織同時和/或不同步地，存在和/或產生，CrylA. 105蛋白 和/或可控制高粱條螟害蟲的另一種物質，則所述另一種物質的存在既不影響CrylA. 105 蛋白對高粱條螟的"控制"和/或"防治"作用，也不能導致所述"控制"和/或"防治"作用 完全和/或部分由所述另一種物質實現，而與CrylA. 105蛋白無關。通常情況下，在大田， 高粱條螟害蟲攝食植物組織的過程短暫且很難用肉眼觀察到，因此，在人工接種高粱條螟 害蟲和/或高粱條螟害蟲自然發生危害的條件下，如轉基因植物（含有編碼CrylA. 105蛋 白的多核苷酸序列）的任何組織存在死亡的高粱條螟害蟲、和/或在其上停留生長受到抑 制的高粱條螟害蟲、和/或與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，即為實現 了本發明的方法和/或用途，即通過高粱條螟害蟲至少與CrylA. 105蛋白接觸以實現控制 高粱條螟害蟲的方法和/或用途。
[0034] 在本發明中，CrylA. 105蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個 Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉 基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種 植物（第1親本）可以通過遺傳工程操作表達CrylA. 105蛋白質，第二種植物（第2親本） 可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第1親本和 第2親本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0035] RNA干擾（RNA interf