專利名稱：：豬繁殖性狀相關基因ncoa1及其在豬標記輔助選擇中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于豬的分子標記制備
技術領域：
，涉及一種與豬繁殖性狀相關的分子標記的存在，具體地說，是涉及一種與豬繁殖性相關的如SEQIDN0:1所示的NC0A1基因，更進一步地說，是涉及檢測該基因的多核苷酸序列中的單核苷酸多態性位點的存在。
背景技術：
：豬繁殖性狀具有重要的經濟性狀，其遺傳基礎十分復雜，繁殖性狀被認為是由多基因控制的一類性狀。該性狀遺傳力極低，并且是限性性狀，所以對該性狀的改良十分有限，20世紀80年代以來，隨著分子輔助選擇和標記輔助滲入等分子育種技術，這些技術與常規育種方法相結合，大大提高了豬的育種效率。目前的研究結果表明，在豬的基因組中存在產仔數的數量性狀基因座(QTL)和主效基因，它們對決定產仔數的多少起重要作用。已經發現多個與產仔數相關的候選基因，如雌激素受體、催乳素受體、促黃體素、視黃酸受體、視黃酸結合蛋白、骨橋蛋白等基因。核受體輔激活蛋白1基因(Nuclearreceptorco-activator1gene,NC0A1)，又稱為類固醇受體輔激活蛋白1基因(SRC1)，是影響豬繁殖性狀的一個候選基因。核受體輔激活蛋白通過與結合到DNA上的核受體相互作用增強轉錄活性。受到NC0A1影響的核受體，如ESR，雄激素受體(AR)，在動物的生長發育，體內平衡，和繁殖等生理過程中起到重要作用。帶負電的DNA和帶正電的組蛋白N端有很強的相互作用，并且核小體的緊密結構通過限制轉錄因子結合到基因進而抑制DNA的轉錄。組蛋白乙酞基轉移酶的活性使輔激活蛋白可以增強核受體的轉錄活性，并可以通過為其他輔因子提供結合位點而形成穩定的起始前復合物。由此可見，NC0A1蛋白可調節與豬繁殖性狀的有關基因的轉錄，從而影響這些基因的表達。NC0A1與結合在DNA上的雌激素受體復雜的相互作用并加強其轉錄活性。NC0A1蛋白在暴露其他難接近的染色質的過程中使組蛋白乙酰化并與其他乙酰基轉移酶(P300/CBP)相互作用。因此，NC0A1蛋白增強了雌激素受體的活性，反過來也刺激特定的雌激素反應基因的轉錄并調節隨后的生理反應。國內雖有一些關于人和小鼠NC0A1基因的報道，但還沒有豬NC0A1基因與產仔數性狀的相關報道，然而有研究表明NC0A1可能是影響母豬多產性狀的候選基因，該基因定位于豬3號染色體上。人的NC0A1基因總共有183.4kb，含有22個外顯子，其cDNA長度為4721bp。
發明內容本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種豬繁殖性狀相關NC0A1基因及其在豬標記輔助選擇中的應用，為豬標記輔助選擇提供有用的分子標記。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種豬繁殖性狀相關基因NC0A1，其DNA序列如序列表SEQIDN0:1所述。所述序列表SEQIDNO1的第314bp處有一個T314—C314的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態性。上述NC0A1基因的多態性是利用比較基因組學方法根據人的NC0A1基因的保守區設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，利用限制性內切酶RsaI對PCR產物進行酶切鑒定，檢測在克隆得到的NC0A1基因片段的第314bp處是否存在T—C的突變。上述克隆及檢測NC0A1基因突變所用的引物為正向引物5‘-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘。上述豬繁殖性狀相關基因NC0A1在豬分子標記輔助選擇中的應用。利用上述制備的與豬繁殖性狀相關的分子標記可對外來豬和中國地方豬進行關聯分析的應用。本發明利用比較基因組學方法根據人的NC0A1基因的保守區設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用SSCP技術和測序技術發現SNP，并利用PCR-RFLP進行基因分型，再利用SAS軟件GLM(通用線性模型)分析SNP與繁殖性狀的關聯度。SNP發現與檢測方法建立發明人設計了擴增包含該SNP引物，該基因擴增片段有440bp，當第314bp位置是T時，則該RsaI酶切位點不存在，RsaI酶切后檢測結果只有1個片段，長度是440bp(定為等位基因A)；當存在T314—C314的轉換時，其結果導致第314bp處一個RsaI酶切位點的產生，得到2個片段，長度分別為314bp和128bp(定為等位基因8)，三種基因型4々^8、88，如圖1所述。基因型與繁殖性狀間關聯結果利用SAS軟件中的一般線性模型(GeneralLinearModel,GLM)程序對基因型與性狀進行關聯分析，具體模型如下Yijk=U+Gi+CJ+Pk+BJ+eiJko其中Yijk是性狀觀察值，i!為總體均數，Gi為基因型效應，Cj為品種效應，Pk為父本效應，B」為批次效應，為隨機誤差，假定相互獨立，服從N(0，o2)分布。本發明將為豬繁殖性狀的分子標記，為標記輔助選擇(MAS)奠定堅實的基礎，進一步闡明繁殖性狀的分子機制，將為改善豬繁殖提供理論依據，可提高養豬生產經濟效益，并指導豬的育種實踐。圖1是本發明的NC0A1基因片段的序列，314bp處的多態位點用()標出表示，下劃線部分為引物序列。圖2是本發明豬NC0A1基因PCR-RFLP-RsaI電泳圖，顯示了PCR-RFLP-Rsal的三種基因型(AA、AB、BB)的電泳結果。其中M:100bpDNAMaker;1，3為PCR擴增產物；2，4，7，10為BB基因型；5，8，11為AA基因型；6，9，12為々8基因型。圖3為PCR產物測序的彩峰圖，上為AA型，下為BB型，突變位置用箭頭表示。具體實施例方式PCR-RFLP技術檢測NC0A1基因的RsaI多態性引物設計用人NCOAl基因cDNA(GenBank收錄號NM_001130915)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數據庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為80%以上的ESTs(片段長度大于IOObp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/ffeb/Search/index.html)查詢相應序列，然后用DNASTAT程序中的ASSEMBLY程序構建豬EST-重疊群。根據EST拼接序列設計一對引物M-F和M-R，以豬的基因組DNA為模板擴增，序列如下NC0A1正向引物5'-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，(SEQIDNO:2)，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘(SEQIDNO3)。PCR擴增條件PCR反應總體積20μL，其中豬基因組DNAIOOng,含1XBuffer(Promega)、1.5mmol/LMgCl2、dNTP終濃度為1.50μmol/L、引物終濃度為0.4μmol/L、及2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是-MV3min。循環35次94°C30s,59°C30s，然后72°C20s,最后72°C延伸5min。PCR反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR-RFLP檢測條件PCR產物酶切反應體積是10μL，其中1XBuffer1μL，PCR產物35μL，限制性內切酶RsaI為0.3ML(10U)，用H2O補足10μL，將樣品混勻后離心，37°C水浴4h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照，結果如圖2所示，表明RsaI過程后存在AA、AB和BB基因型。SNP的篩查運用正向引物和反向引物分離豬基因組片段，通過在不同豬種的基因組中擴增，回收進行產物測序，發現在該基因片段的第314位堿基處有一個T—C的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態性，但不引起氨基酸的改變。結果PCR擴增產物純化后克隆測序，測序結果顯示擴增片斷全長共440bp，見圖1，序列如SEQIDNO:1所示。結果表明存在AA、AB和BB基因型，在NCOAl基因片斷的314bp處存在T—C的突變，進一步證實了PCR產物中存在多態性，見圖3。DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網立占的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數據庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。檢索結果表明所測序列與人NC0A1基因(GenBank收錄號NM_001130915)的部分序列同源性達85%。為了進一步證明該分子遺傳標記為穩定的分子標記，而非群體中存在的基因突變，本發明分析了PCR-RFLP-RsaI分子標記多態性在各豬品種中的分布情況。由下表1可知，在三個外來豬種中，長白豬、大白豬均有AA、AB、BB三種基因型；而在杜洛克豬中只檢測到AA型純合子，無AB、BB基因型。在這三個品種中，等位基因B的頻率分別為0.2333,0.1719,0,A等位基因的頻率分別為0.7667,0.8281、1，由以上結果可看出等位基因B在這三個外來豬種中的頻率較低，而A等位基因的頻率都有較高分布，同理，在這三個品種中基因型頻率最高，BB基因型頻率最低。杜洛克豬群的基因型分布有一個特殊的現象，只檢測到AA—種基因型，等位基因B的頻率為0，這與大白豬和長白豬的基因型分布差異極顯著(P<0.01)。總之，除杜洛克豬外，RsaI酶切位點存在多態現象，均存在三種基因型AA、AB、BB。三個豬種之間基因型分布差異極為顯著(P<0.01)，長白與大白之間基因型分布存在顯著差異(P<0.05)，杜洛克與大白、長白之間基因型分布差異極為顯著(P<0.01)。經卡方檢驗，杜洛克、長白豬、大白豬的基因型分布均符合哈代-溫伯格平衡定律。并且整個正虹豬群的基因型分布符合哈代-溫伯格平衡定律(x2(a(l5,2)=5.59)。表1不同品種NCOAl基因T312C位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發明的分子標記在豬繁殖性狀標記性狀關聯分析中的應用本發明所用樣本全部來自正虹種豬場，涉及3個純種(大白、長白和杜洛克)共454個樣品，其中長白母豬(Landrace，L)224頭；大白母豬(LargeWhiet，W)105頭；杜洛克母豬(DurOC，D)125頭。繁殖性狀記錄包括每頭母豬的各胎次總產仔數和產活仔數。大白、長白兩品種NCOAl各基因型頭胎與經產胎的總產仔數、產活仔數均數及標準差，統計結果列于表2。表2NC0A1基因型母豬的平均仔數比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注各列中肩標相同者表示差異不顯著，肩標不同字母的表示差異顯著。由下表3表明，母豬胎次對其產仔數有顯著影響，頭胎總產仔數、產活仔數均低于經產胎，如大白豬AA型頭胎平均總產仔數為10.16，而經產胎為12.33，經產胎比頭胎高2.17頭(P<0.01)。對頭胎總產仔數和產活仔數的分析表明大白豬AA基因型比BB基因型的總產仔數和產活仔數分別高1.66頭和1.37頭，差異達到顯著水平(P<0.05)；而在長白豬群中，頭胎產仔數和產活仔數在各基因型之間的差異不顯著(P>0.05)。對經產胎次總產仔數和產活仔數的分析則表明大白豬AA基因型比AB、BB基因型的總產仔數和產活仔數分別高2.66頭和2.71頭，差異達到極顯著水平(P<0.01)；長白豬AA基因型比BB基因型的總產仔數和產活仔數分別高2.42頭和2.07頭，差異達到極顯著水平(P<0.01)。總之，胎次對產仔性狀有顯著影響，經產胎次產仔數顯著高于頭胎；并且他們在總產仔數還是產活仔數上都有上有按AA、AB、BB遞減的趨勢，AA型的產仔數和產活仔數均高于AB和BB型。表3NC0A1各基因型初產與經產母豬的產仔數比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注各列中肩標字母相同者表示差異不顯著，肩標字母不相同者表示差異顯著。權利要求一種豬繁殖性狀相關基因NCOA1，其DNA序列如序列表SEQIDNO1所述。2.根據權利要求1所述的豬繁殖性狀相關基因NC0A1，其特征在于所述序列表SEQIDNO1的第314bp處有一個T314—C314的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態性。3.根據權利要求2所述的豬繁殖性狀相關基因NC0A1，其特征在于所述NC0A1基因的多態性是利用比較基因組學方法根據人的NC0A1基因的保守區設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，利用限制性內切酶RsaI對PCR產物進行酶切鑒定，檢測在克隆得到的NC0A1基因片段的第314bp處是否存在T—C的突變。4.根據權利要求3所述的豬繁殖性狀相關基因NC0A1，其特征在于所述克隆及檢測NC0A1基因突變所用的引物為正向引物5‘-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘。5.根據權利要求1-5中任一項所述的豬繁殖性狀相關基因NC0A1在豬分子標記輔助選擇中的應用。全文摘要一種豬繁殖性狀相關基因NCOA1及其在豬標記輔助選擇中的應用，測定出作為豬標記輔助選擇應用與豬繁殖性狀相關的分子標記，該分子標記由NCOA1基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNo1所述，該序列全長440bp，在序列的第314bp處有一個T314→C314的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態性。本發明還公開了擴增NCOA1基因DNA序列所用的引物以及用于多態性的檢測方法。本發明為豬繁殖性狀標記輔助選擇提供了新的分子標記。文檔編號C12Q1/68GK101824417SQ201010169799公開日2010年9月8日申請日期2010年5月12日優先權日2010年5月12日發明者伍小松,李永輝,柳小春,蔣雋,馬海明申請人:湖南農業大學