專利名稱：預防病原性細菌引起的腹瀉的新雙歧桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及雙歧桿菌屬的新的微生物，它能夠預防病原性細菌引起的腹瀉。特別是，本發明涉及所說的微生物在可吸收的載體的制備方面的使用和含有這種微生物的組合物。
很久以來，產生乳酸作為主要代謝組合物的微生物就為人們所知。在牛奶或牛奶處理工廠中，活著或腐爛的植物中也可在人和動物的腸子中發現這些細菌。這些微生物概述為“乳酸細菌”，其代表了一組相當不同類的細菌包括乳球菌(Lactococcus)、乳菌(Lactobacillus)，鏈球菌(Streptococcus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、片球菌(Pediococcus)等。
乳酸細菌作為低pH值條件下保存食物的發酵劑使用，發酵產物的作用抑制有害細菌的生長。另外，乳酸細菌也用于制備不同的乳制品例如奶酪、酸奶酪和其他發酵的乳制品。
近期，乳酸細菌的一些菌株顯示出對人和動物的吸收頗有價值的性質，引起了人們的密切關注。特別是，特殊的乳酸菌或雙歧桿菌的菌株被發現能夠在腸內膜繁殖。它們暫時性或長期的保持在腸胃中被認為對于人類的健康具有巨大的正面的作用。
在這方面，EP0768375公開了雙歧桿菌的特異性菌株，這種菌株能夠灌輸進入腸內并且粘附在腸細胞上。報道說這些雙歧桿細菌有助于免疫功能，能夠競爭性排除病原性細菌對腸內細胞的粘附，有助于維持生物個體的健康。
在最近幾年科研集中在乳酸細菌作為益生菌試劑的潛在應用。益生菌被認為是能通過保持腸內自然微生物區系促進生物個體健康的可生長的微生物制品。微生物制品通常被認為是益生菌也就是這種有效的微生物并且人們已經知道了它們作用的模式。益生菌貼附在腸粘膜上，在腸道內生長并且防止有害微生物在其上粘附。對于它們在腸內發揮作用的至關重要的先決條件是它們必須以一種適當的能存活的方式粘附到內臟的粘膜上而且在胃腸上部不被消滅，特別是不受胃內低pH區域的影響。
在這方面，作為這樣的一種益生菌，WO97/00078公開了一種特異性菌株，稱為乳酸菌GG(ATCC53103)。在防止或治療食物誘發的過敏反應的方法中特定使用這種微生物，也就是將其和已經經過用胃蛋白酶和/或胰酶一起進行水解處理的食品材料一起給藥于受體。所選擇的乳酸菌菌株顯示了粘附和建群性能及蛋白酶體系，以至于含在將被給藥的食物中的蛋白質通過被這種特殊的乳酸菌分泌的蛋白酶進一步水解。這份文件所討論的方法最終導致蛋白質被內臟消化，沒有顯示出存在任何引起過敏的物質。
更進一步，在EP 0 577 903參考資料中采用了這種乳酸菌，它具有取代幽門螺桿菌的能力，幽門螺桿菌公認是引起潰瘍的原因，上述制備可以治療和預防幽門螺桿菌引起的潰瘍。
乳酸菌特定的菌株可以提供有價值的特性，技術人員期望發現另外的細菌菌株能夠有益于人類和/或動物的健康。
因此，本發明的問題是提供另外的乳酸菌菌株，它能表現出對人和/或動物例如寵物有益的新性質。
通過提供新的屬于雙歧桿菌屬的新的微生物得到了解決，這些新的微生物具有防止病原性細菌移植腸胃引起腹瀉的能力且用它們制備可吸收的載體物質。
這種雙歧桿菌是從由長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)CNCMI-2169和CNCMI-2170組成的組中選擇。
本發明的微生物顯示有如下特性它們是革蘭氏陽性，過氧化氫酶試驗陰性和CO2生產陰性，它們生產L(+)乳酸和可以基本上防止引起腹瀉的細菌諸如致病的大腸桿菌、例如致腸病的E大腸桿菌(EPEC)、或沙門氏例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)在腸胃細胞上建群。
新的微生物可以用于制備一種可吸收的載體物質，例如奶、酸奶酪、凝乳、奶基發酵產品、發酵谷類產品、奶粉(milk based powders)、嬰兒食品或寵物食品，也可以大約105cfu/g到1011cfu/g的量包含在載體中。本發明采用的縮寫cfu的意思是“菌落形成單位”，定義為瓊脂板上的微生物計數器所表示的細菌細胞的數目。
本發明也提供一種食品或藥物組合物，含有至少一種雙歧桿菌菌株，和/或含有一種其中生長有微生物的上清液，或其活性部分。在此方面，細菌上清液也顯示具有抗病的活性。
為了制備本發明的食物組合物，至少一種雙裂菌菌株被加到在合適的載體中，其含量為大約105cfu/g到1012cfu/g，優選含量為大約106cfu/g到1010cfu/g，更優選含量為大約107cfu/g到109cfu/g。
藥品可以以片劑、液體細菌懸浮液、干的口服補充劑、濕的口服補充劑(oralsupplements)、干的管飼或濕的管飼等等的形式制備，所用的雙歧桿菌的含量高達1012cfu/g，優選大約107cfu/g到1011cfu/g，更優選107cfu/g到1010cfu/g。
微生物在生物體腸內的活性當然取決于劑量。也就是分別通過上述食品或藥物組合物攝入的微生物越多，保護和/或治療的作用越高。由于所用的微生物對于人類或動物無害，實際上是從自然環境中分離出來的，也就是從嬰兒的糞中分離出來的，加入的量高，生物體腸內新微生物建群的比例也就高。
根據另一個實施方案，本發明的雙歧桿菌培養基的上清液或活性部分，可以用于制備可吸收的載體。這些上清液可以這樣使用或在不毀滅被這些微生物分泌的代謝化合物的條件下干燥例如冷凍干燥加入液體介質，也可以包容在載體中。為了最大程度的減少上清液中未知化合物的數量，雙歧桿菌優選在指定的培養基中培養，培養基的組合物是已知的并且對于宿主沒有負的影響。而且熟練的操作人員根據一般的常識將從上清液分離未知的產物，例如采用色譜方法。
在這些圖中
圖1表示細胞系CNCMI-2169(稱為B128/Cal)和長雙歧桿菌CNCMI-2170(稱為BL29/F9)粘附在培養基中人類腸細胞的能力。
圖2表示病原細菌對于長雙歧桿菌CNCMI-2170(稱為BL29/F9)的病原敏感性。
圖3表示病原細菌對于長雙歧桿菌CNCMI-2169(稱為B128/Cal)的病原敏感性。
圖4表示細胞系B128/cAL和BL29/F9對于鼠沙門氏菌SL1344感染Caco-2細胞的活性。
圖5表示鼠沙門氏菌SL1344感染的小鼠和用雙歧桿菌BL29/F9處理的小鼠的存活率。
在進行本發明的廣泛研究中，發明人調查了嬰兒糞便并分離了不同的細菌菌株。隨后檢驗了這些菌株防止引起腹瀉的細菌在上皮細胞的建群和/或侵入，引起腹瀉的細菌諸如大腸桿菌(E.coli)、志賀氏菌(Sigella)，克雷伯氏桿菌(Klebsiella)，耶爾森氏菌(Yersinia)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、賴文氏菌(Listeria)、鏈球菌(Streptococcus)，Staphilococcus，難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)，幽門螺桿菌(H.pyori)以及白色假絲酵母(Candidaalbicans)。
依據對腹瀉的抑制性，包含雙歧桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬在內的幾種細菌被篩選。采用病原微生物例如大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、耶爾森氏桿菌、銅綠假單胞菌、幽門螺桿菌和鼠沙門氏菌作為感染生物個體引起腹瀉的病原微生物進行抑制性能試驗。
各種細菌在適當的培養基中生長，例如在它們適宜的MRS、Hugo-Jago或M17培養基中，最佳的生長溫度30到40℃生長。在這些細菌穩定生長后采用離心分離和在生理鹽水溶液中重新懸浮收集這些細菌。在這些不同試驗之間這些細菌細胞被冷凍儲存(-20C)。
選擇下列方法評估抗菌的性能。
按照一個方案檢驗了本發明培養的雙歧桿菌減少不同病原性微生物存活能力的性能。為此，病原細菌培養物和濃縮雙歧桿菌培養物的上清液相接觸并檢驗病原細菌的生長勢。
按照第二個方案檢驗了本發明雙歧桿菌在腸的細胞模型培養物T84細胞上的粘附能力。為此，雙歧桿菌和T84細胞一起培養并檢驗粘附率。
按照另一個方案檢測了本發明的雙歧桿菌防止腸細胞沙門氏菌感染的能力，采用了細胞系Caco-2作為腸的模型。在這方面，本發明的雙歧桿菌細胞培養物上清液和病原微生物一起加入腸細胞并分別檢驗粘附或侵入率。
培養的雙歧桿菌和上清液證明具有極大的防止粘附和侵入腸細胞的作用，表明新微生物分泌的代謝化合物具有抗腹瀉能力。
本發明將舉例說明。并不局限于這些例子。
培養基和溶液MRS(Difco)Hugo-Jago(胰蛋白胨30g/l(Difco)，酵母提取物10g/l(Difco)，乳糖5g/l(Difco)，KH2PO46g/l，牛肉汁2g/l(Difco)，瓊脂2g/l(Difco)
M17(Difco)密集的西紅柿瓊脂(罐裝西紅柿汁400ml，密集的瓊脂(Eugon agar)BBL45.5g，麥芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，瓊脂(Difco)5g，蒸餾水600ml)DMEM(Dulbecco`s modified eagle medium)CFA(根據Ghosh等等，Journal of Clinical Microbiology，1993 31 2163-6)Muller Hinton瓊脂(Oxoid)LB(Luria Bertami，Maniatis，實驗室手冊，冷泉港，1992)C14-醋酸鹽(53，4Ci/mMol，Amersham International PLC)PBS(NaCl8/l，KCl0.2g/l，nAhpo4 1.15g/l，kh2po4 0.2g/l)胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)FCS胎牛血清(Gibco)從西雅圖華盛頓大學獲得大腸桿菌DAEC C 1845，從美國馬里蘭大學疫苗發展中心獲得E大腸桿菌JPN15。
從美國加利福尼亞斯坦福大學微生物系獲得鼠沙門氏菌株SL1344。這種菌株作為病員細菌作用在小鼠上，這種細菌抗鏈球菌。它粘附在Cac)-2結腸細胞(Finlay和Falkow，1990)。
從法國Faculte de Pharmacie Paris XI Chatenay-Malabry，微生物實驗室獲得的庫存臨床分離物獲得克雷伯氏桿菌.
從INSERM Unit411，Hpital Necker，Paris，France，獲得耶爾森氏桿菌。
從Faculte de Pharmacie Paris XI，Chatenay-Malabry，France的微生物實驗室的庫存臨床分離物獲得銅綠假單胞菌。
從Institute of Microbiology，Lausanne University，Lausanne Switzerland獲得幽門螺桿菌。
實施例1雙歧桿菌的分離從15到27天大的健康嬰兒的尿布收集新鮮的糞便。1克新鮮糞便在無氧的條件下送到實驗室，并且在從取樣開始的兩小時內用Ringer溶液系列稀釋，并涂在選擇性培養基上進行微生物分析。密集的西紅柿瓊脂(罐裝西紅柿汁400ml，密集的瓊脂BBL45.5g，麥芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，瓊脂(Difco)5g，蒸餾水600ml)37℃下培養48小時用于分離雙歧桿菌。隨機采集菌落并提純。對于分離株進行生理學和遺傳學表征。
實施例2培養細胞系Caco-2細胞細胞系Caco-2作為小腸的成熟的腸細胞模型，用于抑制作用的檢驗。這種細胞具有腸細胞特征例如極化、腸酶表達、特定結構多肽的制備等等。這些細胞在不同的載體上生長，也就是在塑料盤(25cm2Corning)用于生長和繁殖，在脫脂和滅菌6well玻璃皿(22×22mm，cornning)用于粘附和抑制試驗。在培養第二天后按照日常規則改變培養基(DMEM)。在使用之前，用100U/ml的青霉素/鏈霉素，1μm氨芐青霉素，56℃30分鐘滅活的20％FC和含有非必需氨基酸溶液1％(10Mm)(Eurobio，Paris，France)補充培養基。在90％的空氣和10％的CO2組成的大氣中37℃下培養。這些細胞每六天分離一次。這些細胞在PBS中pH7.2條件下用0.015％胰酶和3mM EDTA進行處理。為了中和胰酶的作用，等體積的含有FCS的培養基加入獲得的細胞懸浮液，將這些混合物離心分離(1000轉10分鐘)然后在培養基介質中溶解分離產物。計算活細胞數量(不用苔盼藍染色)。大約3.5×105活細胞轉移到新的培養瓶，每個孔大約1.4×105細胞并培養直到獲得細胞融合單層。
T84細胞為了分析粘附性，細胞系T84作為腸的結腸細胞樣品。這些細胞系具有腸細胞的特征例如極性、腸酶表達、特別結構多肽的生產等等。從University ofCalifornia，San Diego，CA.獲得T84細胞。在90％的空氣和10％的CO2組成的大氣中37℃條件下細胞在DMEM(50％)和Ham`s F12(50％)中生長，用2mM谷氨酸鹽，50mM HEPES，1％非必需氨基酸和10％的滅活(30分鐘，56℃)胎牛血清(Boehringer，Mannheim，Germany)補充。細胞以106/cm2的濃度接種。細胞最遲在匯合后也就是在10天以后進行粘附性能檢驗。
除了雙歧桿菌外所有的菌株-80℃維持在含有15％甘油的培養基中。因為轉移到新培養基的數目對于粘附因子有影響，在24小時內只轉移2次沙門氏菌株，第一次在菌株處于冰凍狀態時轉移。所有培養物進行有氧的培養。
雙歧桿菌
雙歧桿菌菌株(長雙歧桿菌CNCM I-2169(B128/Cal)和長雙歧桿菌CNCMI-2170(BL29/F9)在-20℃貯存在含有15％甘油的MRS培養基中。在抑制性能檢測之前這些菌株在無氧條件下在MRS中生長并以24小時的間隔轉移到新培養基中兩次。用于檢測的濃度是2×109cfu/ml。通過以20,000rpm的轉速離心分離1小時獲得上清液，然后檢測存在的細菌。雙裂菌菌株在MRS37℃無氧培養18小時。然后離心分離(4℃，20分鐘)這些培養基，收集上清液，凍干，轉變成溶液然后離心分離10次(10×)。上清液的pH值最后調節到4.5。
E大腸桿菌C1845在解凍后第一次傳代在CFA-Muller Hinton瓊脂上進行，這種瓊脂適合于完成細菌粘附因子表達。在每一次試驗前，在每24個小時轉移到新的培養基細菌細胞在37℃培養。
克雷伯氏桿菌在37℃條件下細菌在Luria肉湯中過夜培養18小時。
耶爾森氏桿菌在37℃條件下細菌在Luria肉湯中過夜培養18小時。
銅綠假單胞菌在37℃條件下細菌在Luria肉湯中過夜培養18小時。
幽門螺桿菌細菌在含有0.25％的酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，MI)，10％的馬血清和0.4％的Campylobacter選擇性補充劑(Skirrow supplement，SR69；Oxoid Ltd，Basingstoke，England).的腦-心-浸液(BHI)-瓊脂板中培養.
實施例4B1288Cal和BL29/F9對T84和Caco-2細胞的粘附在玻璃蓋玻片上制備的Cac)-2和T84單層用磷酸鹽緩沖劑(PBS)洗滌兩次，所說的玻璃蓋玻片放在6孔Corning組織培養皿中(Corning Glass Works，Corning，NY)。將雙歧桿菌1ml，4×108細菌/ml spent培養基上清液，處理上清液或新鮮的MRS肉湯)加入1ml的這種細胞培養基中。這種上清液(2ml)加入每個組織培養基皿的孔中并將其在37℃ 10％CO2/90％的空氣中培養。在培養1小時后，這種單層用滅菌PBS洗滌5次，用甲醇固化，用革蘭氏染色劑染色，用顯微鏡進行檢測。每一次粘附檢測連續進行三次腸細胞的重復試驗。對于每一個玻璃蓋上的單層在20個任意的顯微區域評估粘附細菌的數目。為了排除人為因素，由兩個不同的技術人員評估粘附。
試驗結果如
圖1所示，很明顯B128/Cal和BL29/F9都有粘附在腸細胞的能力并可以和已知的細胞系GG(WO97/00078)或Lal(EP0577903)相比。
實施例5雙歧桿菌的抗病活性選用了病原性細菌大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、耶爾森氏桿菌、銅綠假單胞菌和幽門螺桿菌。
細菌(B128/Cal或BL29/F9)的培養基在MRS培養基總保持18小時，產生指數增長的培養物(37℃3小時)。取出2ml溶液在4℃5500g離心分離5分鐘。在收集上清液后，沉淀用滅菌PBS洗滌。在離心分離后，收集沉淀加入2ml無菌PBS。計數細菌并按照濃度在1到5×106之間細菌/ml制成懸浮液。
按照Lehrer等J.Imunol.Methods 137(1991)，167-173描述的Lehrer法對本發明的雙歧桿菌的抗菌的作用進行了檢驗，這項方法的文件請見參考文獻。檢驗結果如圖2和圖3所示。
從上述試驗結果可以看出本發明的雙歧桿菌可以有效的抑制各種病原細菌的生長。
實施例6抑制沙門氏菌的檢驗沙門氏菌是一種侵入表皮細胞并在那里大量繁殖的細菌。為了測定本發明雙歧桿菌的抑制鼠沙門氏菌的能力，采用了菌株SL1344和如下的方法。
在LB-培養基中培養病原細胞。在第二次傳代到新的培養基之后，采用10μCi/ml放射性同位素C14-醋酸鹽在LB-培養基中標記細菌菌株。在該培養基中在37℃培養18小時。
隨后離心分離(1041rpm，15分鐘)細菌懸浮液，從上清液中去除殘余的C14-醋酸鹽。將沉淀在PBS中懸浮并洗滌，這些細胞以大約108細胞/ml的濃度在1％的滅菌甘露糖溶液中懸浮。甘露糖抑制非特異性粘附。然后將細菌溶液調整到2×108細胞/毫升。
在37℃將病原菌(1ml；2×108細胞)和一部分(1ml)雙歧桿菌培養基的上清液預培養2小時。然后離心分離懸浮液，去除得到的上清液，將沉淀在0.5ml的PBS中再一次懸浮。隨后將病原菌溶液(0.5ml)和人類腸細胞在培養物中接觸。培養物用滅菌PBS洗滌兩次并加入0.5ml粘附培養基(DMEM)。然后在37℃在10％CO2條件下培養這些細胞1小時。
在培養后，計算培養基中和在腸細胞上/內的細菌數目。為了測定粘附在細胞上的量或侵入腸細胞的量，采用了如下方法。
為了測量粘附細菌的數目，輕輕倒出培養基，用培養基介質洗滌一次，用滅菌PBS洗滌一次。隨后，每個間隔加入1ml滅菌水，溶胞細胞并形成細胞溶液，在37℃培養1-2小時，然后連續稀釋。為了計數粘附和侵入的細菌數目，離心分離細胞溶液去除細胞碎片然后測量放射性。
按照另一個方案，將10等分試樣加在TSA培養基上。然后在37℃培養18-24小時。
為了測量侵入細菌的量，Caco-2細胞用PBS洗滌以去除所有的沒有粘附的細胞。隨后，加入含有慶大霉素(20μg/ml)的培養基并在37℃連續培養1小時。慶大霉素是一種抗生素但不進入腸細胞，于是所有的細胞外的微生物都被殺死，而已經侵入腸細胞的細菌將存活。這些細胞然后在37℃再培養一個小時并用PBS洗滌兩次。在37℃通過加入滅菌蒸餾水和培養，來溶胞這些細胞。在去除了細胞碎片后，測量放射性。按照另一個方案采用TSA培養基連續稀釋。在37℃培養18-24小時。
可以看出培養的細胞和培養物上清液對于防止沙門氏菌的粘附和侵入腸細胞具有極其有效的作用。
實施例7鼠沙門氏菌C5菌株感染小鼠成年、7-8周大的無菌雌性小鼠(C3H/He/oujco conventional，Iffa Credo，France)，在無菌條件下飼養，用固定濃度的鼠沙門氏菌(0.2ml，108cfu/每只小鼠)通過口服感染。一些小鼠植入雙歧桿菌從而成為單主寄生物。將這些小鼠的腸子片段用PBS洗滌并切碎，計算雙歧桿菌的數目。另一些小鼠保持在無菌環境中，和對照組的小鼠的存活天數進行比較。
結果如圖5所示，正如所推測的，對照組幾乎所有的小鼠在大約10天左右死掉。與此對比，用BL29/F9處理的所有的小鼠都活過10天，只有20％的小鼠在30天以后被沙門氏菌致死。這些試驗結果表明本發明的雙歧桿菌有極其有效的上述性能。
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權利要求
1.能夠預防引起腹瀉的細菌在腸內建群的雙歧桿菌的培養物上清液在可吸收的載體物質中的應用。
2.雙歧桿菌的應用，其中用于制備可吸收的載體物質的雙歧桿菌是長雙歧桿菌CNCM1-2169(B128/Cal)或長雙歧桿菌CNCM1-2170(BL29/F9)。
3.權利要求2中的應用，其中的雙歧桿菌在載體物質中的含量為大約105cfu/g到大約1012fu/g載體物質。
4.權利要求1到3中的應用，其中所使用的載體物質是一種食物組合物選自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、發酵奶、奶基發酵產品、冰激凌、谷類發酵產品、奶粉、嬰兒食品、寵物食品或片劑、液體細菌懸浮液、干口服補充劑、濕口服補充劑、干的管飼、濕的管飼或寵物食品。
5.權利要求1到4任一權利要求的應用，其中的載體物質用于治療和/或預防腹瀉相關的失調。
6.能夠防止引起腹瀉的細菌建群的雙歧桿菌，它是長雙歧桿菌CNCM1-2169(B128/Cal)或長雙歧桿菌CNCM1-2170(BL29/F9)。
7.含有至少一種權利要求6雙歧桿菌或能夠防止腹瀉的雙歧桿菌培養物上清液的食物或藥物組合物。
8.權利要求7的組合物，選自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、發酵奶、奶基發酵產品、冰激凌、谷類發酵產品、奶粉、嬰兒食品、寵物食品，片劑、液體細菌懸浮液、干口服補充劑、濕口服補充劑、干的管飼、濕的管飼或寵物食品。
全文摘要
本發明涉及雙歧桿菌屬的新的微生物,它能夠防止病原性細菌引起的腹瀉。特別是,本發明涉及所說的微生物在可吸收的載體的制備方面的應用以及含有這種微生物的組合物。
文檔編號A23L1/03GK1369005SQ00811245
公開日2002年9月11日 申請日期2000年7月26日 優先權日1999年8月5日
發明者J·－R·尼澤爾, R·雷尼羅, F·羅查特, A·賽文 申請人:雀巢制品公司