專利名稱：：與雞胚胎死亡性狀相關的igf2r基因片段克隆及作為分子標記的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于家禽基因工程
技術領域：
，具體涉及一種雞胚胎死亡性狀相關的/G尸2/基因片段的克隆，選擇其突變位點作為雞遺傳標記及其在雞標記輔助選擇上的應用。
背景技術：
：我國是世界上的養雞人國，雞蛋產量連續多年居世界第一位，雞肉產量僅次于美國。種蛋孵化效果、性別比例是重要的生產性狀，直接影響養雞生產效率和經濟效益。種蛋孵化率的影響因素已有大量的研究。研究表明雞品種、年齡、種蛋品質、孵化條件等對孵化效果都有影響，控制這些肉素可以提高孵化率。研究報道認為孵化期間胚胎死亡呈現一定規律。隨著分子生物學和生物技術的發展，人們開展了家禽的性別鑒定和調控研究，并取得了一定的進展；同時也從分子水平開展了有關胚胎發育的研究。胰島素樣生長因子(Insulin-likegrowthfactor,IGF)，因其與胰島素氨基酸序列有同源性而得名，是一類參與調節碳水化合物、脂類、蛋白質的代謝。IGF通過自分泌或旁分泌途徑，調節細胞分裂、分化、程序性死亡、化學趨向等活動，是下丘腦-垂體內分泌調節系統的重要組成部分。胰島素樣生長因子有兩種形式IGF-I和IGF-II，二者在氨基酸水平的同源性為62%。1GFs及其受體和結合蛋白等共同組成了胰島素樣生長因子系統(Insulin-likegrowthfactorsystem,IGF系統)，其成員包括胰島素樣生長因子，IGF-I和IGF-II;膜表面受體，包括胰島素樣生長因子I型受體(TGFtypelrec鄰tor，IGF-IR)、胰島素樣生長因子II型受體(IGFtypeIIreceptor,IGF-IHl);胰島素樣生長因子結合蛋白(IGF-bindingprotein,IGFBPs)。到目前為止，己定義了六種IGFBP,分別命名為IGFBP1-IGFBP6。此夕卜，還將IGFBP相關蛋白IGFBP-relatedproteins,IGFBP-rPs)以及一組IGFBP蛋白酶一并歸入IGF系統。IGF-I是一種重要的生長刺激因子，對于胚胎和成年期的機體發育均具有重要作用，IGF-I基因缺陷的個體表現為軟骨發育不全癥(侏儒癥)。IGF-I對于大多數細胞而言，都是一種強有力的有絲分裂原，合成是不受生長激素影響的，可促進細胞的增殖，對抗凋亡，提高存活率。IGF-II也是一種非常強的有絲分裂原，可促進多種細胞的增殖，抑制細胞凋亡。正常情況下，其表達受到基因印跡(geneimprinting)的調控(WangZ等,Analysisoflossofheterozygosityonchromosome6inhumanprostatecarcinomaandprostaticintraepithelialneoplasia,Z/20"gfe35Z"g丄/AiweZaZW,2001，30:414-417;LiL等，Relationofseruminsulin-likegrowthfactor-I(IGF-I)andIGFbindingprotein-3toriskofprostatecancer(UnitedStates).Ctmce/"0MCofro/,2003，14:721-726)，來自父本的等位基因被轉錄，而母本來源的等位基因由于甲基化修飾而發生基因沉默，IGF-II維持適當的轉錄和表達水平。IGF的功能主要是由細胞膜上的特異性跨膜受體介導，包括1GF-I受體(IGF-IR)和IGF-11受體(IGF-IIR)和胰島素受體(IR)(LeRoithD等，Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,19%，16:143-163)。IGF-1R屬于酪氨酸激酶受體家族，是介導IGF效應的主要受體IR也能結合IGF，介導IGF-I和IGF-II的部分生物學效應(LeRo池D等，Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,1996,16:143-163);IGF-IIR結構與lGF-IR和IR不同'無酪氨酸激酶活性。與IGF-IR不同，IGF-IIR不與IGF-I結合，只結合IGF-II。IGF-IIR,又稱為6-磷酸甘露糖受體(Mannose-6-phosphaterec印tor，M6PR)，IGF-IIR最初發現的功能是作為一種非陽離子依賴的6-磷酸甘露糖受體，可結合6-磷酸甘露糖(Mannose-6-phosphate，M6P)和溶酶體酶，主要在內吞和轉運胞內帶有6-磷酸甘露糖修飾的蛋白等過程中發揮作用(MacDonaldRG等,Asinglereceptorbindsbothinsulin-likegrowthfactorIIandmannose-6-phosphate.Science,1998,239:1134-1137;LeRoithD等,Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,1996，16(2):143—163;ByrdJC等，Mechanismsforhighaffinitymannose6-phosphateligandbindingtotheinsulin-likegrowthfactorIl/mannose6-phosphatereceptor.JBiolChem,2000,275:18638-46)。它是單鏈I型跨膜分子，胞外結構域很大，由15個平均長度為147個氨基酸殘基的重復單位組成，與IGF-II的結合位點位于第11個重復單位上。它是IGF-II清除受體(clearancereceptor),二者的結合可降低細胞外IGF-II的水平，影響IGF-IR的激活，從而抑制IGF-II的功能(LeRo池D等，Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,1996,16(2):143—163)。大量文獻手艮道，IGF-IIR是一種腫瘤抑制因子，肝癌、腎上腺皮質腫瘤、乳腺癌等多種腫瘤組織存在IGF-IIR的雜合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)。首先證明IGF-IIR在生長發育中起作用的證據來自過度生長的Tme(T-maternaleffect)小鼠，IGF-IIR基因敲除后，鼠胚胎個體偏大，循環中IGF-II濃度升高，并常因心臟功能異常導致圍產期死亡，而同時敲除IGF-II或IGF-IR基因后這種現象即消除，因此，推測IGF-IIR缺失致死是由于過量IGF-II刺激IGF-IR的結果。研究基因突變位點在群體中的多態性，并進行性狀關聯分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以申請人對這個基因的部分的外顯子進行了多態研究和關聯分析，以期能夠發現它的功能。
發明內容本發明的目的在于擴增雞/GF2及基因的DNA序列，以尋找該基因突變位點多態性，篩選與雞胚胎死亡性狀相關的基因作為標記輔助選擇的分子標記。本發明通過以下技術方案實現申請人克隆得到一種雞胚胎死亡性狀性關的《尸_2及基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所述。PCR擴增的/(F2及基因組序列全長為305bp,其中包含如序列表SEQIDNO:1所述外顯子序列和內含子的序列。測序結果表明在序列表SEQIDNO:l的第219bp處有一個A219-T219的堿基突變，導致乂/wW7-RFLP多態性。其中用于克隆KW2及基因片段所用的引物序列如SEQIDNO:l所示。一種篩選雞胚胎死亡相關基因分子標記的方法'它按照以下步驟用GenBank報道的雞胚胎發育相關基因KF2及(GeneID:LOC395817)的DNA序列設計引物；從雞胚組織中提取基因組DNA，PCR擴增'應用PCR-RFLP的方法檢測雞JG/T2及基因如序列表SEQIDNO:l所示的A219-T219的堿基突變，導致J/WV/-RFLP多態性'并進行其基因型與雞胚胎相對死亡率的關聯分析。本發明為雞的分子標記輔助育種提供了一個新的遺傳標記。更詳細技術細節如《具體實施方式》所述。本發明的效果是1、雞/GF2ft基因部分DNA序列的擴增及其多態性檢測PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均為特異的PCR產物。將PCR產物回收純化后測序，測序結果顯示PCR產物的長度為305bp。其中包括序列表SEQIDNO:1所示的外顯子和內含子。測序結果表明在該片段在序列表SEQIDNO:1的第219bp處有一個A219-T219的堿基突變，測序峰圖見圖5。2、標記性狀關聯分析在竹絲雞和星星黃雞中，死亡雞胚和正常發育雞胚的/GK及基因exon34的力mW/-RFLP基因型和等位基因頻率及其與胚胎死亡的關聯分析見表1所示。在竹絲雞中，/(7^2及基因^01134的^/^^/-1^1^多態性對雞胚胎成活沒有影響，差異不顯著；在星星黃雞中，AT基因型的相對死亡率是AA基因型的5.89倍，差異極顯著(PO.Ol)。序列表SEQIDNO:1是本發明擴增出的雞胚胎死亡相關基因/6F^ff的DNA序列；圖l:是本發明的技術流程圖圖2:是本發明克隆的/6K2/基因的部分DNA片段，即如序列表SEQIDNO:1所示(斜體字母表示外顯子、下劃線字母表示為引物及測序起始序列)。圖3:是用于PCR產物直接測序的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。瓊脂糖膠濃度為1.2%。1一3泳道為PCR產物，長度為305bp;圖中M為泳道DNA分子量標記(100bpDMladder)圖4:是雞/6KSV基因序列表SEQIDNO:1的第219bp處A219-T219的堿基多態性檢測結果。圖5:PCR產物測序的彩峰圖，黑色背景處即為多態位點。具體實施例方式實施例1雞/GF2/基因部分DNA序列的擴增及其多態性檢測1、雞/(W2fl基因部分DNA序列的擴增1.1引物設計用雞/(F2及基因GenBank的DNA序列(登錄號LOC395817)設計引物，序列信息如下正向引物5'-ggaaaggcagttgcgtaaga-3''反向引物5'-gccaaggaagtatgccaaga-3'。1.2雞基因組DNA的提取與檢測(1)將胚盤和組織樣剪碎后用PBS磷酸緩沖液(購自上海二醫新生基因科技有限公司.PH二7,2)沖洗，在8000r/min的轉速下4'C離心10分鐘，棄上清。(2)在離心沉淀中加入1XSET裂解液(SET裂解液配制10mL/L十二烷基硫酸鈉(SDS),10醒ol/LEDTA,20mmol/LTrisHClpH8.0)500uL混勻，裂解細胞'在8000r/min的轉速下4'C離心10min倒掉上清。(3)重復上一個步驟。(4)在沉淀中加入1XSET500uL和10%十二烷基硫酸鈉(即SDS，購自上海生工生物工程技術有限公司，使終濃度為0.5°/。)，再加入蛋白酶K(終濃度為50-100ug/mL)，置于55。C水浴鍋消化過夜。(5)上述消化液中加入等體積的平衡酚(pH=8.0)，緩慢顛倒離心管10min，4°C8000r/min離心10min。(6)小心吸取上層含有DNA的上清液移至另一離心管中，再次加入苯酚重復操作(5)。(7)吸取的上清液中加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1)，緩慢顛倒離心管10min，4'C8000r/min離心10min。(8)吸取上清后加入氯仿/異戊醇(體積比為24:1)，緩慢顛倒離心管10min，與以上相同的條件離心。(9)吸取上清液，加入l/10體積的3MNaAc及2倍體積的無水乙醇，轉動離心管可見白色的絮狀物，即DNA，于-2(TC放置30min。(10)取出冷凍后的樣品，于12000r/min轉速離心5-8min，去掉上層乙醇，加入70%的乙醇lmL洗滌沉淀，同樣的速度離心5-8min。(11)棄去乙醇，在室溫下揮發殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA。(12)充分溶解后的DNA樣可在含有溴化乙錠(EB)的0.8°/。瓊脂糖膠上電泳檢測，同時在通用的DNA濃度測定儀上測定濃度，于-20。C下存放備用。1.3PCR擴增進行PCR擴增反應體系(20pL)為10xBuffer2.0nL，25mMMg2+2.0jiL，4nM正向引物引物、反向引物各1.0^iL，10mMdNTP0.4(iL,2.5U爾LTaq酶O.化L，500ng/nLDNAl攀,ddH2012.2nL，離心混勻。PCR擴增程序為94。C預熱10min—(94。C變性30sec—60。C退火30sec—72。C延伸30sec)x35—72。C延伸lOmin—15。C10min。PCR反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2pcr-sscp檢測及其測序尋找snp位點2.1pcr-sscp檢測擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取4^L擴增產物中加入溴酚藍變性劑混合物(0.25%溴酚藍:變性劑=1:4)IOmL,95'C變性15min。變性結束后立即將PCR管置于冰水混合物上冰浴，防止DNA單鏈復性。然后在膠聯度為39:1的10%的聚丙烯酰胺凝膠上點樣進行電泳檢測。(1)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制(總體積為35mL)40%丙烯酰胺溶液9mL雙蒸水19mL5XTBE緩沖液(購自北京原平皓生物技術有限公司)3.5mL10。/。AP反應終止液(購自GENMEDSCIENTIFICS,INC.USA大中華區上海分公司)200(iL四甲基乙二胺(TEMED，購自北京拜爾迪生物公司)20fiL將以上溶液于小燒杯中混合搖勻。(2)上樣、電泳凝膠聚合后拔出梳子，用注射器吸取1XTBE緩沖液沖洗梳孔，以除去未聚合的膠液'使樣品容易沉降。組裝好電泳設備，用1%的瓊脂糖膠液封閉好玻璃板與電泳槽之間的縫隙，防止電泳緩沖液滲漏。在上下緩沖槽中倒入足量1XTBE電泳緩沖液，用50nL微量進樣器將PCR變性產物緩緩注入梳孔。上樣完畢后開啟電泳儀電源，在110V-120V恒壓下電泳6-8小時，直至二甲苯氰電泳指示條帶遷移到凝膠底部。(3)凝膠染色電泳完畢，取下玻板，小心地將凝膠從玻板上剝離下來，放入雙蒸水中漂洗一次，然后浸入10%乙醇溶液固定5-10min;用1%硝酸脫色3-8min，然后雙蒸水迅速漂洗一次，0.2%硝酸銀晃動閉光染膠15-25min;染色結束后用雙蒸水快速沖洗凝膠兩次(每次10s)，洗去凝膠表面殘留的硝酸銀溶液。在染膠盒中倒入含3%Na2C03和微量甲醛的顯色液，立即快速地晃動膠盒，避免析出的黑色銀顆粒在凝膠表面沉積。顯色液顏色變暗時立即更換新鮮的顯色液。注意觀察顯色情況，目的條帶顯現清晰后立刻將凝膠轉入3%的乙酸溶液，浸泡10min停顯。(4)凝膠成像與電泳條帶分析將目標條帶清晰的凝膠在BIO-RAD凝膠成像系統中進行掃描并保存電泳圖譜。根據電泳條帶判斷基因型。2.2PCR產物的純化和測序在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mLEpendorff管中，然后用PCR產物純化試劑盒(購自日本TOYOBO公司)純化PCR產物。純化方法為在1.5ml離心管中加入400nL吸附液，在凝膠完全溶解之前將其放置在室溫中，且不時進行攪拌，如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或溶膠難以溶解時，放入55'C7jK浴鍋溫浴5min，加入30^L磁珠，經常用漩渦混合器攪拌，并放置2min(室溫)，然后放入離心機(6000rpm，5sec)，加入600nL洗凈液(用上述試劑盒自帶的)，攪拌10sec,離心(6000rpm，5sec)，加入lmL75X無水乙醇，攪拌10sec，瞬時高速離心，徹底去除上清部分(打開微型試管的蓋子，55。C下放置5min，干燥)，加入25^L-100nL蒸餾水，攪拌10sec，放置2min后離心(6000rpm，5sec)，回收上清液。上清液中含有回收的目的片段。從兩個品種的樣品中分別挑選幾個DNA樣品送到上海生工生物工程技術有限公司進行測序。2.3DNA序列比對及突變位點的鑒定用測序獲得的基因序列進行序列同源性比較，用DNAstar5.01軟件SeqMan和MegAlign工具對測序峰圖進行分析，以鑒定和獲得該DNA序列的突變信息。3、PCR-RFLP診斷方法建立3.1PCR產物的擴增PCR產物的擴增如前面所述。3.2PCR產物酶切PCR產物酶切反應體積是10nL，3~5nL的PCR產物中加入2UAlwNI'10xBuffer1,0jiL'用純水補至10jiL,37。C消化4h。3.3PCR-RFLP檢測酶切產物檢測由于本試驗擴增產物片斷較小，所以都用聚丙烯酰胺凝膠進行酶切結果檢測'所用的丙烯酰胺膠聯度為29:1濃度為8%的凝膠每板膠35mL，配制方法如下(總體積為35mL):30%丙烯酰胺9.3mL雙蒸水18.42mL5XTBE:14mL腦AP:0.23mLTEMED:20uL酶切產物中加入2uL溴酚藍上樣緩沖液(購自上海亞培生物科技有限公司)后點樣電泳。凝膠的制備和染色方法同具體實施例中的2.1。實施例2:雞/(7F2/基因變異對胚胎成活產生的遺傳效應分析死亡雞胚和正常發育雞胚的/GF2及基因exon34的^/^^/-虹0>基因型和等位基因頻率及其與胚胎死亡的關聯分析如表l所示。在竹絲雞中，死亡雞胚中的A和T等位基因頻率分別為0.826和0.174，正常發育雞胚中相應兩個位點的等位基因頻率分別為0.831和0.169,兩組的基因頻率無顯著差異。在星星黃雞中，死亡雞胚中的A和T等位基因頻率分別為0.837和0.163，正常發育雞胚中相應兩個位點的等位基因頻率分別為0.962和0.038，兩組的基因頻率顯著差異(P0.05)。Logistic回歸分析顯示在竹絲雞中，/G^2及基因6乂01134的^/^^/-1^0>多態性對雞胚胎成活沒有影響，差異不顯著；在星星黃雞中，只出現了兩種基因型AT和AA，AT基因型的相對死亡率是AA基因型的5.89倍，差異極顯著(P<0.01)，在兩個品種中的試驗結果有一些差別，可能是品種的差異。表1雞IGF2R外顯子34突變基因型頻率和基因頻率及其與胚胎死亡關聯分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><110>華中農業大學<120>與雞胚胎死亡性狀相關的IGF2K基因片段克隆及作為分子標記的應用<130><141>2008-10-21〈160>1<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉306<212〉薩<213〉雞(Gallusgallus)〈220〉〈221〉gene<222>(1)..(306)<223〉<220><221>mutation〈222>(219)..(219)<223>〈220〉<221>gene<222>(l)..咖〈223〉<220>〈221〉primer—bind〈222〉(290)..(306)〈223><220〉〈221〉exon<222>(56).(289)<223><400>1ggaaaggcagttgcgta卿cttgatctsttctgttcttttctteaaaactgtagctg58Leu1tctgcateactgatggtccaaaaacgttgaatgccgg犯aactaagta106SerAlaSerLeuMetValGinLysArgMetProGluAsnVal51015犯acttt犯cttacgaggateaagtgctgaagettgtttatgaagatg154LysLeuLeuThrArglieLysCysSerLeuPheMetLysMet2025gtgatecttgtcetacagacctea犯atgaageataaaagetatttta202VallieLeuValLeuGinThrSerLysSerlieLysAlalieLeu303540getttgtttgcaagtcatgatgetggagatgacagecagcctgttttt250AlaLeuPheAlaSerHisAspAlaGlyAspAspSerGinProValPhe45505560ctgtcttttgatgagcagacatgcactagttacttctcttggcatactt299LeuSerPheAspGluGinThrCysThrSerTyrPheSer6570ccttggc30權利要求1、一種與雞胚胎死亡性狀相關的IGF2R基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根據權利要求1所述的基因片段，其特征在于序列表SEQIDNO:l的第2196bp處有一個A219-T219的堿基突變，導致J/>WV/-RFLP多態性。3、根據權利要求1所述的基因片段，其中克隆所述JGF2及，基因片段的引物對序列如SEQIDNO:l所示。4、權利要求1所述的與雞胚胎死亡性狀相關的/GF2/f基因片段在雞分子標記輔助選擇中的應用。5、一種篩選與雞胚胎死亡性狀相關的J(7F2及基因分子標記的方法，按照以下步驟-用GenBank報道的與雞胚胎死亡性狀相關的/GF2R，基因的DNA序列設計引物；從雞胚胎基因組中提取DNA，PCR擴增，PCR-RFLP，進行基因型檢測和分型。全文摘要本發明屬于家禽分子標記制備
技術領域：
，具體涉及一種與雞胚胎死亡性狀相關的IGF2R基因片段的克隆，以及作為雞遺傳標記的應用。本發明克隆得到一種與雞胚胎死亡性狀相關的IGF2R基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述，在序列表SEQIDNO1的第2196bp處有一個A219-T219的堿基突變，導致AlwNI-RFLP多態性。其制備方法是，用GenBank報道的與雞胚胎死亡性狀相關的IGF2R，基因的DNA序列設計引物；從雞胚胎基因組中提取DNA，PCR擴增，PCR-RFLP，進行基因型檢測和分型。文檔編號C12N15/11GK101386851SQ200810197308公開日2009年3月18日申請日期2008年10月21日優先權日2008年10月21日發明者吳俊靜,張淑君,翔李,李文明,楊利國,成王,勤童,趙瑞霞申請人:華中農業大學