一種利用白菜拓寬芥菜a亞基因組遺傳變異的方法
【專利摘要】一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，所述方法包括利用黑芥BnBn與芥菜AjAjBjBj有性雜交，經子房培養獲得三倍體種子AjBjBn，三倍體種子AjBjBn經無菌條件萌發后通過染色體加倍獲得異源六倍體AjAjBjBjBnBn，將所述異源六倍體與白菜Ar1?nAr1?n雜交，獲得新型芥菜AjAr1?nBjBn。本發明整個操作過程周期短，可簡單快速地拓寬現有芥菜A亞基因組遺傳變異的方法。
【專利說明】
-種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于植物新品系選育技術領域，具體設及為一種W采用黑芥與現有的芥菜 的異源六倍體為橋梁，與遺傳變異豐富的多種白菜雜交獲得一種新型芥菜，具體為一種利 用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法。
【背景技術】
[0002] 芥菜類作物(Brassica juncea，AABB)包括重要的蔬菜類型和油用類作物型，包括 棒菜、兒菜、青菜頭、大頭菜、W及芥菜型油菜等型，其中芥菜型油菜俗稱油辣菜，巧粒細小， 多為金黃色或暗紅色，含油量高。芥菜型油菜具有耐瘡性強等特點，但產量低，目前種植面 積已越來越小。芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB)是由白菜型油菜（B.rapa，AA)和黑芥 (B.nigra,BB)自然雜交，染色體加倍進化而來的異源四倍體。與白菜型油菜相比，芥菜型油 菜狹窄的遺傳基礎限制了其遺傳改良。
[0003] 傳統利用白菜改良芥菜的方法主要有兩種:第一種是通過白菜和黑芥雜交，創建 人工合成的芥菜;第二種方法是芥菜與白菜雜交，自然條件下收獲Ξ倍體雜種，然后利用Ξ 倍體雜種與芥菜多輪回交，從回交后代中選育含有白菜遺傳背景的芥菜。
[0004] 第一種方法由于白菜與黑芥的雜交障礙，該途徑中每種雜交組合必須經過大量的 胚挽救技術才可能獲得雜交種，且人工合成芥菜遺傳不穩定，無法直接使用，其保種也存在 困難(Wen等.Euphytica. 2007)。
[0005] 第二種方法在實施中，Ξ倍體雜種僅能供當代使用，無法保種，且Ξ倍體與芥菜回 交后代為非整倍體，需要多代繁瑣的選育才可能獲得芥菜型的個體。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是采用現有獲得拓寬芥菜遺傳變異的方法由于物種 間嚴重的生殖隔離親和性障礙，無法實現有性雜交，即使采用大量的胚挽救，也僅只適合于 少量親本種材料的雜交利用;且物種選育周期長，選育過程繁瑣。本發明目的在于提供一種 利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，采用黑芥與芥菜有性雜交，子房培養胚挽救 后經染色體加倍獲得異源六倍體，W該六倍體為橋梁，與白菜雜交，獲得新型芥菜，解決了 現有技術芥菜遺傳變異方法應用范圍有限，選育周期長、選育過程繁瑣等技術缺陷。
[0007] 本發明的通過下述技術方案實現：
[000引一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，所述方法包括利用黑芥護B。與 芥菜AjAjBjRj有性雜交，經子房培養獲得立倍體種子AjRjBn，Ξ倍體種子AjRjBn無菌條件萌發 后通過染色體加倍獲得異源六倍體巧巧巧，將所述異源六倍體與白菜ATl-nAf l-n雜交，獲 得新型芥菜AWi-WB。。
[0009]發明人經多次試驗發現，現有利用白菜改良芥菜一種方法中，白菜與黑芥 B^n雜交，由于白菜ATl-nATl-n與黑芥兩個物種間存在嚴重的生殖隔離親和性障礙，采用 胚挽救技術克服物種間的親和性障礙，但是人工合成的芥菜不穩定，無法直接使用及保種， 且操作過程中需要進行多輪胚挽救步驟才能獲得雜交種，該方法復雜繁瑣，不能快速高效 的篩選出芥菜A亞基因組個體。
[0010]另外一種現有方法是利用芥菜4^巧巧哺白菜Ad-nATl-n雜交，自然條件下收獲Ξ倍 體雜種體雜種A^i-W與芥菜巧皆多輪回交，從回交后代中選育含有白菜 遺傳背景的芥菜，但是該方法中獲得的Ξ倍體雜叫又能當代使用，且無法保種，Ξ 倍體雜種與芥菜4^巧巧^回交后代非整倍體，需要多代繁瑣的選育才能獲得芥菜4亞基因組 個體。
[0011] 基于W上兩種現有方法所產生的缺陷，發明人經研究認識到選擇農藝性狀優良的 芥菜4^巧巧^與黑芥日巧"有性雜交，獲得雜種胚4巧巧"，授粉7-1〇天后對雜種胚進行子房培養 胚挽救可克服黑芥郵。與芥菜巧巧哺個物種間的生殖隔離親和性障礙，具體胚挽救方法 是有性雜交后，采取子房培養獲得雜種胚A巧巧η，獲得的立倍體A巧巧η幼苗通過染色體加倍 獲得異源六倍體巧巧巧巧。，異源六倍體Α^Α巧巧巧巧巧自然條件下可育，可反復使用，可保 種;獲得的異源六倍體巧巧巧巧。與白菜Ατ1-ηΑ"-η雜交親和性較好，田間自然條件下可獲得 雜交后代。
[0012] 發明人所研究的方法中，與第一種現有操作方法相比，選擇雜交的物種不同，物種 先后雜交的順序不同，且僅經過一輪子房培養胚挽救和染色體加倍即可獲得芥菜4^巧巧^ 與黑芥護8。的六倍體雜種巧巧巧ngn，解決了第一種現有操作方法中需要進行大量的胚挽 救技術獲得雜交種;采用本發明所述方法獲得的新型芥菜遺傳穩定，直接可從當代培育出 得芥菜中選育中形狀優良的芥菜A亞基因個體，且培育出得新型可直接使用，可保種，解決 了第一種現有操作方法中人工合成的芥菜遺傳不穩定，無法直接使用，保種困難的問題。
[0013] 與第二種操作方法相比，選擇雜交的物種不同，物種先后雜交的順序不同，整個操 作方法不同，可通過試驗發現本發明所述方法與之相比，解決其需多代繁瑣選育芥菜個體 的問題，且本發明操作簡單，同時采用本發明所述方法獲得的芥菜A亞基因組個體可多代使 用，不限制僅當代使用，可保種，選育程序簡單，整個過程周期短，可簡單快速地拓寬現有芥 菜A亞基因阻遺傳變異。
[0014] 本發明的具體操作過程為：
[0015] (1)獲得六倍體
[0016] 選取農藝形狀優良的芥菜巧郵為母本，剝蕾去雄，授W黑芥B^n花粉，授粉7-10 天后對雜種子房進行胚挽救子房培養，將胚挽救成熟種子萌發的幼苗置于分化培養基中擴 繁2輪，每輪培養25天，分化出大量的無性系，然后采用秋水仙堿誘導染色體加倍，獲得基因 組結構為巧巧巧巧。異源六倍體或W黑芥護8。為母本，剝蕾去雄，授W芥菜巧巧喘粉，授 粉7-10天后對雜種子房進行胚挽救子房培養，將胚挽救成熟種子萌發的幼苗置于分化培養 基中擴繁2輪，每輪培養25天，分化出大量的無性系，然后采用秋水仙堿誘導染色體加倍，獲 得基因組結構為巧巧巧ngn異源六倍體；
[0017] (2)創建新型芥菜A亞基因組個體
[0018] W異源六倍體作為母本，人工去雄，授予白菜ATl-nATl-n花粉，田間自然 條件下生長，至成熟后收獲種子，即得新型芥菜A亞基因組個體或W白菜ATl-nATl-n為母本，授 予異源六倍體巧巧巧巧。的花粉，田間自然條件下生長，至成熟后收獲種子，即得新型芥菜 A亞基因組個體。
[0019] 其中所述芥菜為基因組為巧巧叫勺作物，包括芥菜型油菜和蔬菜用芥菜，所述白 菜為基因組為ATl-nATl-n的作物，包括白菜型油菜和蔬菜用白菜。
[0020] 其中，j、r、n代表染色體的來源，A巧P來自芥菜B.juncea中的A染色體組，AT就是來 自白菜B. rapa的A染色體組，βη就是來自黑芥B. nigra的B染色體組，Bj就是來自芥菜B. nigra 的B染色體組。
[0021] 其中獲得萌發的Ξ倍體A巧巧η幼苗的具體方法為：摘取雜交7一10天后的S倍體 A巧巧η子房，經70 %酒精滅菌30s，無菌水清洗5min，再用10 %次氯酸鋼消毒15min，平均每 3min搖晃一次，然后采用無菌水清洗3次，每次3min，剝離幼胚，之后將子房果柄部位插入接 種到MS培養基中，放置于16小時光照，8小時暗處理，20°C的光照培養室中培育，30-35天收 獲成熟角果，無菌條件下剝離角果皮，獲得立倍體A巧巧η種子。
[0022] 對萌發的Ξ倍體A巧巧η幼苗進行染色體加倍具體操作步驟為:將獲得S倍體A巧巧。 種子置于MS培養基中萌發，萌發后幼苗經分化培養基處理獲得的無性幼苗轉入含lOOmg/L 秋水仙堿的分化培養基暗培養誘導染色體加倍處理7天，之后將無性幼苗轉入分化培養基 中培養25天成苗，最后轉入生根培養基中生根。生根后移栽，檢測植株花粉育性、結實性或 通過染色體計數篩選加倍成功個體。
[0023] 在上述萌發Ξ倍體A巧巧η幼苗、立倍體幼苗進行染色體加倍的操作步驟中所采用 的生根培養基由W下組分組成:MS培養基+0.5mg/L ΙΒΑ;分化培養基由W下組分組成，MS培 養基+2mg/L IBA+0.2mg/L NAA。
[0024] 本
【發明內容】
中所述的芥菜為基因組為AABB的作物，包括芥菜型油菜和蔬菜用芥 菜，所述白菜為基因組為AA的作物，包括白菜型油菜和蔬菜用白菜。
[0025] 本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果：
[00%]本發明通過芥菜4^巧巧^與黑芥護8。雜交，通過一輪胚挽救子房培養和染色體加倍 獲得異源六倍體巧巧巧巧η，并W六倍體A巧巧巧巧η作為橋梁，六倍體巧巧巧ngn自然條 件下可育，可反復使用，與遺傳變異豐富的多種白菜ATl-nATl-n親和性較好，田間自然條件下 可獲得雜交后代。整個操作過程周期短，可簡單快速地拓寬現有芥菜A亞基因組遺傳變異的 方法。
【具體實施方式】
[0027]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發明作 進一步的詳細說明，本發明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發明，并不作為對本 發明的限定。
[002引實施例1:
[0029] -種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，包括W下步驟：
[0030] W品系為PI174795黑芥為母本，剝蕾去雄，授予品系為4N001芥菜花粉，獲得Ξ倍 體F1，授粉第10天后對Ξ倍體F1雜種子房進行第一輪胚挽救子房培養，獲得Ξ倍體種子，萌 發后的幼苗通過秋水仙堿誘導染色體加倍，獲得異源六倍體D1;W異源六倍體D1為母本，人 工去雄，授予3份卷忍大白菜，品系分別為①4M242、②抓244、③抓246和2份白菜型油菜的花 粉，品系分別為④5W395、⑤6Y733，雜種子房在自然條件下生長，成熟后收獲。
[0031] 對實施例中異源六倍體D1與5種不同類型的白菜雜交，獲得的雜交后代的染色體 數據進行檢測，染色體數目均為36條。然后對六倍體與5種編號類型的白菜雜交的結實率進 行統計，統計結果如表1所示。同時對上述不同編號類型白菜雜交后獲得的新型芥菜進行培 育，上述不同類型的新型芥菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農藝形狀 差異明顯，遺傳變異較大。本實施例還采用上述不同類型的新型芥菜進行自交，對自交后新 型芥菜的結實率進行統計，統計結果如表1所示。
[0032] 表 1
[0033]
'[0034]上述六倍體D1與不同類型白菜雜交，其平均結^率為2.33粒/芙，上述新型芥菜自 交后，其平均結實率為4.78粒/芙。
[0035] 實施例2:
[0036] 本實施例與實施例1的區別在于:本實施例中W品系為4N001芥菜為母本，W品系 為PI174795黑芥為父本，雜交，授粉第10天對雜種子房進行子房培養，獲得Ξ倍體種子，萌 發后獲得Ξ倍體Ρ2，Ξ倍體F2經第一輪胚挽救子房培養，獲得的幼苗通過秋水仙堿誘導染 色體加倍，獲得異源六倍體D2; W異源六倍體D2為母本，人工去雄，授予3份卷忍大白菜，品 系分別為①4Μ242、②5W244、③5W246和2份白菜型油菜的花粉，品系分別為④5W395、⑤ 6Υ733，雜種子房在自然條件下生長，成熟后收獲不同類型的新型芥菜。
[0037] 對本實施例雜交后的新型芥菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染色體數目均 為36條，上述多份新型芥菜的的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農藝形狀 差異明顯，遺傳變異較大。
[0038] 按照實施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D2與不同類型白菜雜交后的平均結實 率，W及不同類型的新型芥菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為2.78粒/芙，該自交結 實率為4.82粒/芙。
[0039] 實施例3:
[0040] 本實施例與實施例1的區別在于，本實施例W異源六倍體D1為父本，白菜為母本， 白菜種類與實施例1中相同，雜交后獲得新型芥菜。
[0041 ]對本實施例雜交后的新型芥菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染色體數目均 為36條，上述多份新型芥菜的的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農藝形狀 差異明顯，遺傳變異較大。
[0042] 按照實施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D1與不同類型白菜雜交后的平均結實 率，W及不同類型的新型芥菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為2.48粒/芙，該自交結 實率為4.90粒/芙。
[0043] 實施例4:
[0044] 本實施例與實施例2的區別在于：本實施例中W異源六倍體D2為父本，白菜為母 本，白菜種類與實施例2相同，雜交后獲得的新型芥菜。
[0045] 對本實施例雜交后獲得的新型芥菜的染色體數目進行檢測，發現它們的染色體數 目均為36條，上述多份新型芥菜的的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農藝 形狀差異明顯，遺傳變異較大。
[0046] 按照實施例1中相同的檢測方法檢測六倍體D2與不同類型白菜雜交后的平均結實 率，W及不同類型的新型芥菜自交后的平均結實率，該雜交結實率為2.50粒/芙，該自交結 實率為4.65粒/芙。
[0047] 實施例5:
[0048] 本實施例與實施例1的區別在于，本實施例中黑芥和芥菜的品系不同，其他均與實 施例1相同。
[0049] 本實施例中黑芥的品系為PI174796，芥菜的品系為4N001。按照實施例1中相同的 檢測方法檢測六倍體D3與不同類型白菜雜交后的平均結實率，W及不同類型的新型芥菜自 交后的平均結實率，該雜交結實率為2.75粒/芙，該自交結實率為4.82粒/芙。
[0050] 對本實施例雜交后獲得的新型芥菜的染色體數目進行檢測，檢測結果染色體數據 均為36條，本實施例中多份新型芥菜的葉型、花色、株高、分枝數目和形態、開花期等多種農 藝形狀差異明顯，遺傳變異較大。
[0051] W上所述的【具體實施方式】，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步 詳細說明，所應理解的是，W上所述僅為本發明的【具體實施方式】而已，并不用于限定本發明 的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含 在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在于:所述方法包括利用 黑芥B nBn與芥菜WB如有性雜交，經子房培養獲得三倍體種子MBMn，三倍體種子A也 無菌條件萌發后通過染色體加倍獲得異源六倍體WBMW nBn，將所述異源六倍體與白菜 AmA+n雜交，獲得新型芥菜AjAm BjBn。2. 根據權利要求1所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述將采用胚挽救子房培養方法萌發的三倍體MBB n幼苗置于分化培養基中擴繁2輪， 每輪培養25天，分化出無性幼苗，然后將無性幼苗通過秋水仙堿誘導染色體加倍。3. 根據權利要求2所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述萌發的三倍體AjB jBn幼苗的獲得方法為:摘取雜交7-10天后的三倍體AjBjB n子房， 經70%酒精滅菌3〇8，無菌水清洗5111；[11，再用10%次氯酸鈉消毒151]1；[11，平均每31]1；[11搖晃一 次，然后采用無菌水清洗三次，每次3min，然后將子房的果柄部位插入剝離幼胚，接種到MS 培養基中，放置于16小時光照，8小時暗處理，20 °C的光照培養室中培育，30-35天收獲成熟 角果，無菌條件下剝離角果皮，獲得三倍體幼苗種子。4. 根據權利要求3所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述染色體加倍具體操作步驟為:將獲得的三倍體AMM n種子置于MS培養基中萌發，萌 發后幼苗轉入分化培養基中擴繁2次，每次培養25天，處理之后將獲得的無性系幼苗轉入含 100mg/L秋水仙堿的分化培養基中暗培養誘導染色體加倍處理7天，然后將無性處理后的幼 苗轉入分化培養基中培養25天成苗，最后轉入生根培養基中生根，生根后移栽，檢測植株花 粉育性、結實性、通過染色體計數篩選加倍成功個體。5. 根據權利要求4所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述生根培養基由以下組分組成:MS培養基+0.5mg/L IBA;分化培養基由以下組分組 成:MS培養基+2mg/L IBA+0.2mg/L NAA。6. 根據權利要求1所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述黑芥BnB n為母本，剝蕾去雄，授以芥菜^\也初花粉，有性雜交，經子房培養獲得三倍 體種子MBBn，三倍體種子AMM n染色體加倍獲得異源六倍體WBMMnBn，將所述異源六倍 體A j AjBjBjBnBn與白菜A rl-nArl-n雜交，獲得新型芥菜Aj Arl-nBjB'7. 根據權利要求1所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述芥菜WB初為母本，剝蕾去雄，授以黑芥B nBn花粉，有性雜交，經子房培養獲得三倍 體種子MBBn，三倍體種子AMM n經染色體加倍獲得異源六倍體WBMMnBn，將所述異源六 倍體A jAjBjBjBnBn與白菜A rl-nArl-n雜交，獲得新型芥菜AjA rl-nBjB'8. 根據權利要求1所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述以染色體加倍獲得的異源六倍體WB^B nBn為母本，剝蕾去雄，授以白菜Α+ηΑ+η 花粉，獲得新型芥菜Α^^ηΒ%η。9. 根據權利要求1所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征在 于:所述以白菜Alrl- nA1^n為母本，剝蕾去雄，授以染色體加倍獲得的異源六倍體WBBBnB n 花粉，獲得新型芥菜Α^^ηΒ%η。10. 根據權利要求1所述的一種利用白菜拓寬芥菜A亞基因組遺傳變異的方法，其特征 在于:所述芥菜為基因組為AABB的作物，包括芥菜型油菜和蔬菜用芥菜，所述白菜為基因組 為AA的作物，包括白菜型油菜和蔬菜用白菜。
【文檔編號】A01H4/00GK105918105SQ201610269977
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】錢偉, 明佳熠, 梅家琴, 魏瑞芳, 李勤菲
【申請人】西南大學