專利名稱：乳牙牙髓在制備間充質干細胞中的應用和乳牙牙髓間充質干細胞的培養方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，涉及ー種乳牙牙髓組織間充質干細胞，尤其是ー種乳牙牙髓在制備間充質干細胞中的應用和乳牙牙髓間充質干細胞的培養方法。
背景技術：
干細胞是ー種未分化的細胞，有兩個基本特性，ー是具有自我復制能力，ニ是能分化成ー種以上的功能細胞，根據分化潛能的大小，干細胞一般分成三類，第一類是全能干細胞(totipotent stem cell)即可以分類為功能一致的全能細胞，可以發育為胎兒；第二類是多潛能干細胞(pturipotent stem cell),它能夠分化為身體中的姆種細胞類型,但是不能形成胎盤或胎兒發育所必需的支持組織。由于多潛能干細胞的分化潛能不是“全體” 的，因此不將這種細胞稱為“全能”，而且它們不是胚胎。多潛能干細胞進一歩特化為多能(multiPotent)干細胞,其專用于分化為特定功能特化的特定種系的細胞。多能干細胞能夠分化為它們所源自的組織中含有的細胞類型；例如血液干細胞只能夠分化為紅血細胞、白血細胞和血小板。胚胎干細胞(Embryonic stem cell)具有廣泛的潛能,能生成除胎盤外的機體所有的組織細胞；第三類是成體干細胞(aduit stem cell)是ー種將擁有終生自我復制(identical copies)和自我更新(self-renewal)能力的未分化細胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類型的資質細胞。干細胞的分類，主要分為造血干細胞及非造血干細胞。造血干細胞主導血液、免疫方面的疾病，來源例如臍帶血；非造血干細胞則以細胞分化與修復為主，可應用于中風、糖尿病、老年癡呆等再生醫學，來源有臍帶、乳牙等。間充質干細胞(mesenchymal stem cell MSC)是可形成多種細胞類型的多能干細胞。MSC最早在骨髄中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。鑒于間充質干細胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進造血干細胞植入、調節免疫以及分離培養操作簡便等特點，正日益受到人們的關注。隨著間充質干細胞及其相關技術的日益成熟，臨床研究已經在許多國家開展。作為種子細胞，臨床上主要用于治療機體無法自然修復的組織細胞和器官損傷的多種難治性疾病；作為免疫調節細胞，治療免疫排斥和自身免疫性疾病。目前，已經能夠從骨髄、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質干細胞，用得最多的是骨髓來源的間充質干細胞。但骨髓來源的間充質干細胞存在以下問題隨著年齡的老化，干細胞數目顯著降低、増殖分化能力大幅度衰退；制備過程不容易質控；移植異體可能引起免疫反應；取材時對患者有損傷，患者有骨髄疾病時不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髄。這都限制了骨髄間充質干細胞臨床應用，使得尋找骨髄以外其他可替代的間充質干細胞來源成為ー個重要的問題。胎盤和臍帶組織中分離出的間充質干細胞，不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且具有細胞更原始，有更強的増殖分化能力；免疫細胞較為幼稚，功能活性低，不會觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病；干細胞易于分離，純度高，便于質控；采集時對產婦及新生兒無任何危害及損傷，倫理學爭議少等優點。雖然胎盤或臍帶含有非常豐富的干細胞，但是其問題是組織材料的收集只能一次完成，局限于生產時的一瞬間做收集，錯過時機將不能再次得到。臍帶血、骨髄、牙髓干細胞功能各有不同，臍帶血主要針對血液性疾病、骨髓則在器官的修補。乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduousteeth, SHED)屬于多功能的成體干細胞，利用生物晶片技術分析后，顯示乳牙及牙齦干細胞可大量表現各種生長因子。其作用包括①可運用于組織修復的再生醫療，這些細胞經由特別處理后，可分化為造骨細胞、造軟骨細胞、神經細胞、血管細胞、脂肪細胞、造象牙質細胞等，未來可以運用于各種間質組織修復的再生醫療。②用于醫學美容，目前醫學美容常用的肉毒桿菌及玻尿酸，只能維持6至12個月的功效，若以牙齦自體干細胞治療皮膚皺紋與法令紋等，則可以達到3年之久，且無排斥性。③對治療神經退化性疾病如阿茲海默癥乃至于抗老化、皮膚及骨質再生、器官及血管修補、象牙質、牙髓組織、嚴重牙周病修復，甚至巴金森氏癥、糖尿病的改善及軟骨再生方面均具有很大的應用潛力。④能及時對病變部位和外傷受損處進行再生性治療。目前干細胞儲存以臍帶血及骨髄最熱門，但相較之下，SHED在未來細胞治 療應用上，具有相當大的優勢和不可替代的作用。乳牙干細胞的増殖再生力強、組織相容性高、儲存方便，提供現代人第2次機會儲存干細胞(第I次是臍帶血、臍帶和胎盤)。若能將干細胞儲存起來，未來可望造福到自己、父母甚至祖父母。現有的培養人干細胞的方法需要使用飼養層、飼養條件培養基(feederconditioned media)或在培養基中供應人或動物細胞提取物以擴增干細胞和防止自發分化。另外，在現有的方法中，如果將所產生的人干細胞用于臨床治療，培養條件可能需要源自動物的產品，而這樣的產品有傳輸疾病的風險。因此，如果將培養的干細胞用于人類治療，該方法是不適合的。人干細胞的臨床應用需要在標準化的、受良好控制的無動物產品的環境(稱為“無外源物”的培養環境)，其降低傳輸疾病的風險中培養細胞的方法。此外，需要在不存在飼養層或支持細胞的情況下培養人干細胞的方法以降低飼養細胞或源自飼養細胞的污染物污染干細胞治療產品的風險。世界衛生組織對疾病康復、抗衰老的新定義為“治愈疾病、抗衰老最根本的途徑是修復細胞、改善細胞代謝、激活衰老細胞的功能”。只有及時對受損細胞、衰老細胞進行有效治療，使受損細胞得到康復，衰老細胞得到激活，器官組織和生理功能才能完全恢復正常，人體才能從真正意義上保持健康、保持年輕態。干細胞治療即是把健康的干細胞移植到病人體內，以達到修復病變細胞或重建功能正常的細胞和組織的目的。干細胞療法就像給機體注入新的活力，激活人體自身的“自愈功能”，對病變的細胞進行補充與調控，激活細胞功能，増加正常細胞的數量，提高細胞的活性，改善細胞的質量，防止和延緩細胞的病變，恢復細胞的正常生理功能，從而達到疾病康復、對抗衰老的目的。應用干細胞治療疾病與傳統治療方法比較具有很多優點低毒性或無毒性，一次藥有效；不需要完全了解疾病發病的確切機理；不存在傳播疾病的風險；還可能應用自身干細胞移植，避免產生免疫排斥反應。美國國家食品藥品監瞀管理局(FDA)在2004 2009年間相繼批準了細胞治療心肌疾病、細胞治療神經系統疾病等治療技術，推動全世界細胞治療的開展，在全美有四十多家醫院相繼開展了用細胞治療心肌疾病和細胞治療神經系統疾病等治療技木。與之同時，美國、英國、日本等發達國家相繼立法，使細胞治療合法化。在我國目前也有多家醫院開展了細胞治療，每年數以萬計患者因之受益。通過檢索，發現與本發明專利申請相關的如下專利公開文獻利用角朊細胞干細胞和牙髓干細胞進行牙齒再生的技術(CN200410071721. 8)，本發明屬于器官再生技術，具體說，本發明涉及利用角朊細胞干細胞和牙髓干細胞進行牙齒再生的技木。本發明的技術方案從白牙中取出牙髓組織，經消化酶消化后，轉入培養液中培養；培養24h后，用PBS洗滌三次，去除未貼壁細胞，貼壁生長的細胞繼續培養至14 16天吋，進行傳代培養；牙髓干細胞經生長因子BMP4和FGFlO誘導24h后將體外培養的角朊細胞干細胞和牙髓干細胞進行重組，形成重組團塊；將重組團塊置于37°C、5% CO2培養箱中培養24h，再移植到口腔內，經培養10 12周后，在口腔內形成牙齒。本發明的優點在于利用角朊細胞干細胞和牙髓干細胞進行牙齒再生，角朊細胞干細胞和牙髓干細胞可根據公開的技術手段通過體外大量培養得到，大大擴大了材料的來源，方便推廣使用。 通過對比，本發明專利申請與上述的專利公開文獻存在本質的不同。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種乳牙牙髓在制備間充質干細胞中的應用和乳牙牙髓間充質干細胞的培養方法，該培養方法中所采用的乳牙牙髓組織采集方便、在培養過程中不需要特殊的滋養層細胞的制備，特別是不需要添加任何動物血清和其它任何動物源成分，采用無外源動物血清的細胞培養技術，并且使用高度純化的動物源性的胰蛋白酶代用品進行細胞的消化，方法簡單易行。本發明實現目的的技術方案是乳牙牙髓在制備間充質干細胞中的應用。一種乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，步驟如下將乳牙經過原代培養獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液，再將乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液經傳代培養即獲得乳牙牙髓間充質干細胞。而且，所述原代培養方法為⑴將乳牙經過無菌處理、物理切割成組織碎塊，加入間充質干細胞完全培養液即獲得牙髓組織混合液；⑵將步驟⑴中的牙髓組織混合液置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養；⑶培養10 15天即獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液。而且，所述的傳代培養的方法為⑴吸出乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液中上清液得貼壁細胞，向貼壁細胞中加入胰酶替代物消化液至浸沒貼壁細胞，再將其置于CO2孵育箱中，36 38°C保溫5分鐘進行消化；⑵消化結束后將消化液吸出，加入間充質干細胞完全培養液沖洗，離心；離心結束后，吸出上清得沉淀；⑶向步驟⑵的沉淀中加入間充質干細胞完全培養液至浸沒沉淀，置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養，培養5 7天，即獲得乳牙牙髓間充質干細胞。
而且，所述的胰酶替代物消化液的成分為質量百分數為O. 25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液。—種乳牙牙髓間充質干細胞的保存方法，步驟如下⑴凍存細胞的收集收集如權利要求2所述的培養方法所制備的乳牙牙髓間充質干細胞，加入胰酶替代物消化液，加入量為浸沒乳牙牙髓間充質干細胞，進行消化得細胞液，將細胞液離心得細胞沉淀，再將細胞沉淀用間充質干細胞完全培養液重懸得細胞懸液，并進行細胞計數；⑵細胞凍存懸液配制按照細胞懸液中細胞數為1-5 X IO6吋，細胞懸液與DMSO的配制體積比例為3_5:1向細胞懸液中加入DMS0，混勻，然后分裝得細胞凍存懸液； ⑶細胞凍存將步驟⑵中的細胞凍存懸液以I °C .HiirT1的降溫速度降溫至-85 °C，然后置于-196°C液氮中即可對乳牙牙髓間充質干細胞進行保存。一種乳牙牙髓組織間充質干細胞的復蘇方法，步驟如下⑴取出如權利要求7所述保存的乳牙牙髓間充質干細胞，立即放入36_38°C水浴中融化得細胞懸液；⑵將細胞懸液用間充質干細胞完全培養液進行洗滌離心得細胞沉淀；⑶將細胞沉淀用間充質干細胞完全培養液重懸，然后置于37°C、體積分數為4 6%的C02孵育箱中培養5 7天即復蘇獲得乳牙牙髓組織間充質干細胞。本發明的優點和有益效果為I、本發明采用了乳牙牙髓作為制備間充質干細胞的組織材料，這與骨髄、臍帶血、胎盤不同，采集的方式為自然脫落或手術拔除的兒童完整乳牙。它具有同胎盤和臍帶組織中分離出的間充質干細胞相同的優點，同吋，由于兒童有20顆乳牙，以上下顎各6顆乳牙培養出之乳牙干細胞最好，由于不必一出生就取樣，而且還有20次采集的機會，所以即使錯過胎盤和臍帶組織采集機會的人，和目前已曾掉落來不及收集的兒童，20顆中的任何ー顆乳牙，皆有機會獲得乳牙間充質干細胞。2、本發明制備乳牙間充質干細胞的條件培養基名稱為StemPro MSC SFMXenoFree,貨號A10675_01，為美國GIBCO公司生產的商品化培養基，其組成包括StemPro MSC SFMBasal Medium (500mL),貨號A13829-01 ；StemPro MSC SFM XenoFreeSupplement (5mL),貨號A11577-01。其不含任何動物成分，以無熱源水配制，經除菌過濾后分裝，無抗生素添加，該試劑使用時不需要添加動物血清和其它任何動物源成分，可以最大限度的減少非人源因素的影響，使生產的間充質干細胞適用于臨床醫療。3、本發明的乳牙間充質干細胞傳代培養方法中使用的胰酶替代物名稱為TrypLETMSelect，商品號12563-029，為美國GIBCO公司生產的商品化細胞消化液，使用其對貼壁細胞進行消化處理，以便對細胞進行擴增培養。該胰酶替代物為重組酶，是高度純化的動物源性的胰蛋白酶代用品，無細胞分解酶，使用其進行貼壁依賴性細胞的消化，細胞生長擴增狀態良好，并可進行多次傳代，與用傳統方法獲得的水平無明顯差別。適用于任何含血清和無血清的培養條件，使用時不需要胰蛋白酶抑制劑，該試劑在各種溫度條件下保持性狀穩定，容易儲存和使用。4、本發明乳牙間充質干細胞保存方法，該方法可以使細胞暫時脫離生長狀態而使其細胞特性得以保存，需要時再復蘇細胞進行擴増。細胞凍存時，向培養基中加入保護劑ニ甲基亞砜(DMSO)，DMSO是ー種重要的滲透型細胞保護劑。在深低溫(零下200度)保存細胞的過程中，可以防止細胞內冰晶形成、滲透壓改變、細胞結構紊亂等導致的損傷。DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。凍存后的干細胞増殖率、凋亡率和多向分化能力與新鮮培養SHED的差別無統計學意義。5、本發明致カ于開發適于大規模生產的維持和擴增干細胞的方法以為臨床應用提供足夠數量的干細胞或其分化衍生物。通過使用本發明的方法培養SHED的條件消除了對飼養細胞支持的需求，可以在不存在飼養細胞的情況下在多至150天的時間內維持未分化。本發明的方法則是開發改良間充質細胞的培養方法以用于擴增和在需要時進一歩分化干細胞，使其適于為治療應用標準化、調控和擴大SHED的生產。
圖I為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞原代培養細胞圖，即牙髓組織塊周圍生長細胞圖；圖2為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞傳代培養細胞的散在單個細胞圖；圖3為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞的細胞生長密度80%以上的傳代培養細胞圖，;圖4為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞傳代培養細胞逐日生長狀態圖；其中，圖4-1為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞傳代培養細胞的I天生長狀態圖；圖4-2為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞傳代培養細胞的3天生長狀態圖；圖4-3為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞傳代培養細胞的5天生長狀態圖；圖4-4為本發明的乳牙牙髓間充質干細胞傳代培養細胞的7天生長狀態圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進ー步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。本發明中所使用的方法，如無特殊說明，均為常規方法；本發明中所使用的試劑，如無特殊說明，均為常規試劑。本發明中所使用的胰酶替代物消化液為TrypLE Select，商品號12563-029，美國GIBCO公司生產；其成分為重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液，重組動物胰蛋白酶的質量百分數為O. 25%。本發明專利申請中間充質干細胞完全培養液及其配制方法如下I、間充質干細胞培養液組成美國GIBCO公司生產的商品化間充質干細胞培養基StemPro MSC SFM XenoFree 共 2 瓶,包括基礎培養基StemPro MSC SFM Basal Medium(500mL),添加劑StemPro MSC SFM XenoFree Supplement (5mL)；其成分包括人源膠原蛋白(由細胞自體分泌產生)、轉鐵蛋白、重組人血小板源生長因子、重組人表皮生長因子、α-ΜΕΜ。2、配制方法取添加劑I瓶5ml，無菌操作加入到500ml基礎培養基中，使成間充質干細胞完全培養液StemPro MSC SFM XenoFree，37°C保溫備用。—、一種乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，每ー顆乳牙分別處理的具體步驟如下(一)乳牙牙髓間充質干細胞的原代培養I、乳牙組織材料采集的條件及標準⑴收集乳牙的基本條件為采集乳牙的兒童年齡為處于換牙階段的5 10歲兒童，共20顆，優選上下顎各6顆乳牙。
⑵乳牙采集的方式為自然脫落或手術拔除的兒童完整乳牙。⑶收集乳牙的標準為新鮮拔除或自然脫落的乳牙，選擇牙體和牙髓健康、無齲齒、無牙髓炎癥和牙髓壞死等癥狀的清潔無附著物的乳牙。這是成功獲取SHED的前提。⑷采集乳牙的保存條件自然脫落或新鮮拔除的每ー顆乳牙應于4小時內放入含有IOml乳牙保存液的轉移管中，2 8°C低溫保存運送至實驗室，且從收集乳牙到處理牙髓的時間不應超過40 120小時。2、乳牙保存液的配制⑴乳牙保存液的組成成分DMEM/F12液體培養液Penicillin (青霉素)100IU/mlStreptomycin (鏈霉素)100IU/ml⑵配制方法500ml DMEM/F12液體培養液中加入青鏈霉素混合液(含Penicillin10000IU/ml、Streptomycin 10000IU/ml) 10ml。⑶乳牙保存液保存條件2 8 °C。3、乳牙牙髓材料的處理方法⑴配制抗菌劑溶液①成分青霉素80萬單位/支鏈霉素100萬單位/支；②配制方法生理鹽水注射液中加入青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml，混合均勻。⑵乳牙牙髓材料的無菌處理①在無菌環境下，用鑷子從乳牙保存液中取出牙齒，放入抗菌劑中反復沖洗，并浸洗10分鐘；②劈開牙冠或用牙科裂鉆鉆開牙冠，取出冠根部牙髓，放入新的抗菌劑15ml中浸洗10分鐘，用眼科彎剪將牙髓組織剪成碎塊；③將含有牙髓組織的抗菌劑放入50ml離心管中，200g離心10分鐘；④離心后，用巴氏吸管吸出上清，將含有牙髓組織碎塊的沉淀用3ml間充質干細胞完全培養液重懸成牙髓組織懸液。4、乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞的培養⑴配制間充質干細胞完全培養液①間充質干細胞培養液組成美國GIBCO公司生產的商品化間充質干細胞培養基StemPro MSC SFM XenoFree 共2 瓶，包括基礎培養基 StemPro MSC SFM Basal Medium(500mL),添加劑StemPro MSC SFM XenoFree Supplement (25mL)。②配制方法取添加劑I瓶25ml，無菌操作加入到500ml基礎培養基中，使成間充質干細胞完全培養液StemPro MSC SFM XenoFree，37°C保溫備用。⑵將前述的懸浮有牙髓組織碎塊的牙髓組織懸液3ml (在培養液中有2、3顆肉眼可見的剪斷的牙髓，牙髓的重量為IOug)轉移至25cm2的細胞培養瓶中，另取2ml間充質干細胞完全培養液沖洗離心管，并全部加入上述細胞培養瓶中，充分混勻，旋緊瓶蓋，將培養瓶置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養。⑶培養約10 15天后，從牙髓組織塊邊緣生長出貼壁的成纖維樣細胞，此時對細胞進行換液，即用無菌移液器吸取培養的細胞懸液3ml棄之，加入新鮮的間充質干細胞完全培養液3ml至培養瓶中，將培養瓶置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中繼
續培養。 ⑷繼續培養約10天左右，貼壁細胞逐漸増殖成較大的細胞集落，細胞培養瓶壁形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島，即獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液，再經離心即可獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞。此時應進行細胞傳代。(ニ)乳牙牙髓間充質干細胞的傳代培養I、取TrypLE Select I瓶，商品號12563-029，此為細胞消化用胰酶替代物，美國GIBCO公司生產，室溫放置保存；2、用無菌移液器將25cm2細胞瓶中的組織塊和培養液全部吸出，吸取3ml消化液加入培養瓶中，蓋緊瓶蓋，輕輕搖動培養瓶，致使消化液鋪滿瓶底；3、將加入消化液的培養瓶放入CO2孵育箱中，37°C保溫5分鐘；4、保溫結束后，取出培養瓶，輕輕拍打瓶體，鏡下觀察，貼壁細胞圓縮，部分細胞已經脫離瓶底后，即可用移液器將消化液吸出，加入間充質干細胞完全培養液沖洗瓶底細胞，并將全部細胞懸液移入50ml離心管中，IOOg 200g室溫離心5分鐘；5、離心結束，吸出上清，吸取少量間充質干細胞完全培養液，以每秒鐘3 5滴的速度，邊加邊輕輕旋轉離心管，將培養液加入到細胞沉淀中，輕輕吹打混勻；6、吸取上述細胞懸液，加入到I只175cm2細胞培養瓶中，補足培養液到35 40ml ；7、將培養瓶置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養；8、當細胞傳代培養至5 7天后，貼壁細胞有70 90%長滿單層后，即得乳牙牙髓間充質干細胞傳代細胞，該細胞可進行繼代傳代。ニ、乳牙牙髓間充質干細胞傳代細胞的保存方法I、細胞凍存用保護液成分ニ甲基亞砜(DMSO)2、凍存細胞懸液的配制方法⑴凍存細胞的收集當傳代后培養瓶中的細胞貼壁密度達到60 90%時，先將細胞液全部吸出，加入IOmlGIBCO TrypLE Select消化液，37°C保溫5分鐘，待鏡下觀察細胞圓縮時將消化液吸出，用間充質干細胞完全培養液反復沖洗培養瓶內細胞，并將細胞懸液全部收集至離心管中，100 200g離心5分鐘，棄上清，將細胞沉淀用間充質干細胞完全培養液重懸。
⑵細胞計數取重懸并混合均勻的細胞懸液，用無菌水適當稀釋，取IOul細胞稀釋液加入到細胞計數板蓋玻片下邊緣中，此時細胞懸液即可利用液體的表面張カ充滿計數區，靜置30秒，將計數板置于顯微鏡載物臺上，找到計數區后，對四角大方格(每個大方格又分16個小方格)進行合計計數，對壓線細胞采取記上限細胞不計下限細胞、計左限細胞不計右限細胞。然后按照公式計算出每ml細胞懸液所含細胞數量。細胞計算公式細胞數/ml= (4個大方格合計數/4) X 10000X稀釋倍數⑶細胞凍存懸液配制細胞懸液與凍存保護液DMSO的配制體積比ml :ml比例為4:1，即以ー支凍存管中裝量為2ml為標準，加入細胞懸液的量為I. 6ml，加入DMSO的量為O. 4ml。按照每支凍存管中的凍存細胞數量，取已經計數的細胞懸液若干，按比例將其與DMSO溶液混合均勻，加入到細胞凍存管中。用于復蘇傳代用的凍存細胞數應為2X106/管。 3、細胞凍存方法將細胞凍存管以1°C .HiirT1的降溫速度降溫至-85で。然后將降溫至-85°C的細胞凍存管放入液氮中(_196°C )保存，即可對乳牙牙髓間充質干細胞進行保存。三、乳牙牙髓間充質干細胞凍存細胞的復蘇方法I、凍存細胞的融化從液氮中取出準備復蘇的細胞凍存管，立即放入37°C水浴中迅速融化；2、凍存細胞的培養⑴用無菌移液器吸出凍存管中的細胞液放入含有間充質干細胞完全培養液的離心管中，吹打混勻；⑵將離心管用200g離心8分鐘進行離心洗滌，棄上清液，將細胞沉淀用間充質干細胞完全培養液重懸；⑶將重懸的細胞液分別加入到2只175cm2細胞培養瓶中，然后按照每瓶35 40ml液體量補足間充質干細胞完全培養液；⑷將培養瓶置于37°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養。(5)當細胞傳代培養至5 7天后，貼壁細胞有70 90%長滿單層后，即復蘇獲得乳牙牙髓組織間充質干細胞。四、乳牙牙髓可應用在間充質干細胞的制備中乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduousteeth, SHED)屬于多功能的成體干細胞，利用生物晶片技術分析后，顯示乳牙及牙齦干細胞可大量表現各種生長因子。目前干細胞儲存以臍帶血及骨髄最熱門，但相較之下，SHED在未來細胞治療應用上，具有相當大的優勢和不可替代的作用。乳牙干細胞的増殖再生力強、組織相容性高、儲存方便，提供現代人第2次機會儲存干細胞(第I次是臍帶血、臍帶和胎盤)。若能將干細胞儲存起來，未來可望造福到自己、父母甚至祖父母。將乳牙牙髓作為制備間充質干細胞的組織材料，這與骨髄、臍帶血、胎盤不同，采集的方式為自然脫落或手術拔除的兒童完整乳牙。它具有同胎盤和臍帶組織中分離出的間充質干細胞相同的優點，同吋，由于兒童有20顆乳牙，以上下顎各6顆乳牙培養出之乳牙干細胞最好，由于不必一出生就取樣，而且還有20次采集的機會，所以即使錯過胎盤和臍帶組織采集機會的人，和目前已曾掉落來不及收集的兒童，20顆中的任何ー顆乳牙，皆有機會獲得乳牙間充質干細胞。因此，乳牙牙髓可應用在間充質干細胞的制備中。本發明專利申請中制備乳牙間充質干細胞所使用的條件培養基名稱為StemPro MSCSFM XenoFree，貨號A10675_01，為美國GIBCO公司生產的商品化培養基，其組成包括StemPro MSC SFM Basal Medium (500mL),貨號A13829-01 ; StemPro MSC SFMXenoFreeSupplement (5mL),貨號A11577-01。其不含任何動物源成分，以無熱源水配制，經除菌過濾后分裝，無抗生素添加。物理性狀為無色、澄清透明的液體，PH7. 2 7. 6。該試劑使用時不需要添加動物血清和其它任何動物源成分，可以最大限度的減少非人源因素的影響，使生產的間充質干細胞適用于臨床醫療。本發明專利申請中乳牙間充質干細胞傳代培養方法中使用胰酶替代物為TrypLETMSelect，商品號12563-029，為美國GIBCO公司生產的商品化細胞消化液，用于對貼壁細胞進行消化處理，以便對細胞進行擴增培養。該胰酶替代物為重組酶，是高度純化的動物源性的胰蛋白酶代用品，無細胞分解酶，使用其進行貼壁依賴性細胞的消化，細胞生長擴增狀態良好，并可進行多次傳代，與用傳統方法獲得的水平無明顯差別。適用于任何含血清 和無血清的培養條件，使用時不需要胰蛋白酶抑制劑，該試劑在各種溫度條件下保持性狀穩定，容易儲存和使用。本發明專利申請中乳牙間充質干細胞保存方法，該方法可以使細胞暫時脫離生長狀態而使其細胞特性得以保存，需要時再復蘇細胞進行擴増。細胞凍存時，向培養基中加入保護劑ニ甲基亞砜(DMSO)，DMSO是ー種重要的滲透型細胞保護劑。在深低溫(零下200度)保存細胞的過程中，可以防止細胞內液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結構紊亂等導致的損傷。DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。凍存后的干細胞増殖率、凋亡率和多向分化能力與新鮮培養SHED的差別無統計學意義。細胞凍存數量為以每2mL的細胞凍存液含有2) X IO6個細胞為宜，密度太高或太低均會導致細胞復蘇率的下降；干細胞凍存的溫度為_196°C，保存于液氮內，以最大限度保存干細胞的活性。凍存方法為將細胞凍存管以1°C .HiirT1的降溫速度降溫至_85°C，隨后放于液氮中進行長期儲存。本發明專利申請中乳牙間充質干細胞凍存細胞的復蘇方法，即將液氮中取出的準備復蘇的細胞凍存管立即放入37°C水浴中迅速融化，然后立即用培養液進行洗滌離心，以除去凍存保護劑DMS0，因凍存細胞時加入的DMSO對細胞的毒性很大，因此復蘇時動作要快，盡快洗掉ニ甲基亞砜，以免造成對細胞的嚴重毒性。結果I、本發明乳牙間充質干細胞培養方法所分離培養的牙髓間充質干細胞經多次傳代仍能保持多向分化潛能，且純度可達到90%以上。所獲得的乳牙間充質干細胞為貼壁依賴性細胞，其生長性狀為長梭型或不規則型，傳代培養后5 7天可貼壁長滿單層。2、本發明所培養的乳牙間充質干細胞的形態為貼壁依賴性細胞，具有成纖維細胞樣的形狀，長梭型或不規則型，有長短不一的突起，胞核卵圓形。其生長特性為，原代細胞生長較慢，約10 15天后細胞呈克隆樣生長，形成大小不一的集落，2周左右集落密集生長；傳代后細胞呈均勻分布生長，倍增時間ニ到三天。
權利要求
1.乳牙牙髓在制備間充質干細胞中的應用。
2.一種乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，其特征在于步驟如下將乳牙經過原代培養獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液，再將乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液經傳代培養即獲得乳牙牙髓間充質干細胞。
3.根據權利要求2所述的乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，其特征在于所述原代培養方法為 ⑴將乳牙經過無菌處理、物理切割成組織碎塊，加入間充質干細胞完全培養液即獲得牙髓組織混合液； ⑵將步驟⑴中的牙髓組織混合液置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養； ⑶培養10 15天即獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液。
4.根據權利要求2所述的乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，其特征在于所述的傳代培養的方法為 (I)吸出乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液中上清液得貼壁細胞，向貼壁細胞中加入胰酶替代物消化液至浸沒貼壁細胞，再將其置于CO2孵育箱中，36 38°C保溫5分鐘進行消化； ⑵消化結束后將消化液吸出，加入間充質干細胞完全培養液沖洗，離心；離心結束后，吸出上清得沉淀； ⑶向步驟⑵的沉淀中加入間充質干細胞完全培養液至浸沒沉淀，置于36 38°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養，培養5 7天，即獲得乳牙牙髓間充質干細胞。
5.根據權利要求4所述的乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，其特征在于所述的胰酶替代物消化液的成分為質量百分數為O. 25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液。
6.一種乳牙牙髓間充質干細胞的保存方法，其特征在于步驟如下 ⑴凍存細胞的收集 收集如權利要求2所述的培養方法所制備的乳牙牙髓間充質干細胞，加入胰酶替代物消化液，加入量為浸沒乳牙牙髓間充質干細胞，進行消化得細胞液，將細胞液離心得細胞沉淀，再將細胞沉淀用間充質干細胞完全培養液重懸得細胞懸液，并進行細胞計數； ⑵細胞凍存懸液配制 按照細胞懸液中細胞數為1-5X IO6時，細胞懸液與DMSO的配制體積比例為3-5:1向細胞懸液中加入DMS0，混勻，然后分裝得細胞凍存懸液； ⑶細胞凍存 將步驟⑵中的細胞凍存懸液以1°C · min-1的降溫速度降溫至_85°C，然后置于_196°C液氮中即可對乳牙牙髓間充質干細胞進行保存。
7.一種乳牙牙髓組織間充質干細胞的復蘇方法，其特征在于步驟如下 ⑴取出如權利要求7所述保存的乳牙牙髓間充質干細胞，立即放入36-38°C水浴中融化得細胞懸液； ⑵將細胞懸液用間充質干細胞完全培養液進行洗滌離心得細胞沉淀； ⑶將細胞沉淀用間充質干細胞完全培養液重懸，然后置于37°C、體積分數為4 6%的CO2孵育箱中培養5 7天即復蘇獲得乳牙牙髓組織間充質干細胞。
全文摘要
本發明涉及一種乳牙牙髓在制備間充質干細胞的應用及乳牙牙髓間充質干細胞培養方法，步驟如下將乳牙經過原代培養獲得乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液，再將乳牙牙髓間充質干細胞原代細胞混合液經傳代培養即獲得乳牙牙髓間充質干細胞。本發明采用了乳牙牙髓作為制備間充質干細胞的組織材料，這與骨髓、臍帶血、胎盤不同，采集的方式為自然脫落或手術拔除的兒童完整乳牙。由于兒童有20顆乳牙，以上下顎各6顆乳牙培養出之乳牙干細胞最好，由于不必一出生就取樣，而且還有20次采集的機會，所以即使錯過胎盤和臍帶組織采集機會的人，和目前已曾掉落來不及收集的兒童，20顆中的任何一顆乳牙，皆有機會獲得乳牙間充質干細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102807967SQ201210318439
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者劉忱, 蔡鵬 , 張京 申請人:沙船(天津)生物科技發展有限公司