用于玉米基因滲入的性狀堆疊策略的制作方法

用于玉米基因滲入的性狀堆疊策略的制作方法
【專利摘要】提供了一種方法來減少將3個或更多個期望性狀從供體植物系滲入優良植物背景中所需的時間。該方法包括雜交兩個供體植物，其中每一個供體植物已經被回交從而具有高的輪回親本百分比，并共有一個待滲入到優良植物背景內的期望基因座。
【專利說明】用于玉米基因滲入的性狀堆疊策略
[0001] 相關專利申請相互參考
[0002] 本申請要求根據35US巧119 (e)獲得2013年12月30日提交的美國臨時專利申請系 列號61/921,681的利益，其全部公開內容通過引用并入本文。
[000；3]背景
[0004] 植物育種是生產具有新組合期望特征的植物的技術和科學。植物育種可W通過許 多不同的技術實現，從簡單地選擇具有期望特征的植物用于繁殖，到更復雜的分子技術。雖 然分子生物學已經取得了長足進步，并具備了產生轉基因植物的能力，但傳統的植物育種 方法在植物品種開發中仍然具有一席之地。傳統植物育種方法的一個重要用途設及利用回 交程序將轉基因從在轉化中使用的良好組織培養栽培種轉移到優良的實驗品系或栽培種。 對于許多作物，一旦轉基因處于作物物種中，雜交轉化優良品系便會比重組技術更加高效， 因為大部分轉化方案是專為特定的實驗室品系優化的(往往適應性較差并且產量較低）。很 多優良品系(高產的)并不適于轉化。因此，遺傳工程師通常轉化實驗室品系，而育種師將轉 基因從實驗室品系回交到優良品系中。
[0005] 然而，標準回交育種方法是費時的。為了將Ξ個基因滲入到優良近交種質中，從開 始到產生種子通常需要4年。因此，需要能夠減少運個時間框的回交育種新方法。當有Ξ個 或更多個轉基因事件要滲入輪回親本時，本公開提供的方法可W省略一代或多代回交，并 為更多、更快地增加親本種子創造條件。
[0006] 概要
[0007]根據一個實施方案，提供了改良的回交育種方法，其可W減少將Ξ個或更多個堆 疊性狀或核酸區段滲入到優良近交植物系內所需的時間。在一個實施方案中，該方法包括 回交兩個供體植物，其中運兩個供體植物各自包含Ξ種共同的期望堆疊轉基因事件中的一 種，并且每個供體已經與相同的輪回親本進行了回交，從而產生具有高的輪回親本百分比 并攜帶來自供體的感興趣基因的回交供體系。然后，將兩個回交供體系(每一個具有一組不 同的來自供體的基因）進行雜交，W產生包含最初存在于兩個供體親本系中的Ξ個轉基因 事件并且輪回親本百分比為至少94%的后代。
[000引在一個實施方案中，用于將Ξ個或更多個轉基因事件從兩個供體系基因滲入到單 個輪回植物種質內的方法包括:將第一供體/輪回植物與第二供體/輪回植物雜交，其中該 第一供體/輪回植物包含第一轉基因事件和第二轉基因事件，該第二供體/輪回植物包括所 述第二轉基因事件和第Ξ轉基因事件，兩個供體/輪回植物均具有輪回植物基因組的大于 80%。在雜交兩個供體/輪回植物之后，對產生的植物后代進行檢查，W鑒定和選擇包含所 述第一、第二和第Ξ轉基因事件者。在一個實施方案中，所述第一供體/輪回植物和所述第 二供體/輪回植物是作為平行的植物系生成的，其中該第一供體植物和第二供體植物分別 與相同的輪回植物雜交，W分別產生第一后代和第二后代，其中所述第一供體植物包括所 述第一轉基因事件和所述第二轉基因事件，而所述第二供體植物包括所述第二轉基因事件 和所述第Ξ轉基因事件。然后，通過將所述第一植物后代和所述第二植物后代與所述輪回 親本植物雜交，分別產生第一和第二回交植物，從而產生一個或多個回交世代。然后將第一 和第二回交植物與所述輪回植物回交，分別產生第一供體/輪回植物(包括所述第一轉基因 事件、第二轉基因事件，并具有輪回植物基因組的大于80%)和第二供體/輪回植物(包括所 述第二轉基因事件、第Ξ轉基因事件，并具有輪回植物基因組的大于80%)。在一個實施方 案中，在每次供體轉換內用輪回植物進行的至少一個雜交中，輪回親本植物是雌性植物。
[0009] 在一個實施方案中，提供了用于將Ξ個或更多個轉基因事件基因滲入到輪回植物 種質內的方法，所述方法包括：
[0010] a)提供第一供體植物，其包括至少兩個轉基因事件的第一堆疊；
[0011] b)將該第一供體植物與選定的輪回親本植物雜交，W產生包含該第一堆疊的轉基 因事件的第一 F1后代植物；
[0012] C)將第一 F1后代植物與輪回親本植物進行第一育種回交，并選擇包含所述第一堆 疊的轉基因事件的第一育種回交后代植物；
[0013] d)將所選第一育種回交后代與輪回親本植物連續回交一次或多次，W產生包含所 述第一堆疊的轉基因事件的BC2或更高代的第一回交后代植物；
[0014] e)選擇包含至少2個轉基因事件的第二堆疊的第二供體植物，其中所述第二堆疊 的轉基因事件中的至少一個也存在于所述第一堆疊的轉基因事件中；
[0015] f)將所述第二供體植物與選定的輪回親本植物雜交，W產生包含所述第二堆疊的 轉基因事件的第二F1后代植物；
[0016] g)將第二F1后代植物與輪回親本植物進行第二育種回交，并選擇包含所述第二堆 疊的轉基因事件的第二育種回交后代植物；
[0017] h)將選定的第二育種回交后代與輪回親本植物連續回交一次或多次，W產生包含 第二堆疊的轉基因事件的BC2或更高代的第二回交后代植物；
[0018] i)將所述BC2或更高代的第一回交后代與所述BC2或更高代的第二回交后代雜交 W產生第Ξ后代植物，該第Ξ后代植物包含來自所述第一和第二堆疊的轉基因事件的Ξ個 獨特的轉基因事件。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1.用于將Mon 88017和Mon89034與TC1507-起堆疊到優良種質中并回收98%輪 回親本基因組的性狀轉換策略的示意圖。
[0021] 圖2.提供了用于Monl7(Mon88017: :TC1507)和Mon89(Mon88017: :Mon890：M)的平 行轉換的BC2和BC3后代的標志物輔助選擇方案的流程圖。
[0022] 圖3.提供了用于BC2的標志物輔助選擇方案的流程圖。
[0023] 圖4.提供了用于BC3的標志物輔助選擇方案的流程圖。
[0024] 圖5.提供了用于堆疊世代的標志物輔助選擇方案的流程圖。
[00巧]詳細說明
[0026] 定義
[0027] 在本發明的描述和權利要求中，下列術語將根據下文提出的定義使用。
[0028] 如本文所使用的，術語"約"意思是大于或小于所述數值或數值范圍的10%，但并 不意圖將任何數值或數值范圍僅指定于運個較廣的定義內。前面有術語"約"的每個數值或 數值范圍還意圖包括所述絕對數值或數值范圍的實施方案。
[0029] 如本文所使用的，術語"植物"包括整個植物和任何后代、細胞、組織或植物部分。 術語"植物部分"包括植物的任何部分，包括例如但不僅限于:種子(包括成熟的種子和不成 熟的種子）；植物插枝;植物細胞;植物細胞培養物;植物器官(例如，花粉、胚、花、果實、芽、 葉、根、莖和外植體）。植物組織或植物器官可W是種子、原生質體、愈傷組織，或者任何其它 可組織成結構或功能單元的植物細胞群。植物細胞或組織培養物可能能夠再生具有該細胞 或組織所得植物的生理學和形態學特征的植物，W及再生具有與該植物基本上相同基因型 的植物。與此相反，某些植物細胞不能夠再生產生植物。植物細胞或組織培養物中的可再生 細胞可W是胚，原生質體，分生細胞，愈傷組織，花粉，葉，花藥，根，根尖，須，花，果仁，穗，穗 軸，殼，或莖。
[0030] 如本文所使用的，術語"天然的"或"自然的"定義了在自然界中發現的條件。"天然 DNA序列"是自然界中存在的DNA序列，其通過自然手段或傳統育種技術產生，而不是通過遺 傳工程化(例如，使用分子生物學/轉化技術)產生。
[0031] 如本文所使用的，"內源序列"定義處于生物體的自然位置或者處于生物體基因組 內的多核巧酸、基因或多膚的天然形式。
[0032] 如本文所使用的，術語"分離的"意思是已從其自然環境中移出。
[0033] 如本文所使用的，術語"純化的"定義分子或化合物的分離形式，該分子或化合物 實質上游離于在天然或自然環境中通常與之相伴隨的污染物，并意味著由于和原始組合物 的其它組分分離而導致純度增加。術語"純化的核酸"在本文中用于描述與其它化合物分離 的核酸序列，包括但不僅限于，多膚、脂和碳水化合物。
[0034] 如本文所使用的，術語"外源DNA序列"是任何核酸序列，其已經從其自然位置移出 并插入到新的位置內，從而改變了被移出核酸序列兩側的序列。例如，外源DNA序列可W包 括來自另一物種的序列。
[0035] 如本文所使用的，"(經過)修飾的內源序列"是內源核酸序列的改變，包括內源基 因組序列的刪除、插入、取代和重排，包括插入外源DNA序列。
[0036] 如本文所使用的，術語"轉基因事件"意圖指示編碼一個或多個期望性狀的基因 座。轉基因事件可W包括代表單一改變的修飾內源序列，或者可W包括一系列共同分離的 修飾內源序列，包括例如，一個或多個緊密連鎖的外源序列，其可W含有一個或多個轉基 因。
[0037] 如本文所使用的，術語"(基因）滲入"指一個物種、變體或栽培種的性狀、基因或 DNA序列通過與另一個物種、變體或栽培種雜交而被轉移到該另一個物種、變體或栽培種的 基因組中的自然和人工過程，W及所得到的事件。運個過程任選地可W通過與輪回親本回 交實現。基因滲入的實例包括基因、轉基因、調節元件、標志物、性狀、性狀基因座或染色體 區段從一個植物的基因組進入或被引入另一個植物的基因組中。
[0038] "基因座"是指基因或DNA序列在基因組中的特定位置。基因座可W指特定的性狀， 并可W存在于細胞核、葉綠體或線粒體DNA中。
[0039] 如本文所使用的，術語"輪回親本"或"輪回植物"描述在雜交中作為受體植物系的 優良品系，其將被用作連續回交的親本系W產生最終的期望品系。
[0040] 如本文所使用的，術語"雜交"是指雌性植物(或配子)被雄性植物(或配子)授精。 術語"配子"是指植物中通過減數分裂從配子體產生的單倍體生殖細胞(卵或花粉），并參與 有性繁殖，其中兩個相反性別的配子融合形成二倍體合子。該術語一般包括花粉(包括精細 胞)和胚珠(包括卵）。因此，"雜交"一般指一個個體的胚珠從另一個個體的花粉受精，而"自 交"通常定義某一個體的胚珠從來自同一個體的花粉受精。當在實現基因組區域或區段的 基因滲入的語境中提到雜交時，技術人員會理解，為了實現一個植物僅一部分染色體基因 滲入到另一個植物的染色體中，兩個親本系的基因組的隨機部分會在雜交過程中重組，運 是由于在親本系中產生配子時會出現交換事件。因此，雙親的基因組通過雜交一定會被組 合在單個細胞內，在從該細胞產生配子之后，它們在受精中的融合將產生基因滲入事件。
[0041] 如本文所使用的，術語"受體"（recipient)是指從供體接受性狀、轉基因事件或基 因組區段的植物或植物系，受體自身可W具有或者不具有處于雜合或純合狀態的所述性 狀、轉基因事件或基因組區段。
[0042] 如本文所使用的，術語"育種系"或"優良系"是指具有商業上有價值的或者農學上 期望特征的栽培植物系，與野生型品種或具有和實驗操作相關的有益品質的品種相對。該 術語也指稱優良植物系，后者代表基本上純合的，即近交或加倍單倍的植物系，用于產生F1 植物。
[0043] 如本文所使用的，術語"F1"意思是兩個在遺傳上不相似的個體之間雜交的任何后 代。
[0044] 如本文所使用的，術語"供體"是指性狀、轉基因事件或基因組區段所來源的植物 或植物系，并且該供體的所述性狀、基因滲入或基因組區段可W處于雜合或純合狀態。
[0045] 如本文所使用的，術語"回交"定義了F1植物與其中一個原始親本的雜交。回交用 于保持一個親本(物種）的身份（identity),并納入來自第二親本(物種）的特定性狀。如本 文所使用的，術語"回交世代"是指回交的后代。
[0046] 如本文所使用的，術語"自交的"（selfed)定義兩個遺傳上相同的植物的雜交。通 常，術語"自交的"定義了自花授粉事件，并且包括胚珠和花粉來自相同的植物或植物系的 受精過程。
[0047] 如本文所使用的，術語"輪回親本百分比"是指回交后代植物與回交中使用的輪回 親本植物相同的百分比。與輪回親本的百分比同一性可W通過測量遺傳標志物，例如RFLP， 而實驗地加 W確定，或者可W根據數學公式理論計算。
[0048] 如本文所使用的，術語"后代"是指從雜交或自交產生的任何后代。
[0049] 如本文所使用的，術語"鑒定"是指證明植物的身份，或者區分植物的特征(例如顯 示某些性狀)的過程。
[0050] 如本文所使用的，術語"選擇"是指從一群個體中煉選某些個體植物的過程，通常 是根據該個體的特定身份。
[0051] 如本文所使用的，術語"標志物輔助選擇"是指一種診斷性的鑒定過程，任選地后 續W分子標志物的存在作為診斷特征或選擇標準，從一群植物中選擇某個植物。該過程通 常設及在某個植物的基因組中檢測某些核酸序列或多態性的存在。
[0052] 如本文所使用的，術語"分子標志物"定義在方法中用于可視化核酸序列特征差異 的指標。運些指標的實例有：限制性片段長度多態性(RFLP)標志物，擴增片段長度多態性 (A化P)標志物，單核巧酸多態性（SNP)，微衛星標志物（例如SSR)，序列表征的擴增區域 (SCAR)標志物，分子標志物的下一代測序(NGS)，酶切擴增多態性序列(CAPS)標志物或同工 酶標志物，或本文所述標志物的組合，其可界定特定的遺傳和染色體位置。
[0053] 如本文所使用的，術語"基因"是指由DM序列構成的遺傳單位，其占據染色體上的 特定位置并含有關于生物體的特定特征的遺傳指令。因此，術語"基因"包括核酸(例如DNA 或RNA)序列，其包括產生RNA、多膚或其前體所需的編碼序列。功能性多膚可W由全長編碼 序列或者由編碼序列的任何部分編碼，只要保留該多膚的期望活性或功能性質(例如，酶活 性，配體結合，信號轉導等)即可。
[0054] 實施方案
[0055] 回交或家系選擇是育種者向優良育種系添加期望的農學性狀的一種方法。該方法 設及育種系與表達期望性狀的品系雜交，隨后將表達該性狀的后代植物與輪回親本回交。 本公開設及將Ξ個或更多個期望轉基因事件基因滲入到優良植物種質內的改良方法。在一 個實施方案中，該方法包括平行制備兩個供體系，其中運些供體系包括至少一個共享的待 轉移到優良種質內的期望轉基因事件。運兩個供體系最初根據具有某些期望的可遺傳性狀 而被選擇。隨后將該第一和第二供體系與優良品系雜交W產生F1后代。分別對第一和第二 F1后代進行分析，并從兩個品系各自選擇出具有期望的堆疊轉基因事件的植物，將運些植 物分別與輪回親本回交，產生具有期望性狀并具有原始優良品系的基本上全部生理學和形 態學特征的第一和第二回交后代植物。在一個實施方案中，至少一個所述回交步驟將使用 雌性輪回親本植物進行。
[0056] 在一個實施方案中，通過與輪回親本回交產生的最終第一和第二供體植物將包括 期望的堆疊轉基因事件，并將會顯示高的輪回親本百分比（RPP)。理論RPP可W用簡單的公 式，根據所實施的回交的次數進行計算。如果用于回交的親本是純合的，那么N代回交后的 輪回親本百分比是1-(1/2)Μ+?χ 100。因此，需要6個回交世代才能獲得大于99%的輪回親本 百分比。用限制性片段長度多態性(RFLP)標志物對回交后代進行分析，是一種分析結果、并 將近交的理論量與觀察到的近交實際水平相比較的方法。其它分子標志物也能夠用于評估 RPP，包括例如，擴增片段長度多態性(Α化Ρ)標志物，單核巧酸多態性(SNP)，微衛星標志物 (例如SSR)，序列特征性擴增區域(SCAR)標志物，酶切擴增多態性序列(CAPS)標志物或同工 酶標志物，或其組合。下一代測序(NGS)技術也可W用于覆蓋整個基因組。
[0057] 在一個實施方案中，將Ξ個轉基因事件基因滲入輪回親本內的方法包括平行制備 兩個供體系，其中運兩個供體系將被與相同的輪回親本植物回交。所得的兩個平行回交的 供體系在它們所含的期望轉基因事件上將會有差異，但是它們會各自包含一個共同的轉基 因事件，并且兩個供體將會具有至少75，85，88，90，94，97或97.5 %的輪回親本百分比。在一 個實施方案中，兩個平行的供體植物系將會各自包含至少兩個待基因滲入到優良品系內的 轉基因事件，并且至少一個所述待基因滲入的轉基因事件將會在兩個供體植物中均存在。 [0化引轉基因事件
[0059]最初的供體植物系包括至少兩個期望的轉基因事件，其期望被基因滲入到優良品 系中。在本公開的一個實施方案中，供體植物包含兩個或更多個轉基因事件，其中運些轉基 因事件并不緊密連鎖，而且更典型地，位于不同的染色體上。在其它實施方案中，供體植物 包括兩個或多個轉基因事件，其中運些轉基因事件緊密連鎖在相同染色體上。每個轉基因 事件代表一個或多個期望的序列，它們充分連鎖W至于一起分離。在一個實施方案中，轉基 因事件是包含導致一個或多個性狀表達的遺傳組分的基因座。在一個實施方案中，轉基因 事件包括一系列調控序列或基因，包括例如，一個或多個插入的外源序列，它們可W含有一 個或多個轉基因。包括轉基因事件的組分可w包括開放閱讀框或經過修飾的內源序列。在 一個實施方案中，轉基因事件包括一個或多個基因表達盒，所述基因表達盒進一步包括活 躍轉錄和/或翻譯的基因序列。反過來，轉基因事件可W包括運樣的多核巧酸序列：其不包 含功能性基因表達盒或完整基因（例如，可W簡單地包括調控序列如啟動子），或者可W不 包含任何可識別的基因表達元件或任何活躍轉錄的基因序列。
[0060] 在一個實施方案中，轉基因事件包括一個或多個編碼除草劑耐受性、昆蟲抗性、營 養物、抗生素或治療性分子的基因。根據一個實施方案，供體植物系包括"堆疊"在供體植物 基因組內的多個轉基因事件，其中該轉基因事件包括兩個或更多個編碼可提供農學性狀的 序列的基因。可W堆疊在供體植物基因組內的農學性狀的實例包括，對草甘麟或其它除草 劑的抗性或耐受性，和/或提供對選定昆蟲或疾病的抗性，和/或營養增強，和/或改良的農 學特性，和/或在飼料、食品、工業、醫藥或其它用途中有用的蛋白質或其它產物。兩個或多 個感興趣的核酸序列(例如，基因）在供體植物基因組內的"堆疊"可W通過，例如，使用兩個 或更多個事件進行常規植物育種、用含有感興趣序列的構建體轉化植物、轉基因植物再轉 化、或者通過同源重組的祀向整合添加新的性狀等來實現。
[0061] 根據本公開的轉基因事件可W包括的序列包括，但不僅限于，如下實例：
[0062] 1.賦予害蟲或疾病抗性的基因或編碼序列(例如iRNA)
[0063] (A)植物疾病抗性基因。植物防御經常通過植物中疾病抗性基因(R)的產物與病原 體中相應的無毒性(Avr)基因的產物的特異相互作用而被激活。可W用克隆的抗性基因轉 化植物品種，從而工程構建對特定病原體株有抗性的植物。運些基因的實例包括:提供黃枝 抱霉（Cladosporium fulvum)抗性的番茄 Cf-9 基因 （Jones et al.,1994Science 266: 789);，提供下香假單胞桿菌番茄致病變種抗性的番茄Pto基因，其編碼一種蛋白激酶 (Madin et al.，1993Science 262:1432)，和提供下香假單胞菌抗性的擬南芥RSSP2基因 (Mindrinos et al.，1994Cell 78:1089)。
[0064] (B)蘇云金芽抱桿菌蛋白質、其衍生物或W其為模本的人造多膚，例如化δ-內毒素 基因的多核巧酸序列(Geiser et al.，1986Gene 48:109)和植物殺蟲(VIP)基因（見，例如， Estruch et al. (1996)Proc.化tl. Acad. Sci . 93:5389-94)。此外，編碼δ-內毒素基因的DNA 分子可W從美國典型培養物保藏中屯、(Rockville，Md.)購得，ATCC登錄號為40098,67136， 31995和31998。
[0065] (C)植物凝集素，例如，多種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結合性植物凝集素基 因的核巧酸序列（化η Damme et al.，1994Plant Molec.Biol.24:825)。
[0066] (D)維生素結合蛋白質，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的 殺幼蟲劑。見美國專利No. 5，659，026。
[0067] 化)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。運些基因的實例包括水稻半脫 氨酸蛋白質酶抑制劑(Abe et al.，1987J.Biol.畑em.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑I (Huubetal.,1993PlantMolec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制劑（Sumitanietal., 1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)〇
[0068] (F)昆蟲特異性激素或信息素，例如蟻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模 擬物，或其括抗劑或激動劑，例如桿狀病毒表達的克隆保幼激素醋酶，保幼激素的失活子 (Hammock et al.,l990Na1:ure 344:458)。
[0069] (G)昆蟲特異性膚或神經膚，其在表達時會擾亂受影響的害蟲的生理機能 (J.Biol.化em. 269:9)。運些基因的實例包括昆蟲利尿激素受體(Regan, 1994)，在太平洋折 翅賺(Diploptera punctata)中鑒定的咽側體抑制素（allostatin) (Pratt, 1989)，和昆蟲 特異性麻搏神經毒素(美國專利No. 5，266，361)。
[0070] 化)在自然界中由蛇、馬蜂等產生的昆蟲特異性毒液，例如蝸子昆蟲毒性膚(Pang, 1992Gene 116:165)。
[0071] (I)負責超富集單祗、倍半祗、醬體、異徑朽酸、苯丙烷衍生物或其它具有殺蟲活性 的非蛋白質分子的酶。
[0072] (J)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾）的酶；例如糖酵解酶、蛋白質水解 酶、脂肪分解酶、核酸酶、環化酶、轉氨酶、醋酶、水解酶、憐酸酶、激酶、憐酸化酶、聚合酶、彈 性蛋白酶、幾下質酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是人造的。運些基因的實例包括馬蹄蓮 (callas)基因（PCT公開的申請W0 93/02197)，幾下質酶編碼序列（其可W從例如ATCCW登 錄號3999637和67152獲得），煙草鉤蟲幾下質酶（Kramer et al.，1993Insect Molec.Biol.23:691)，和歐芹 ubi4-2多聚泛素基因 （Kawalleck et al.，1993Plant Molec.Biol.21:673)。
[0073] 化)刺激信號轉導的分子。運些分子的實例包括綠豆巧調蛋白cDNA克隆的核巧酸 序列（Botella et al.，1994Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米巧調蛋白cDNA克隆的核巧 酸序列（Griess et al.,1994Plant F*hysiol. 104:1467)。
[0074] (L)疏水矩膚化yho曲obic moment peptide)。見例如美國專利Nos.5,659,026和 5，607，914，后者教導了賦予疾病抗性的人造抗微生物膚。
[0075] (M)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌膚-β裂解膚類似物(Jaynes et al.，1993Plant Sci . 89:43)，其使轉基因煙草植物對青枯病有抗性。
[0076] (N)病毒侵襲性蛋白質或由其衍生的復雜毒素。例如，在經轉化的植物細胞中，病 毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒W及相關病毒所致的病毒感染和/ 或疾病發展的抗性。已經給轉化植物賦予了衣殼蛋白介導的，針對首猜花葉病毒、黃瓜花葉 病毒、煙草條紋病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉 病毒的抗性。參見，例如，Beachy et al. (1990)Ann.Rev.F*h}ftopathol.28:451。
[0077] (0)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，祀向昆蟲腸道關鍵代謝功能的 抗體可W使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，Taylor等人(1994)，在第屯屆國際分子植物- 微生物相互作用研討會（Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497號摘要顯示了轉基因煙草中通過產生單鏈抗體片段的酶失活。
[0078] (P)病毒特異性抗體。見例如Tavladoraki et al. (1993)化 1:ure 266:469,其顯示 了表達重組抗體基因的轉基因植物被保護免于病毒攻擊。
[0079] (Q)由病原體或寄生物自然產生的發育阻滯(developmen1:a；L-a;rrestive)蛋白質。 因此，真菌內切α-1，4-D多聚半乳糖醒酸酶通過溶解植物細胞壁的均聚-α-1，4-D-半乳糖醒 酸而促進真菌定殖和植物營養素釋放化amb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。 1'〇加曰的等（1992口1曰11* J. 2:367)描述了豆類內切多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的編碼基因 的克隆和表征。
[0080] (R)由植物自然產生的發育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質，例如大麥核 糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性化ongemann et al.，1992) .Bio/ Technology 10:3305。
[0081 ] (S)RNA干擾，其中用RNA分子抑制祀基因的表達。一個實施例中的RNA分子是部分 或完全雙鏈的，其觸發沉默響應，導致dsRNA被切割成小的干擾RNA，它們隨后被納入到祀向 復合體中，祀向復合體破壞同源的mRNA。見例如Fire等人，美國專利6,506,559; Graham等 人，美國專利6,573,099。
[0082] 2.賦予除草劑抗性的基因
[0083] ( A )編碼針對抑制生長點或分生組織的除草劑，例如咪挫嘟酬類 (imidazalinone)、橫酷苯胺類（3111的11日]1；[11(1日）或橫酷脈類除草劑的抗性或耐受性的基 因。運類基因的實例編碼一種突變乙酷乳酸合酶(ALSKLee et al.，1988EMB0J.7:1241)， 其也稱乙酷徑酸合酶(AHALKM化i et al.，1990Theor.Appl.Genet.80:449)。
[0084] (B)-種或多種額外的編碼針對草甘麟抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性 是由突變體EPSP合酶和aroA基因賦予的，或者是通過一些基因如DGT-28，2mEPSPS，GAT(草 甘麟乙酷轉移酶)或G0X(草甘麟氧化酶)和其它麟酷基化合物，如草胺麟(pat, bar,和dsm-2 基因），和芳氧基苯氧基丙酸和環己二酬(ACC酶抑制劑編碼基因）所致的代謝失活而獲得 的。見例如美國專利齡.4,940,835，其公開了可賦予草甘麟抗性的6?5?形式的核巧酸序列。 編碼突變體aroA基因的DNA分子能夠WATCC登錄號39256獲得，突變體基因的核巧酸序列在 美國專利No. 4，769，061中公開。歐洲專利申請No. 0 333 033和美國專利No. 4，975，374公開 了可賦予除草劑如レ草錠麟抗性的谷氨酷胺合酶基因的核巧酸序列。歐洲專利申請No.0 242 246提供了草錠麟乙酷轉移酶基因的核巧酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/ Technology 7:61中描述了表達編碼草錠麟乙酷轉移酶活性的嵌合bar基因的轉基因植物 的產生。賦予針對芳氧基苯氧基丙酸和環己二酬如稀禾定和甲禾靈化aloxyfop)的抗性的 示例性基因是Accl-Sl，Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.( 1992) Theor.Appl .Genet.83:435所述。
[0085] (C)編碼針對可抑制光合作用的除草劑例如Ξ嗦(psbA和gs+基因）和節臘(臘水解 酶基因）的抗性的基因。Prz化illaetal.α991)PlantCell3:169描述了使用編碼突變 體psbA基因的質粒轉化衣藻。在美國專利No. 4，810，648中公開了臘水解酶基因的核巧酸序 列，含有運些基因的DNA分子可W通過ATCC登錄號53435、6744巧日67442獲得。化yes et al. (1992)81〇油6111.1285:173中描述了編碼谷脫甘膚5-轉移酶的0臟的克隆和表達。
[0086] (D)編碼針對可結合徑基苯基丙酬酸二加氧酶化PPD)的除草劑的抗性基因 ，HPPD 是催化對-?基苯基丙酬酸（HPP)轉化形成尿黑酸的反應的酶。運包括例如異嗯挫 化P418175，EP470856，EP487352，EP527036，EP560482，EP682659，美國專利No. 5,424，276)， 特別是異嗯挫草酬，其是玉米的選擇性除草劑，二酬臘（diketonitrileKEP496630, EP496631)，特別是2-氯基-3-環丙基-1-(2-S02C冊-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酬和2-氯基- 3-環丙基-1-(2-S02C 冊-4-2，3C12 苯基）丙烷-1，3-二酬，Ξ 酬類化 P625505，EP625508，美國 專利No. 5，506，195)，特別是橫草酬、和pyrazolinate等除草劑。在植物中產生過量HPPD的 基因能夠提供針對運些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利Nos. 6,268,549和6， 245,968和美國專利申請公開No. 20030066102中描述的基因。
[0087] 化)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(ΑΟΡΡ)除草劑的抗性或耐受性。運些基 因的實例包括α-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利No. 7，838，733所述。
[0088] (F)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對化晚基氧基生長素除草劑，如氣草煙或綠草定的抗性或耐受 性。運些基因的實例包括α-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-12)基因，如W02007/053482- A2所述。
[0089] (G)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因（見例如美國專利公開 No.20030135879)〇
[0090] 化)編碼針對抑制原化嘟原氧化酶(PP0)的除草劑的抗性或耐受性的基因（見美國 專利No. 5,767,373)。
[0091] (I)提供針對可結合光系統II反應中屯、(PS II)核屯、蛋白質的Ξ嗦除草劑(例如莽 去津）和尿素衍生物（如敵草隆）除草劑的抗性或耐受性的基因。見化ussian et al.， (1989)EMB0 J.1989,8(4):1237-1245。
[0092] 3.可賦予或貢獻數量疊加性狀(化lue Added Trait)的基因
[0093] (A)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用反義基因或硬脂酷-ACP去飽和酶轉化玉米或 蕓苔屬植物從而增加植物的硬脂酸含量（K η U 1 t Z 0 η e t a 1 .，1 9 9 2 ) Proc. Nat. Acad.Sci.USA89:2624 〇
[0094] (B)降低的植酸含量
[00巧](1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因 （Van Hartingsveldt et al.， 1993Gene 127:87)，提高植酸降解，向被轉化植物添加更多游離憐酸鹽。
[0096] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，運可W通過，例如，克隆然后重新導入 如下所述的單個等位基因的相關DNA來實現:該單個等位基因導致W植酸水平低為特征的 玉米突變體的原因 （Raboy et al.，1990Maydica 35:383)。
[0097] (C)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉 化植物而實現。運些酶的實例包括，粘液鏈球菌(Streptococcus mucus)果糖基轉移酶基因 (化iroza et al.,1988)J.Bacte;riol.170:810,枯草芽抱桿菌果聚糖薦糖酶基因 (Steinmetz et al.,1985Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽抱桿菌α-淀粉酶（Pen et al., 1992Bio/Technology 10:292)，番茄轉化酶基因化lliot et al. ,1993)，大麥淀粉酶基因 (Sogaard et al.，1993J.Biol.化em.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶iKFisher et al.，1993Plant I^ysiol.102:10450)。
[0098] 在一個實施方案中，轉基因事件包括一個或多個選自下組的轉基因：殺蟲劑抗性 轉基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水分利用效率轉基因，營養質量轉基因， DNA結合轉基因，和選擇性標志物轉基因。
[0099] 供體植物
[0100] 根據一個實施方案，選擇包含至少兩個轉基因事件的堆疊組的供體植物。運些供 體植物能夠使用標準重組或育種技術或其任何組合來產生。在一個實施方案中，供體植物 包含2,3,4,5,6或更多個堆疊的轉基因事件。而且，每個轉基因事件可^包括多個緊密連鎖 并且一起分離的組分。在一個實施方案中，每個轉基因事件包括一系列基因，它們在功能上 有關或者與特定的期望性狀相關。供體系的遺傳背景有助于創建具有轉基因的植物。然而， 為了完全把握與轉基因事件相關的性狀的利益，必須將轉基因事件基因滲入到優良育種系 內。
[0101] 在根據一個實施方案，提供了一種方法來減少在傳統回交選擇方法學中所需的雜 交次數。該方法包括平行制備兩個供體植物系，其中期望用于基因滲入的轉基因事件在運 兩個供體植物之間分配，運兩個供體共享至少一個轉基因。在一個實施方案中，第一供體植 物包括第一和第二轉基因事件，而第二供體植物包含相同的第二轉基因事件和第Ξ轉基因 事件。在一個實施方案中，第一供體植物包括第一、第二和第Ξ轉基因事件，而第二供體植 物包括相同的第Ξ轉基因事件，W及第四轉基因事件。在一個實施方案中，第一供體植物包 括第一、第二和第Ξ轉基因事件，而第二供體植物包括相同的第Ξ轉基因事件，W及第四和 第五轉基因事件。在一個實施方案中，第一供體植物包括第一、第二、第Ξ和第四轉基因事 件，而第二供體植物包括相同的第Ξ和第四轉基因事件，W及第五和第六轉基因事件。
[0102] 根據一個實施方案，第一和第二供體植物作為兩個不同的系被維持，每個系被與 相同的輪回親本系回交W產生第一和第二供體系，其每一個具有高輪回親本百分比。更具 體地，在一個實施方案中，第一和第二供體植物的每一個與相同的優良植物系雜交，并且將 保留期望轉基因事件的第一和第二F1后代進一步與輪回親本系回交，W產生第一和第二回 交后代植物，其包括所述期望的性狀和所述優良品系的基本上全部的生理學和形態學特 征，除了來自期望轉基因事件的特性之外。所得第一供體/輪回植物可W隨后與所述第二供 體/輪回植物雜交，W產生期望的轉基因事件被固定在期望的優良植物種質內的后代。
[0103] 根據一個實施方案，提供了用于將Ξ個或更多個轉基因事件從供體系基因滲入到 單一優良植物種質內的方法。該方法包括：
[0104] a)提供第一供體/輪回植物，其包括第一轉基因事件，第二轉基因事件，并且具有 大于80% ,88% ,90% ,94% ,97%或97.5%的輪回親本百分比；
[0105] b)提供第二供體/輪回植物，其包括所述第二轉基因事件，第Ξ轉基因事件，并且 具有大于80% ,88% ,90% ,94% ,97%或97.5%的輪回親本百分比；
[0106] C)將所述第一供體/輪回植物與所述第二供體/輪回植物雜交，W產生后代；
[0107] d)從步驟(C)中培育的植物、或任選地，步驟(C)的植物的自交后代中鑒定和選擇 包括所述第一、第二和第Ξ轉基因事件的產物植物。
[0108] 根據一個實施方案，第一和第二供體/輪回植物是運樣產生的:使最初的第一和第 二供體植物與優良品系雜交，W產生第一和第二F1后代品系。然后，基于具有期望的性狀從 第一和第二F1后代選擇出一個或多個后代植物，并將它們進一步與輪回親本平行（即，第一 F1后代和第二F1后代二者作為兩個單獨的系繁殖)雜交，W產生回交后代植物;隨后選擇具 有所述期望性狀的回交后代植物，并將回交步驟重復一次、兩次或更多次，W產生選定的第 二、第Ξ或更高代的回交后代植物，其除了來自供體植物的特性之外，包含期望的性狀和基 本上全部的優良品系生理學和形態學特征。根據一個實施方案，在回交中使用的輪回親本 植物是至少一次所述回交的雌性植物。
[0109] 根據一個實施方案，通過使用標志物輔助選擇來篩選和選擇包含期望性狀的后代 植物。在一個實施方案中，所用的標志物輔助選擇技術選自下組:SNP標志物輔助選擇，SSR 標志物輔助選擇，RFLP標志物輔助選擇，RAPD標志物輔助選擇，和AFLP標志物輔助選擇。下 一代測序(NGS)技術也可W用于在回交過程中覆蓋整個基因組。
[0110] 根據一個實施方案，回交供體植物包含與輪回親本系享有超過80 % ,88% ,90%， 94% ,97%，或97.5%的序列同一性的基因組序列。根據一個實施方案，第一和第二回交供 體植物分別包含少于5cM，lOcM，20cM，25cM，30cM，35cM，40cM，45cM，或50cM的來自第一或第 二供體親本植物的連鎖累寶。根據一個實施方案，回交供體植物包含期望的轉基因事件，同 時與輪回親本植物共有超過88% ,90% ,95% ,97%，或97.5%的分子標志物。在一個實施方 案中，回交供體植物包含期望的轉基因事件，同時具有基本上全部的優良品系生理學和形 態學特征。
[0111] 根據一個實施方案，提供了包含至少2個轉基因事件的第一堆疊的第一供體植物， 并且將該第一供體植物與選定的輪回親本植物雜交，產生包含所述轉基因事件的第一堆疊 的第一 F1后代植物。用第一 F1后代植物與輪回親本植物進行第一育種回交，并且選擇包含 所述轉基因事件的第一堆疊的第一育種回交后代。然后將第一育種回交后代與所述輪回親 本植物連續回交一次或多次，W產生包含所述轉基因事件的第一堆疊的BC2、BC3或BC4或更 高代的第一回交后代植物。根據一個實施方案，一次或多次所述回交是使用雌性輪回植物 進行的。
[0112] 按照相似的方式，選擇包括至少2個轉基因事件的第二堆疊的第二植物，其中該第 二堆疊中的至少一個轉基因事件也存在于所述第一供體植物的轉基因事件的第一堆疊中。 將第二供體植物與相同的選定輪回親本植物雜交W產生第一 F1后代植物。此雜交產生了包 含所述轉基因事件的第二堆疊的第二F1后代植物。用第二F1后代植物與輪回親本植物進行 第二育種回交，并且選擇包含所述轉基因事件的第二堆疊的第二育種回交后代。然后將第 二育種回交后代與所述輪回親本植物連續回交一次或多次，W產生包含所述轉基因事件的 第二堆疊的BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物。根據一個實施方案，一次或多次 所述回交是使用雌性輪回植物進行的。
[0113] BC2、BC3或BC4或更高代的第一和第二回交后代植物將具有高的輪回親本百分比， 與輪回親本植物共有大于88%，90%，95%，97%或97.5%的分子標志物，并且/或者分別來 自第一或第二供體親本植物的連鎖累寶少于20cM。然后將BC2、BC3或BC4或更高代的第一回 交后代植物與BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物雜交，W產生第Ξ后代植物，其 包含來自所述轉基因事件第一和第二堆疊的獨特的Ξ個(或更多個)轉基因事件。任選地， 將所述第Ξ后代植物自交或者與輪回親本回交，同時選擇包含期望的基因滲入的轉基因事 件的后代植物。在一個實施方案中，第Ξ后代植物具有至少97.5%的輪回親本百分比。在一 個實施方案中，一個或多個所述轉基因事件W純合狀態被固定在最終的育種系中。在一個 實施方案中，所述轉基因事件全部W純合狀態被固定。在一個實施方案中，包含基因滲入的 期望轉基因事件的植物W及輪回親本種質包含少于5cM，10cM，15cM，20cM，25cM，30cM, 35cM，40cM，45cM，或50cM的來自第一和/或第二供體親本植物的連鎖累寶。
[0114] 根據一個實施方案，包含期望轉基因事件的植物和輪回親本種質可W和緊密親緣 的物種而非相同的物種雜交。例如，在一個實施方案中，玉米植物可W和親緣的植物，例如 類蜀泰(teosinte)，雜交。并且/或者，在一個實施方案中，包含期望轉基因事件的第一和第 二供體植物可W來自緊密親緣的但不相同的物種。
[0115] 根據一個實施方案，所述的將Ξ個或多個轉基因事件基因滲入到優良品系中的方 法可W對任何能夠通過回交選擇進行育種的植物物種使用。在一個實施方案中，植物是作 物物種，并且可w選自單子葉植物或雙子葉植物。例如，可根據本公開使用的單子葉植物包 括選自下組的任何植物:玉米植物，小麥植物，或水稻植物。可W使用的單子葉植物的進一 步的具體實例包括，但不僅限于，玉米（Zea mays)，水稻（OiTza sativa)，黑麥（Secale cereale)，高梁（Sor曲um bicolo;r,Sorghum vulgare)，小米（例如，珍珠粟（Pennisetum glaucum)，泰（Panicum mi 1 iaceum)，粟（Setar ia i tal ica)，龍爪稷（E1 eusine coracana))，小麥（Triticum aestivum)，甘薦（甘薦屬），燕麥(Avena)，大麥化ordeum)，鳳 梨(Ananas comosus)，香蕉（香蕉屬），棟桐，觀賞植物，和草。在一個實施方案中，單子葉植 物是玉米。可W根據本公開使用的雙子葉植物的實例包括任何選自下組的植物:大豆植物， 番茄植物，首猜植物，芥花(canola)植物，油菜(rapeseed)植物，蕓苔屬植物，棉花植物，和 向日葵植物。可W根據本公開使用的雙子葉植物的其它實例包括，但不僅限于，芥花，棉花， 馬鈴馨，昆諾阿襲，寬，養麥，紅花，大豆，甜菜，向日葵，芥花，油菜，煙草，擬南芥，蕓苔屬和 棉花。在一個實施方案中，雙子葉植物是大豆。實施例1
[0116] 在玉米中RR冊3近交系與Mon88017:Mon89034的標志物輔助性狀轉換
[0117] Sma;rtStax 8
[0118] SmartStax 8(SSX 8)是一種通過標志物輔助回交育種將8個基因[TC1507(PAT， 打y IF)，DAS591227(PAT，Cry34Abl，打y35Abl)，Mon89034(Cry 1A.105，Cry2Ab2)， Mon88017化PSPS,C巧3Bbl)]滲入到高產玉米系中而產生的玉米植物。SmartStax 8的最終 目的是保護玉米免于主要害蟲，例如玉米懼、根蟲、夜盜蟲、玉米穗蛾和粘蟲的傷害。 SmadStax 8還可W提供對草甘麟除草劑的抗性，并納入草錠麟作為選擇性標志物。
[0119] 標志物輔助回交育種(MABB)
[0120] 通過經典育種方法的作物改良在上個世紀取得了顯著進展。然而，考慮到人口穩 定增長和可供作物種植的±地不斷減少，采用新的策略W滿足需求是當務之急。在短時間 內開發具有期望性狀的高產品種是育種計劃的一個重要關注點。標志物輔助選擇(mas)有 助于在比傳統方法更短的時間內開發出優越品種。為了有利地使用MAS,必須有可用的基因 組資源，例如中性(基于DNA)分子標志物(特別是共顯性標志物）。回交育種業已成為將一個 或數個基因從供體納入到適應品種內的常用方法，在植物育種中已經應用了將近一個世 紀。雖然性狀的基因滲入可W通過傳統的回交育種方法實現，但是該方法需要長達6代才能 獲得99%的輪回親本百分比(RPP)。然而，MAS預期可W在僅僅3個回交世代內回收超過99% 的RPP，表明分子標志物可W極大地提高回交效率(Bassett et al.2000)。
[0121] 目標
[0122] 通過標志物輔助回交將Mon89034和Mon88017基因滲入到玉米優良近交系SMA07BM 中，運些基因最終將在BC3代與Mon88017和TC1507基因堆疊，獲得具有全部Ξ個基因 Mon88017: :Mon890：M: :TC1507、并且回收超過98%輪回親本基因組(RPP)的SMA07BM。
[0123] 轉換策略
[0124] 在SSX8的雌性側，關注點是將Mon88017和Mon89034與TC1507-起堆疊到某一優良 種質內，并回收98%或更高的輪回親本基因組。為此，分別進行Monl7(Mon88017: :TC1507) 和Mon89(Mon88017: :Mon89034)的平行轉換，并且從BC2和BC3開始標志物輔助選擇策略并 在BC3實現堆疊（圖1)。在由于不可預知的原因導致不可能在BC3實現堆疊的情況下，各品系 在BC4或BC5進行堆疊。或者，運個策略還可W使用標志物在BC1和BC2上實施，并在BC2進行 堆疊。因為Mon88017在兩側均存在，所W我們能夠選擇對于Mon88017: :TC1507: :Mon89034 而言分別是純合：：雜合：：雜合的等位基因狀態的堆疊品系。
[0125] 材料和方法
[0126] BC2
[0127] DNA提取和制備
[0128] 從8〔23畑631〇1188017::]\1〇1189034群體采取422個樣品。使用1日旨41化日。1咖方案在 Agilent Biocel Robot?(Bohl et al 2010)上從新鮮組織提取DNA。對樣品進行高通量分 子分析化TMA)測試，考察Mon89034的存在化inch巧2002)。接著，將對Mon89034測試為雜合 的188個DNA樣品拾取化it-picked)到2個96孔板內。
[01巧]用蒸饋水Wl:10的比例稀釋DNA。接著，從MA化存儲DNA(MA化stock DNA)獲得 6RC162Mon88017: :Mon89034(群體供體)和RR冊3(輪回親本），并添加到平板1的A1和A2孔和 平板2的化0和化1孔。
[0130] SNP標志物和基因型分型平臺
[0131] 標志物分析使用KASPar?SNP平臺進行。標志物選擇在下面的表1中列出。所得數據 用Kraken Kluster (filler?軟件上傳和分析。使用Marker Sl:udy Manager為每個樣品組裝 染色體表，并計算輪回親本百分比(RPP)。
[0132] 連鎖累寶分析
[0133] 為了實施連鎖累寶化D)分析，使用標志物選擇在整個基因組中可擴增基因座的多 態性標志物。LD在染色體1和4上實施，因為事件Mon89034先前被定位到染色體1大約342cM 處，事件Mon88017先前被定位到染色體4大約llOcM處。所選標志物在染色體1和4上相隔大 約lOcM。
[0134] 基因組分析
[0135] 將具有最高RPP的45個樣品從提取平板拾取化itpiclO到1塊96孔板中，供HTMA實 驗室檢查Mon88017的存在，并拾取到另一塊用于jinxing基因組分析(GA)dGA在染色體2-3， 5-10上使用KASPar? SNP分析來實施。選定的標志物相隔大約20cM，并且在下文表1中列出。 所得的數據用Kraken Kluster (filler?軟件上傳和分析。使用Marker Sl:udy Manager?為 每個樣品組裝染色體表，該染色體表既包括先前的LD又包括新的GA分析，并計算輪回親本 百分比(RPP)。
[0136] 選擇10個具有最高RPP并且對Mon88017和Mon89034均測試為雜合的植物。
[0137] BC3
[013引 DNA提取和制備
[0139] 接下來，從BC3RR冊3Mon88017: :Mon89034群體，W及輪回親本RR冊3，采取188個樣 品。使用MagAttract?方案在Agilent Biocel Robot?上從新鮮組織提取DM。提取的DNA用 蒸饋水:10的比例稀釋。從存儲DNA獲得6RC172Mon88017: :Mon89034(群體供體），并添加 到平板1的A2孔和平板2的化1孔。
[0140] SNP標志物和基因型分型平臺
[0141] BC3標志物分析使用KASPar? SNP分析進行。標志物的選擇在下面的表1中列出。所 得數據用Kraken Kluster (filler?軟件上傳和分析。使用Marker Sl:udy Manager為每個樣 品組裝染色體表并計算輪回親本百分比(RPP)。
[0142] 連鎖累寶分析
[0143] 使用MarkerDB?選擇在整個基因組中擴增了多個基因座的多態性標志物。LD在染 色體1和4上執行，因為事件Mon89034先前被定位到染色體1大約342cM處，而事件Mon88017 先前被定位到染色體4大約llOcM處。選定的標志物在染色體1和4上相隔大約lOcM，并且在 基因組的所有其余部分上每隔大約20cM分布。評估了來自BC2的用作BC3代的供體的植物的 基因型。將在全部BC3群體供體中對A等位基因為純合的標志物從分析中淘汰，并添加到最 終的結果中作為歷史的非分離標志物。
[0144] 選擇具有最高RPP的 10個植物。將Mon88017: :Mon89034群體和Mon88017: :TC1507 群體的最佳選擇投入到堆疊程序中，W發現最佳的可能堆疊組合。
[0145] 表1.在BC2連鎖累寶分析、BC2基因組分析和BC3連鎖累寶/基因組分析中用于 KASPar? SNP平臺的標志物W及基因座染色體和染色體位置
[0146]
[0147] 堆疊
[0148] 如圖1所示進行R畑63與Mon 17: :TC1507的平行回交轉換。目標是在R畑63的雙側 均實現堆疊，并獲得可產生RPP大于98%的品系的堆疊組合。使用Mon 17側和Mon 89側的10 個最佳選擇來進行堆疊組合程序，W統計學確定可產生〉98%RPP的組合的獲得概率。對所 得的堆疊群體執行標志物分析。
[0149] 表型分型
[0150] 親if起點育苗(new start nursery)
[0151] 此育苗是將感興趣的性狀轉移到目標輪回親本(RPP)近交系的初始步驟。使用定 量化ISA測試對所有可能的供體植物篩選基因表達。僅有高表達的供體植物被用于給輪回 親本授粉。應當從供體轉移花粉到RPP，W捕獲RPP胞質。進行最少10次授粉，對穗進行批量 脫殼(bu化-shell)。
[0152] 從F1到BC1育苗
[0153] 對每一個F1群體進行測試，W確認感興趣的基因的存在。運通過噴灑合適的選擇 性除草劑標志物(民饑ind-Up⑧，用于Mon 88017;或者Libe;rtyLi]lk?，用于TC1507)或者使 用定量化ISA測試(Mon 89034)來實現。如果沒有錯誤，則被測試的全部植物都應該具有感 興趣的基因。在開花時，通過從RPP花粉轉移到F1材料中進行最少10次授粉。
[0154] 從BC巧化C2育苗
[01W]運里再一次實施選擇性除草劑標志物和定量化SIA，并且在后續的全部育苗中也 實施。植物將關于每種基因的存在Wl:l的比例分離。在開花時，選擇20個陽性植物并進行 授粉。在收獲時，根據穗的類型選擇10個植物并進行批量脫殼。
[0156] 從BC2至化C3育苗
[0157] 運是群體接受基因型分型的第一代。種植的行數必須足W在測定了基因的存在 (通過除草劑應用或定量化ISA)之后獲得至少186株的陽性植物。在3-4周齡的植物上收集 葉組織樣品。實驗室選擇開花最好的植物，并且只用那些植物授粉。在運個階段，最好的植 物W兩種方式使用：用RPP對其授粉W進行反向回交;用它們給RPP授粉W實施最高達5次回 交授粉。使用每個群體的最好的10個植物進行授粉并收獲，但是僅再次種植最佳的3個植 物。在BC2中使用表型選擇作為標志物選擇的補充，僅拋棄那些具有嚴重表型問題的植物。 [015引 BC3堆疊育苗
[0159] 隨著堆疊基因數目的增加，堆疊設計變得越來越復雜。當有3個或更多個性狀需要 基因滲入到某個品系中時，最好應當在開始時將基因滲入分成兩個不同的標志物基因滲入 項目，并通過堆疊實現最終的基因組合。通常，堆疊在BC3(或者更晚，例如BC4)代進行，使用 對其各自的基因而言為半合的植物。
[0160] 當使用BC3(半合)植物實施堆疊時，重要的是在授粉之前對待在堆疊中使用的植 物進行全基因組分析。具體的雜交組合當在基因組分析結果出來之后，與實驗團隊協商來 確定。待堆疊的品系必須經過選擇，使它們具有"互補"的供體提親本背景滲入。運將為隨后 在S1植物的標志物的幫助下近乎完全地消除供體遺傳背景創造條件。
[0161] 結果
[0162] 基因型分型數據W輔助在選擇中進行定量遺傳
[0163] LD BC2
[0164] 在少數基因座中，RPP(來自田間）和供體等位基因是單態的，但群體是分離的。對 于運些情況，在化IM中將RPP的等位基因強制判讀為雜合一一W符合預期判讀并符合群體 分離。在大多數情況下，親本是多態的，在群體中存在BB。運些田間的基因型最有可能來自 在早前世代中使用的不凈的RPPnMon89在染色體1上標志物覆蓋低并且沒有右側標志物。數 據返回率是99.1 %。選擇最好的45個植物用于授粉和接合性測試。
[01 化]GA BC2
[0166] 數據返回率是98.2%。由于異常的群體分離一一特別是染色體4和染色體9上的cM 110附近，去掉了數個標志物。
[0167] LDGA BC3
[016引數據返回率是99.1%。下列植物:94305117,94308841,94308798是劣種(rogue)樣 品。Mon 89的右側沒有標志物。在運些劣種植物中觀察到了出乎意料的分離;所有其它的家 族群與歷史分離模式相符。分離標志物7594,2479對于運個雜交似乎不是多態性標志物(在 BC2和BC3之間提供了不同的RPP來源）。根據開花情況選擇了最佳的10個植物用于堆疊。另 夕h如果有超過10個植物具有l00%RPP，則選擇它們，W便能夠基于表型選擇植物。
[0169] 選擇
[0170] 在下面的表2中列出了最佳的植物選擇，W及它們的RPP，用于BC2和BC3LDGA。表3 列出了最佳的堆疊組合。
[0171] 表2.最終從R畑63Mon88017: :Mon89034群體挑選，并通知育種者獲取BC2和BC2世 代育種的10個植物，W及每個植物的輪回親本百分比和選擇排名
[0172]
[0173] 堆疊組合
[0174] 通過堆疊組合程序，使用Mon 17側和Mon 89側的10個最佳選擇，為W統計學方式 確定了所有組合的獲得可產生〉98%RPP的組合的概率。使用概率最高的組合在田間進行實 際雜交。表3指示了在田間使用的堆疊組合。
[01巧]表3.最佳堆疊組合，顯示為植物編號，來自每個轉換（Mon88017:TC1507和 Mon89034: Mon88017)的配對在一起
[0176]
[0177] 討論
[0178] RRH63X SLBOl轉換是窄雜交，因此只有相對較少的多態性標志物可用于分析。假 設基因組中沒有多態性標志物覆蓋的大部分區域在兩個品系間沒有差異，因此不必轉換。 BC2到BC3的RPP進展顯著，并且在為堆疊設定的98%最小RPP內。
[0179] 自交和測交育苗
[0180] 運是要種植的最后一代。運個育苗用于將項目材料從自交的S1水平推進到S2水 平，同時產生雜交種子用于在目標環境中進行產量性狀測試。通常，種植從最好的5個S1植 物獲得的全部種子，并且運些植物構成用于產量試驗的5個選擇。
[0181] 對此項育苗的全部植物測試接合性。在授粉時，對就Mon88107和Mon 89034而言均 為純合、并且就TC1507而言為純合或無效的植物進行自花授粉，并送去進行最終育苗。群體 中的其它植物用作雌性，通過從雄性測試者傳遞花粉來產生雜交種子。
【主權項】
1. 一種用于將三個或更多個轉基因事件從供體系滲入到輪回植物基因組內的方法，所 述方法包括： a) 提供第一供體/輪回植物，其包括第一轉基因事件、第二轉基因事件，并且具有大于 80%的輪回親本百分比； b) 提供第二供體/輪回植物，其包括所述第二轉基因事件、第三轉基因事件，并且具有 大于80%的輪回親本百分比； c) 將所述第一供體/輪回植物與所述第二供體/輪回植物雜交，以產生后代植物； d) 從步驟(c)中的那些后代植物、或者任選地步驟(c)的后代植物的自交后代中鑒定并 選擇包括所述第一、第二和第三轉基因事件的后代植物。2. 權利要求1的方法，其中： i) 所述第一供體/輪回植物是如下產生的： e) 使第一供體植物與輪回植物雜交產生第一后代，其中所述第一供體植物包括所述第 一轉基因事件和所述第二轉基因事件； f) 通過將步驟(e)的第一后代、或者任選地，步驟(e)的第一后代的自交后代與所述輪 回植物雜交而提供一個或多個回交世代，從而提供第一回交植物，并將所述第一回交植物 與所述輪回植物雜交，從而產生包含所述第一轉基因事件、所述第二轉基因事件，并且具有 大于80 %的輪回親本百分比的所述第一供體/輪回植物;和 ii) 第二供體/輪回植物是如下產生的： g) 使第二供體植物與所述輪回植物雜交以產生第二后代，其中所述第二供體植物包括 所述第二轉基因事件和所述第三轉基因事件； h) 通過將步驟(g)的第二后代、或者任選地，步驟(g)的第二后代的自交后代與所述輪 回植物雜交而提供一個或多個回交世代，從而提供第二回交植物，并將所述第二回交植物 與所述輪回植物雜交，從而產生包含所述第二轉基因事件、所述第三轉基因事件，并且具有 大于80%的輪回親本百分比的所述第二供體/輪回植物。3. 權利要求2的方法，其中所述輪回親本植物在步驟(e)到(h)的至少一個步驟中是雌 性育種植物。4. 權利要求3的方法，其中所述第一和第二后代植物各自與所述輪回植物回交至少2次 以產生平行的BC2系或更高代的第一回交后代植物，分別代表所述第一供體/輪回植物和第 二供體/輪回植物。5. 權利要求2的方法，其中第一供體/輪回植物的第一或第二轉基因事件中的至少一個 作為純合性狀被固定。6. 權利要求2的方法，其中第二供體/輪回植物的第二或第三轉基因事件中的至少一個 作為純合性狀被固定。7. 權利要求1的方法，其中在包含所述第一、第二和第三轉基因事件的后代植物中，該 第一、第二和第三轉基因事件作為純合性狀被固定。8. 權利要求1-7中任一項的方法，其中包含所述第一、第二和第三轉基因事件的后代植 物具有大于94%的輪回親本百分比。9. 權利要求1-7中任一項的方法，其中包含所述第一、第二和第三轉基因事件的后代植 物具有大于97.5%的輪回親本百分比。10. 權利要求9的方法，其中該植物是單子葉植物。11. 權利要求1 〇的方法，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物、小麥植物、草植物和水 稻植物。12. 權利要求9的方法，其中該植物是雙子葉植物。13. 權利要求12的方法，其中該雙子葉植物選自下組:大豆植物，芥花植物，煙草植物， 番茄植物，油菜植物，蕓苔屬植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。14. 權利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三轉基因性狀中的至少一個包括選自 下組的轉基因：殺蟲劑抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效 率轉基因、營養品質轉基因、DNA結合蛋白轉基因、和選擇標志物轉基因。15. 權利要求1的方法，其中所述第一和第二供體/輪回植物中的一個還包括第四轉基 因事件。16. 權利要求15的方法，其中所述第一和第二供體/輪回植物中的一個還包括第五轉基 因事件。17. -種用于將三個或更多個轉基因事件滲入到植物內的方法，所述方法包括： a) 提供第一供體植物，其包括至少兩個轉基因事件的第一堆疊； b) 將該第一供體植物與選定的輪回親本植物雜交，以產生包含所述轉基因事件的第一 堆疊的第一F1后代植物； c) 將第一 F1后代植物與所述輪回親本植物進行第一育種回交，并選擇包含所述轉基因 事件的第一堆疊的第一育種回交后代植物； d) 將選定的第一育種回交后代與所述輪回親本植物連續回交一次或多次，以產生包含 所述轉基因事件的第一堆疊的BC2或更高代的第一回交后代植物； e) 選擇包含至少兩個轉基因事件的第二堆疊的第二供體植物，其中該第二堆疊的轉基 因事件中的至少一個也存在于所述第一堆疊的轉基因事件中； f) 將該第二供體植物與所述選定的輪回親本植物雜交，以產生包含所述轉基因事件的 第二堆疊的第二F1后代植物； g) 將第二F1后代植物與所述輪回親本植物進行第二育種回交，并選擇包含所述轉基因 事件第二堆疊的第二育種回交后代植物； h) 將選定的第二育種回交后代與所述輪回親本植物連續回交一次或多次，以產生包含 所述轉基因事件的第二堆疊的BC2或更高代的第二回交后代植物； i) 將所述BC2或更高代的第一回交后代與所述BC2或更高代的第二回交后代雜交，以產 生包含來自所述轉基因事件的第一和第二堆疊的三個轉基因事件的第三后代植物。18. 權利要求17的方法，其中該第三后代植物包含至少97.5 %的重組親本基因組。19. 權利要求17的方法，其中該輪回親本植物在步驟(c)到(h)中的至少一個中是雌性 育種植物。20. 權利要求17的方法，其中該植物是單子葉植物。21. 權利要求20的方法，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物、小麥植物、草植物和水 稻植物。22. 權利要求17的方法，其中該植物是雙子葉植物。23. 權利要求22的方法，其中該雙子葉植物選自下組:大豆植物，芥花植物，煙草植物， 番茄植物，油菜植物，蕓苔屬植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。24. 權利要求17的方法，其中所述第一、第二和第三轉基因性狀的至少一個包括選自下 組的轉基因：殺蟲劑抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率 轉基因、營養品質轉基因、DNA結合蛋白轉基因、和選擇標志物轉基因。25. 權利要求17-24中任一項的方法，其中第一堆疊的轉基因事件中的至少一個在第一 回交后代植物中作為純合性狀被固定。26. 權利要求17-24中任一項的方法，其中第二堆疊的轉基因事件中的至少一個在第一 回交后代植物中作為純合性狀被固定。27. 權利要求17-24中任一項的方法，其中第三后代植物包含所有作為純合性狀被固定 的轉基因事件。28. 權利要求17的方法，其中該第三后代植物包括少于20cM的來自第一供體植物的連 鎖累贅。29. 權利要求17的方法，其中該第三后代植物包括少于20cM的來自第二供體植物的連 鎖累贅。30. 權利要求17的方法，其中步驟(e)的第一回交后代植物和步驟（i)的第二回交后代 植物是通過標志物輔助選擇而選擇的。31. 權利要求30的方法，其中該標志物輔助選擇選自下組：SNP標志物輔助選擇，SSR標 志物輔助選擇，RFLP標志物輔助選擇，下一代測序輔助選擇，RAH)標志物輔助選擇，和AFLP 標志物輔助選擇。32. 通過權利要求17的方法產生的植物，其中該植物包括所述轉基因事件的第一和第 二堆疊。
【文檔編號】A01H5/00GK106028797SQ201480076355
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月24日
【發明人】J·邁耶, J·W·賓
【申請人】美國陶氏益農公司