一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，解決了現有選育方法均需要經過胚挽救等技術，導致操作繁瑣的問題。本發明包括利用甘藍型油菜AnAnCnCn與白菜型油菜ArAr雜交獲得三倍體種子AnArCn，三倍體種子AnArCn再經過人工誘導染色體加倍獲得人工六倍體AnAnArArCnCn，將該人工六倍體AnAnArArCnCn與甘藍CoCo雜交，獲得新型甘藍型油菜AnArCnCo。本發明具有簡化操作步驟，能快速利用甘藍廣泛的遺傳變異拓寬甘藍型油菜的遺傳基礎等效果。
【專利說明】
-種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種植物新品系選育方法，具體設及一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺 傳多樣性的方法。
【背景技術】
[0002] 甘藍型油菜（公rassica na/ws, ΑΟΑΤΤ。)是由白菜型油菜（公rassica rapa, Α^ΑΤ) 和甘藍(公rassica ο如races，CT°)自然雜交，染色體自然加倍進化而來的異源四倍體。與 親本種甘藍相比，甘藍型油菜進化和馴化歷史短，遺傳資源相對狹窄，利用甘藍豐富的遺傳 變異創建新型甘藍型油菜是改良和拓寬甘藍型油菜現有種質資源的重要途徑。
[0003] 傳統利用甘藍資源創建新型甘藍型油菜的方法有兩種，一種是通過甘藍與白菜型 油菜雜交，創建人工合成的甘藍型油菜。另外一種方法，則是通過甘藍型油菜與甘藍雜交， 獲得Ξ倍體(ΑΤΤα)，然后對雜交后代的不斷自交，或者與甘藍型油菜回交，選育含有甘藍 遺傳背景的甘藍型油菜化i等Molecular Breeding 2014)。
[0004] 采用上述兩種方法，雖然能有效拓寬現有甘藍型油菜的遺傳基礎，但是由于甘藍 與白菜型油菜之間、W及甘藍與甘藍型油菜之間的雜交親和性障礙，導致兩種方法均需采 用胚挽救等技術獲得雜種，否則會導致不能結實的情況產生，因而操作十分繁瑣。
[0005] 并且采用第一種方法時，獲得的人工合成甘藍型油菜自交結實性差，其染色體倍 性穩定需要的周期較長，運些不足限制了該方法的廣泛使用。而采用第二種方法時，一旦選 出甘藍型油菜類型，育性迅速恢復，但是獲得的Ξ倍體育性低，自交和雜交難結巧，使選育 產生難度，育種周期也較長，選育過程繁瑣。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是:現有選育方法均需要經過胚挽救等技術，導致操 作繁瑣的問題，提供解決上述問題的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法。
[0007] 本發明通過下述技術方案實現： 一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，包括利用甘藍型油菜ADAnCnCn與白 菜型油菜ATAT雜交獲得Ξ倍體種子AnATCn，S倍體種子ADATCn再經過人工誘導染色體加倍獲 得人工六倍體ΑηΑηΑΤΑΧΤη，將該人工六倍體AnADATATCnCn與甘藍。r雜交，獲得新型甘藍型油 ^A"A"C"C°〇
[000引發明人發現，由于六倍體ΑηΑηΑΤΑΤΤη與甘藍CT°的親和性較高，在自然條件下可自 然雜交結實。因而，本發明通過選育步驟的優化，先采用甘藍型油菜ADAnCnCn與白菜型油菜 Α^ΑΤ雜交后，再經過染色體加倍處理獲得六倍體AnADATATCnCn，通過六倍體AnADATATCnCn與甘藍 C°C°雜交獲得新型甘藍型油菜ADATCnCD。通過該步驟的優化后能有效避免甘藍CT鳴甘藍型 油菜ADAnCnCn之間需要經過胚挽救才能結實的情況，進而使本發明選育的整個過程中均不 需要進行胚挽救，操作更加簡單。4\4\(：\(：°代表不同的基因組。
[0009]并且六倍體與甘藍的雜交在田間自然條件下可成功，因而容易將多個品種的甘藍 的遺傳物質轉移到甘藍型油菜中，能有效利用甘藍廣泛的遺傳變異拓寬甘藍型油菜的遺傳 基礎。
[0010] 本發明中的六倍體可長期使用，無需重復創建，極大地節約后期采用不同遺傳變 異性能甘藍對甘藍型油菜遺傳多樣性拓寬的時間。
[0011] 本發明的具體培育過程包括： (1)Ξ倍體的獲得 W甘藍型油菜為母本，人工去雄，授W白菜型油菜花粉，田間自然條件下生長，至成熟 期收獲命名為Τ1的雜種種子ADATCn。或W白菜型油菜為母本，人工去雄，授W甘藍型油菜花 粉，田間自然條件下生長，至成熟期收獲命名為T2的雜種種子ADATCn。
[0012] (2)六倍體的獲得 將步驟（1)中收獲的種子T1或T2進行表面消毒后，置于MS固體培養基上萌發獲得組培 苗，再將長出的組培苗轉移到含100 mg/L秋水仙堿的分化培養基中誘導染色體加倍，獲得 與T1對應且命名為D1的人工六倍體ADADATA 乂％η，獲得與T2對應且命名為D2的人工六倍體 A"A"A"A"C"C"〇
[0013] 本步驟中組培苗的具體獲得步驟為： Ξ倍體種子T1或T2經70%的酒精滅菌30s，無菌水洗3min，再用10 %的次氯酸鋼溶液表 面消毒15min，無菌水洗立次，每次5min，然后接種于MS培養基中，放置在18小時光照、8小時 黑暗和20 °C的光照培養室中培育后即獲得組培苗。
[0014] 為了達到更高的誘導效率，所述組培苗需先轉入分化培養基中快繁2~3次，再轉 入MS培養基中培養后篩選出用于秋水仙堿誘導加倍的健壯組培苗。
[0015] 本步驟中秋水仙堿誘導的具體方法為： 將上述健壯組培苗置于含lOOmg/L秋水仙堿的分化培養基中避光暗培養7~10天，植物 組織出現膨大愈傷后，再將愈傷組織轉入分化培養基中培養20~25天成苗，最后轉入生根 培養基中培養生根。
[0016] (3)新型甘藍型油菜的創建 W六倍體D1或D2作為母本，人工去雄，分別授W遺傳變異豐富的多種甘藍的花粉，或者 W多種甘藍為母本，人工去雄后授予六倍體D1或D2的花粉，田間自然條件下生長，種子成熟 后收獲，獲得新型甘藍型油菜AnATcnr。
[0017] 本發明中，所述分化培養基由W下組分組成： MS培養基，終濃度為3mg/L的6-BA，W及終濃度為0.2mg/L的NAA; 所述生根培養基由W下組分組成： MS培養基，終濃度為0.5mg/L的IBA。
[0018] 本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果： 1、 本發明整個過程不需要進行胚挽救，因而該方法操作更加簡便、周期短； 2、 本發明的六倍體在自然條件下自交可結實，六倍體可長期使用，無需重復創建，節約 大量六倍體重新培育的時間，能快速利用甘藍廣泛的遺傳變異拓寬甘藍型油菜的遺傳基 礎； 3、 六倍體與甘藍的雜交在田間自然條件下可成功，容易將多份甘藍的遺傳物質轉移到 甘藍型油菜中，操作更加簡便容易。
【具體實施方式】
[0019] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發明作 進一步的詳細說明，本發明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發明，并不作為對本 發明的限定。
[0020] 實施例1 一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，包括： W品系為中雙11號的甘藍型油菜為母本，品系為6Y733的白菜型油菜為父本，雜交后獲 得Ξ倍體T1，采用染色體加倍后獲得六倍體D1; WD1為母本人工去雄，分別授予3個栽培甘 藍和5個野生甘藍的花粉，雜交后獲得不同類型的新型甘藍型油菜。
[0021] 上述八個類型的甘藍包括3個栽培甘藍和5個野生甘藍，其中3個栽培甘藍分別為 編號為①的白花芥藍(jSrassica 知a6ra)，編號為②的羽衣甘藍(jSrassica oJeracea Z. var. acejoAaJa)，編號為③的抱子甘藍（公rassica oJerace var germmi扣ra)。上述5個 野生甘藍均從歐洲各種質資源庫征集而來，分別為編號為④的批ica inc加 a Ten.，從 德國ΙΡΚ insti1:ution征集，征集代號BRA1166;編號為⑤的公rassica皿Miana Pourr.，從 西班牙UPM大學征集，征集代號651-6816-85;編號為⑥的jSrassica i/3sWa_ris Moris.，從 德國ΙΡΚ征集，征集代號K8934;編號為⑦的公rassica WJJosa，從德國ΙΡΚ征集，征集代號 BRA2853;編號為⑧的6ot/rgeat/i，從西班牙UPM大學征集，征集代號8856。
[0022] 對本實施例獲得的新型甘藍型油菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染色體數 目均為38條。然后對六倍體D1與不同編號類型甘藍雜交的結實率進行統計，統計結果如表1 所示。同時，對上述不同編號類型甘藍雜交后獲得的新型甘藍型油菜進行培育，上述不同類 型的新型甘藍型油菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農藝性狀差異明 顯，遺傳多樣性豐富。本實施例還采用上述不同類型的新型甘藍型油菜進行自交，對自交后 的新型甘藍型油菜的結實率進行統計，統計結果如表1所示。
[0023] 表 1
上述六倍體D1與不同類型甘藍雜交的平均結實率為4.36粒/芙，上述新型甘藍型油菜 自交后的平均結實率為7.01粒/芙。
[0024] 實施例2 本實施例與實施例1的區別在于，本實施例中D1為父本，甘藍為母本，甘藍種類與實施 例1中相同，雜交后獲得新型甘藍型油菜。
[0025] 對本實施例雜交后獲得的新型甘藍型油菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染 色體數目均為38條，上述多份新型甘藍型油菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期 等多種農藝性狀差異明顯，遺傳多樣性豐富。
[0026] 按照實施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D1與不同類型甘藍雜交后的平均結實 率，W及不同類型的新型甘藍型油菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為3.15粒/芙，該 自交結實率為4.11粒/芙。
[0027] 實施例3 本實施例與實施例1的區別在于:本實施例中白菜型油菜6Y733為母本，甘藍型油菜中 雙11號為父本，雜交后獲得Ξ倍體T2，采用染色體加倍后獲得六倍體D2。WD2為母本，人工 去雄，分別授予3個栽培甘藍和5個野生甘藍的花粉，雜交后獲得不同類型的新型甘藍型油 菜。本實施例中該甘藍種類與實施例1中相同。
[0028] 對本實施例雜交后獲得的新型甘藍型油菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染 色體數目均為38條，上述多份新型甘藍型油菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期 等多種農藝性狀差異明顯，遺傳多樣性豐富。
[0029] 按照實施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D2與不同類型甘藍雜交后的平均結實 率，W及不同類型的新型甘藍型油菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為4.97粒/芙，自 交結實率為8.48粒/芙。
[0030] 實施例4 本實施例與實施例3的區別在于，本實施例中D2為父本，甘藍為母本，甘藍種類與實施 例3中相同，雜交后獲得新型甘藍型油菜。
[0031] 對本實施例雜交后獲得的新型甘藍型油菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染 色體數目均為38條，上述多份新型甘藍型油菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期 等多種農藝性狀差異明顯，遺傳多樣性豐富。
[0032] 按照實施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D1與不同類型甘藍雜交后的平均結實 率，W及不同類型的新型甘藍型油菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為2.17粒/芙，該 自交結實率為9.31粒/芙。
[0033] 實施例5 本實施例與實施例1的區別在于，本實施例中甘藍型油菜和白菜型油菜的品系不同，其 他均與實施例1相同。
[0034] 本實施例中該甘藍型油菜的品系為中雙9號，白菜型油菜的品系為5W394。按照實 施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D3與甘藍雜交后的平均結實率，W及不同類型的新型 甘藍型油菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為5.96粒/芙，該自交結實率為8.21粒/芙。 新型甘藍型油菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農藝性狀差異明顯，遺 傳多樣性豐富。
[0035] 實施例6 本實施例與實施例1的區別在于，本實施例中甘藍型油菜和甘藍的品系不同，本實施例 中選擇為品系是中雙9號的甘藍型油菜，同時選擇品系是R9054的甘藍。
[0036] 本實施例中甘藍型油菜為母本，白菜型油菜為父本，雜交，染色體加倍獲得六倍體 D4，或甘藍型油菜為父本，白菜型油菜為母本，雜交，染色體加倍獲得六倍體D5。
[0037] D4為母本、甘藍為父本雜交后的平均結實率為3.84,該新型甘藍型油菜自交后的 平均結實率為7.63。
[0038] D4為父本、甘藍為母本雜交后的平均結實率為2.66,該新型甘藍型油菜自交后的 平均結實率為6.38。
[0039] D5為母本、甘藍為父本雜交后的平均結實率為4.65,該新型甘藍型油菜自交后的 平均結實率為8.92。
[0040] D5為父本、甘藍為母本雜交后的平均結實率為2.97,該新型甘藍型油菜自交后的 平均結實率為6.28。
[0041] W上所述的【具體實施方式】，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步 詳細說明，所應理解的是，W上所述僅為本發明的【具體實施方式】而已，并不用于限定本發明 的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含 在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在于，包括利用甘藍型油 菜AnA nCnCn與白菜型油菜Af雜交獲得三倍體種子AnA lrCn，三倍體種子AnAlrCr^經過人工誘導 染色體加倍獲得人工六倍體A nAnATCnCn，將該人工六倍體AnA nATCnCn與甘藍C°C°雜交，獲得 新型甘藍型油菜AnA lrCnC'2. 根據權利要求1所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在 于，所述甘藍型油菜AnA nCnCn為母本，剝蕾去雄，授予白菜型油菜AT的花粉，有性雜交獲得 三倍體種子A nAlrCn，三倍體種子AnAlrC n再經過人工誘導染色體加倍獲得命名為Dl的人工六倍 體 AnAnAr ArCnCn〇3. 根據權利要求1所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在 于，所述白菜型油菜AT為母本，剝蕾去雄，授予甘藍型油菜A nAnCnCn的花粉，有性雜交獲得 三倍體種子A nAlrCn，三倍體種子AnAlrC n再經過人工誘導染色體加倍獲得命名為D2的人工六倍 體 AnAnAr ArCnCn〇4. 根據權利要求2或3所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征 在于，所述人工誘導染色體加倍的過程為： 將三倍體種子AnAlrCn通過無菌處理后置于MS培養基上培養獲得組培苗，采用含100mg/L 秋水仙堿的分化培養基誘導該組培苗分化出染色體加倍的人工六倍體AnAHVnCn。5. 根據權利要求4所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在 于，所述組培苗的獲得步驟為： 三倍體種子AnAiCn經70%的酒精滅菌30s，無菌水洗3min，再用10 %的次氯酸鈉溶液表面 消毒15min，無菌水洗三次，每次5min，然后接種于MS培養基中，放置在18小時光照、8小時黑 暗和20 °C的光照培養室中培育后獲得組培苗。6. 根據權利要求4所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在 于，所述秋水仙堿誘導的具體方法為： 將組培苗置于含l〇〇mg/L秋水仙堿的分化培養基中避光暗培養7~10天，植物組織出現 膨大愈傷后，再將愈傷組織轉入分化培養基中培養20~25天成苗，最后轉入生根培養基中 培養生根。7. 根據權利要求6所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在 于， 所述分化培養基由以下組分組成： MS培養基，終濃度為3mg/L的6-BA，以及終濃度為0.2mg/L的NAA; 所述生根培養基由以下組分組成： MS培養基，終濃度為0.5mg/L的IBA。8. 根據權利要求4所述的一種利用甘藍拓寬甘藍型油菜遺傳多樣性的方法，其特征在 于，所述組培苗需先轉入分化培養基中快繁2~3次，再轉入MS培養基中培養后篩選出用于 秋水仙堿誘導加倍的健壯組培苗。
【文檔編號】A01H1/08GK105918104SQ201610269203
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】梅家琴, 汪雷, 錢偉, 李勤菲
【申請人】西南大學