專利名稱：新穎的縮肽化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及對人體癌細胞具有細胞毒作用和TGF-β樣作用的醫藥，特別涉及可作為抗腫瘤藥使用的新穎化合物或其制藥學上允許的鹽及以該化合物為有效組分的醫藥組合物。
背景技術：
已知來源于微生物代謝產物的化合物絲裂霉素C、博來霉素或阿霉素等對人體癌細胞具有細胞毒作用，這些化合物一直作為抗腫瘤藥用于臨床。此外，還揭示了縮肽化合物作為抗腫瘤藥使用(歐洲專利公開公報第352646號)。
目前，正進行具有以往所沒有的化學結構和新穎骨架的抗腫瘤藥的研制。
另一方面，著眼于TGF-β作為促進細胞增殖和轉化的因子已開始對其機理進行研究，但現在僅明確TGF-β能夠阻礙各種動物細胞的繁殖(Cell，第63卷，245-247頁，1990年)。此外，還有許多與腫瘤細胞有關的報道(Br.Med.J.，第296卷1621-1624頁，1988年；Br.J.Cancer，第61卷612-617頁，1990年；Br.J.Cancer，第69卷1006-1009頁，1994年；J.Cell Physiol.，第172卷1-11頁，1997年；Growth-Factors.，第7卷207-213頁，1992年；J.Biol.Chem.，第272卷3967-3972頁，1997年；Nature，第360卷361-364頁，1992年)。此外，還有TGF-β受體作為各種腫瘤的腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)的報道(International J.Hematology，第65卷97-104頁，1997年)。因此，具有TGF-β樣作用的化合物可能作為與該作用有關的疾病的治療藥，例如，作為抗腫瘤藥。
發明的揭示本發明的目的是提供對人體癌細胞具有細胞毒作用和TGF-β樣作用的可作為抗腫瘤藥使用的新穎化合物及含有該化合物的醫藥。
本發明者們對天然存在的多種微生物產生的化合物進行研究后，在屬于假單胞菌屬的新微生物中發現了可產生對人體癌細胞具有良好細胞毒作用及TGF-β樣作用的化合物的微生物。此外，本發明者們對該微生物進行培養后發現，和上述公知的縮肽化合物(歐洲專利公開公報第352646號)相比，該培養物能夠分離出化學結構完全不同的下列新穎的縮肽化合物，即3位上具有羥基、4位上具有R基(R基為選自異丙基、仲丁基或異丁基的任1種基團)、8位上具有甲基，從而完成了本發明。
即，本發明涉及以下通式(1) 表示的縮肽化合物或其制藥學上允許的鹽。式中，R表示異丙基、仲丁基或異丁基。本發明還涉及以上述縮肽化合物或其制藥學上允許的鹽為有效成分的醫藥組合物，更具體涉及作為抗腫瘤藥的醫藥組合物。
以下，對本發明進行詳細說明。在營養培養基中培養屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的可產生上述化合物的產生菌，然后通過常規方法從蓄積了上述化合物的培養液中獲得本發明的縮肽化合物或其制藥學上允許的鹽。在上述化合物的制備方法中所用的微生物只要是屬于假單胞菌的可產生上述化合物的微生物即可。這類微生物包括從日本長野縣北佐久郡望月町采集到的土壤中分離出的屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)的Q71576菌株。本菌株的細菌學性狀如下所述。
1)形態本菌株為革蘭氏陰性桿菌，因極生鞭毛而具有游動性。細胞的大小為0.7～0.9μm×1.0～1.4μm。未見胞子形成。
2)培養情況在肉汁瓊脂培養基中形成淡茶色的菌落。該菌落為圓形，其表面光滑。在進行肉汁液體培養時，培養基表面形成了皮膜，整個培養基是混濁的。在肉汁明膠穿刺培養時，明膠液化。在石蕊牛乳中培養時，培養1周后，未出現凝固和胨化現象。
3)生理學性質表1Q71576株的生理性質(1)
表2Q71576株的生理性質(2)
表3Q71576株的生理性質(3)
總結以上微生物學性質可知，本菌株為革蘭氏陰性好氧桿菌，具有游動性。其培養溫度范圍為3～32℃，氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、明膠的液化反應、檸檬酸的利用、無機氮源的利用、精氨酸分解反應都呈陽性。L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖可產生酸，OF試驗的結果為氧化型。另外，硫化氫的生成、吲哚的生成、VP試驗、硝酸鹽的還原和脫氮反應的結果都為陰性。
根據上述性質，檢索Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，1989及其他文獻后可判定本菌株是屬于假單胞菌(Pseudomonas)屬的細菌，命名為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)Q71576菌株。此外，本菌株作為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)Q71576菌株，以FERM BP-6944號(保藏日1999年1月8曰)保藏于工業技術院生命工程技術研究所(日本國茨城縣っくば市東1丁目1番3號(郵編305-8566))內。此外，由于微生物容易發生人工或自然變異，所以，本發明所用的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)Q71576菌株除了天然分離出的微生物之外，還包括通過紫外線、X射線和化學試劑等人工變異而獲得的菌株及他們的天然變異菌株。
(制備方法)對屬于假單胞菌屬的能夠產生本發明化合物的微生物進行培養，就可獲得本發明的化合物。培養時可采用普通微生物培養方法。
培養時所用的培養基只要為含有假單胞細菌屬Q71576菌株能利用的營養源的培養基即可，包括合成培養基、半合成培養基或天然培養基。在培養基中添加的是公知營養物質。培養基的組成是，碳源為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、肌醇、D-甘露糖醇、D-半乳糖、海藻糖、黃嘌呤、淀粉、葡萄糖、糊精、甘油、植物油等；氮源為肉膏、胨、麥麩粉、棉籽餅、大豆粉、花生粉、魚粉、玉米漿、干酵母、酵母浸膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、尿酸及其他有機和無機碳源。此外，還可根據需要添加金屬鹽，例如，鈉、鉀、鎂、鈣、鋅、鐵、鈷等的硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽等。另外，根據需要還可添加甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫代硫酸鹽、油酸甲酯、豬油、硅油、表面活性劑等生成促進化合物或消泡劑。
培養一般在好氧條件下進行。培養溫度為3～32℃(參考上述生理學性質)，較好為20～25℃。培養基的pH一般約為4.5～9，較好約為5～7.5，這樣能夠獲得較理想的結果。培養時間可根據培養基的組成和溫度條件適當設定，一般為1～7天左右，較好為2～4天左右。
從培養物中分離出本發明化合物時，可采用對微生物產生的代謝產物常用的萃取和精制方法。例如，直接或通過離心分離或在培養物中添加過濾助劑過濾而獲得的培養液中添加不與水混溶的乙酸乙酯等有機溶劑再萃取培養物中的該化合物。此外，也可使培養液和適當的載體接觸，使濾液中的化合物被吸附，然后用適當的溶劑進行洗脫處理而萃取出該化合物。例如，使培養液和阿姆伯拉特離子交換樹脂XAD-2、迪阿翁離子交換樹脂HP-20、迪阿翁離子交換樹脂CHP-20或迪阿翁離子交換樹脂SP-900等多孔性吸附樹脂接觸而吸附該化合物，然后用選自甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙腈或氯仿等的1種或多種有機溶劑，或上述溶劑和水的混合液使該化合物洗脫。此時有機溶劑的混合比例階段性地或連續地由低濃度向高濃度上升，這樣就能夠獲得該化合物包含比例更高的流分。用乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑進行萃取時，在培養濾液中加入這些溶劑，充分振蕩后，就可萃取出該化合物。然后，通過使用了硅膠、ODS等的柱色譜法，離心液液分配色譜法，使用了ODS的高速液相色譜法(HPLC)等常規方法，進一步對通過上述各操作法而獲得的含有該化合物的部分進行分離精制。
另外，也可以TGF-β樣作用為指標，通過利用對適當溶劑的溶解性及溶解度的差異等一般生理活性化合物的制備用手段，進行分離和精制。根據需要這些方法可單獨使用，也可按照任意順序組合使用或反復使用。
本發明的縮肽化合物的制藥學上允許的鹽包括和無機或有機堿形成的鹽，較好為制藥學上允許的鹽。這些鹽具體包括和鈉、鉀、鎂、鈣、鋁等無機堿，甲胺、乙胺、乙醇胺等有機堿，賴氨酸和鳥氨酸等堿性氨基酸形成的鹽等。
此外，由于本發明化合物具有手性碳原子及雙鍵，所以，存在立體異構體(外消旋體、旋光異構體和非對映立體異構體等)及幾何異構體(順式體或反式體)。因此，本發明化合物還包括這些立體異構體或幾何異構體的混合物或分離物。
此外，本發明還包括該化合物的水合物或各種溶劑合物，或該化合物的多晶型物質。
以下，對本發明化合物的制劑法和給藥方法進行詳細說明。
混合以1種或2種以上本發明的縮肽化合物及其制藥學上允許的鹽為有效成分的醫藥組合物，使用常用于制劑的藥用載體，賦形劑和其他添加劑，就可調制出片劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏和貼附劑等，這些藥物可通過經口給藥方式或非經口給藥方式給藥。
本發明化合物對人的臨床給藥量可根據患者的癥狀、體重、年齡和性別等適當決定。
本發明的經口給藥的固體組合物包括片劑、散劑和顆粒劑等。這種固體組合物中將至少1種活性物質，與至少1種惰性稀釋劑，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸鋁鎂相混合。按照常規方法，組合物中還可包含惰性稀釋劑以外的添加劑，例如，硬脂酸鎂等潤滑劑，纖維素乙醇酸鈣等崩解劑，乳糖等穩定劑及助溶劑。根據需要，片劑或丸劑可被蔗糖、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯等形成的糖衣，或胃溶性及腸溶性化合物薄膜包衣。
經口給藥的液體組合物包括藥劑學上允許的乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑和酏劑等。常用惰性稀釋劑包括精制水和乙醇。這種組合物除了惰性稀釋劑之外，其中還可包含助溶劑、潤濕劑和懸浮劑等助劑，甜味劑、矯味劑、芳香劑和防腐劑。
非經口給藥的注射劑包括無菌的水性或非水性溶液劑，懸浮劑和乳劑。水性溶液劑、懸浮劑的稀釋劑包括注射用蒸餾水及生理鹽水。非水性溶液劑、懸浮劑的稀釋劑包括丙二醇、聚乙二醇和橄欖油等植物油，乙醇等醇類，吐溫80(商品名)等。這類組合物中還可包含等滲劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩定劑(例如，乳糖)和助溶劑等添加劑。使這些組合物通過除菌過濾器，配合使用殺菌劑或光照就可使它們無菌化。也可將它們制成無菌的固體組合物，在使用前用無菌水或無菌注射用溶劑溶解就可使用。
當本發明化合物的溶解性較低時，還可進行增溶化處理。增溶化處理是指利用適合醫藥制劑的公知方法，例如，添加表面活性劑(聚氧乙烯硬化蓖麻油類，聚氧乙烯山梨糖醇酐高級脂肪酸酯類，聚氧乙烯聚丙二醇類，蔗糖脂肪酸酯類)的方法；形成藥物和高分子(羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)等水溶性高分子，羧甲基乙基纖維素(CMEC)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物(Eudragit L，S，商品名，Rhm and Hüls公司制)等腸溶性高分子)等增溶劑的固體分散體的方法。根據需要，還可采用形成可溶性鹽的方法，利用環糊精等形成包合化合物的方法等。增溶化方法可根據目的藥物作適當改變[參考《最新制劑技術及其應用I》內海勇等，醫藥雜志157-159(1983)及《藥學專論No.1，生物學的利用度》永井恒司等，Soft Science株式會社，78-82(1988)]。
實施發明的最佳狀態以下，通過實施例對本發明進行具體說明，但本發明并不僅限于此。
實施例1將包含10g葡萄糖、20g馬鈴薯淀粉、5g細菌培養基用胨、5g酵母浸膏、4g碳酸鈣和1L蒸餾水的培養基(pH7.0)分注入500mL的三角燒瓶中，每個100mL，于120℃進行20分鐘的滅菌處理。然后刮取經過貝內特瓊脂培養基的良好培養的假單胞菌屬Q71576菌株，在其中接種，在28℃的溫度下，以200轉/分鐘的速度振蕩培養3天，獲得種子培養液。接著，將包含30g甘油、1g葡萄糖、5g細菌培養基用胨、5g肉膏、5gNaCl、0.5g消泡劑(NKL5430)和1L蒸餾水的培養基(pH7.0)分注入500mL三角燒瓶中，每個100mL，于120℃進行20分鐘的滅菌處理。在該培養基中接種前述種子培養液，每個2mL，在28℃的溫度下，以200轉/分鐘的速度振蕩培養3天。
以6000rpm對2.5L通過以上培養獲得的培養液進行10分鐘的離心分離，用乙酸乙酯萃取上清液后，添加硫酸鈉脫水，在減壓下濃縮至干。將油狀粗萃取物進行硅膠柱色譜分析(30i.d.×200mm)，用氯仿-甲醇(20∶1)洗凈后，用氯仿-甲醇(5∶1)洗脫，濃縮活性流分。然后，將其進行葡聚糖凝膠LH-20柱色譜分離(20i.d.×500mm)，用氯仿-甲醇(1∶1)進行凝膠過濾，濃縮活性流分后，進行CPC(centrifugal partition chromatography)，用上升法通過氯仿-甲醇-水(5∶6∶4)的溶劑系統除去雜質。最后將活性流分濃縮至干后，將其溶于甲醇，再用センシ，-科學株式會社制PEGASIL ODS柱(20i.d.×250mm)，用35％的乙腈水溶液進行反相HPLC(流速10mL/分鐘)。其結果是，確認在10.8分鐘時有化合物A峰，在15.4分鐘時有化合物B，分取各峰，獲得化合物A及B的白色粉末各10mg。
實施例2將包含10g葡萄糖、20g馬鈴薯淀粉、5g細菌培養基用胨、5g酵母浸膏、4g碳酸鈣和1L蒸餾水的培養基(pH7.0)分注入500mL的三角燒瓶中，每個100mL，于120℃進行20分鐘的滅菌處理。然后刮取經過貝內特瓊脂培養基的良好培養的假單胞菌屬Q71576菌株在其中接種，在28℃的溫度下，以200轉/分鐘的速度振蕩培養3天。將400mL同樣的培養基分注入2L的三角燒瓶中，于120℃進行20分鐘的滅菌處理后，在其中接種8mL前述培養液，于28℃，以200轉/分鐘的條件振蕩培養3天，獲得種子培養液。然后，將包含30g甘露糖醇、5g細菌培養基用胨、5g肉膏、5gNaCl和1L自來水的培養基(pH7.0)分注入30L發酵罐中，每個18L，于120℃進行20分鐘的滅菌處理后，在該培養基中接種前述種子培養液，每個360mL，在24℃的溫度下，以150轉/分鐘的速度，在1vvm下培養64小時。
在填充HP-20的柱子中通過經夏普勒斯離心機分離除去菌體的培養液50L，用水、20％丙酮水溶液和40％甲醇水溶液洗凈后，用80％的丙酮水溶液洗脫。濃縮所得流分，用氯仿、乙酸乙酯對所得水溶液進行萃取，混合各萃取物濃縮后，裝入填充有硅膠的柱子中。用氯仿-甲醇(50∶1)(20∶1)(10∶1)洗脫后，混合氯仿-甲醇(20∶1)及(10∶1)的部分洗脫流分，濃縮后，用乙醇溶解，并重結晶，獲得包含化合物A、B及C的混合物的白色粉末776mg。用ODS-HPLC柱(cosmosil AR-II 20i.d.×250mm)對所得粉末進行處理，獲得化合物C的洗脫流分，即獲得20mg化合物C的白色粉末。
本發明化合物的物理化學性質用上述方法萃取、精制和分離出的化合物A、B和C顯現以下物理化學性質。
表4化合物A、B和C的物理化學性質
N.T.未試驗化合物A、B和C的1H及13C NMR的化學位移值(氘代氯仿中)分別如下所示。
表5化合物A的1H及13C NMR的化學位移值(氘代氯仿中)
表中編號(No.)表示以下化合物A的化學結構式中的碳原子位置表6化合物B的1H及13C NMR的化學位移值(氘代氯仿中)
表中編號(No.)表示以下化合物B的化學結構式中的碳原子位置表7化合物C的1H及13C NMR的化學位移值(氘代氮仿中)
表中編號(No.)表示以下化合物C的化學結構式中的碳原子位置具備上述物理化學性質的化合物A、B和C的化學結構式如下所示。
化合物A 化合物B 化合物C
產業上利用的可能性由于本發明化合物對人體癌細胞具有細胞毒作用及TGF-β樣作用，所以，可作為抗腫瘤藥使用，例如，作為大腸癌、肺癌、前列腺癌或宮頸癌等的治療藥物是有效的。
本發明化合物對人體癌細胞的細胞毒作用及TGF-β樣作用可通過以下方法確認。
對人體癌細胞的細胞毒作用的測定法(1)在96孔板中注入調制成6×104個/mL的HeLa S3細胞200μL及4μL各種濃度的化合物A和化合物B，在CO2培養箱中于37℃培養3天。培養結束后，用Cell Counting Kit(DOJINDO制)測定細胞增殖程度，求出各濃度的增殖抑制率，算出IC50值。其結果是，化合物A及化合物B對HeLa S3細胞的IC50值分別為1.6μM和1.2μM，顯現出細胞毒作用。
對人體癌細胞的細胞毒作用的測定法(2)在96孔板中注入調制成6×104個/mL的人大腸癌WiDr細胞、調制成4×104個/mL的人非小細胞肺癌A549細胞或調制成6×104個/mL的人前列腺癌DU-145細胞，在CO2培養箱中于37℃進行培養。24小時后，添加100μL各種濃度的化合物A、化合物B或化合物C，再在CO2培養箱中于37℃培養72小時。培養后，利用Sulforhodamine(スルフォロ-ダミン)B測定細胞數，算出對細胞增殖的各化合物的IC50值。其結果是，化合物A、B及C對WiDr細胞、A549細胞或DU-145細胞等各種不同的細胞都顯現出良好的細胞增殖抑制活性。由于細胞種類不同所以抑制活性不同，例如，對A549細胞顯現出IC50值為5.OnM以下的活性。
TGF-β樣作用的測定法為了檢測TGF-β樣活性，構建了利用報道基因的表達的篩選系統。在過量表達TGF-β受體，會引起由TGF-β引起的纖維蛋白溶酶原活性化因子-1(PAI-1)表達的水貂肺上皮細胞(MvlLu)(Journal of Biologicai Chemistry第262卷17467-17414頁，1987年)的PAI-1啟動子基因的下游轉染熒光素酶基因(Analytical Biochemistry第216卷276-284頁，1994年)。
采用上述細胞，添加化合物時獲得的熒光強度即為TGF-β樣活性的指標。其結果是，TGF-β因PAI-1啟動子基因表達的誘導作用而使其熒光強度有所增加。同樣，化合物A的濃度為26nM～100μM、化合物B的濃度為12nM～100μM時，熒光強度也有所增加。
權利要求
1.縮肽化合物或其制藥學上允許的鹽，其特征在于，由以下通式 表示，式中，R表示異丙基、仲丁基或異丁基。
2.醫藥組合物，其特征在于，以權利要求1所述的縮肽化合物或其制藥學上允許的鹽為有效成分。
3.如權利要求2所述的醫藥組合物，其特征還在于，所述醫藥組合物是一種抗腫瘤藥。
全文摘要
本發明涉及對人體癌細胞具有細胞毒作用和TGF-β樣作用,可作為抗腫瘤藥的新穎化合物,以及含有該化合物的醫藥組合物。
文檔編號C12P21/04GK1335852SQ00802510
公開日2002年2月13日 申請日期2000年1月12日 優先權日1999年1月13日
發明者永井浩二, 荒尾央子, 上桐和磨, 早田錦矢, 森政道, 新堂信昭, 瀨戶治男, 新家一男 申請人:山之內制藥株式會社