一種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝，該工藝包括以下步驟：(1)從桑樹采集獲得野生桑黃子實體，經過菌株分離純化后接種到母種培養基中培養獲得桑黃母種，桑黃母種接種到液體培養基中培養獲得桑黃原種，桑黃原種接種到液體發酵罐中進行放大發酵培養獲得桑黃栽培種；(2)將桑黃栽培種接種到菌棒中進行發菌生產；(3)出菇管理：將布滿菌絲體的菌棒進行切口，轉入出菇室進行工廠化管理出菇。本發明的優點是：自動化液體接種極大的提高接種效率、減少污染；工廠化栽培保證桑黃出菇率高、桑黃子實體生長迅速，生長周期縮短，子實體成熟期統一，顏色金黃、外形大小均一，經過大量培養實踐證明，桑黃可實現高效工廠化培養。CGMCC No.1140720151023
【專利說明】
一種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝。
【背景技術】
[0002]桑黃是一種真菌，因寄生于桑樹而得名。分類上屬真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basid1mycotas)、層菌綱(Hymenomycetes)非裙菌目(AphyI lophoraIes)銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)針層孔菌屬(PhellinusQuel.)。主要分布于東亞(中國、日本、韓國、朝鮮、俄羅斯)一帶。在中國，桑黃的使用從漢朝起至今已經有2000多年的歷史了，中國最早的本草學著作《神農本草經》就已經有了 “桑寄生”的藥物功效記載(戴玉成，崔寶凱.藥用真菌桑黃種類研究;北京林業大學學報，2014;36(5):2-8)。現代研究證實桑黃含有多種活性成分，如多糖、黃酮、多酚等，具有抗癌、護肝、抗過敏等藥理作用，備受消費者青睞(張維博，王家國，李正闊，楊麗群，秦檢，向仲懷，崔紅娟.藥用真菌桑黃的研究進展，中國中藥雜志，2014,39(15):2838-2845)o
[0003]由于桑黃人工馴化栽培過程較為復雜，難度較大，現有的桑黃栽培方法存在出菇率低，人工培養生長情況不好，桑黃子實體顏色成褐色，生長周期長，導致生產成本較高等問題，需要對現有的栽培方法進行改良。自動化液體接種、高效工廠化栽培是現代高效農業的典范，屬新興產業，是高效現代化農業的發展趨勢和重要模式。通過現代設施設備的調控減少人為操作和氣候因素的影響，進行工廠化常年生產，提高栽培成功率，形成穩定的產品來源是目前桑黃生產的關鍵問題。同時由于“桑黃”種類繁多，尋找具有藥用活性和價值的桑黃菌種進行人工栽培才具有市場化應用價值，才能實現真正的產業化生產和應用。
【發明內容】
[0004]本發明提供了一種接種高效、培養簡單，管理容易，出菇率高、可進行大面積工廠化人工栽培的桑黃袋料栽培工藝。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的:一種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝，包括以下步驟:
[0006]A、栽培設施
[0007]a、栽培房:栽培房要求:高2.6-3.2111，長8-12111，寬5-6111，栽培房分為菌種室、接種室、發菌室、出菇室，接種室、發菌室和出菇室之間設有內隔門相連，每兩個室之間有緩沖室，房內外地面及周圍用水泥磚石鋪設，栽培房內設有通風設備和控溫控濕設備;b、栽培床:搭建栽培床架用不銹鋼搭建，栽培床設有橫梁托撐，能承受菌棒重壓，床寬0.5-0.8m，長1.8-2.0m，床架層數以3-4層，床架底層離地面0.1-0.2m，最頂層離房頂1.2-1.5m，上下層間距0.4-0.5m，床架排與排之間留有0.5-0.6m的走道；
[0008]B、菌種的制備
[0009]本發明所使用的桑黃菌(InonotusIinteus)來自浙江省農業科學院蠶桑所，是從浙江省桐廬縣桑樹上寄生的野生桑黃子實體分離純化菌株，該菌株經過ITS分子生物學鑒定后，于2015年10月23日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.11407，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所郵編100 101，本發明保藏提供的生物材料為桑黃S9，分類命名為:桑黃InonotusIinteus；
[0010]母種培養基配方(PDA培養基):馬鈴薯200克，白砂糖20克，瓊脂20克，MgSO4 1.5克，KH2PO4 1.5克，水 1000毫升;
[0011]原種、栽培種培養基配方:馬鈴薯200克，白砂糖20克，MgSO4 1.5克，KH2PO4 1.5克，水1000毫升；
[0012]原種是由母種液體接種培養而成，栽培種則由原種放大發酵而成。本發明中桑黃菌種活化后，在無菌條件下將母種接種到液體培養基上培養，20°C-3(TC震蕩培養獲得桑黃原種;待菌絲成熟后在無菌條件下接種至液體發酵罐中，20°C-30°C培養獲得栽培種；
[0013]C、菌棒的制備
[0014]袋料培養基配方:桑黃栽培培養基的含水量為50-70%，固相配方為:桑樹枝木肩20-60重量份，棉籽殼25-60重量份，麩皮10-25重量份，白糖0.5_2重量份，石膏0.5_2重量份，具體配置方法為:先將桑樹枝條用粉碎機加工成粒度為0.5-2cm的木肩；再按培養基配方稱取白糖、石膏用水溶化;繼續稱取桑樹枝木肩、棉籽殼、麩皮，加入溶化好的白糖、石膏充分混勻，并補充水分，使培養料含水量達到50-70 % ;用17cm X 33cm X 0.05cm的聚乙烯菌袋裝袋，每袋裝濕料0.8-lkg，套上菌環和菌蓋封口 ；
[0015]D、菌棒滅菌
[0016]菌棒進行高壓滅菌時壓力為3-5個大氣壓，溫度120°C，滅菌時間為6-8小時;常壓滅菌時壓力為為I個大氣壓，溫度100°C，滅菌時間為24-36小時，滅菌結束后冷卻至室溫；
[0017]E、接種
[0018]接種開始前，對接種箱進行清洗消毒。按常規的無菌接種法，在無菌條件下，打開菌蓋，接入15_30ml液體菌種迅速蓋上菌蓋，移入發菌室內培養；
[0019]F、出菇管理
[0020]發菌時溫度控制在18-300C，濕度控制在40-50%，培養30_40天。待栽培袋內菌絲開始呈現黃色或出現突起的瘤狀原基時，將菌袋移至出菇室進行出菇管理。在菌袋中部用手術刀開兩個1-1.5\4-7(^長方形的小口，菌袋與菌袋之間留有10-15(^空間，溫度控制在20-300C，濕度控制在80-95 %，每天通風3次，每次1_3小時。培養50-60天，當桑黃子實體由橙黃色轉成深黃色，邊緣硬化，表明已經成熟，可采收。
[0021]與現有技術相比，本發明的優點是:本發明的高效工廠化人工袋料栽培桑黃工藝經過大量的培養實踐證明，可真正實現桑黃的工廠化人工培養，自動化液體接種不僅可以節省大量勞動力成本，而且還可以避免人為操作所帶來接種量不均、易污染等因素，使得生產過程高效可控;工廠化栽培可以節省大量空間，溫濕度可控，使得桑黃生產管理簡化易于掌控。根據本發明方法得到的桑黃子實體出現在菌棒切口處，桑黃出菇率大于>90 %，桑黃子實體生長迅速，生長周期縮短，子實體成熟期統一，顏色金黃、外形大小均一，桑黃子實體鮮品重30-60克，干重為15-30克。經成分檢測分析發現:人工袋料栽培的桑黃子實體藥用活性成分含量顯著高于野生桑黃，這可能是由于野生桑黃常年野外生長木質化造成有效成分下降。藥理學實驗證實本發明所生產的桑黃子實體具有顯著的抑制腫瘤細胞，特別是腸道腫瘤細胞增殖的功效。
【附圖說明】
[0022]圖1是采用本發明栽培桑黃子實體圖；
[0023]圖2是多糖含量分析的葡萄糖標準曲線；
[0024]圖3是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃子實體的多糖含量；
[0025]圖4是黃酮含量分析的蘆丁標準曲線圖；
[0026]圖5是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃子實體的黃酮含量；
[0027]圖6是多酚含量分析的沒食子酸標準曲線圖；
[0028]圖7是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃子實體的多酚含量；
[0029]圖8是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃多糖對HT-29細胞增殖抑制作用；
[0030]圖9是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃黃酮對HT-29細胞增殖抑制作用；
[0031]圖10是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃多酚對HT-29細胞增殖抑制作用；
[0032]圖11是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃多糖對HCT116細胞增殖抑制作用；
[0033]圖12是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃黃酮對HCT116細胞增殖抑制作用；
[0034]圖13是野生桑黃和采用本發明栽培桑黃多酚對HCT116細胞增殖抑制作用。
【具體實施方式】
[0035]—種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝，包括以下步驟:
[0036]A、栽培設施
[0037]a、栽培房:栽培房要求:高2.6-3.2111，長8-12111，寬5-6111，栽培房分為菌種室、接種室、發菌室、出菇室，接種室、發菌室和出菇室之間設有內隔門相連，每兩個室之間有緩沖室，房內外地面及周圍必須用水泥磚石鋪設，整個建筑設施應結構牢固，具有良好的通風條件，各個房間都應保證水電供應，并配置控溫控濕設備;b、栽培床:搭建栽培床架用不銹鋼搭建，栽培床設有橫梁托撐，能承受菌棒重壓，床寬0.5-0.8m，長1.8-2.0m，床架層數以3_4層，床架底層離地面0.1-0.2m，最頂層離房頂1.2-1.5m，上下層間距0.4-0.5m，床架排與排之間留有0.5-0.6m的走道；
[0038]B、菌種的制備
[0039]本發明所使用的桑黃菌(Inonotuslinteus)來自浙江省農業科學院蠶桑所，是從浙江省桐廬縣桑樹上寄生的野生桑黃子實體分離純化菌株，該菌株經過ITS分子生物學鑒定后，于2015年10月23日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.11407，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101，本發明保藏提供的生物材料為桑黃S9，分類命名為:桑黃Inonotus linteus；
[0040]母種培養基配方(PDA培養基):馬鈴薯200克，白砂糖20克，瓊脂20克，MgSO4 1.5克，KH2PO4 1.5克，水 1000毫升;
[0041 ] 原種、栽培種培養基配方:馬鈴薯200克，白砂糖20克，MgSO4 1.5克，KH2PO4 1.5克，水1000毫升；
[0042]原種是由母種液體接種培養而成，栽培種則由原種放大發酵而成。本發明中桑黃菌種活化后，在無菌條件下將母種接種到液體培養基上培養，20°C-3(TC震蕩培養獲得桑黃原種;待菌絲成熟后在無菌條件下接種至液體發酵罐中，20°C-30°C培養獲得栽培種；
[0043]C、菌棒的制備
[0044]袋料培養基配方:桑黃栽培培養基的含水量為50-70%，固相配方為:桑樹枝木肩20-60重量份，棉籽殼25-60重量份，麩皮10-25重量份，白糖0.5_2重量份，石膏0.5_2重量份，具體配置方法為:先將桑樹枝條用粉碎機加工成粒度為0.5-2cm的木肩；再按培養基配方稱取白糖、石膏用水溶化;繼續稱取桑樹枝木肩、棉籽殼、麩皮，加入溶化好的白糖、石膏充分混勻，并補充水分，使培養料含水量達到50-70 % ;用17cm X 33cm X 0.05cm的聚乙烯菌袋裝袋，每袋裝濕料0.8-lkg，套上菌環和菌蓋封口 ；
[0045]D、菌棒滅菌
[0046]菌棒進行高壓滅菌時壓力為3-5個大氣壓，溫度120°C，滅菌時間為6-8小時;常壓滅菌時壓力為為I個大氣壓，溫度100°C，滅菌時間為24-36小時，滅菌結束后冷卻至室溫；
[0047]E、接種
[0048]接種開始前，對接種箱進行清洗消毒。按常規的無菌接種法，在無菌條件下，打開菌蓋，接入15_30ml液體菌種迅速蓋上菌蓋，移入發菌室內培養；
[0049]F、出菇管理
[0050]發菌時溫度控制在18-300C，濕度控制在40-50%，培養30_40天。待栽培袋內菌絲開始呈現黃色或出現突起的瘤狀原基時，將菌袋移至出菇室進行出菇管理。在菌袋中部用手術刀開兩個1-1.5\4-7(^長方形的小口，菌袋與菌袋之間留有10-15(^空間，溫度控制在20-300C，濕度控制在80-95 %，每天通風3次，每次1_3小時。培養50-60天，當桑黃子實體由橙黃色轉成深黃色，邊緣硬化，表明已經成熟，可采收。
[0051 ]桑黃活性物質含量測定:
[0052] 1.總多糖含量測定
[0053 ]稱取樣品，用50mL雙蒸水(料液比1:1O) 95 °C提取4h，過濾，重復3次，合并濾液用旋轉蒸發儀濃縮，加3倍無水乙醇4°C醇沉2次，5000rpm離心5min，純水溶解后定容至50mL備用。測定方法采用硫酸-苯酸(sulfuric acid-phenol)法測定，以葡萄糖作標準曲線，計算總多糖類物質含量。
[0054]2.總黃酮含量測定
[0055]稱取樣品，用70 %乙醇50mL(料液比1:10)避光超聲波提取4h，過濾，重復3次，合并濾液用旋轉蒸發儀濃縮，70%乙醇定容至50mL備用。采用Al (NO3)3-KAC分光光度比色法測定，以蘆丁作標準曲線計算總黃酮含量。
[0056]3.總多酚含量測定
[0057]稱取樣品，用70%乙醇50mL(料液比1:10)避光提取4h，過濾，重復3次，合并濾液用旋轉蒸發儀濃縮，去除乙醇，純水定容至50mL備用。采用福林-肖卡(Folin-C1calteu)法測定，以沒食子酸標準品作標準曲線，計算總酚類物質含量。
[0058]桑黃活性物質抗腫瘤活性試驗(MTT法):
[0059]取對數生長期腫瘤細胞(人原性結腸癌HT29和HCT116細胞)經胰酶消化后，用培養液吹打配成細胞I X 18IT1懸液，加入96孔培養板，每孔10ul，在5 % C02，37 °C培養箱中培養24h待細胞完全貼壁后，分別加入人工和野生桑黃活性提取物(多糖、黃酮、多酚)100uL，終濃度分別為12.5,50,100,200和400ug.mL—1，每組8孔，正常對照孔(含細胞10uL)加入無血清培養lOOuL，培養箱中孵育48h后，加入20uL 5g.L一1MTT，繼續培養4h，去上清液，加入DMSO 150uL，混合均勻后在酶標儀570nm波長下測得各孔吸光度(absorbance，A)值，實驗重復3次。按下式計算肝細胞的存活率存活率(% )=(實驗組A570nm—正常對照組A570nm)/正常對照組A570nmX 100% ο
[0060]經成分檢測分析發現:人工袋料栽培的桑黃子實體藥用活性成分含量顯著高于野生桑黃，如圖2至圖13，工廠化人工栽培桑黃子實體中多糖、黃酮、多酚含量分別為7.69%、5.49 %和9.31 %，野生桑黃子實體中這三種活性物質含量分別為0.70 %、1.55 %和2.86 %，僅為人工袋料栽培桑黃子實體的9.10%,28.23%和30.72 %。這可能是由于野生桑黃常年野外生長木質化造成有效成分下降的緣故。而MTT試驗結果表明野生桑黃和工廠化栽培桑黃子實體中這三類活性物質對結腸癌細胞HT-29和HCT116具有顯著的增殖抑制作用，但作用效果并沒有明顯差別。
[0061]本發明的高效工廠化人工袋料栽培桑黃工藝經過大量的培養實踐證明，可真正實現桑黃的工廠化人工培養，自動化液體接種不僅可以節省大量勞動力成本，而且還可以避免人為操作所帶來接種量不均、易污染等因素，使得生產過程高效可控;工廠化栽培可以節省大量空間，溫濕度可控，使得桑黃生產管理簡化易于掌控。根據本發明方法得到的桑黃子實體出現在菌棒切口處，桑黃出菇率大于>90%，桑黃子實體生長迅速，生長周期縮短，子實體成熟期統一，顏色金黃、外形大小均一，見圖1，桑黃子實體鮮品重30-60克，干重為15-30克。經成分檢測分析發現:人工袋料栽培的桑黃子實體藥用活性成分含量顯著高于野生桑黃，這可能是由于野生桑黃常年野外生長木質化造成有效成分下降。藥理學實驗證實本發明所生產的桑黃子實體具有顯著的抑制腫瘤細胞，特別是腸道腫瘤細胞增殖的功效。
[0062]以上所述僅為本發明的具體實施例，但本發明的技術特征并不局限于此，任何本領域的技術人員在本發明的領域內，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發明的專利范圍之中。
【主權項】
1.一種具有抗腫瘤活性的桑黃高效工廠化袋料栽培工藝，其特征在于:包括以下步驟: A、栽培設施 a、栽培房:栽培房要求:高2.6-3.2m，長8-12m，寬5-6m，栽培房分為菌種室、接種室、發菌室、出菇室，接種室、發菌室和出菇室之間設有內隔門相連，每兩個室之間有緩沖室，房內外地面及周圍用水泥磚石鋪設，栽培房內設有通風設備和控溫控濕設備;b、栽培床:搭建栽培床架用不銹鋼搭建，栽培床設有橫梁托撐，能承受菌棒重壓，床寬0.5-0.8m，長1.8-2.0m，床架層數以3-4層，床架底層離地面0.1-0.2m，最頂層離房頂1.2-1.5m，上下層間距0.4-.0.5m，床架排與排之間留有0.5-0.6m的走道； B、菌種的制備 母種培養基配方(PDA培養基):馬鈴薯200克，白砂糖20克，瓊脂20克，MgSO4 1.5克，KH2PO4 1.5克，水 1000毫升; 原種、栽培種培養基配方:馬鈴薯200克，白砂糖20克，MgSO4 1.5克，KH2PO4 1.5克，水.1000暈升； 原種是由母種液體接種培養而成，栽培種則由原種放大發酵而成，本發明中桑黃菌種活化后，在無菌條件下將母種接種到液體培養基上培養，20°c-3(rc震蕩培養獲得桑黃原種;待菌絲成熟后在無菌條件下接種至液體發酵罐中，20°C-30°C培養獲得栽培種； C、菌棒的制備 袋料培養基配方:桑黃栽培培養基的含水量為50-70 %，固相配方為:桑樹枝木肩20-60重量份，棉籽殼25-60重量份，麩皮10-25重量份，白糖0.5_2重量份，石霄0.5_2重量份，具體配置方法為:先將桑樹枝條用粉碎機加工成粒度為0.5-2cm的木肩;再按培養基配方稱取白糖、石膏用水溶化;繼續稱取桑樹枝木肩、棉籽殼、麩皮，加入溶化好的白糖、石膏充分混勻，并補充水分，使培養料含水量達到50-70 % ;用17cm X 33cm X 0.05cm的聚乙烯菌袋裝袋，每袋裝濕料0.8-lkg，套上菌環和菌蓋封口 ； D、菌棒滅菌 菌棒進行高壓滅菌時壓力為3-5個大氣壓，溫度120°C，滅菌時間為6-8小時；常壓滅菌時壓力為為I個大氣壓，溫度100°C，滅菌時間為24-36小時，滅菌結束后冷卻至室溫； E、接種 接種開始前，對接種箱進行清洗消毒，按常規的無菌接種法，在無菌條件下，打開菌蓋，接入15-30ml液體菌種迅速蓋上菌蓋，移入發菌室內培養； F、出菇管理 發菌時溫度控制在18_30°C，濕度控制在40-50%，培養30-40天，待栽培袋內菌絲開始呈現黃色或出現突起的瘤狀原基時，將菌袋移至出菇室進行出菇管理，在菌袋中部用手術刀開兩個l-1.5X4-7Cm長方形的小口，菌袋與菌袋之間留有10-15Cm空間，溫度控制在20-.30°C，濕度控制在80-95 %，每天通風3次，每次1-3小時，培養50-60天，當桑黃子實體由橙黃色轉成深黃色，邊緣硬化，表明已經成熟，可采收。
【文檔編號】A01G1/04GK105993593SQ201610345986
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】鐘石, 李有貴, 計東風
【申請人】浙江省農業科學院