一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法
【專利摘要】本發明涉及細胞生物學技術領域，特別涉及一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法。該凍存液包括DMSO、右旋糖酐和無血清培養基。采用本發明提供的凍存液能夠顯著提高牙髓干細胞的活力，增強牙髓干細胞的增殖能力。
【專利說明】
一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法
技術領域
[0001] 本發明涉及細胞生物學技術領域，特別涉及一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其 凍存方法。
【背景技術】
[0002] 牙周炎是累及四種牙周支持組織(牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質）的慢性感染性 疾病，往往引發牙周支持組織的炎性破壞。在35歲以后較為多見。常見病因為菌斑、牙石、創 傷性咬合、食物嵌塞、不良修復體、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的 炎癥、牙槽骨吸收、牙齒逐漸松動。嚴重的牙周炎會造成牙齒脫落，從而導致咀嚼功能低下 而引起消化不良及胃腸病，影響全身心的健康。
[0003] 治療牙周炎的主要在于消除炎癥，促進被破壞的牙周組織的再生，恢復牙齒的正 常功能。臨床常采用的牙周炎治療方法包括:牙周基礎治療(潔治、刮治、根面平整）、牙周翻 瓣術及牙周組織再生術。
[0004] 牙周基礎治療:潔治，也稱潔牙，俗稱洗牙，其是預防和治療牙病的一種方法。即用 潔治器械清除齦上牙石、菌斑和牙面上附著的色素，并拋光牙面，是防止菌斑和牙石再沉 積，防治牙周病的措施。在潔治時還應該將齦溝內與齦上牙石相連的一部分齦下牙石也一 并清除掉。根據所用的器械不同，齦上潔治術分為手用器械潔治法和超聲波潔牙機潔治法。 對于牙齦炎患者，每6~12個月作一次潔治，可有效地維護牙周健康。齦下刮治術，即根面平 整術，其是用手工的齦下刮治器械伸入牙周袋內去除附著于牙周袋內根面上和嵌入牙骨質 內的齦下牙石和菌斑，并刮除牙根表面受到毒素污染的病變牙骨質，從而形成光滑、清潔的 根面，使根面具有生物相容的表面，有利于牙周組織的附著和新生。根面平整術不應用于健 康牙周部位，以免導致牙周附著喪失。
[0005] 牙周翻瓣術：指采用不同的手術切口，將牙齦與下方的組織分離，形成牙齦組織 瓣，暴露病變區的根面和牙槽骨，提供清創入路和可視性。刮除病變組織和菌斑牙石后，將 牙齦瓣復位在合適的位置上并縫合，達到消除牙周袋或使牙周袋變淺的目的。
[0006]牙周組織再生術:在已經缺失的牙槽骨區植入人工骨，并覆蓋專用的生物引導膜， 使牙周膜上的細胞選擇性地在根面上生長，從而達到牙周膜、牙槽骨和牙骨質的再生。通過 這種骨植和生物膜的技術，恢復已經破壞的牙槽骨、牙齦及其他的牙周組織，完成牙齒的重 新穩定。
[0007] 以上方法無法修復損傷的牙周附著及牙槽組織，不能滿足目前臨床上對口腔頌面 部組織缺損修復再生及功能、外形恢復的要求，其次牙周炎治療通過抗生素來控制菌斑生 長，進行全身和局部的藥物治療。但抗生素副作用較多，病原微生物也會產生耐藥性。
[0008] 牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齒牙髓組織中的一類 具有自我更新、增殖能力強，及多向分化能力的間充質干細胞。牙髓干細胞具有多向分化的 潛能，它除了能形成礦化結節能力的細胞外，經過不同細胞因子的誘導，還能夠分化為脂 肪、骨、軟骨、肌肉、血管內皮、肝、神經等細胞系類型。據報道，牙髓干細胞在牙周炎治療中 可起到很好的修復作用，作用機制為:通過植入局部并分化為缺損細胞，分泌細胞因子，趨 化干細胞到局部，抑制局部炎癥，促進局部血管新生。
[0009] 在牙髓干細胞的臨床應用中涉及到牙髓干細胞的凍存技術，細胞凍存是將37°C生 長培養的細胞，添加營養成分及防凍保護劑DMS0,通過逐漸降溫的方式將細胞長期超低溫 凍存于液氮中的過程。當細胞迅速解凍到常溫過程，依然可以恢復細胞的活性與保持良好 的生物學特征。
[0010] 專利公開號為CN 103563888A的中國專利公開了一種牙髓干細胞的凍存方法，具 體為:采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培養基 中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:8%的人血白蛋白、 10%的二甲基亞砜、5.1 %的右旋糖酐-40和4.25%的葡萄糖。用無菌鉗將牙齒根尖部分切 開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒完 全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進行 長期保存。
[0011]專利號為US20130217123的美國專利公開了一種牙髓干細胞的凍存方法，具體為： 采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4 °C預冷的含雙抗的無血清培養基中保 存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液：1〇%的二甲基亞砜、90% 地塞米松。用無菌鉗將牙齒根尖部分切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C 預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中 (裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進行長期保存6個月。
[0012] 但上述凍存液在細胞的凍存過程中還是會無法避免地對牙髓干細胞造成一定的 損傷，無法保證干細胞的活力，細胞增值率較低，影響干細胞的臨床利用。因此，需要開發一 種能夠更好地維持牙髓間充質干細胞活力的凍存液及其凍存方法。
【發明內容】
[0013] 有鑒于此，本發明提供了一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法。該凍存 液能夠顯著提高牙髓干細胞的活力，增強牙髓干細胞的增殖能力。
[0014] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0015] 本發明提供了一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液，包括DMS0、右旋糖酐和無血清培 養基。
[0016] 作為優選，凍存液中各組分用量為:DMSO的體積百分含量為5%~15%，右旋糖酐 為0.005~0.02g/mL，無血清培養基補足。
[0017]在本發明提供的一些實施例中，凍存液中各組分用量為:DMSO的體積百分含量為 10%，右旋糖酐為0.01g/mL，無血清培養基補足。
[0018] 在本發明提供的另一些實施例中，凍存液中各組分用量為:DMSO的體積百分含量 為5%，右旋糖酐為0.02g/mL，無血清培養基補足。
[0019] 在本發明提供的另一些實施例中，凍存液中各組分用量為:DMSO的體積百分含量 為15%，右旋糖酐為0.005g/mL，無血清培養基補足。
[0020] 本發明還提供了一種牙髓或牙髓干細胞的凍存方法，采用本發明提供的凍存液凍 存牙髓或牙髓干細胞;該凍存液包括DMSO、右旋糖酐和無血清培養基;作為優選，凍存液中 各組分用量為:DMSO的體積百分含量為5%~15%，右旋糖酐為0.005~0.02g/mL，無血清培 養基補足。
[0021] 作為優選，凍存的溫度為-80°C~-185°C。
[0022] 作為優選，凍存方法具體為:去除牙齒根尖部分，將去除根尖的牙齒放置于預冷的 凍存液中進行凍存。
[0023]作為優選，牙齒根尖部分為距根尖1~2mm范圍內的牙齒組織。
[0024] 作為優選，預冷的溫度為0~5°C。
[0025] 在本發明提供的一些實施例中，預冷的溫度為4°C。
[0026] 本發明提供了一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法。該凍存液包括 DMS0、右旋糖酐和無血清培養基。本發明的有益效果為:采用本發明提供的凍存液能夠顯著 提高牙髓干細胞的活力，增強牙髓干細胞的增殖能力。
【附圖說明】
[0027] 圖1示試驗組牙髓干細胞原代培養7天后細胞形態圖，其中，a為40倍;b為100倍；
[0028] 圖2示試驗組牙髓干細胞流式檢測結果;其中圖2-1、2_2、2-3為對照組流式鑒定結 果，2-1示空白對照，2-2示CD59、HLA-DR的表達情況，2-3示CD90、CD45的表達情況；圖2-4、2- 5、2-6為樣品組流式鑒定結果，2-4示空白對照，2-5示CD59、HLA-DR的表達情況，2-6示CD90、 ⑶45的表達情況；
[0029] 圖3示試驗組P3代牙髓干細胞誘導成骨分化鑒定結果；其中，3-1示未誘導組，3-2 示誘導組；
[0030] 圖4示試驗組P3代牙髓干細胞誘導成脂分化鑒定結果；其中，4-1示未誘導組，4-2 示誘導組。
【具體實施方式】
[0031] 本發明公開了一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法，本領域技術人員可 以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本 領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經 通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文 所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0032] 本發明提供的牙髓或牙髓干細胞的凍存液及其凍存方法中所用生物材料或試劑 均可由市場購得。
[0033] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0034] 實施例1
[0035]( - )牙髓的凍存 [0036] 實驗分為試驗組和對照組：
[0037] 1、試驗組牙髓的凍存:采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷 的含雙抗的無血清培養基中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍 存液：10% (體積百分數)DMS0; 1 % (0.Olg/mL)右旋糖酐;其余為無血清培養基；用無菌鉗將 牙齒根尖部分切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存 管中，使牙齒完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放 置-80°C冰箱進行長期保存6個月。
[0038] 2、對照組1牙髓的凍存(根據專利CN 103563888A的方法進行凍存）：
[0039] 采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培 養基中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:8%的人血白蛋 白、10%的二甲基亞砜、5.1%的右旋糖酐-40和4.25%的葡萄糖。用無菌鉗將牙齒根尖部分 切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒 完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進 行長期保存6個月。
[0040] 3、對照組2牙髓的凍存(根據專利US20130217123的方法進行凍存）：
[0041] 采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培 養基中保存;用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:1〇%的二甲基亞 砜、90%地塞米松。用無菌鉗將牙齒根尖部分切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在 裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍 存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進行長期保存6個月。
[0042](二)牙髓的復蘇過程
[0043]將牙髓凍存管放置在37°C-40 °C的水中進行快速解凍復蘇;取出牙齒，放置在SOSO 體積的 PBS 中清洗牙齒 2-3 次后 ，迅速的將牙齒切開，取出牙髓 (試驗組與對照組取出的牙 髓組織體積大小相同），用0.3%的I型膠原酶與0.1 %中性蛋白酶聯合作用牙髓組織30-60min，隨后以1000-1500rpm離心5-10min;收集細胞沉淀；用無血清培養基重懸;計算細胞 總量及細胞活力，并按照2000細胞/cm 2-10000細胞/cm2接種于培養皿或培養孔中，加入 bFGF、FGF(終濃度均為10ng/mL)，放置CO2培養箱，以37 °C、5 % CO2、95 %的濕度培養5-8天時 間；待細胞匯合度達到80-90%左右；用0.125%胰蛋白酶消化細胞，隨后以1000-1500rpm離 心5-10min;收集細胞，進行擴增培養。
[0044] 試驗組培養的細胞形態見圖1。
[0045] 由圖1可知，細胞為貼壁生長，呈現長梭狀生長，符合干細胞形態特征。對照組細胞 形態與試驗組細胞形態相近，符合干細胞形態特征。
[0046]細胞總量及細胞活力數據見表1。
[0047]表1細胞總量及細胞活力數據 L〇〇49」如表1可知，試驗組所分離得到的才髓
干細胞總量與活力均高于對照組。
[0050](三)流式細胞儀檢測牙髓細胞表面標志
[0051 ]消化收集試驗組細胞，計數后每管加入2 X IO5細胞數，染色緩沖液洗1次，1000 rpm 離心5min;棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細胞;加入⑶45、⑶59、⑶90及HLA-DR抗體各2yL， 并設一管為空白對照;在4°C下，避光反應15-20min;染色緩沖液洗一次，1000 rpm離心5min; 直接標記的細胞棄上清，避光加入500yL的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網過濾細胞樣品， 流式細胞儀檢測細胞表面抗原。流式結果見圖2。
[0052]由圖2可知，牙髓干細胞表面標志CD45(白細胞陽性）、HLA-DR(MHC-II類分子)為均 呈現陰性，同時乳牙牙髓干細胞表面標記物CD59、CD90均呈現陽性。第三代牙髓干細胞細胞 形態均一。
[0053](四）P3代細胞誘導成骨分化鑒定
[0054] 方法為:試驗組細胞培養至第2代時，按照I X IO3細胞/cm2接種于六孔板中，加入完 全培養基培養24h后，加入成骨誘導培養基進行誘導培養，每隔2-3天換液，28天后進行茜素 紅染色，結果見圖3。
[0055] (五)P3代細胞誘導成脂分化鑒定
[0056] 方法為:試驗組細胞培養至第2代時，按照I X IO3細胞/cm2接種于六孔板中，加入完 全培養基，24h后，加入成脂誘導培養基進行培養。成脂誘導培養基包括基礎培養基DMEM、 10%胎牛血清、〇.5mM ΙΒΜΧ、1μΜ地塞米松、100μΜ吲哚美辛、5yg/mL胰島素、2mmol/L谷氨酰 胺等。每三天換液。二周后進行油紅〇染色，鑒定脂滴形成情況，結果見圖4。
[0057] 實施例2
[0058](一)牙髓的凍存
[0059] 實驗分為試驗組和對照組：
[0060] 1、試驗組牙髓的凍存:采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷 的含雙抗的無血清培養基中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍 存液:5%DMSO; 2% (0.02g/mL)右旋糖酐；其余為無血清培養基；用無菌鉗將牙齒根尖部分 切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒 完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進 行長期保存6個月。
[0061 ] 2、對照組牙髓的凍存(根據專利CN 103563888A的方法進行凍存）：
[0062]采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培 養基中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:8%的人血白蛋 白、10%的二甲基亞砜、5.1%的右旋糖酐-40和4.25%的葡萄糖。用無菌鉗將牙齒根尖部分 切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒 完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進 行長期保存6個月。
[0063] 3、對照組2牙髓的凍存(根據專利US20130217123的方法進行凍存）：
[0064]采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培 養基中保存;用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:1〇%的二甲基亞 砜、90%地塞米松。用無菌鉗將牙齒根尖部分切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在 裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍 存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進行長期保存6個月。
[0065](二)牙髓的復蘇過程
[0066]將牙髓凍存管放置在37 °C_40°C的水中進行快速解凍復蘇;取出牙齒，放置在SOSO 體積的 PBS 中清洗牙齒 2-3 次后 ，迅速的將牙齒切開，取出牙髓 (試驗組與對照組取出的牙 髓組織體積大小相同），用0.3%的I型膠原酶與0.1 %中性蛋白酶聯合作用牙髓組織30- 60min，隨后以1000-1500rpm離心5-10min;收集細胞沉淀；用無血清培養基重懸;計算細胞 總量及細胞活力，并按照2000細胞/cm2-10000細胞/cm2接種于培養皿或培養孔中，加入 bFGF、FGF(終濃度均為10ng/mL)，放置CO2培養箱，以37 °C、5 % CO2、95 %的濕度培養5-8天時 間；待細胞匯合度達到80-90%左右；用0.125%胰蛋白酶消化細胞，隨后以1000-1500rpm離 心5-10min;收集細胞，進行擴增培養。
[0067]試驗組培養的細胞形態與圖1相近，細胞為貼壁生長，呈現長梭狀生長，符合干細 胞形態特征。對照組細胞形態與試驗組細胞形態相近，符合干細胞形態特征。
[0068]細胞總量及細胞活力數據見表2。
[0069]表2細胞總量及細胞活力數據
[0071] 如表2可知，試驗組所分離得到的牙髓干細胞總量與活力均高于對照組。
[0072](三)流式細胞儀檢測牙髓細胞表面標志
[0073]消化收集試驗組細胞，計數后每管加入2 X IO5細胞數，染色緩沖液洗1次，1000 rpm 離心5min;棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細胞;加入⑶45、⑶59、⑶90及HLA-DR抗體各2yL， 并設一管為空白對照;在4°C下，避光反應15-20min;染色緩沖液洗一次，1000 rpm離心5min; 直接標記的細胞棄上清，避光加入500yL的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網過濾細胞樣品， 流式細胞儀檢測細胞表面抗原。流式結果與圖2相近。
[0074]由流式結果可知，牙髓干細胞表面標志CD45(白細胞陽性）、HLA-DR(MHC-II類分 子)為均呈現陰性，同時乳牙牙髓干細胞表面標記物CD59、CD90均呈現陽性。第三代牙髓干 細胞細胞形態均一。
[0075](四）P3代細胞誘導成骨分化鑒定
[0076]方法為:試驗組細胞培養至第2代時，按照I X IO3細胞/cm2接種于六孔板中，加入完 全培養基培養24h后，加入成骨誘導培養基進行誘導培養，每隔2-3天換液，28天后進行茜素 紅染色，結果與圖3相近。
[0077](五)P3代細胞誘導成脂分化鑒定
[0078]方法為:試驗組細胞培養至第2代時，按照I X IO3細胞/cm2接種于六孔板中，加入完 全培養基，24h后，加入成脂誘導培養基進行培養。成脂誘導培養基包括基礎培養基DMEM、 10%胎牛血清、〇.5mM ΙΒΜΧ、1μΜ地塞米松、100μΜ吲哚美辛、5yg/mL胰島素、2mmol/L谷氨酰 胺等。每三天換液。二周后進行油紅〇染色，鑒定脂滴形成情況，結果與圖4相近。
[0079] 實施例3
[0080](一)牙髓的凍存
[0081 ] 實驗分為試驗組和對照組：
[0082] 1、試驗組牙髓的凍存:采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷 的含雙抗的無血清培養基中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍 存液：15 %DMSO; 0.5 % (0.005g/mL)右旋糖酐；其余為無血清培養基；用無菌鉗將牙齒根尖 部分切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使 牙齒完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰 箱進行長期保存6個月。
[0083] 2、對照組牙髓的凍存(根據專利CN 103563888A的方法進行凍存）：
[0084]采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培 養基中保存；用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:8%的人血白蛋 白、10%的二甲基亞砜、5.1%的右旋糖酐-40和4.25%的葡萄糖。用無菌鉗將牙齒根尖部分 切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒 完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進 行長期保存6個月。
[0085] 3、對照組2牙髓的凍存(根據專利US20130217123的方法進行凍存）：
[0086]采集30歲以下完整無損的人或動物的牙齒，放置于4°C預冷的含雙抗的無血清培 養基中保存;用含雙抗的生理鹽水去除牙齒表面的污垢;配制牙髓凍存液:1〇%的二甲基亞 砜、90%地塞米松。用無菌鉗將牙齒根尖部分切開;至少切開一個小口即可，將牙齒放置在 裝有4°C預冷牙髓凍存液的凍存管中，使牙齒完全浸沒于凍存液中。將凍存管放置在程序凍 存盒中（裝有異丙醇）；隨后放置-80°C冰箱進行長期保存6個月。
[0087](二)牙髓的復蘇過程
[0088]將牙髓凍存管放置在37 °C_40°C的水中進行快速解凍復蘇;取出牙齒，放置在SOSO 體積的 PBS 中清洗牙齒 2-3 次后 ，迅速的將牙齒切開，取出牙髓 (試驗組與對照組取出的牙 髓組織體積大小相同），用0.3%的I型膠原酶與0.1 %中性蛋白酶聯合作用牙髓組織30-60min，隨后以1000-1500rpm離心5-10min;收集細胞沉淀；用無血清培養基重懸;計算細胞 總量及細胞活力，并按照2000細胞/cm 2-10000細胞/cm2接種于培養皿或培養孔中，加入 bFGF、FGF(終濃度均為10ng/mL)，放置CO2培養箱，以37 °C、5 % CO2、95 %的濕度培養5-8天時 間；待細胞匯合度達到80-90%左右；用0.125%胰蛋白酶消化細胞，隨后以1000-1500rpm離 心5-10min;收集細胞，進行擴增培養。
[0089] 試驗組培養的細胞形態與圖1相近，細胞為貼壁生長，呈現長梭狀生長，符合干細 胞形態特征。對照組細胞形態與試驗組細胞形態相近，符合干細胞形態特征。
[0090] 細胞總量及細胞活力數據見表3。
[0091 ]表3細胞總量及細胞活力數據
LUUW」 如表加」知，試驗組所分咼得到的才髓十細胞總重與沽力均咼于對照組。
[0094](三)流式細胞儀檢測牙髓細胞表面標志
[0095]消化收集試驗組細胞，計數后每管加入2 X IO5細胞數，染色緩沖液洗1次，1000 rpm 離心5min;棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細胞;加入⑶45、⑶59、⑶90及HLA-DR抗體各2yL， 并設一管為空白對照;在4°C下，避光反應15-20min;染色緩沖液洗一次，1000 rpm離心5min; 直接標記的細胞棄上清，避光加入500yL的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網過濾細胞樣品， 流式細胞儀檢測細胞表面抗原。流式結果與圖2相近。
[0096]由流式結果可知，牙髓干細胞表面標志CD45(白細胞陽性）、HLA-DR(MHC-II類分 子)為均呈現陰性，同時乳牙牙髓干細胞表面標記物CD59、CD90均呈現陽性。第三代牙髓干 細胞細胞形態均一。
[0097](四）P3代細胞誘導成骨分化鑒定
[0098]方法為:試驗組細胞培養至第2代時，按照I X IO3細胞/cm2接種于六孔板中，加入完 全培養基培養24h后，加入成骨誘導培養基進行誘導培養，每隔2-3天換液，28天后進行茜素 紅染色，結果與圖3相近。
[0099](五)P3代細胞誘導成脂分化鑒定
[0100]方法為:試驗組細胞培養至第2代時，按照I X IO3細胞/cm2接種于六孔板中，加入完 全培養基，24h后，加入成脂誘導培養基進行培養。成脂誘導培養基包括基礎培養基DMEM、 10%胎牛血清、〇.5mM ΙΒΜΧ、1μΜ地塞米松、100μΜ吲哚美辛、5yg/mL胰島素、2mmol/L谷氨酰 胺等。每三天換液。二周后進行油紅〇染色，鑒定脂滴形成情況，結果與圖4相近。
[0101]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種牙髓或牙髓干細胞的凍存液，其特征在于，包括DMSO、右旋糖酐和無血清培養 基。2. 根據權利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述凍存液中各組分用量為:DMSO的體 積百分含量為5%~15%，右旋糖酐為0.005~0.02g/mL，無血清培養基補足。3. 根據權利要求2所述的凍存液，其特征在于，所述凍存液中各組分用量為:DMSO的體 積百分含量為10 %，右旋糖酐為0.01g/mL，無血清培養基補足。4. 根據權利要求2所述的凍存液，其特征在于，所述凍存液中各組分用量為:DMSO的體 積百分含量為5%，右旋糖酐為0.02g/mL，無血清培養基補足。5. 根據權利要求2所述的凍存液，其特征在于，所述凍存液中各組分用量為:DMSO的體 積百分含量為15 %，右旋糖酐為0.005g/mL，無血清培養基補足。6. -種牙髓或牙髓干細胞的凍存方法，其特征在于，采用如權利要求1至5中任一項所 述凍存液凍存牙髓或牙髓干細胞。7. 根據權利要求6所述的凍存方法，其特征在于，所述凍存的溫度為-80°C~-185°C。8. 根據權利要求6所述的凍存方法，其特征在于，所述凍存方法具體為：去除牙齒根尖 部分，將去除根尖的牙齒放置于預冷的所述凍存液中進行凍存。9. 根據權利要求8所述的凍存方法，其特征在于，所述牙齒根尖部分為距根尖1~2mm范 圍內的牙齒組織。10. 根據權利要求8所述的凍存方法，其特征在于，所述預冷的溫度為0~5 °C。
【文檔編號】A01N1/02GK105941390SQ201610347793
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】陳海佳, 王飛, 王一飛, 葛嘯虎, 馮德龍, 馬巖巖
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司