專利名稱：人牙周膜干細胞庫的構建方法
技術領域：
本發明屬于生物組織材料技術領域，具體涉及人牙周膜干細胞的制備及其細胞庫
的構建方法。
背景技術：
目前，牙周炎已成為危害口腔乃至人體健康的一大疾患，其發病率逐年上升。牙周 炎發展最終的直接結果就是牙齒缺失，進而危及全身健康，因此，尋求有效的治療途徑是目 前的迫切任務。如何有效地在病變根面上獲得新生的牙骨質、牙周膜和牙槽骨，是治療牙 周炎的關鍵。牙周膜是介于牙根與牙槽骨之間的一層結締組織，主要由成纖維細胞、成牙 骨質細胞和一些未分化的間充質細胞組成。利用克隆篩選并用磁珠分離方法得到具有形 成細胞克隆能力和高度增殖能力的牙周膜干細胞，證實了牙周膜中存在一種具有多向分化 潛會g的干細胞(Byoung_Moo Seo， Masako Miura， StanGronthos, et al， Investigation of multipotent postnatal stem cells from humanperiodontal ligament, Lancet 2004 ; 364:149 55)。對牙周組織發育和牙周損傷后再生機制的研究表明牙周組織在疾病或受 到外界剌激時，通過牙周膜中不同細胞亞群的增殖、分化和定向遷移，能夠實現組織的修復 再生。 種子細胞來源是進行牙周組織工程的首要問題。近年來，隨著對成體干細胞研究 的深入，采用成體干細胞作為種子細胞治療牙周病已成為研究熱點，而骨髓基質干細胞、牙 周膜細胞、牙周膜干細胞的應用也有報道。Seo的研究顯示只有不同亞群的牙周膜干細胞 能分化為成牙骨質細胞樣細胞、成骨細胞樣細胞以及成纖維細胞樣細胞，形成類似天然的 牙周膜樣結締組織和牙周膜與牙骨質復合體的結構，實現完全意義上的牙周組織的自我更 新，這是區別于其他成體干細胞的重要特征之一。另外，牙周炎已被證實是糖尿病、心腦血 管疾病及呼吸系統疾病的危險因素，因此，利用牙周膜干細胞治療牙周炎對全身性疾病的 預防和治療具有重要的意義。 總之，牙周膜干細胞研究為牙周炎的治療提供了新思路，而對牙周膜干細胞的研 究及臨床應用則需要大量的牙周膜干細胞。 干細胞庫是在深低溫中儲存干細胞以及搜集存儲干細胞資源相關資料的場所，完 善的干細胞庫應具備隨時隨地將健康的干細胞提供于臨床使用的能力。目前已成功建立有 一些干細胞庫(如臍帶血干細胞庫)，而至今仍無人牙周膜干細胞庫。從乳恒牙替換至阻生 牙、多生牙及正畸牙齒，大量的牙齒被廢棄，其中的牙周膜干細胞資源被白白流失；因此，建 立人牙周膜干細胞庫，可以為自體及他人提供牙周疾病治療及牙齒再生的種子細胞。
發明內容
本發明的目的是提供一種人牙周膜干細胞庫的構建方法，并提出一種充分利用乳 牙、阻生牙、多生牙及正畸牙為來源的人牙周膜干細胞的制備方法；為人牙周膜干細胞庫的 構建和人牙周膜干細胞的制備提供容易掌握、安全可行、成本低廉的操作規范。
本發明人牙周膜干細胞庫的構建方法，有基本信息采集、牙周膜干細胞獲取、牙周 膜干細胞的凍存、入庫以及信息記錄與核對的步驟；具體包括 步驟一、采集基本信息如檢索編碼、供體姓名、年齡、身份證號碼、出生日期、種 族、通訊地址、聯系方式、常規檢查結果以及后續步驟的相關信息；所述的常規檢查包括 供體血液的AB0/Rh血型檢測、HLA分型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗 體檢測及HIV免疫檢測等，還可以包括供體三代以內上述項目的檢測；
步驟二、獲取牙周膜干細胞(1)將供體新鮮含豐富牙周膜組織的牙齒采用含V/V 為5% 20%新生牛血清的DMEM培養液完成轉移，在無菌狀態下用PBS液沖洗，在所述含 新生牛血清的DMEM培養液中刮取牙周膜組織，用PBS液沖洗組織碎塊；(2)在1000 2000 轉/分鐘離心3 10分鐘，去除上清液，加入5 10倍體積的消化液后，用吸管吹散均勻， 置入37t:孵箱中透氣孵育10 60分鐘；所述的消化液為3 9U/ml膠原酶溶液與相同體 積的0. 2 5U/ml分散酶溶液的混合；(3)孵育完成后，在懸液中加入所述含新生牛血清的 DMEM培養液，吹散組織細胞懸液阻止消化，在800 2000轉/分鐘離心3 10分鐘，棄上 清后，加入5 10倍體積的完全培養基重懸細胞，將細胞懸液轉入培養瓶中進行原代培養， 期間1 4天換液一次；(4)細胞培養至7 9天后用3 9U/ml濃度的胰酶溶液消化并 吹打細胞，使細胞完全脫落后重新接種培養；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離 法分離出牙周膜干細胞；再用干細胞標志物(如STR0-1和CD146)對所得到的細胞進行鑒 定，然后采用細胞工廠進行擴增培養； 所述的完全培養基是在a -MEM培養液中按體積比加有10 30%的胎牛血清，終 濃度為400 600ng/ml的Noggin和終濃度為20 60ng/ml的成纖維細胞生長因子；另 外，細胞條件培養基是牙周膜干細胞在完全培養基中培養2 4天后，收集其培養液去除雜 質后的液體。 步驟三、牙周膜干細胞凍存、入庫將所獲得的牙周膜干細胞按2X 107 9X 107個 /ml的密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，將凍存管在0 fC條件下，以0. 5 2°C /分 鐘的速度冷凍至-80 -120°C ;再將凍存管轉移至_1961:液氮中貯存入庫；貯存入庫可以 按AB0/Rh和HLA分型進行分類保存； 所述的凍存液包括以下四種①完全培養基中含10%體積的甘油；②完全培養基 中含10%體積的二甲基亞砜(DMS0);③所述凍存液①與同體積細胞條件培養基的混合；
所述凍存液②與同體積細胞條件培養基的混合。其中，①和②適用于乳牙及《40歲供體的 恒牙牙周膜干細胞庫的構建；③和④適用于40 60歲供體的牙周膜干細胞庫的構建。所述 凍存液中的二甲基亞砜和甘油，能夠快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點、延緩冷凍過程， 同時提高胞內離子濃度，避免液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結構紊亂等導致的細胞損傷。
步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關信息，將前述所采集 供體基本信息和相應牙周膜干細胞制備及其細胞庫構建過程的相關信息錄入計算機信息
庫；并按檢索編碼調出相關記錄與供體資料進行核實，納入細胞庫管理；即完成人牙周膜 干細胞庫的構建。 本發明所構建人牙周膜干細胞庫的應用方法是，按檢索編碼在細胞庫管理中核對 相關信息后，將對應的存貯細胞凍存管由液氮中取出，即刻放入37t: 45t:的水浴中，30 秒至1分鐘內融化，急速融化復蘇可防止損害細胞；將所復蘇細胞按照實際需要進行擴增培養后即可應用。 本發明的人牙周膜干細胞制備及其細胞庫的構建方法，可從廢棄的人健康牙齒的 牙周膜中獲得大量的牙周膜干細胞，利用系統工程，建立有效資源的儲備庫。本發明儲存于 庫內的人牙周膜干細胞，經短期培養可獲得大量(2X1(T 8X1(T)富有功能活性的牙周 膜干細胞，并能長期保存而不失其活性。與已有的干細胞庫相比，本發明的構建操作規范， 簡單容易掌握，安全可行，建庫成本低廉，標準化程度高，針對不同年齡段來源的細胞采用 不同的凍存液使得復蘇后細胞的活性增強，擴大了細胞的來源、增強了細胞的活性。此外， 本發明所使用的牙齒均為各種原因被拔除廢棄的牙齒，大大節約了醫療資源；因此，人牙周 膜干細胞庫的構建具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式以下結合實例對本發明技術方案作進一步說明，但并不受限于下述實例。實例中 的操作均在嚴格無菌環境進行，為保證細胞不受污染，在所有使用的PBS、 o-MEM及DMEM的 溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
實施例1、人智齒牙周膜干細胞的制備及其干細胞庫的構建 步驟一、采集基本信息抽取供體靜脈血經過檢測程序(AB0/Rh血型檢測、HLA分 型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等)確定安 全性后記錄，采集供體基本信息包括檢索編碼、姓名、年齡、身份證號、出生日期、種族、通 訊地址及聯系方式等； 步驟二、獲取牙周膜干細胞獲取供體阻生智齒兩顆置入準備好的含V/V為10% 小牛血清的DMEM培養液的離心管中，用膜封口后轉移至無菌超凈臺，用pH7. 4的PBS液反 復沖洗去除表面殘留血液，在含V/V為10%小牛血清的DMEM培養液中刮取牙周膜，用PBS 液沖洗組織碎塊；把所得到的組織碎塊采用1200轉/分鐘離心5分鐘，去除上清液，加入 2ml消化液(為6. 25U/ml的膠原酶溶液與相同體積的1U/ml分散酶溶液的混合)后用吸管 吹散牙周膜組織碎塊，放入37°C、5% C02條件的孵箱中透氣孵育50分鐘；孵育完成后，在 懸液中加入上述含小牛血清的DMEM培養液5ml，吹散組織細胞懸液阻止其繼續消化，1000 轉/分鐘離心5分鐘，去除上清，加入4ml的完全培養基重懸細胞(完全培養基是在a -MEM 培養液中按體積比加有20%的胎牛血清，終濃度為400ng/ml的Noggin和終濃度為60ng/ ml的成纖維細胞生長因子)，將細胞懸液移入T型培養瓶進行原代培養，12小時后換液，此 后每間隔2 4天換液；8天后用3U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫落 后重新接種培養；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙周膜干細胞；對 所獲得的牙周膜干細胞進行STR0-1及CD146鑒定檢測；然后將牙周膜干細胞接種于細胞工 廠中擴增培養； 步驟三、牙周膜干細胞凍存、入庫將擴增所得的牙周膜干細胞按4Xl(f個/ml的 密度在凍存液(細胞條件培養基與同體積含10%二甲基亞砜的完全培養基的混合)中重 懸，分裝進凍存管，將凍存管置于4t:環境中，以1°C /分鐘的速度冷凍至_120°〇，然后將凍 存管轉移到-196t:液氮罐中貯存入庫；按AB0/Rh和HLA分型進行分類保存；
步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關信息(如檢索編碼 和供體姓名)，將前述所采集供體基本信息和牙周膜干細胞制備及細胞庫構建過程的相關信息(如細胞培養液構成及濃度、胰酶及膠原酶濃度及消化時間、細胞接種密度及原代與
擴增培養時間、凍存液構成及凍存時間等)錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調出相關記
錄與供體資料進行核實，確認所有資料及操作準確無誤，納入細胞庫管理；即完成人智齒牙
周膜干細胞庫的構建。應用時將上述細胞按照實際需要進行復蘇和擴增培養。 實施例2、人正畸拔除牙牙周膜干細胞的制備及其干細胞庫的構建 步驟一、采集基本信息抽取供體靜脈血經過檢測程序(AB0/Rh血型檢測、HLA分
型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等)確定安
全性后記錄，采集供體基本信息包括檢索編碼、姓名、年齡、身份證號、出生日期、種族、通
訊地址及聯系方式等； 步驟二、獲取牙周膜干細胞獲取供體因正畸需拔除的尖牙4顆放入準備好的含 V/V為15%小牛血清的DMEM培養液的離心管中，用膜封口后轉移至無菌超凈臺，用pH7. 4 的PBS液反復沖洗去除表面殘留血液，在所述含小牛血清的DMEM培養液中刮取根部牙周 膜，并使牙周膜組織塊成碎塊，用PBS液沖洗，采用1200轉/分鐘離心5分鐘，棄上清液，加 入2ml消化液(為6. 25U/ml的膠原酶溶液與相同體積的1U/ml的分散酶溶液的混合)后 用吸管吹散牙周膜組織碎塊，放入37°C、5% C02條件的孵箱中透氣孵育50分鐘；孵育完成 后，在懸液中加入所述含小牛血清的DMEM培養液3ml，吹散組織細胞懸液阻止其繼續消化， 1000轉/分鐘離心5分鐘，去除上清，加入4ml的完全培養基重懸細胞(完全培養基是在 a -MEM培養液中按體積比加有20%的胎牛血清，終濃度為600ng/ml的Noggin和終濃度為 40ng/ml的成纖維細胞生長因子)，將細胞懸液移入T型培養瓶進行原代培養，12小時后換 液，此后每間隔2天換液；7天后用6U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫 落后重新接種培養；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙周膜干細胞； 對所獲得的牙周膜干細胞進行STR0-1及CD146鑒定檢測；然后將牙周膜干細胞接種于細胞 工廠中擴增培養； 步驟三、牙周膜干細胞凍存、入庫將擴增所得的牙周膜干細胞按5Xl(f個/ml的 密度在凍存液(含10%體積的二甲基亞砜的完全培養基)中重懸，分裝進凍存管，將凍存管 置于2t:環境中，以1°C /分鐘的速度冷凍至-IO(TC，然后將凍存管轉移到_1961:液氮罐中 貯存入庫；按AB0/Rh和HLA分型進行分類保存； 步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關信息(如檢索編碼 和供體姓名)，將前述所采集供體基本信息和牙周膜干細胞制備及細胞庫構建過程的相關 信息(如細胞培養液構成及濃度、胰酶及膠原酶濃度及消化時間、細胞接種密度及原代與 擴增培養時間、凍存液構成及凍存時間等)錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調出相關記 錄與供體資料進行核實，確認所有資料及操作準確無誤，納入細胞庫管理；即完成人牙周膜 干細胞庫的構建。應用時將上述細胞按照實際需要進行復蘇和擴增培養。
實施例3、人乳牙牙周膜干細胞的制備及其干細胞庫的構建 步驟一、采集基本信息抽取供體靜脈血經過檢測程序(AB0/Rh血型檢測、HLA分 型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等)確定安 全性后記錄，采集供體基本信息包括檢索編碼、姓名、年齡、身份證號、出生日期、種族、通 訊地址及聯系方式等； 步驟二、獲取牙周膜干細胞獲取供體因乳恒牙替換需拔除的乳牙3顆置入準備
6好的含V/V為10X小牛血清的匿EM培養液的離心管中，用膜封口后轉移至無菌超凈臺，用 pH7. 4的PBS液反復沖洗去除表面殘留血液，在所述含小牛血清的DMEM培養液中刮取牙周 膜，并使牙周膜組織塊成碎塊，用PBS液沖洗；采用1200轉/分鐘離心4分鐘，去除上清液， 加入2ml消化液(為4. 25U/ml的膠原酶溶液與相同體積的0. 4U/ml分散酶溶液的混合) 后用吸管吹散牙周膜組織碎塊，放入37°C、5% C02條件的孵箱中透氣孵育40分鐘；孵育完 成后，在懸液中加入所述含小牛血清的DMEM培養液2ml，吹散組織細胞懸液阻止其繼續消 化，800轉/分鐘離心5分鐘，去除上清，加入4ml的完全培養基重懸細胞(完全培養基是在 a -MEM培養液中按體積比加有20%的胎牛血清，終濃度為500ng/ml的Noggin和終濃度為 50ng/ml的成纖維細胞生長因子)，將細胞懸液移入T型培養瓶進行原代培養，12小時后換 液，此后每間隔3天換液；7天后用5U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫 落后重新接種培養；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙周膜干細胞； 對所獲得的牙周膜干細胞進行STRO-1及CD146鑒定檢測；然后將牙周膜干細胞接種于細胞 工廠中擴增培養； 步驟三、牙周膜干細胞凍存、入庫將擴增所得的牙周膜干細胞按3Xl(f個/ml的 密度在凍存液(含10%體積甘油的完全培養基)中重懸，分裝進凍存管，將凍存管置于4t: 環境中，以1°C /分鐘的速度冷凍至-IO(TC，再將凍存管轉移到-196t:液氮罐中貯存入庫； 按ABO/Rh和HLA分型進行分類保存； 步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關信息(如檢索編碼 和供體姓名)，將前述所采集供體基本信息和牙周膜干細胞制備及細胞庫構建過程的相關 信息(如細胞培養液構成及濃度、胰酶及膠原酶濃度及消化時間、細胞接種密度及原代與 擴增培養時間、凍存液構成及凍存時間等)錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調出相關記 錄與供體資料進行核實，確認所有資料及操作準確無誤，納入細胞庫管理；即完成人乳牙牙 周膜干細胞庫的構建。應用時將上述細胞按照實際需要進行復蘇和擴增培養。
權利要求
一種人牙周膜干細胞庫的構建方法，其特征在于，有基本信息采集、牙周膜干細胞獲取、牙周膜干細胞的凍存、入庫以及信息記錄與核對的步驟；具體包括步驟一、采集基本信息包括檢索編碼，供體姓名、年齡、身份證號碼、出生日期、種族、通訊地址、聯系方式、常規檢查結果以及后續步驟的相關信息；步驟二、獲取牙周膜干細胞①將供體新鮮牙齒組織采用含V/V為5％～20％新生牛血清的DMEM培養液完成轉移，在無菌條件下用PBS液沖洗，在所述含小牛血清的DMEM培養液中刮取牙周膜，并使牙周膜組織成碎塊用PBS液沖洗；②在1000～2000轉/分鐘離心3～10分鐘，去除上清液，加入5～10倍體積的消化液后，用吸管吹散均勻，置入37℃孵箱中透氣孵育10～60分鐘；所述的消化液為3～9U/ml膠原酶溶液與相同體積的0.2～5U/ml分散酶溶液的混合；③孵育完成后，在懸液中加入所述含新生牛血清的DMEM培養液，吹散組織細胞懸液阻止消化，在800～2000轉/分鐘離心3～10分鐘，棄上清后，加入5～10倍體積的完全培養基重懸細胞，轉入培養瓶中進行原代培養，期間1～4天換液一次；④培養7～9天后用3～9U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫落后重新接種培養；待細胞長滿瓶底80～90％時，采用磁珠分離法分離出牙周膜干細胞；采用干細胞標志物對所得到的細胞進行鑒定，再采用細胞工廠進行擴增培養；步驟三、牙周膜干細胞凍存、入庫將所獲得的牙周膜干細胞按2×107～9×107個/ml的密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，在0～4℃條件下以0.5～2℃/分鐘的速度冷凍至-80～-120℃；再將凍存管轉移至-196℃液氮中貯存入庫；步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關信息，將前述所采集供體基本信息和相應牙周膜干細胞制備及其細胞庫構建過程的相關信息錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調出相關記錄與供體資料進行核實，納入細胞庫管理；即完成人牙周膜干細胞庫的構建。
2. 根據權利要求l所述的細胞庫構建方法，其特征在于，所述的完全培養基是在 a -MEM培養液中按體積比加有10 30%的胎牛血清，終濃度為400 600ng/ml的Noggin 和終濃度為20 60ng/ml的成纖維細胞生長因子；所述的細胞條件培養基是牙周膜干細胞 在完全培養基中培養2 4天后，收集其培養液去除雜質后的液體。
3. 根據權利要求1所述的細胞庫構建方法，其特征在于，所述的凍存液包括以下四種①完全培養基中含10%體積的甘油；②完全培養基中含10%體積的二甲基亞砜；③所述凍存液①與同體積細胞條件培養基的混合；④所述凍存液②與同體積細胞條件培養基的混 合。
4. 根據權利要求1或2所述的細胞庫構建方法，其特征在于，在所有使用的PBS、 a -MEM及DMEM的溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
全文摘要
一種人牙周膜干細胞庫的構建方法，本發明包括基本信息采集、牙周膜干細胞獲取、牙周膜干細胞的凍存、入庫以及信息記錄與核對的步驟；應用時按照實際需要進行復蘇和擴增培養。本發明由廢棄的人健康牙齒的牙周膜中獲得牙周膜干細胞，利用系統工程，建立有效資源的儲備庫，儲存于庫內的人牙周膜干細胞，經短期培養可獲得大量富有功能活性的牙周膜干細胞，并能長期保存而不失其活性；與已有技術相比，本發明的構建操作規范，簡單容易掌握，安全可行，建庫成本低廉，標準化程度高，針對不同年齡段來源的細胞采用不同的凍存液使得復蘇后細胞的活性增強，擴大了細胞的來源、增強了細胞的活性。本發明所用的牙齒均為各種原因被拔除廢棄的牙齒，大大節約了醫療資源，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N5/074GK101717751SQ20091021940
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月9日 優先權日2009年12月9日
發明者張勇杰, 郭維華, 金巖 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學;西安組織工程工程技術研究中心