介導除蟲菌素b2∶b1比例的除蟲鏈霉茵基因的制作方法

專利名稱：介導除蟲菌素b2∶b1比例的除蟲鏈霉茵基因的制作方法
1.發明領域本發明涉及除蟲菌素的組合物及除蟲菌素的生產方法，主要應用于動物健康領域。更具體地，本發明涉及含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該產物可用于調整除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)培養物發酵所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，本發明還涉及篩選這類多核苷酸分子的組合物及方法。本發明進一步涉及除蟲鏈霉菌載體，轉化的宿主細胞，和新型突變株(其中aveC基因已突變從而調整所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例)。
2.發明背景2.1.除蟲菌素鏈霉菌可產生各種各樣的次級代謝產物，其中包括除蟲菌素，其含有一系列八種相關的具有有效的抗蠕蟲和殺昆蟲活性的十六員的大環內脂類化合物，這八種截然不同但又密切相關的化合物指A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a及B2b。“a”系列化合物指的是天然除蟲菌素，其在C25位的取代基為(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基為異丙基的那些化合物。代號“A”及“B”指的是C5位取代基分別為甲氧基和羥基的除蟲菌素。數字“1”指的是在C22位及C23位為雙鍵的除蟲菌素，而數字“2”為C22位有一個氫原子及在C23位有一個羥基的除蟲菌素。在這些相關的除蟲菌素中，B1型的除蟲菌素被公認為具有最強的抗寄生蟲和殺害蟲活性，因而也是最具商業前景的除蟲菌素。
除蟲菌素及其通過除蟲鏈霉菌菌株需氧發酵的生產方法在美國專利4,310,519及4,429,042中都已有描述。天然除蟲菌素的生物合成被認為內源性起始于異丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的輔酶A硫代脂類似物。
經過隨機誘變進行菌株改進并聯合使用外源提供的脂肪酸可以有效生產除蟲菌素類似物。支鏈2-氧代酸脫氫酶缺陷的除蟲鏈霉菌的突變體(bkd缺陷突變體)只有在補充有脂肪酸進行發酵時才能產生除蟲菌素。篩選和分離支鏈脫氫酶活性缺陷的突變體(如除蟲鏈霉菌，ATCC 53567)在歐洲專利(EP)276103中已有描述。在有外源提供的脂肪酸存在下發酵這些突變體的結果為對應于所使用的脂肪酸僅產生四種除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充除蟲鏈霉菌(ATCC 53567)發酵，結果產生天然除蟲菌素A1a，A2a，B1a及B2a；用異丁酸補充發酵，結果產生天然除蟲菌素A1b，A2b，B1b及B2b；而用環戊烷羧酸補充發酵，結果產生四種新型的環戊基除蟲菌素A1，A2，B1及B2。
如果用其它脂肪酸補充發酵可以產生新的除蟲菌素。通過篩選800多種潛在的前體，已經鑒定出60多種其它新的除蟲菌素(例見Dutton等，1991，抗生素雜志，44357-365；和Banks等，1994，Roy.Soc.Chem.14716-26)。此外，5-O-甲基轉移酶活性缺陷的除蟲鏈霉菌突變體實際上只能產生B類除蟲菌素，因而，同時缺少支鏈2-氧代酸脫氫酶及5-O-甲基轉移酶活性的除蟲鏈霉菌的突變體對應于補充發酵所用的脂肪酸僅生產出B類除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充該雙重突變體發酵，結果僅產生天然除蟲菌素B1a及B2a，而用異丁酸或環戊烷羧酸補充發酵則可以分別產生天然除蟲菌素B1b及B2b或新型環戊基B1及B2除蟲菌素。而用環己烷羧酸補充該雙重突變體菌是產生商業上重要的新型除蟲菌素環己基除蟲菌素B1(doramectin)的首選方法。該雙重突變體如除蟲鏈霉菌(ATCC 53692)的分離及特性描述在歐洲專利申請EP 276103中。
2.2.參與除蟲菌素生物合成的基因在很多情況下，涉及次生代謝產物生產的基因及編碼一特定抗生素的基因在染色體上的位置常常是簇集在一起的，例如，鏈霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(見Hopwood和Sherman，1990，遺傳學年評，2437-66)。這樣，通過生物合成途徑進行基因克隆的一個策略是分離抗藥性基因及然后檢測染色體上相鄰區域中其它與該特定抗生素生物合成相關的基因。另外一種克隆重要代謝產物生物合成之相關基因的策略是突變體互補。例如，來自能產生特定代謝產物之生物的部分DNA文庫被導入不產生該代謝產物的突變體和篩選產生該代謝產物的轉化株。另外，利用來自其它鏈霉菌的探針進行文庫雜交已被用于鑒別及克隆生物合成途徑中的基因。
涉及除蟲菌素生物合成的基因(ave基因)，就象其它鏈霉菌次生代謝產物(例如，PKS)生物合成所需基因一樣，同樣簇集于染色體上。使用載體已成功克隆了許多ave基因以補充除蟲菌素生物合成受阻的除蟲鏈霉菌突變體。這些基因的克隆在美國專利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，抗生素雜志48532-534，描述了涉及C22，C23脫水步驟的染色體區域(aveC)定位在除蟲鏈霉菌4.82Kb BamHI酶切片斷上，并描述了產生單一組份B2a生產者的aveC基因的突變。既然雙氫除蟲菌素，一潛在抗蠕蟲化合物，能由除蟲菌素B2a化學合成，該除蟲菌素B2a的單一組分生產者被認為在商業上生產雙氫除蟲菌素是特別有用的。
可以使除蟲菌素生產的復雜度最小化的aveC基因突變，例如，降低除蟲菌素B2∶B1比率的突變的鑒定可以簡化商業上重要的除蟲菌素的生產及純化。
3.發明簡述本發明提供了分離的多核苷酸分子，其含有除蟲鏈霉菌完整的aveCORF或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位于除蟲鏈霉菌染色體上aveC ORF所處位置下游的下一個完整的ORF。本發明分離的多核苷酸分子優選包括與質粒pSE 186(ATCC 209604)上除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或與圖1(SEQ ID NO1)中aveC ORF或其實質性部分相同的核苷酸序列。本發明還提供一種分離的多核苷酸分子，其含有SEQID NO1的核苷酸序列或其簡并變體。
本發明進一步提供了一種分離的多核苷酸分子，其具有與質粒pSE 186(ATCC 209604)上除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列同源或與圖1(SEQ IDNO1)中aveC ORF的核苷酸序列或其實質性部分同源的核苷酸序列。
本發明進一步提供了一種分離的多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽的氨基酸序列與質粒pSE 186(ATCC 209604)上AveC基因產物編碼序列編碼的氨基酸序列同源或與圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或其實質性部分同源。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其含有一編碼AveC同源基因產物的核苷酸序列。在優選的實施方案中，分離的多核苷酸分子含有編碼吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)AveC同源基因產物的核苷酸序列，其中的同源基因產物含有SEQ ID NO4的氨基酸序列或其實質性部分。在優選的實施方案中，編碼吸水鏈霉菌AveC同源基因產物的本發明分離的多核苷酸分子含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其含有與SEQ ID NO3所示的吸水鏈霉菌核苷酸序列同源的核苷酸序列。本發明還提供了分離的多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的吸水鏈霉菌AveC同源基因產物同源。
本發明還提供了寡核苷酸，其與具有圖1(SEQ ID NO1)或SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或與具有圖1(SEQ ID NO1)或SEQIDNO3所示核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。
本發明進一步提供了重組克隆載體及表達載體，它們可用于克隆或表達本發明的多核苷酸，包括含有除蟲鏈霉菌的aveC ORF或aveC同系物的ORF的多核苷酸分子。在一非限制性的實施方案中，本發明所提供的質粒pSE186(ATCC 209604)含有除蟲鏈霉菌aveC基因的完整ORF。本發明進一步提供了轉化宿主細胞，其含有本發明的多核苷酸分子或重組載體及由此得到的新的菌株或細胞系。
本發明進一步提供了基本上純化或分離的重組表達型AveC基因產物或AveC同源基因產物或其實質性部分及其同系物。本發明進一步提供了產生重組AveC基因產物的方法，所述方法包括在有利于生產重組AveC基因產物或AveC同源基因產物的條件下，培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，并從細胞培養物中回收AveC基因產物或AveC同源基因產物，其中所述重組表達載體所含有的多核苷酸分子的核苷酸序列可以編碼AveC基因產物或AveC同源基因產物，該多核苷酸分子與控制多核苷酸分子在宿主細胞中表達的一或多個調控元件可操作相連。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含相同于除蟲鏈霉菌aveC等位基因、或質粒pSE 186(ATCC 209604)上AveC基因產物編碼序列或其簡并變體、或如圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列的一種核苷酸序列，但是其進一步包含一或多個突變以使其中野生型的aveC等位基因已經失活且其表達的多核苷酸分子含有突變的核苷酸序列的除蟲鏈霉菌菌株(ATCC 53692)的細胞相對于僅表達野生型的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株(ATCC 53692)的細胞而言，產生不同比例或量的除蟲菌素。根據本發明，可使用這種多核苷酸分子生產除蟲鏈霉菌新菌株，其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比較，除蟲菌素的產量有可測的改變。在優選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素)。在進一步優選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比可以生產增加水平的除蟲菌素)。在進一步優選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其中aveC基因已經失活)。
本發明提供了鑒別能改變所產生的除蟲菌素的比例和/或量的除蟲鏈霉菌aveC ORF突變的方法。在優選的實施方案中，本發明提供了鑒別能改變所產生的除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中被表達；(b)測定與步驟(a)中除蟲鏈霉菌為相同菌株、但僅表達野生型aveC等位基因或圖1(SEQ ID NO1)所示ORF或其同源核苷酸序列的細胞產生的除蟲菌素2類∶1類之比；及(c)將步驟(a)中除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類之比與步驟(b)中除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類之比進行比較，如果二者不同，則鑒定出能改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變。在優選的實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種鑒定aveC ORF突變或含aveC ORF之基因構建體的方法，所述突變或構建體能改變所產生的除蟲菌素的量，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中野生型aveC等位基因已失活，且含有編碼突變型AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，或含有編碼AveC基因產物之核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子已經導入該細胞并被表達；(b)測定與步驟(a)中除蟲鏈霉菌為相同菌株、但僅表達具有圖1(SEQ ID NO1)所示ORF的核苷酸序列或與其同源的核苷酸序列的單個aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素的量；及(c)比較步驟(a)中除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)中除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同，則鑒定出能改變除蟲菌素量的aveC ORF突變或基因構建體。在優選的實施方案中，除蟲菌素的量因突變而增加。
本發明進一步提供了重組載體，該載體可用于制備具有改變的除蟲菌素產量的除蟲鏈霉菌新菌株。例如，本發明提供了這樣一種載體，其可用于將任一個含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈霉菌染色體上的aveC基因位點，或插入，或以同源重組的方式取代aveC ORF或其部分。然而，根據本發明，當插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因以外的位點時或在除蟲鏈霉菌細胞中以附加體的形式出現時，含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子在調控除蟲菌素生物合成方面也起到一定作用。因此，本發明也提供了這樣一種載體，其含有的多核苷酸分子含有本發明的突變核苷酸序列，可使用該載體將多核苷酸分子插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因以外的位點處，或該載體可以附加體的形式出現。在優選實施方案中，本發明所提供的基因取代載體可被用于將突變的aveC等位基因插入到除蟲鏈霉菌染色體上以產生新型的細胞株，其可以較僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。
本發明進一步提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株含有能表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的比例和/或量發生改變。在優選的實施方案中，本發明提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株含有能表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發生改變，選擇轉化細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變。在優選實施方案中，在新菌株細胞中，所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例有所減少。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株包括能產生改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用攜有突變aveC等位基因或含有該aveC等位基因的基因構建體的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，其表達的結果使表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞所生產的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變，挑選已轉化的細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞產生的除蟲菌素量有所改變。在優選實施方案中，在新菌株細胞中，所產生的除蟲菌素的量有所增加。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，這些除蟲鏈霉菌細胞中含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使得aveC等位基因失活的載體轉化表達任何aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞，并且挑選其中aveC等位基因已經失活的轉化細胞。
本發明進一步提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞已被任一含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子或載體轉化。在優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞表達了突變的aveC等位基因而不是野生型的aveC等位基因，或同時表達突變的aveC等位基因和野生型的aveC等位基因，其中該新菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變。在更優選的實施方案中，新菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所降低。這種新菌株可用于大規模生產有商業應用價值的除蟲菌素例如doramectin。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞可以表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，而不是野生型的aveC等位基因，或同時表達這兩者，其結果是相對于僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量而言，含有該突變的aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，新細胞產生的除蟲菌素的量有所增加。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有的細胞中aveC基因已失活。這種菌株不僅可用于產生與野生型菌株所產生的不同譜的除蟲菌素，而且可用于本文所述的互補篩選試驗以便測定靶向或隨機誘變的aveC基因是否影響除蟲菌素產量。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因，與不表達突變aveC等位基因而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，該突變等位基因編碼的基因產物改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優選的實施方案中，表達突變的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例有所減少。該方法提供了商業上有價值的除蟲菌素例如doramectin的高效率的生產方法。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，表達突變或基因構建體的細胞產生的除蟲菌素的量增加。
本發明進一步提供了由表達本發明的突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株產生的除蟲菌素的新的組合物，其中與僅表達野生型的aveC等位基因而不表達突變的aveC等位基因的相同除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例相比，其生產的除蟲菌素中2類∶1類比例減少。這種新型的除蟲菌素組合物可以存在于發酵培養液中或從培養液中獲得，并且可以部分或基本上純化。
4.


圖1.含有除蟲鏈霉菌aveC ORF的DNA序列(SEQ ID NO1)及其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2.含有除蟲鏈霉菌aveC基因完整的ORF的質粒載體pSE186(ATCC209604)。
圖3.含有插入除蟲鏈霉菌aveC ORF中的紅色糖多孢菌ermE基因的基因取代載體pSE180(ATCC 209605)。
圖4.除蟲鏈霉菌的除蟲菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHI限制性酶切圖譜，并鑒定了五種重疊的粘粒克隆(即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，PSE69)。還指示了pSE118與pSE119的關系。
圖5.除蟲鏈霉菌菌株的發酵產物的HPLC分析。通過與環己基B1的標準量比較進行峰定量。環己基B2的保留時間是7.4-7.7分鐘，環己基B1的保留時間是11.9-12.3分鐘。FIG.5A.攜帶失活的aveC ORF的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株；FIG.5B.用pSEI86(ATCC 209604)轉化的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株；FIG.5C.用pSE187轉化的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株；FIG.5D.用pSE188轉化的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株。
圖6.由除蟲鏈霉菌aveC ORF編碼的推定氨基酸序列(SEQ IDNO2)，來自產灰色鏈霉菌(S.griseochromogenes)的aveC同系物的部分ORF(SEQ ID NO5)，及來自吸水鏈霉菌的aveC同系物ORF(SEQ ID NO4)的比較。以粗體表示的纈氨酸殘基是該蛋白質推定的起始位點。以大寫字母表示的保守殘基顯示出全部三種序列中的同源性，以小寫字母表示的保守殘基顯示出3種序列中的2種的同源性。這些氨基酸序列有近50％的序列同一性。
圖7.一種雜合質粒構建體，其含有吸水鏈霉菌aveC同源基因中564 bp的BsaAI/KpnI片段，該片段插入除蟲鏈霉菌的aveC ORF上BsaAI/KpnI位點。
5.發明詳述本發明涉及鑒定及表征具有編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，構建可用于篩選突變的AveC基因產物對生產除蟲菌素的影響的除蟲鏈霉菌新菌株，并且發現某些突變的AveC基因產物可以降低除蟲鏈霉菌產生的除蟲菌素B2∶B1的比例。作為例子，本發明將在下文中描述具有與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或具有圖1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子，及具有由此得來的突變核苷酸序列的多核苷酸分子及其簡并變體。然而，本發明闡明的原理可被類似地應用于其它的多核苷酸分子，包括來自其它鏈霉菌例如吸水鏈霉菌及產灰色鏈霉菌等的aveC同源基因。
5.1.編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的多核苷酸分子本發明提供了一種分離的多核苷酸分子，其含有除蟲鏈霉菌完整的aveC ORF或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少處于除蟲鏈霉菌染色體中aveC ORF所處位置下游的下一個完整的ORF。
本發明分離的多核苷酸分子優選包括的核苷酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產物的編碼序列相同，或與圖1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列或其實質性部分相同。本文所用的含有編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產物的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的“實質性部分”指的是分離的多核苷酸分子，其至少包括圖1(SEQ ID NO1)所示的完整的aveC ORF序列的約70％，并且編碼功能等同型AveC基因產物。這里，“功能等同”的AveC基因產物被定義為基因產物，當其在其中天然aveC等位基因失活的除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692中表達時，結果產生的除蟲菌素與僅表達除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692天然的野生型功能性aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692產生的除蟲菌素具有基本上相同的比例及量。
除了aveC ORF的核苷酸序列外，本發明分離的多核苷酸分子可以進一步包括天然側翼于除蟲鏈霉菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如圖1(SEQID NO1)所示的側翼核苷酸序列。
本發明還提供了一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其簡并變體。
本文所用的術語“多核苷酸分子”，“多核苷酸序列”，“編碼序列”，“開放閱讀框”及“ORF”都意指出DNA分子和RNA分子，其可以是單鏈或雙鏈，其可以被轉錄或翻譯(DNA)，或被翻譯(RNA)成AveC基因產物，或者，如下所述，被翻譯為AveC同源基因產物，或被翻譯成多肽(當置于適當調控元件的控制之下時，在適當宿主細胞表達系統中其與AveC基因產物或AveC同源基因產物同源)。編碼序列包括但不限于原核序列，cDNA序列，基因組DNA序列，及化學合成的DNA和RNA序列。
如圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列在bp位置42，174，177及180包含四個不同的GTG密碼子。如下面第9部分所示，可構建aveC ORF(圖1SEQ ID NO1)5′區域的多個缺失以幫助確定這些密碼子中的哪些能在aveC ORF中用作蛋白質表達的起始位點。bp 42位置處第一個GTG位點的缺失并不能消除AveC的活性。此外，再缺失bp位置174，177及180的所有GTG密碼子才能消除AveC的活性，這表明該區域對于蛋白質表達是必須的。本發明因此包括具有不同長度的aveC ORF。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈霉菌aveC基因產物編碼序列同源，或與圖1(SEQ ID NO1)所示的aveC ORF核苷酸序列或其實質性部分同源。術語“同源”當用于指與除蟲鏈霉菌aveC基因產物編碼序列同源的多核苷酸分子時，指具有以下核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與質粒pSE186(ATCC209604)上除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列編碼相同的AveC基因產物，或與圖1(SEQ ID NO1)所示aveC ORF核苷酸序列編碼相同的AveC基因產物，但其含有一或多個根據遺傳密碼子簡并性而言的對核苷酸序列的沉默改變(即簡并變體)；或(b)在中度嚴緊的條件下，與下述多核苷酸分子的互補序列雜交，該多核苷酸分子含有的核苷酸序列編碼由質粒pSE186(ATCC209604)aveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或編碼圖1(SEQ IDNO2)所示的氨基酸序列，并編碼如上文所定義的功能等同型AveC基因產物，所述中度嚴緊的條件也即在65℃下，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及在42℃下，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等(編)，1989，分子生物學最新方法，Vol.1，Green Publishing Associates公司，和John Wiley & Sons公司，紐約，p.2.10.3)。在優選的實施方案中，同源的多核苷酸分子在高度嚴緊的條件下與質粒pSE186(ATCC 209604)中編碼AveC基因產物的核苷酸序列的互補序列雜交，或與圖1(SEQ ID NO1)所示的AveC ORF核苷酸序列或其實質性部分的互補序列雜交，并編碼如上文所定義的功能等同型AveC基因產物，高度嚴緊的條件指的是在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及在68℃下，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。
如下文實施例所述，AveC基因產物及其潛在的功能等同物的活性可以通過用HPLC分析發酵產物的方式來測定。不管是天然的還是人工合成的，多核苷酸分子(其含有的核苷酸序列編碼除蟲鏈霉菌aveC基因產物的功能等同物)包括天然存在于除蟲鏈霉菌其它菌株中的AveC基因，存在于鏈霉菌其它種的aveC同源基因及突變的aveC等位基因。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所編碼的多肽含有的氨基酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的氨基酸序列，或與圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或其實質性部分有同源性。本文所用的圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的“實質性部分”指的是該多肽至少包括約70％的如圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列，并且組成了如上所定義的功能等同型AveC基因產物。
本文用來描述同源于除蟲鏈霉菌AveC基因產物之氨基酸序列的氨基酸序列時，術語“同源性”指含有圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列、但其中一或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守取代的那些多肽，其中所述氨基酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因產物編碼序列編碼的多肽、或與圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列有，按照任何標準氨基酸序列同一性算法如BLASTP算法(GENBANK，NCBI)所確定的至少約70％，更優選至少約80％，最優選至少約90％的氨基酸序列同一性。保守的氨基酸取代是本領域眾所周知的。進行這樣的取代的規則描述于Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，Vol.5，Sup.3等。更具體地，保守的氨基酸取代是通常發生在氨基酸的酸性或極性相關家族中的那些。基因編碼的氨基酸一般分為四組(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性＝丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以被通稱為芳香的氨基酸。在任何特定組中的一或多個取代，例如，用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，或用谷氨酸取代天冬氨酸，或用絲氨酸取代蘇氨酸，或用結構相關的氨基酸殘基取代任一個其它氨基酸殘基。例如，具有相似的酸性，極性或其某些結合的相似性的氨基酸殘基進行取代對于整個多肽的功能沒有顯著的影響。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其包括的核苷酸序列編碼aveC同源基因產物。本文所用“AveC同源基因產物”定義為與下述除蟲鏈霉菌AveC基因產物具有按照任何標準氨基酸序列同一性算法如BLASTP算法(GENBANK，NCBI)所確定的至少約50％氨基酸序列同一性的基因產物，所述除蟲鏈霉菌AveC基因產物含有由質粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列、或圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列。在一個非限制性的實施方案中，AveC同源基因產物來自吸水鏈霉菌(歐洲專利申請0298423已有描述；保藏號為FERM BP-1901)，其含有SEQ ID NO4的氨基酸序列或其實質性部分。SEQ ID NO4的氨基酸序列的“實質性部分”指的是含有SEQ ID NO4的至少約70％的氨基酸序列的多肽，其構成功能等同型AveC同源基因產物。“功能等同型”AveC同源基因產物被定義成基因產物，當在吸水鏈霉菌菌株FERM BP-1901中表達時(其中天然的AveC同系物等位基因已經失活)，導致所產生的米爾倍霉素的比例和量基本上相同于僅表達吸水鏈霉菌菌株FERM BP-1901天然的野生型功能性aveC同系物等位基因的吸水鏈霉菌菌株FERM BP-1901所產生的比例和量。在一個非限制性實施方案中，本發明分離的多核苷酸分子(其編碼吸水鏈霉菌aveC同源基因產物)含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分。在這點上，含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的“實質性部分”指的是該分離的多核苷酸分子至少包括約70％的如SEQ IDNO3所示的核苷酸序列，并且編碼如上所定義的功能等同的AveC同源基因產物。
本發明進一步提供了含有同源于SEQ ID NO3所示的吸水鏈霉菌核苷酸序列之核苷酸序列的多核苷酸分子。術語“同源”當用來指含有同源于SEQID NO3中吸水鏈霉菌aveC同源基因產物編碼序列之核苷酸序列的多核苷酸分子時，指具有以下核苷酸序列的多核苷酸分子(a)編碼與SEQ ID NO3的核苷酸序列相同的基因產物，但在所述核苷酸序列中包括一或多個根據遺傳密碼簡并性的沉默改變的核苷酸序列(即簡并變體)；或(b)與含有編碼SEQ ID NO4的氨基酸序列之核苷酸序列的多核苷酸分子的互補序列在中度嚴緊條件下雜交、并編碼上述功能等同型AveC同源基因產物的核苷酸序列，所述中度嚴緊條件即65℃在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及42℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等，文獻同上)。在優選實施方案中，所述同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO3中編碼AveC同源基因產物的核苷酸序列的互補序列雜交，并編碼上述功能等同型AveC同源基因產物，所述高度嚴緊條件指65℃，0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中與結合于濾膜上的DNA雜交，及68℃，0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。
本發明進一步提供了一種含有編碼下述多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，所述多肽同源于吸水鏈霉菌AveC同源基因產物。本文用于指同源于SEQ ID NO4所示吸水鏈霉菌的AveC同源基因產物的多肽時，術語“同源性”指含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列、但其中一或多個氨基酸殘基已如上述被不同氨基酸殘基保守取代，從而產生上述功能等同型AveC同源基因產物的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO4的多肽具有，按照任何標準氨基酸序列同一性算法如BLASTP算法(GENBANK，NCBI)所確定的至少約70％、更優選至少約80％、最優選至少約90％的氨基酸序列同一性。
本發明進一步提供了寡核苷酸分子，其與具有如圖1(SEQ ID NO1)或SEQ ID NO3之核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或與具有如圖1(SEQ IDNO1)或SEQ ID NO3之核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。該寡核苷酸的長度至少約為10個核苷酸，且優選約為15-30個核苷酸，其在高度嚴緊的條件下與前述多核苷酸分子之一種雜交，即在37℃左右，6×SSC/0.5％焦磷酸鈉中洗滌14個堿基左右的寡核苷酸，在48℃左右洗滌17個堿基左右的寡核苷酸，在55℃左右洗滌20個堿基左右的寡核苷酸，及在60℃左右洗滌23個堿基左右的寡核苷酸。在一個優選實施方案中，該寡核苷酸與前述多核苷酸分子之一的部分互補。這些寡核苷酸分子可用于不同目的，包括編碼，或用作基因調控所用的反義核酸分子，或用作擴增編碼aveC或aveC同系物的多核苷酸分子的引物。
此外，可以結合已知技術，使用本文公開的多核苷酸分子或寡核苷酸在鏈霉菌的其它種或菌株中鑒定其它aveC同源基因。例如，含有圖1(SEQID NO1)的除蟲鏈霉菌核苷酸序列的一部分或SEQ ID NO3的吸水鏈霉菌核苷酸序列的一部分的寡核苷酸分子可被可測地標記及用于篩選由來源于相關生物體的DNA所構建的基因組文庫)。雜交條件嚴緊性的選擇是基于所涉及生物體的相互關系，在這個例子中，指的是除蟲鏈霉菌或吸水鏈霉菌與其它相關生物體的關系。對不同嚴緊條件的要求是本領域技術人員眾所周知的，這樣的條件將根據衍生得到文庫及標記序列的特定生物體的不同而進行可預測的改變。優選所述寡核苷酸的長度至少為約15個核苷酸，其包括，如下述實施例描述的那些。可以利用這些和其它的寡核苷酸通過應用聚合酶鏈反應(PCR)等標準技術進行同源基因擴增，但也可使用本領域已知的其它擴增技術，如連接酶鏈反應。
可以檢測被鑒定為含有aveC同系物核苷酸序列的克隆編碼功能AveC同源基因產物的能力。為此，可對該克隆進行序列分析以鑒別適當的閱讀框以及起始和終止信號。另一方面或另外，可將克隆的DNA序列插入合適的表達載體，即含有轉錄及翻譯插入的蛋白質編碼序列所必需的元件的載體。可按下述使用多種宿主/載體系統中的任一種，包括但不局限于如質粒，噬菌體，或粘粒表達載體等的細菌系統。可以如下面第7部分所述，通過使用如HPLC分析發酵產物來分析用含有潛在aveC同系物編碼序列的載體轉化的適當宿主細胞的AveC型活性。
本文所述的多核苷酸分子的生產和操作是本領域技術人員易于做到的，其可以依下述的重組技術進行操作，例如，Maniatis等，1989，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，現代分子生物學教程，Greene Publishing Associates & Wiley Interscience，紐約；Sambrook等，1989，分子克隆實驗指南，(第二版)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995，PCR策略，Academic Press公司，SanDiego；和Erlich(編)，1992，PCR技術，牛津大學出版社，紐約，所有文獻均引入本文作為參考。編碼AveC基因產物或AveC同源基因產物的多核苷酸克隆可以通過本領域已知的任何方法進行鑒別，包括但不限于下面第7部分所列舉的方法。通過使用如Benton和Davis，1977，科學196180中所述的篩選噬菌體文庫的方法和Grunstein及Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965所述的篩選質粒文庫的方法，可以從基因組DNA文庫中篩選aveC及aveC同系物編碼序列。存在于如質粒pSE186(ATCC209604)，或質粒pSE119中，且具有已知含有aveC ORF之核苷酸序列的多核苷酸分子(在下面第7部分進行描述)可以用作這些篩選實驗的探針。或者，可以合成對應由純化的AveC同源基因產物的部分或全部氨基酸序列推出的核苷酸序列的寡核苷酸探針。
5.2.重組系統5.2.1.克隆與表達載體本發明進一步提供了重組克隆載體與表達載體，其可用于克隆或表達本發明的，包括有除蟲鏈霉菌aveC ORF或任一aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性實施方案中，本發明提供了質粒pSE186(ATCC209604)，其含有除蟲鏈霉菌aveC基因的完整ORF。
除非特別說明，所有下面有關除蟲鏈霉菌aveC ORF或含有除蟲鏈霉菌aveC ORF或其部分的多核苷酸分子，或除蟲鏈霉菌AveC基因產物的描述，同時也指的是AveC同系物和AveC同源基因產物。
已研制出多種不同的具體用于鏈霉菌的載體，包括噬菌體，高拷貝數質粒，低拷貝數質粒，及大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒等，其中任一個都可以用來實施本發明。也從鏈霉菌中克隆了大量藥物抗性基因，其中某些基因被摻入載體作為選擇性標記。在其它文獻如Hutchinson，1980，應用生物化學與生物技術，16169～190中已經列舉了在鏈霉菌中使用這些載體的例子。
優選構建出本發明的重組載體，尤其是表達載體使得本發明多核苷酸分子的編碼序列與轉錄或翻譯編碼序列所必需的一或多個調控元件可操作相連以生產多肽。本文所用術語“調控元件”包括但不限于這樣的核苷酸序列，其編碼可誘導的及不可誘導的啟動子，增強子，操作子，及本領域已知的用于驅動和/或調控多核苷酸編碼序列的表達的其它元件。同時，如本文所用，該編碼序列與一或多個調控元件“可操作相連”，其中這些調控元件有效地調節并允許轉錄編碼序列或翻譯其mRNA，或既轉錄也翻譯。
可被加工成含有本發明的多核苷酸分子的典型的質粒載體包括pCR-Blunt，pCR2.1(Invitrogen)，pGEM3Zf(Promega)，及其穿梭載體pWHM3(Vara等，1989，細菌學雜志，1715872-5881)等。
構建含有特殊編碼序列(其與合適的調控元件可操作相連)的重組載體的方法是本領域眾所周知的，可使用這些方法實施本發明。這些方法包括體外重組技術，合成技術，體內基因重組。例見Maniatis等，1989，文獻同上；Ausubel等，1989，文獻同上；Sambrook等，1989，文獻同上；Innis等，1995，文獻同上；及Erlich，1992，文獻同上中描述的技術。
這些載體的調控元件的強度和特異性可以不同。根據所用的宿主/載體系統，可使用多種適當的轉錄及翻譯元件中的任一種。對于細菌來說，轉錄調控區或啟動子的非限制性例子包括有β-gal啟動子，T7啟動子，TAC啟動子，λ左及右啟動子，trp及lac啟動子，trp-lac融合啟動子，對于鏈霉菌來說更具體地是，啟動子為ermE，melC，及tipA等。在下面第11部分所述的具體的實施方案中，一個含有aveC ORF的表達載體得以產生，所述ORF被克隆在與紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的強組成型ermE啟動子相鄰的位置。將該載體轉化到除蟲鏈霉菌中，隨后用HPLC分析發酵產物顯示所產生的除蟲菌素的滴度相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株的產量有所增加。
融合蛋白表達載體可被用于表達AveC基因產物-融合蛋白。純化的融合蛋白可被用于提高抗AveC基因產物的抗血清，用于研究AveC基因產物的生化特性，用不同的生化活性加工AveC融合蛋白，或有助于鑒定及純化表達的AveC基因產物。可能的融合蛋白表達載體包括但不局限于這樣的載體，其整合有編碼β-半乳糖苷酶及trpE融合子，麥芽糖結合蛋白融合子，谷胱甘肽-S-轉移酶融合子及多組氨酸融合子(運載區域)的序列。在一個可供選擇的實施方案中，AveC基因產物或其部分可與AveC同源基因產物或其部分融合，該AveC同源基因產物來源于鏈霉菌的其它種或菌株，例如吸水鏈霉菌或產灰色鏈霉菌。在下面第12部分及圖-7所述的特定實施方案中，構建了嵌合質粒，其含有吸水鏈霉菌aveC同系物ORF的564 bp區域，其取代了除蟲鏈霉菌aveC ORF的同源564 bp區域。將該雜合載體轉化至除蟲鏈霉菌細胞中，并且檢測其對所產生的除蟲菌素2類∶1類之比例的影響。
AveC融合蛋白可被設計成含有對純化有用的區域。例如，可以使用直鏈淀粉樹脂純化AveC-麥芽糖結合蛋白融合子；可以使用谷胱甘肽瓊脂糖珠純化AveC-谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白；可以使用二價鎳樹脂純化AveC-多組氨酸融合子。或者，抗載體蛋白或多肽的抗體可被用于融合蛋白的親和層析純化。例如，可將與調控元件可操作相連的編碼單克隆抗體靶表位的核苷酸序列加工入表達載體的適當位置處，以使表達的表位與AveC多肽融合。例如，可通過標準技術將編碼FLAGTM表位標記(InternationalBiotechnologies Inc.)(其為親水性標記肽)的核苷酸序列插入表達載體中對應于如AveC多肽羧基末端的位點。可以利用商購的抗FLAGTM抗體檢測及親和純化表達的AveC多肽FLAGTM表位融合產物。
編碼AveC融合蛋白的表達載體同樣也可以被設計成含有編碼特殊的蛋白酶裂解位點的多接頭序列，以使表達的AveC多肽經用特定的蛋白酶處理可以從載體區域或融合配對物中釋放。例如，該融合蛋白載體可以包括編碼凝血酶或Xa因子酶切位點等的DNA序列。
利用已知的方法將aveC ORF上游和讀框內的信號序列加工入表達載體中以介導表達的基因產物的運輸和分泌。信號序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青霉素酶和T細胞受體等的信號序列。
為了幫助選擇用本發明的克隆或表達載體轉化或轉染的宿主細胞，該載體也可被設計為進一步包括報道基因產物或其它可選擇標記的編碼序列。優選所述編碼序列與上述調控元件編碼序列可操作相連。對本發明有用的報道基因是本領域眾所周知的，其包括那些編碼綠熒光蛋白，熒光素酶，xylE及酪氨酸酶等的報道基因。編碼可選擇標記的核苷酸序列是本領域眾所周知的，其包括那些編碼賦予抗生素抗性，抗代謝物抗性，或提供營養缺陷型需求之基因產物的序列。這些序列包括例如編碼紅霉素，硫鏈絲菌肽或卡那霉素等抗性的核苷酸序列。
5.2.2宿主細胞的轉化本發明進一步提供轉化的宿主細胞，其含有本發明的多核苷酸分子或重組載體，或由該宿主細胞衍生的新菌株或細胞系。可用于本發明實施中的宿主細胞優選為鏈霉菌細胞，但其它的原核細胞或真核細胞同樣也可被使用。該轉化的宿主細胞一般包括但不局限于微生物，例如用重組噬菌體DNA，質粒DNA，或粘粒DNA載體轉化的細菌，或用重組載體等轉化的酵母。
本發明的多核苷酸分子欲在鏈霉菌細胞中發揮作用，其也可以因克隆及表達目的轉化至其它細菌或真核細胞中。例如一般使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，可得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA(保藏號31343)，或可商購(Stratagene)。優選的真核宿主細胞包括酵母細胞，但哺乳動物細胞或昆蟲細胞也可被有效使用。
本發明的重組表達載體最好被轉化或轉染至基本上均一培養的一或多個宿主細胞中。一般根據已知技術，例如，通過原生質體轉化，磷酸鈣沉淀，氯化鈣處理，微量注射，電穿孔，通過與重組病毒接觸進行轉染，脂質體介導的轉染，DEAE-葡聚糖轉染，轉導，接合，或微粒轟擊將表達載體導入宿主細胞中。可以通過標準方法選擇轉化子，例如，選擇表達與上述重組載體相關的選擇性標記，如抗生素抗性的細胞。
一旦將表達載體導入宿主細胞，可以通過檢測預期基因產物的標準技術證實aveC編碼序列已整合并維持在宿主染色體上或以游離體的形式存在，所述技術如Southern雜交分析，限制酶分析，PCR分析，包括逆轉錄酶PCR(rt-PCR)或免疫測定法。含有和/或表達重組aveC編碼序列的宿主細胞可以通過至少四種公知的一般方法中的任一種來證實，所述方法包括(i)DNA-DNA，DNA-RNA，或RNA-反義RNA雜交；(ii)檢測標記基因功能的存在；(iii)通過測定宿主細胞中aveC特異性mRNA轉錄物的表達來評估轉錄水平，及(iv)通過免疫測定法或AveC生物活性的存在(例如，特定比例和量的除蟲菌素的產生表示如除蟲鏈霉菌宿主細胞中存在AveC活性)檢測成熟多肽產物的存在。
5.2.3.重組AveC基因產物的表達及鑒定一旦aveC編碼序列被穩定導入合適的宿主細胞，該轉化的宿主細胞被無性增殖，可以在有助于AveC基因產物最大量生產的條件下培養所得細胞。所述條件一般包括將細胞培養至高密度。當表達載體含有可誘導的啟動子時，根據需要使用合適的誘導條件例如，溫度變化，營養耗盡，添加義務誘導物(例如，碳水化合物的類似物，例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))，過量的代謝副產物的積累等來誘導表達。
當表達的AveC基因產物保留在宿主細胞內部時，收集細胞并裂解，在本領域已知的提取條件下，例如，在4℃或有蛋白酶抑制劑的存在，或二者共存的條件下，從裂解物中分離及純化產物以使蛋白質的降解最小化。當表達的AveC基因產物從宿主細胞中分泌時，只需收集耗盡的營養培養基并從中分離產物。
利用標準方法，可從細胞裂解物或培養基(適當時)中分離或基本上純化表達的AveC基因產物，所述方法包括但不局限于下列方法的任何組合硫酸銨沉淀，大小分級分離，離子交換層析，HPLC，密度離心及親和層析。當表達的AveC基因產物表現出生物活性時，可使用適當試驗在純化步驟的每一步監控制品純度的提高。不管表達的AveC基因產物是否表現出生物活性，都可以依據其大小或與AveC特異性抗體的反應性來檢測，或在融合標記的存在下檢測。如本文所用，AveC基因產物當在具體制劑中占蛋白重量比的20％以上時為“基本上純化”。同樣，如本文所用，AveC基因產物當在具體制劑中占蛋白重量比的至少約80％時是“分離的”。
本發明因此提供分離的或基本上純化的重組表達型除蟲鏈霉菌AveC基因產物及其同系物，所述基因產物含有可以被質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或其實質性部分。
本發明進一步提供分離的或基本上純化的重組表達型吸水鏈霉菌AveC同源基因產物及其同系物，所述基因產物含有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列或其實質性部分。
本發明進一步提供了生產AveC基因產物的方法，所述方法包括在有助于產生重組AveC基因產物的條件下，培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，并從細胞培養物中回收AveC基因產物，其中所述載體含有具有編碼AveC基因產物之核苷酸序列的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子與一或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中表達的調控元件可操作相連。
重組表達的除蟲鏈霉菌AveC基因產物可用于不同的目的，其中包括篩選改變AveC基因產物功能的化合物，及因此調制除蟲菌素的生物合成以及產生針對AveC基因產物的抗體。
一旦獲得純度足夠高的AveC基因產物，通過下列標準方法就可以鑒定基因產物，所述方法如SDS-PAGE，大小排阻層析，氨基酸序列分析，在除蟲菌素生物合成途徑中產生合適產物的生物活性等等。例如，可以使用標準的肽測序技術測定AveC基因產物的氨基酸序列。可以用親水性分析(例見Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 783824)，或類似的軟件運算法則鑒定AveC基因產物的親水區及疏水區，籍此進一步鑒定AveC基因產物。可進行結構分析以鑒定AveC基因產物中具有特殊二級結構的區域。可使用如X-射線結晶學的生物物理法(Engstrom，1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)，計算機模型制作法(Fletterick及Zoller(編)，1986，分子生物學最新通訊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)和核磁共振(NMR)作圖及研究AveC基因產物及其底物之間相互作用的位點。通過這些研究所取得的信息可被用于選擇aveC ORF的新突變位點，以幫助開發具有更合適的除蟲菌素生產特性的除蟲鏈霉菌新菌株。
5.3.aveC突變體的構建及應用本發明提供一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因或其簡并變體相同的核苷酸序列，或含有質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列或其簡并變體，或含有圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列或其簡并變體，但其進一步含有一或多個突變，以致于除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692(其中已使野生型aveC等位基因失活并表達含有突變型核苷酸序列或其簡并變體的多核苷酸分子)較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692的細胞產生了不同比例及量的除蟲菌素。
按照本發明，所述多核苷酸分子可被用于生產除蟲鏈霉菌新菌株，所述新菌株與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株比較，除蟲菌素的生產發生可測的改變。在優選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株相比，以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素)。在另一個優選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其與僅表達單一的野生型aveC等位基因的相同菌株相比可以產生增加水平的除蟲菌素)。在進一步優選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用于生產除蟲鏈霉菌新菌株(其中aveC基因已經失活)。
AveC等位基因或編碼序列的突變包括，在AveC基因產物中導入一或多個氨基酸缺失、添加或取代，或導致AveC基因產物截短，或它們的任何組合，且產生所需結果的任何突變。所述突變型aveC等位基因序列還包括它們的任何簡并變體。例如，本發明提供以下多核苷酸分子，其包含aveC等位基因的核苷酸序列或其簡并變體，或包含質粒pSE186(ATCC 209604)上的aveC基因產物編碼序列或其簡并變體，或圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列或其簡并變體，但其進一步含有一或多個突變，所述突變編碼用不同氨基酸殘基在AveC基因產物的選定位點對氨基酸殘基進行的取代。在下文例舉的幾個非限制性實施方案中，這類取代發生在相應于SEQ ID NO2的氨基酸殘基38，48，55，89，99，111，136，138，139，154，179，228，230，238，266，275，289或298位，或它們的某些組合的aveC基因產物的任何氨基酸位置處。
aveC編碼序列的突變可通過多種已知方法的任一種進行，包括使用易錯PCR，或通過盒式誘變。例如，可以使用寡核苷酸定向誘變以一種確定的方式改變aveC等位基因或ORF的序列，如在該aveC等位基因或ORF中特定區域導入一或多個限制性位點或終止密碼子。也可使用如美國專利5,605,793、5,830,721、5,837,458所述的方法，包括隨機片斷化，重復誘變循環及核苷酸改組產生較大的具有編碼aveC突變的核苷酸序列的多核苷酸文庫。
靶向突變是有用的，對于用于改變AveC基因產物的一或多個保守的氨基酸殘基尤其有用。例如，如圖6所示，通過將AveC基因產物與來自除蟲鏈霉菌(SEQ ID NO2)、產灰色鏈霉菌(SEQ ID NO5)及吸水鏈霉菌(SEQID NO4)的AveC同源基因產物推定的氨基酸殘基序列相比較，顯示了這些種之間顯著保守的氨基酸殘基位點。導致一或多個所述保守的氨基酸殘基改變的靶向誘變對于產生顯示所需的除蟲菌素產量改變的新突變株是非常有效的。
隨機誘變也是有用的，可以通過將除蟲鏈霉菌細胞暴露于紫外線或X-射線照射，或暴露于如N-甲基-N′-亞硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亞硝酸或氮芥子類的化學誘變劑進行誘變。有關誘變技術的綜述可參見Ausubel，1989，文獻同上。
一旦產生突變的多核苷酸分子，可進行篩選以測定其是否可調制除蟲鏈霉菌中的除蟲菌素生物合成。在優選的實施方案中，通過互補除蟲鏈霉菌菌株(其中aveC基因已經失活從而給出aveC-背景)檢測具有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子。在非限制性方法中，突變的多核苷酸分子被剪接成與一或多個調控元件可操作相連的表達質粒，該質粒優選還包括一或多個藥物抗性基因以選擇轉化細胞。使用已知技術將該載體轉化至aveC-宿主細胞中，選擇轉化細胞并在允許或誘導除蟲菌素產生的條件下在合適的發酵培養基中進行培養。然后通過HPLC分析發酵產物以測定突變的多核苷酸分子互補宿主細胞的能力。在下面8.3部分要舉例說明攜有能降低除蟲菌素B2∶B1比例的突變的多核苷酸分子的幾個載體，其包括pSE188，pSE199，pSE231，pSE239，以及pSE290至pSE297。
本發明提供了鑒定除蟲鏈霉菌aveC ORF突變(其可以改變所產生的除蟲菌素的比例和/或產量)的方法。在優選的實施方案中，本發明提供了鑒定除蟲鏈霉菌aveC ORF突變(其可以改變所產生的除蟲菌素的B2∶B1比例)的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞并在其中被表達；(b)測定與步驟(a)中除蟲鏈霉菌為相同菌株、但僅表達野生型aveC等位基因或具有圖1(SEQ ID NO1)所示ORF的核苷酸序列的aveC等位基因或其同源核苷酸序列的細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例；及(c)比較步驟(a)中除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類之比與步驟(b)中除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類之比，如果二者不同，則鑒定出有能改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變。在優選的實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種方法，該方法用于鑒定aveC ORF或含有aveC ORF的基因構建體中能改變所產生的除蟲菌素量的突變，所述方法包括(a)測定除蟲鏈霉菌菌株的細胞所產除蟲菌素的量，所述細胞中野生型aveC等位基因已失活，且含有編碼突變型AveC基因產物之核苷酸序列的多核苷酸分子、或含有編碼AveC基因產物之核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子已導入該細胞并被表達；(b)測定與步驟(a)中除蟲鏈霉菌為相同菌株、但僅表達野生型aveC等位基因或其同源核苷酸序列的細胞所產生的除蟲菌素的量；及(c)比較步驟(a)中除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素的量與步驟(b)中除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素的量，如果二者不同，則鑒定出能改變除蟲菌素量的aveC ORF突變或基因構建體。在優選的實施方案中，除蟲菌素的量因突變而增加。
上述的任一用于鑒定突變的方法可以通過使用發酵培養基進行，優選在該培養基中添加環己烷羧酸，但其它合適的脂肪酸前體，例如，如表1所列的脂肪酸前體中的任一種也可以被使用。
一旦鑒定出按所需方向調制除蟲菌素生產的突變的多核苷酸分子，也可以確定核苷酸序列上發生突變的位置。例如，可以通過PCR分離含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子并使用已知方法對其進行DNA序列分析。通過比較突變的及野生型的aveC等位基因的DNA序列，可以確定負責改變除蟲菌素生產的突變。在本發明的非限制性具體實施方案中，在第55(S55F)，138(S138T)，139(A139T)或230(G230D)位的任一處含有單個氨基酸取代或在第138(S138T)及139(A139T或A139F)位含有雙重取代的除蟲鏈霉菌AveC基因產物發生功能改變，使得所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例改變(參見下文第8部分)，其中所述氨基酸位置對應于圖1(SEQID NO2)中所示。此外，以下7種突變組合分別顯示能有效降低除蟲菌素的2類∶1類之比(1)D48E/A89T；(2)S138T/A139T/G179S；(3)Q38P/L136P/E238D；(4)F99S/S138T/A139T/G179S；(5)A139T/M228T；(6)G111V/P289L；(7)A139T/K154E/Q298H。如本文所用，上述表達方式，如A139T，表示用單字母表示的原始氨基酸殘基(本例中為丙氨酸A)，在指定位置(本例中為SEQ ID NO2所示多肽的第139位)，隨后為取代原始氨基酸殘基的氨基酸殘基(本例中為蘇氨酸T)。因此，本發明包括含有能編碼突變型除蟲鏈霉菌aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其含有在第38，48，55，89，99，111，136，138，139，154，179，228，230，238，266，275，289或298位氨基酸中的一或多處，或它們的任意組合位置處的氨基酸取代或缺失(參見圖1)。
在優選的實施方案中，所述突變編碼選自下組的一或多個氨基酸取代
(a)第38位的氨基酸殘基Q被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(b)第48位的氨基酸殘基D被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(c)第89位的氨基酸殘基A被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(d)第99位的氨基酸殘基F被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(e)第111位的氨基酸殘基G被V取代或被相對于V為保守取代的一種氨基酸取代；(f)第136位的氨基酸殘基L被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(g)第138位的氨基酸殘基S被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(h)第139位的氨基酸殘基A被T或F取代或被相對于T或F為保守取代的一種氨基酸取代；(i)第154位的氨基酸殘基K被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(j)第179位的氨基酸殘基G被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(k)第228位的氨基酸殘基M被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(l)第238位的氨基酸殘基E被D取代或被相對于D為保守取代的一種氨基酸取代；(m)第289位的氨基酸殘基P被L取代或被相對于L為保守取代的一種氨基酸取代；(n)第298位的氨基酸殘基Q被H取代或被相對于H為保守取代的一種氨基酸取代；其中保守氨基酸取代均按上文第5.1節的定義。
在另一優選實施方案中，所述突變編碼氨基酸取代的組合，其中被取代的氨基酸殘基的組合選自
(a)氨基酸殘基S138和A139；(b)氨基酸殘基D48和A89；(c)氨基酸殘基S138，A139和G179；(d)氨基酸殘基Q38，L136和E238；(e)氨基酸殘基F99，S138，A139和G179；(f)氨基酸殘基A139和M228；(g)氨基酸殘基G111和P289；和(h)氨基酸殘基A139，K154和Q298。
在另一優選實施方案中，在aveC等位基因中可有效降低本發明除蟲菌素2類∶1類之比例的特定突變組合選自下組的一或多種(a)S138T/A139T(b)S138T/A139F(c)D48E/A89T(d)S138T/A139T/G179S(e)Q38P/L136P/E238D(f)F99S/S138T/A139T/G179S(g)A139T/M228T(h)G111V/P289L；和(i)A139T/K154E/Q298H。
本發明進一步提供了制備新的除蟲鏈霉菌菌株的組合物，該菌株的細胞含有突變的aveC等位基因而導致除蟲菌素生產的變化。例如，本發明提供了重組載體，可使用該載體將任何含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈霉菌染色體上的aveC基因位點，以通過同源重組插入或取代aveC ORF或其部分。然而，按照本發明，此處提供的含有本發明突變的核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因外的位點，或在除蟲鏈霉菌細胞中保持游離狀態時，同樣起到調制除蟲菌素生物合成的作用。因此，本發明還提供了具有含有本發明突變的核苷酸序列的多核苷酸分子的載體，可使用這些載體將多核苷酸分子插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因位點以外的位置，或保持游離狀態。
在優選的實施方案中，本發明提供了基因取代載體，其可以用于將突變的aveC等位基因或其簡并變體插入除蟲鏈霉菌菌株細胞中，籍此產生新的除蟲鏈霉菌菌株，所述菌株的細胞與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，產生的除蟲菌素2類∶1類比例有所改變。在優選的實施方案中，該細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例減少。可使用本文提供的表達載體如pSE188，pSE199，及pSE231(這些表達載體在下面第8.3部分將舉例說明)中存在的突變的多核苷酸分子構建所述基因取代載體。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了載體，可使用該載體將突變的aveC等位基因或其簡并變體插入除蟲鏈霉菌菌株細胞中以產生新細胞株，所述新細胞與僅表達野生型的AveC等位基因的相同菌株細胞相比，產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，所述新細胞產生的除蟲菌素的量增加。在具體的、非限制性實施方案中，該載體進一步包含本領域已知的強啟動子，例如，來自Saccharopolyspora erythraea的強組成型ermE啟動子，其位于ave等位基因上游并與該aveC等位基因可操作相連。所述載體可以是如下面實施例11所述的質粒pSE189，或可通過使用質粒pSE189的突變的aveC等位基因進行構建。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了基因取代載體，該載體可用于滅活野生型除蟲鏈霉菌菌株中的aveC基因。在非限制性的實施方案中，可以通過使用質粒pSE180(ATCC 209605)中存在的突變的多核苷酸分子構建所述基因取代載體，其在下面第8.1部分中舉例說明(圖3)。本發明進一步提供了含有多核苷酸分子的基因取代載體，所述多核苷酸分子包含天然側翼于除蟲鏈霉菌染色體上原位aveC基因的核苷酸序列或由該序列組成，例如，包括那些如圖1(SEQ ID NO1)所示的側翼核苷酸序列，可使用所述載體缺失除蟲鏈霉菌aveC ORF。
本發明進一步提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述新菌株含有表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞比較，所產生的除蟲菌素的比例和/或量發生改變。在優選的實施方案中，本發明進一步提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述新菌株含有能表達突變型aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞比較，所產生的除蟲菌素2類∶1類之比例發生改變，所述方法包括用攜有突變型aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株的細胞，該突變型aveC等位基因編碼的基因產物使得與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細胞比較，表達其突變型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例有所改變；選擇所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變的轉化細胞。在一個更優選的實施方案中，本發明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括用能向除蟲鏈霉菌細胞的aveC等位基因中導入突變的載體轉化所述細胞，其中所述aveC等位基因的突變導致在所編碼的AveC基因產物中，在對應于SEQ ID NO2中第38，48，55，89，99，111，136，138，139，154，179，228，230，238，266，275，289或298位的一或多個氨基酸位置上發生不同氨基酸殘基的取代，使得除蟲鏈霉菌菌株中攜有如此突變之aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例不同于除蟲鏈霉菌相同菌株中僅表達野生型aveC等位基因的細胞所產生的比例。在優選實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例有所降低。
如本文所用，當除蟲鏈霉菌染色體中、或本發明的載體或分離的多核苷酸分子中由aveC等位基因編碼的氨基酸殘基被描述為“對應于”SEQ IDNO2中的特定氨基酸殘基時，或當在“對應于”SEQ ID NO2中特定編號的氨基酸殘基的具體位置處發生氨基酸取代時，它是指在AveC基因產物中由本領域技術人員參照本文SEQ ID NO2所示氨基酸序列能快速確定的相同位置處的氨基酸殘基。
本發明還提供了制備新菌株的方法，所述新菌株中aveC等位基因上的特定突變均以aveC等位基因中“對應于”SEQ ID NO1所示具體核苷酸位置的特定核苷酸位置處的堿基改變。與上文中關于相應氨基酸位置的描述一樣，當將aveC等位基因中的某一個核苷酸位置描述為“對應于”SEQ IDNO1上具體核苷酸位置時，表示在aveC核苷酸序列中由本領域技術人員參照本文SEQ ID NO1所示核苷酸序列能快速確定的相應位置的核苷酸。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株含有生產改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用攜有突變aveC等位基因或含有該aveC等位基因的基因構建體的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株細胞，所述突變的aveC等位基因的表達使得表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素的量較僅表達單一的野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變；選擇所產生的除蟲菌素的量較僅表達單個野生型aveC等位基因的菌株細胞所產生的量有所改變的轉化細胞。在優選實施方案中，轉化細胞中所產生的除蟲菌素的量有所增加。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，所述菌株的細胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使aveC等位基因失活的載體轉化除蟲鏈霉菌菌株中表達任一種aveC等位基因的細胞；選擇其中aveC等位基因已失活的轉化細胞。在非限制性優選實施方案中，除蟲鏈霉菌菌株細胞被基因取代載體轉化，該載體所攜帶的aveC等位基因已經因突變或用異源基因序列取代AveC等位基因的一部分而失活，選擇其中天然aveC等位基因已被失活的aveC等位基因所取代的轉化細胞。如下所述，AveC等位基因的失活可以通過用HPLC分析發酵產物來測定。在如下面第8.1部分所述的具體的、非限制性的實施方案中，通過在aveC ORF中插入來自紅色糖多孢菌的ermE基因而使aveC等位基因失活。
本發明進一步提供了除蟲鏈霉菌的新菌株，其含有用本發明的任何多核苷酸分子或載體轉化的細胞。在優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有能表達突變型aveC等位基因或其簡并變體而不表達，或另外還表達野生型aveC等位基因的細胞，其中新菌株的細胞生產的除蟲菌素的2類∶1類的比例相對于相同菌株中僅表達野生型aveC等位基因的細胞而言有所改變。在優選的實施方案中，新細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例降低。這些新菌株可用于大規模生產具有商業價值的除蟲菌素如doramectin。在一個更優選的實施方案中，本發明提供除蟲鏈霉菌的細胞，它們在aveC等位基因上對應于上述位置的核苷酸處含有上述任一種突變或突變組合，或者它們編碼AveC基因產物中的上述任一種氨基酸取代。盡管這些突變可出現在上述細胞中一種染色體外元件如質粒上，但優選這些突變出現在除蟲鏈霉菌染色體上的aveC等位基因中。在一個優選實施方案中，本發明提供了一種除蟲鏈霉菌菌株，其含有在編碼AveC基因產物的aveC等位基因中攜帶突變的細胞，其中這種細胞產生的除蟲菌素2類∶1類之比不同于相同除蟲鏈霉菌菌株中僅表達野生型aveC等位基因的那些細胞所產生的比例，其中所述AveC基因產物在對應于SEQ ID NO2中第38，48，55，89，99，111，136，138，139，154，179，228，230，238，266，275，289或298位氨基酸的一或多個氨基酸位置上發生取代。
本文所述篩選試驗的根本目的是鑒定突變的aveC等位基因，其在除蟲鏈霉菌細胞中的表達已發生改變，特別是降低了所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例。在優選的實施方案中，由本發明能表達突變型aveC等位基因或其簡并變體的除蟲鏈霉菌新菌株的細胞所產生的除蟲菌素B2∶B1之比約為1.6∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為1∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為0.84∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為0.80∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為0.75∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為0.73∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為0.68∶1或更小。在一個還更優選的實施方案中，所述比例約為0.67∶1或更小。在一個更優選的實施方案中，所述比例約為0.57∶1或更小。在一個還更優選的實施方案中，所述比例約為0.53∶1或更小。在一個還更優選的實施方案中，所述比例約為0.42∶1或更小。在一個還更優選的實施方案中，所述比例約為0.40∶1或更小。
在下述一個具體實施方案中，本發明的新細胞以小于1.6∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.94∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.88∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.84∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.75∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.73∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.68∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.67∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.57∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.53∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.42∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。在下述另一不同的具體實施方案中，本發明的新細胞以約0.40∶1的比例產生環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。
在更優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有能表達突變型aveC等位基因或其簡并變體，或含有aveC等位基因或其簡并變體之基因構建體，而不表達或另外還表達野生型aveC等位基因的細胞，其中新菌株的細胞以相對于僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變的量生產除蟲菌素。在優選的實施方案中，新菌株產生的除蟲菌素的量增加。在非限制性的實施方案中，基因構建體進一步包括強啟動子，例如，來自紅色糖多孢菌的強組成型ermE啟動子，其位于aveC ORF上游并與aveC ORF可操作相連。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈霉菌新菌株，其含有其中aveC基因已經失活的細胞。所述菌株可用于產生與野生型菌株相比有不同譜的除蟲菌素，在本文所述的互補篩選試驗中還可測定aveC基因靶向或隨機誘變是否影響除蟲菌素的生產。在下文所述的具體實施方案中，除蟲鏈霉菌宿主細胞經基因改造后含有失活的aveC基因。例如，下面實施例中所述的菌株SE180-11就是使用基因取代質粒pSE180(ATCC209605)(圖3)產生的，通過在aveC編碼區插入ermE抗性基因而使除蟲鏈霉菌aveC基因失活。
本發明進一步提供了重組表達的、突變的除蟲鏈霉菌AveC基因產物及其制備方法，所述基因產物由本發明上述多核苷酸分子的任一種編碼。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養物中回收所述除蟲菌素，所述細胞表達編碼基因產物的突變的aveC等位基因，與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，所述突變的等位基因改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優選的實施方案中，表達突變的aveC等位基因的細胞在培養物中所產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例有所減少。該方法提供了商業上有價值的除蟲菌素例如doramectin的高效率的生產方法。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈霉菌菌株細胞，并從培養物中回收所述除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈霉菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，在培養物中表達突變aveC等位基因或基因構建體的細胞產生的除蟲菌素的量有所增加。
本發明進一步提供了由表達突變型aveC等位基因或其簡并變體的除蟲鏈霉菌菌株產生的除蟲菌素新組合物，其中所述突變型aveC等位基因或其簡并變體所編碼的基因產物使表達該突變型aveC等位基因或其簡并變體的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與除蟲鏈霉菌相同菌株中僅表達野生型aveC等位基因的細胞相比有所降低，其中，與除蟲鏈霉菌相同菌株中僅表達野生型aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例相比，新組合物中除蟲菌素2類∶1類的比例降低。這種新型除蟲菌素組合物可以產生于營養耗竭的發酵培養液中或從中回收，可通過已知的生化純化技術如硫酸銨沉淀，透析，大小分級分離，離子交換層析，HPLC等從培養液中部分純化或基本上純化。
5.4.除蟲菌素的用途除蟲菌素是可具體作為治蠕蟲劑、殺體外寄生蟲劑、殺蟲劑及殺螨劑來使用的一種高效抗寄生蟲藥劑。按本發明方法產生的除蟲菌素化合物均可用于這些用途。例如，按本發明方法產生的除蟲菌素化合物可用于治療人類的各種疾病或癥狀，尤其是本領域已知的由寄生蟲感染造成的那些疾病。參見Ikeda and Omura，1997，Chem.Rev.97(7)2591-2609。更具體地，按本發明方法產生的除蟲菌素化合物可有效治療由內寄生蟲所致各種疾病，所述內寄生蟲如能感染人，家畜，豬，綿羊，家禽，馬或牛的寄生性線蟲。
更具體地，按本發明方法制備的除蟲菌素化合物可有效抵抗感染人體的線蟲以及感染各種動物的線蟲。這類線蟲包括胃腸道寄生蟲如鉤蟲(Ancylostoma)，線蟲(Necator)，蛔蟲(Ascaris)，類圓線蟲(Strongyloides)，旋毛蟲(Trichinella)，毛細線蟲(Capillaria)，鞭蟲(Trichuris)，蟯蟲(Enterobius)，惡絲蟲(Dirofilaria)，及血管或其它組織或器官中發現的寄生蟲如絲蟲性蠕蟲以及類園線蟲和旋毛蟲的腸道提取物。
按本發明方法產生的除蟲菌素化合物也可用于治療體外寄生蟲感染，包括節肢動物對哺乳動物或鳥類的感染，如能感染馬和牛的蜱(tick)、螨、虱、蚤、綠頭蒼蠅、咬蟲(biting insect)、或移棲雙翅目幼蟲等引起的感染。
按本發明方法產生的除蟲菌素化合物也可作為殺蟲劑用于針對室內害蟲(household pest)如蟑螂、衣蛾、地毯甲蟲、及家蠅等，以及侵害儲存的谷物和農作物的有害昆蟲，包括紅蜘蛛(spider mite)、蚜蟲、毛蟲、和直翅目幼蟲如蝗蟲(locust)等。
用按本發明方法產生的除蟲菌素化合物能治療的動物包括綿羊、牛、馬、鹿、山羊、豬、鳥類包括家禽、狗和貓。
按本發明方法產生的除蟲菌素化合物可根據特定用途、接受治療的宿主動物的具體種類、所涉及的寄生蟲或昆蟲等情況以相應劑型給藥。當作為殺寄生蟲劑使用時，按本發明方法產生的除蟲菌素化合物可以以膠囊、丸劑、片劑、或灌服液的劑型口服，或以傾注(pour-on)、注射或植入的形式給藥。這類制劑可以按標準獸醫學實踐以傳統方式制備。因此，可將活性成分與合適的細分稀釋劑或載體混合來制備膠囊、丸劑或片劑，所述稀釋劑或載體另外含有崩解劑和/或粘合劑如淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸鎂等。灌服劑是將活性成分與分散劑或潤濕劑等一起分散在水溶液中來制備。注射劑可配制成無菌溶液，其中可含其它物質如足夠的鹽和/或葡萄糖以便使該溶液與血液成等滲狀態。
這些制劑中活性化合物的重量可根據患者、或將要治療的宿主動物種類、感染的嚴重性及類型、宿主的體重等而變化。通常，口服給藥的一劑為約0.001-10mg活性化合物/kg患者或動物的體重，以單劑或分幾劑給藥，期間為1-5天。但有時可由醫生或獸醫根據臨床癥狀確定較高或較低的劑量。
或者，按本發明方法產生的除蟲菌素化合物也可以與動物飼料一起給藥，為此，可制備濃縮的食物添加劑或預混劑以便與常規動物飼料混合。
當作為殺蟲劑使用，及用于處理農業害蟲時，按本發明方法產生的除蟲菌素化合物也可以按標準農業實踐以噴霧劑，粉劑，乳劑和類似形式來施用。
6.實施例除蟲鏈霉菌的發酵及除蟲菌素B2∶B1的分析如果發酵培養基中不補充脂肪酸，則既缺失支鏈2-氧代酸脫氫酶又缺失5-O-甲基轉移酶活性的菌株將不產生除蟲菌素。該實施例證實這類突變株在有不同脂肪酸存在的條件下啟動生物合成時，可獲得很寬范圍的除蟲菌素B2∶B1比例。
6.1.材料及方法除蟲鏈霉菌ATCC 53692儲存在-70℃的全肉湯種子培養基中，培養基的組成為淀粉(Nadex，Laing National)-20g；Pharmamedia(Trader′sProtein，Memphis，TN)-15g；Ardamine pH(Yeast Products Inc.)-5g；碳酸鈣-1g。終體積用自來水調整為1升，pH調整至7.2，培養基在121℃高壓滅菌25分鐘。
取2ml上述制劑的解凍后懸浮液接種到一個含有50ml同樣培養基的燒瓶中。以180rpm在旋轉振蕩器上28℃培養48小時后，取2ml肉湯接種到一個含有50ml生產培養基的燒瓶中，該培養基含有淀粉-80g；碳酸鈣-7g；Pharmamedia-5g；磷酸氫二鉀-1g；硫酸鎂-1g；谷氨酸-0.6g；七水合硫酸亞鐵-0.01g；硫酸鋅-0.001g；硫酸亞鎂-0.001g。終體積用自來水調整為1升，pH調整至7.2，培養基在121℃高壓滅菌25分鐘。
將不同的羧酸底物(見表1)溶于甲醇中并在接種24小時后添加到發酵肉湯中使終濃度為0.2g/l。將該發酵肉湯于28℃培養14天，然后離心(2,500rpm，2分鐘)，去除上清。菌絲沉淀用丙酮(15ml)，然后用二氯甲烷(30ml)提取，分離有機相，過濾，然后蒸發使之干燥。殘余物用1ml甲醇吸收，并用配有設置在240nm的掃描二極管陣列檢測器的Hewlett-Packard 1090A液相色譜進行HPLC分析，所用柱子是保持在40℃的Beckman Ultrasphere C-18，5μm，4.6mm×25cm柱。將25μl上述甲醇溶液注入該柱子中。以0.85/mlmin的流速，用甲醇-水從80∶20到95∶5的線性梯度洗脫40分鐘。用兩種標準濃度的環己基B1校準檢測器的反應，測量除蟲菌素B2及B1的曲線下的面積。
6.2.結果除蟲菌素B2和B1的HPLC保留時間，及2∶1比例如表1所示。
表1
表1所列數據證實B2∶B1除蟲菌素的產量比有相當寬的范圍，其表明根據所提供的脂肪酸側鏈啟動子單元的性質，2類化合物相對于1類化合物的脫水轉化結果有很大的差異。這指示由AveC蛋白的改變所致B2∶B1比例的改變只特異性針對特定底物。因此，對用特定底物獲得的B2∶B1比例發生變化的突變體進行篩選時需要在該底物的存在下進行。下面這些例子描述了使用環己烷羧酸作為篩選底物。然而，該底物僅用于舉例說明本發明潛在的實用性，而不是有意要限制本發明。
7.實施例aveC基因的分離本實施例描述了除蟲鏈霉菌染色體中編碼AveC基因產物的區域的分離及鑒定，如下文所證實，aveC基因經鑒定能改變所產生的環己基B2對環己基B1除蟲菌素的比例(B2∶B1)。
7.1.材料與方法7.1.1.用于DNA分離的鏈霉菌的生長下面的方法用于培養鏈霉菌。除蟲鏈霉菌ATCC 31272株單菌落(單菌落分離物#2)在1/2強度的YPD-6中分離，YPD-6含有Difco酵母提取物-5g；Difco細菌用胨-5g；葡萄糖-2.5g；MOPS-5g；Difco細菌用瓊脂-15g，終體積用dH2O調整至1升，pH調整至7.0，培養基在121℃高壓滅菌25分鐘。
將上述培養基中生長的菌絲體接種到25mm×150mm試管中的10mlTSB培養基(Difco Tryptic Soy Broth-30g，在1升dH2O中，在121℃高壓滅菌25分鐘)中，在28℃以300rpm振蕩培養48-72小時。
7.1.2.從鏈霉菌中分離染色體DNA將如上所述生長的菌絲體取等份試樣(0.25ml或0.5ml)置于一個1.5ml的微量離心試管中，將細胞在12,000×g離心60秒而濃縮。去除上清液，使細胞重新懸浮于0.25ml TSE緩沖液(20ml 1.5M蔗糖，2.5ml 1MTris-HCl，pH8.0，2.5ml 1M EDTA，pH8.0，和75ml dH2O)中，該緩沖液含有2mg/ml溶菌酶。樣品在37℃振蕩培養20分鐘，上樣至AutoGen 540TM自動核酸分離儀(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，用Cycle 159(儀器軟件)按照操作手冊分離基因組DNA。
或者，將5ml菌絲體置于一個17mm×100mm的試管中，3,000rpm離心5分鐘使細胞濃縮，去除上清液。將細胞重新懸浮在1ml TSE緩沖液中，3,000rpm離心5分鐘使細胞濃縮，去除上清液。將細胞重新懸浮在含有2mg/ml溶菌酶的1ml TSE緩沖液中，37℃振蕩培養30-60分鐘。培養后，加入0.5ml 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，將細胞在37℃下保溫，直到裂解完成。裂解產物在65℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，分到兩個1.5mlEppendorf試管中，并用0.5ml苯酚/氯仿(50％苯酚，預先用0.5M Tris平衡，pH8.0；50％氯仿)萃取1次。去除水相，用氯仿∶異戊醇(24∶1)萃取2到5次。通過加入1/10體積3M醋酸鈉，pH4.8沉降DNA，在冰中保溫混合物10分鐘，在15,000rpm，5℃將混合物離心10分鐘，將上清液移至干凈試管中，并在其中加入1倍體積的異丙醇。然后將上清液與異丙醇混合物一起在冰中保溫20分鐘，在15,000rpm 5℃將混合物離心20分鐘，將上清液移除，用70％乙醇洗滌DNA粒狀沉淀物1次。在粒狀沉淀物干燥后，將DNA再懸浮于TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中。
7.1.3.從鏈霉菌中分離質粒DNA將一份菌絲體(1.0ml)置于一個1.5ml的微量離心試管中，在12,000xg下離心60秒濃縮細胞。去除上清液，細胞再懸浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000xg下離心濃縮60秒，去除上清液。然后將細胞重新懸浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.25ml TSE緩沖液中，37℃下振蕩保溫20分鐘，然后上樣至AutoGen 540TM自動核酸分離儀中。按照操作手冊，使用Cycle 106(儀器軟件)分離質粒DNA。
或者，將1.5ml的菌絲體置于1.5ml微型離心試管中，12,000xg離心60秒濃縮細胞。去除上清液，細胞再懸浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000xg離心濃縮60秒，去除上清液。細胞重新懸浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.5ml TSE緩沖液中，37℃保溫15-30分鐘。保溫后，加入0.25ml堿性SDS(0.3N NaOH，2％SDS)，細胞在55℃保溫15-30分鐘或直到溶液變清。將醋酸鈉(0.1ml，3M，pH4.8)加入到DNA溶液中，將其在冰中保溫10分鐘。DNA樣品在5℃14,000rpm離心10分鐘。將上清液移至干凈試管中，并在其中加入0.2ml的苯酚/氯仿(50％苯酚∶50％氯仿)并輕輕混和。DNA溶液在5℃下以14,000rpm離心10分鐘，上層移至干凈的Eppendorf試管中。加入異丙醇0.75ml，將溶液輕輕混和，然后在室溫下保溫20分鐘。將該DNA溶液在5℃下以14,000rpm離心15分鐘，移除上清液，用70％乙醇洗滌DNA沉淀顆粒，干燥，再在TE緩沖液中重新懸浮。
7.1.4.從大腸桿菌中分離質粒DNA將單個大腸桿菌轉化菌落接種在5ml Luria-Bertani(LB)培養基(細菌用胰蛋白胨-10g，細菌用酵母提取物-5g，和NaCl-10g在1升dH2O中，pH7.0，121℃高壓滅菌25分鐘，并添加100μg/ml氨芐青霉素)中。將培養物過夜培養，將1毫升等分試樣置于1.5ml微型離心試管中，將培養樣品載至AutoGen 540TM自動核酸分離器中，按照操作手冊，使用Cycle 3(儀器軟件)分離質粒DNA。
7.1.5.除蟲鏈霉菌原生質體的制備及轉化將除蟲鏈霉菌單菌落在1/2強度的YPD-6中分離。將菌絲體接種到25mm×150mm試管中的10ml TSB培養基中，在28℃以300rpm振蕩培養48小時。將1ml菌絲體接種至50ml YEME培養基。每升YEME培養基含有Difco酵母提取物-3g；Difco細菌用胨-5g；Difco Malt Extract-3g；蔗糖-300g。121℃高壓滅菌25分鐘后，加入下列物質2.5M MgCl2·6H2O(單獨在121℃高壓滅菌25分鐘)-2ml；及甘氨酸(20％)(過濾除菌)-25ml。
將菌絲體在30℃下培養48-72小時，然后在50ml離心管(Falcon)中在3,000rpm下離心20分鐘收獲。去除上清液，菌絲體在P緩沖液中重新懸浮，P緩沖液含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2·6H2O-2.02g；H2O-600ml；K2PO4(0.5％)-10ml；痕量元素溶液-20ml；CaCl2·2H2O(3.68％)-100ml；及MES緩沖液(1.0M，pH6.5)-10ml(*痕量元素溶液每升含有ZnCl2-40mg；FeCl3·6H2O-200mg；CuCl2·2H2O-10mg；MnCl2·4H2O-10mg；Na2B4O7·10H2O-10mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O-10mg)。pH調至6.5，終體積調至1升，培養基用0.45微米濾膜熱過濾。
菌絲體以3,000rpm離心20分鐘得到粒狀沉淀，去除上清液，將菌絲體在含有2mg/ml溶菌酶的20ml P緩沖液中重新懸浮。菌絲體在35℃振蕩保溫15分鐘，經顯微鏡檢查確定原生質體的形成程度。當原生質體的形成完全時，將其在8,000rpm下離心10分鐘。去除上清液，將原生質體在10ml P緩沖液中重新懸浮。將原生質體在8,000rpm離心10分鐘，去除上清液，將其在2ml P緩沖液中重新懸浮，將約1×109個原生質體分配至2.0ml低溫小瓶(Nalgene)中。
含1×109個原生質體的小瓶在8,000rpm離心10分鐘，去除上清液，原生質體在0.1ml P緩沖液中重新懸浮。將2～5μg轉化的DNA加入到原生質體中，接著加入0.5ml T工作緩沖液。T緩沖基質含有PEG-1000(Sigma)-25g；蔗糖-2.5g；H2O-83ml。用1N NaOH(已濾膜除菌)將pH調節至8.8，將T緩沖基質經濾膜過濾除菌，于4℃保存。T工作緩沖液(于使用當天制備)是T緩沖基質-8.3ml；K2PO4(4mM)-1.0ml；CaCl2·2H2O(5M)-0.2ml；及TES(1M，pH8)-0.5ml。T工作緩沖液的每一組分均分別過濾除菌。
在20秒鐘內將T緩沖液加入到原生質體中，還加入1.0ml P緩沖液，然后將原生質體在8,000rpm離心10分鐘。去除上清液后將原生質體在0.1mlP緩沖液中重新懸浮。然后將原生質體鋪板至RM14培養基上，該培養基含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2.6H2O-10.12g；葡萄糖-10g；Difco酪蛋白氨基酸-0.1g；Difco酵母提取物-5g；Difco燕麥瓊脂-3g；Difco細菌用瓊脂-22g；dH2O-800ml。溶液在121℃高壓滅菌25分鐘。然后加入下列的無菌原液K2PO4(0.5％)-10ml；CaCl2.2H2O(5M)-5ml；L-脯氨酸(20％)-15ml；MES緩沖液(1.0M，pH6.5)-10ml；痕量元素溶液(同上)-2ml；環己酰亞胺原液(25mg/ml)-40ml；及1N NaOH-2ml。將25ml RM14培養基等分在每個平板上，這些平板在使用前都要干燥24小時。
原生質體在濕度95％、溫度30℃下保溫20-24小時。為了選擇硫鏈絲菌肽抗性轉化子，將含有125μg/ml硫鏈絲菌肽的1ml上層緩沖液均勻覆蓋在RM14再生平板上。每100ml上層緩沖液含有蔗糖-10.3g；痕量元素溶液(與上相同)-0.2ml；及MES(1M，pH6.5)-1ml。原生質體在濕度95％、溫度30℃下保溫7-14天直到能觀察到硫鏈絲菌肽抗性(Thior)菌落。
7.1.6.變青鏈霉菌原生質體的轉化在某些情況下，用變青鏈霉菌(S.lividans)TK64(由John Innes研究所，Norwich，U.K提供)進行轉化。用于變青鏈霉菌生長、原生質化及轉化的方法和組合物在Hopwood等，1985，Genetic Manipulation of Streptomyces，ALaboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，U.K.中作了描述。如上述7.1.3中所述從變青鏈霉菌轉化株中分離質粒DNA。
7.1.7.除蟲鏈霉菌菌株的發酵分析除蟲鏈霉菌的菌絲體在1/2強度的YPD-6上培養4-7天后，接種到含有8ml預制培養基及兩個5mm玻璃珠的1×6英寸試管中，預制培養基含有可溶性淀粉(為稀的煮沸的淀粉或KOSO，Japan Corn Starch Co.，Nagoya)-20g/L；Pharmamedia-15g/L；Ardamine pH-5g/L(Champlain Ind.，Clifton，NJ)；CaCO3-2g/L；2xbcfa(″bcfa指支鏈脂肪酸)，其在培養基中含有終濃度為50ppm的2-(+/-)-甲基丁酸，60ppm的異丁酸，及20ppm的異戊酸。將pH調至7.2，培養基在121℃高壓滅菌25分鐘。
試管以17°角在29℃下以215rpm振蕩培養3天。將種子培養物的2ml等分試樣接種到含有25ml生長培養基的300ml Erlenmeyer燒瓶中，該培養基含有淀粉(為稀的煮沸的淀粉或KOSO)-160g/L；Nutrisoy(Archer DanielsMidland，Decatur，IL)-10g/L；Ardamine pH-10g/L；K2HPO4-2g/L；MgSO4.4H2O-2g/L；FeSO4.7H2O-0.02g/L；MnCl2-0.002g/L；ZnSO4.7H2O-0.002g/L；CaCO3-14g/L，2xbcfa(同上)；及環己烷羧酸(CHC)(在pH7.0下制成20％的溶液)-800ppm。pH調至6.9，培養基在121℃高壓滅菌25分鐘。
接種后，將燒瓶在29℃以200rpm振蕩培養12天。培養后，從燒瓶中取2ml樣品，用8ml甲醇稀釋，混合，混合物在1,250xg離心10分鐘以沉淀碎片。用Beckman Ultrasphere ODS柱(25cm×4.6mm ID)以0.75ml/min的流速進行HPLC來分析上清液，檢測240nm的吸光度。流動相為86/8.9/5.1甲醇/水/乙腈。
7.1.8.除蟲鏈霉菌PKS基因的分離制備除蟲鏈霉菌(ATCC 31272，SC-2)染色體DNA的粘粒文庫并使其與由紅色糖多孢菌聚酮化合物合成酶(PKS)基因的片段制成的酮合成酶(KS)探針雜交。粘粒文庫的制備詳見Sambrook等，1989，同上。鏈霉菌染色體DNA文庫的制備詳見Hopwood等，1985，同上。帶有酮合成酶-雜交區域的粘粒菌落可通過與pEX26(由Dr.P.Leadlay，Cambridge，UK提供)的2.7KbNdeI/Eco47III片段雜交來識別。將約5ng pEX26用Ndel及Eco47III消化。將反應混合物上樣至0.8％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts，Rockland，ME)。電泳后從凝膠中切出2.7Kb的Ndel/Eco47III片段，用FastProtocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。2.7Kb的Ndel/Eco47III片段使用BRL Nick翻譯系統(BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD)按說明書進行[α-32P]dCTP(脫氧胞苷5′-三磷酸鹽，四(三乙胺)鹽，[α-32P]-)(NEN-Dupont，Boston，MA)標記。一個典型反應在0.05ml體積中進行。加入5μl終止緩沖液后，用G-25 Sephadex Quick SpinTMColumn(Boehringer Mannheim)按說明書將標記的DNA分子與未發生摻入的核酸分子分離。
約1,800個粘粒菌落通過菌落雜交進行篩選。鑒定出10個與紅色糖多孢菌KS探針強力雜交的克隆。將含有粘粒DNA的大腸桿菌菌落在LB液體培養基中培養，用Cycle 3(儀器軟件)在AutoGen 540TM自動核酸分離器中按照操作說明分離每一培養物中的粘粒DNA。限制性核酸內切酶作圖及Southern印跡雜交分析揭示五個克隆中含有重疊的染色體區域。五種粘粒(也即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，pSE69)的除蟲鏈霉菌基因組BamHI酶切圖譜通過對重疊粘粒的分析及雜交法進行構建(圖4)。
7.1.9.能調控除蟲菌素B2∶B1比例的DNA鑒定及aveC ORF的鑒定以下方法用于測試來自pSE66粘粒克隆的亞克隆片段調控AveC突變株中除蟲菌素B2∶B1比例的能力。用SacI及BamHI消化pSE66(5μg)。將反應混合物上樣至0.8％SeaplaqueTMGTG瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)，電泳后從凝膠中切出2.9Kb的SacI/BamHI片段，使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。約5μg穿梭載體pWHM3(Vara等，1989，J.Bacteriol.1715872-5881)用SacI及BamHI消化。將約0.5μg所述2.9Kb插入子與0.5μg已消化的pWHM3混合，并按照廠商說明與1個單位的連接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在15℃、總體積20μl中保溫過夜。保溫后，將5μ連接混合物在70℃保溫10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用于轉化感受態的大腸桿菌DH5α細胞(BRL)。從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA，通過限制性分析可以證實2.9Kb SacI/BamHI插入子的存在。該質粒被命名為pSE119。
如上7.1.5部分所述，制備除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株(Pfizer內部(in-house)菌株)的原生質體并用pSE119轉化。1100-SC38株是一種突變體，當補充環己烷羧酸時，相對于除蟲菌素環己基-B1形式，其產生明顯多的除蟲菌素環己基-B2形式(B2∶B1的比例大約是30∶1)。用于轉化除蟲鏈霉菌原生質體的pSE119從大腸桿菌GM2163株(得自Dr.B.J.Bachmann，Curator，大腸桿菌Genetic Stock Center，Yale University)、大腸桿菌DM1株(BRL)、或變青鏈霉菌TK64株中分離。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化子并通過對發酵產物的HPLC分析來進行分析。除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的含有pSE119的轉化子產生了比例已改變的除蟲菌素環己基B2∶環己基-B1，該比例大約是3.7∶1(表2)。
確定了pSE119能調控AveC突變體中的除蟲菌素B2∶B1的比例后，測出插入的DNA序列。按照操作手冊，使用質粒DNA分離試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)，大約有10μg的pSE119被分離，然后用ABI 373A自動DNA測序儀(Perkin Elmer，Foster City，CA)進行測序。用遺傳學計算機組程序(GCG，Madison，WI)組合和編輯測序數據。DNA序列及aveC ORF示于圖1(SEQ ID NO1)中。
如下構建一種新的質粒，命名為pSE118。用SphI及BamHI消化大約5μg的pSE66。將反應混合物上樣至0.8％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上，電泳后從凝膠中切出2.8Kb的SphI/BamHI片段，使用FastProtocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。約5μg穿梭載體pWHM3用SphI及BamHI消化。將0.5μg2.8Kb插入子與0.5μg已消化的pWHM3混合，在15℃、總體積20μl中按照廠商說明與1個單位的連接酶(New England Biolabs)一起保溫過夜。保溫后，將5μl連接混合物在70℃保溫10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用于轉化感受態的大腸桿菌DH5α細胞。從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA，通過限制性分析可以證實2.8Kb SphI/BamHI插入子的存在。該質粒被命名為pSE118。在pSE118及pSE119中的DNA插入子中約有838個核苷酸重疊(圖4)。
除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的原生質體用pSE118如上進行轉化。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化子并通過對發酵產物的HPLC分析來進行分析。除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的含pSE118的轉化株相對于1100-SC38株在除蟲菌素環己基B2∶環己基-B1的比例上并未改變(表2)。
7.1.10.對除蟲鏈霉菌染色體DNA上aveC基因的PCR擴增通過PCR擴增法從除蟲鏈霉菌染色體DNA中分離含aveC ORF的～1.2Kb片段，所用引物根據從上所獲的aveC核苷酸序列進行設計。PCR引物由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。右向引物是5′-TCACGAAACCGGACACAC-3′(SEQ ID NO6)；左向引物是5′-CATGATCGCTGAACCGAG-3′(SEQ ID NO7)。在由生產商所提供的緩沖液中，在有300μM dNTP，10％甘油，每種引物各200pmol，0.1μg模板及2.5單位酶，終體積100μl的條件下，用Deep VentTM聚合酶(New England Biolabs)在Perkin-Elmer Cetus熱循環儀中進行PCR反應。第一循環的加熱分布(thermal profile)為95℃5分鐘(變性步驟)，60℃2分鐘(退火步驟)，72℃2分鐘(延伸步驟)。隨后24循環的加熱分布與此相似，但變性步驟的時間縮短至45秒種且退火時間縮短至1分鐘。
PCR產物在1％瓊脂糖凝膠中電泳后，檢測到約1.2Kb的單一DNA帶。從凝膠中純化該DNA，并以1∶10摩爾的載體插入子比例與25ng線性化鈍端PCR-Blunt載體(Invitrogen)按照操作手冊進行連接。按照操作手冊用該連接混合物轉化感受態One ShotTM大腸桿菌細胞(Invitrogen)。從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA，該～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性分析證實。該質粒被命名為pSE179。
將pSE179中的DNA插入子通過用BamHI/XbaI消化而分離，電泳分辨，從凝膠中純化，并與已被BamHI/XbaI消化的穿梭載體pWHM3連接，該反應中DNA總濃度為1μg，載體與插入子的摩爾比為1∶5。按照操作手冊用該連接混合物轉化感受態大腸桿菌DH5α細胞。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，所述～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性分析證實。該質粒(被命名為pSE186(圖2，ATCC 209604))被轉化至大腸桿菌DM1中，并從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA。
7.2.結果鑒定出來自pSE119的2.9Kb SacI/BamHI酶切片段，當其轉化至除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株中時，顯著地改變了B2∶B1除蟲菌素的產量比。一般情況下，除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的B2∶B1比約為30∶1，但當用含有2.9KbSacI/BamHI酶切片段的載體轉化時，除蟲菌素B2∶B1的比例減少至大約3.7∶1。對轉化體培養物進行發酵后分析證實了轉化DNA的存在。
對2.9Kb pSE119片段進行測序，鑒定了約0.9Kb的ORF(圖1)(SEQ IDNO1)，其包含一個已于他處發生突變而僅產生B2產物的PstI/SphI片段(Ikeda等，1995，同上)。該ORF或其相應的推導多肽，與已知數據庫(GenEMBL，SWISS-PROT)相比，并不表明其與已知DNA或蛋白序列有任何強烈的同源性。
表2表示用不同質粒轉化的除蟲鏈霉菌1100-SC38株的發酵分析表2
8.實施例除蟲鏈霉菌aveC突變株的構建本實施例描述用上述組合物及方法對幾種不同除蟲鏈霉菌aveC突變株的構建。在鏈霉菌基因中引入突變的技術見Kieser及Hopwood，1991，Meth.Enzym.204430-458。詳見Anzai等，1988，J.Antibiot.XLI(2)226-233和Stutzman-Engwall等，1992，J.Bacteriol.174(1)144-154。這些參考資料在此都被全文引用。
8.1.除蟲鏈霉菌AveC基因的失活含有失活的AveC基因的AveC突變株可通過下述的幾種方法構建。
在第一種方法中，將pSE119(上文第7.1.9所述質粒)上aveC基因內部的640bp SphI/PstI片段用紅色糖多孢菌的ermE基因(賦予紅霉素抗性)取代。ermE基因通過用BglII和EcoRI進行限制酶切消化而從pIJ4026(來自John InnesInstitute，Norwich，U.K.；還參見Bibb等，1985，Gene 41357-368)中分離，然后電泳，從凝膠中純化。將此約1.7Kb的片段連接到已用BamHI和EcoRI消化的pGEM7Zf(Promega)中，將該連接混合物依照操作手冊轉化到大腸桿菌DH5α的感受態細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA，所述約1.7Kb插入子的存在可以通過限制性分析證實。將該質粒命名為pSE27。
pSE118(如上第7.1.9部分描述)用SphI及BamHI消化，將消化物電泳，從凝膠中純化約2.8Kb的SphI/BamHI插入子。pSE119用PstI和EcoRI消化，將消化物電泳，從凝膠中純化約1.5Kb的PstI/EcoRI插入子。將穿梭載體pWHM3用BamHI及EcoRI消化。pSE27用PstI和SphI消化，將消化物電泳，從凝膠中純化約1.7Kb的PstI/SphI插入子。將全部四種片段(即約2.8Kb，約1.5Kb，約7.2Kb，約1.7Kb)通過一個4步驟(4-way)連接反應連接在一起。將該連接混合物依照操作手冊轉化到大腸桿菌DH5α的感受態細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化子中分離質粒DNA，通過限制性分析證實正確插入子的存在。該質粒被命名為pSE180(圖3；ATCC209605)。
將pSE180轉化入變青鏈霉菌TK64細胞，用針對硫鏈絲菌肽和紅霉素的抗性鑒定轉化的菌落。從變青鏈霉菌中分離pSE180，用其轉化除蟲鏈霉菌的原生質體。鑒定出四種硫鏈絲菌肽抗性除蟲鏈霉菌轉化體，制備原生質體并在非選擇性條件下將其鋪板至RM14培養基中。使原生質體再生，然后篩選有紅霉素抗性而無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，其表明失活型aveC基因的染色體整合但游離復制子已丟失。鑒定出一個ErmrThios轉化體，將其命名為SE180-11菌株。從SE180-11株中分離總染色體DNA，用限制性酶BamHI，HindIII，PstI或SphI消化，在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳分辨，然后轉移至尼龍膜上，與ermE探針進行雜交。這些分析顯示，通過一個雙交換事件使得ermE抗性基因進行染色體整合并同時使640bp PstI/SphI片段缺失。對SE180-11株發酵產物的HPLC分析顯示不再產生正常的除蟲菌素(圖5A)。
在使aveC基因失活的第二種方法中，從除蟲鏈霉菌SE180-11株的染色體上取出1.7Kb的ermE基因，使得aveC基因中缺失640bp PstI/SphI。如下構建基因取代質粒pSE180用XbaI進行部分消化，從凝膠中純化約11.4Kb的片段。該約11.4Kb的帶缺少所述1.7Kb ermE抗性基因。將此DNA連接并轉化進大腸桿菌DH5α細胞。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，正確插入子的存在可以通過限制性分析證實。將該質粒(被命名為pSE184)轉化進大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA。用該質粒轉化除蟲鏈霉菌SE180-11株的原生質體。從SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體制備原生質體，并在RM14上鋪板為單菌落。使原生質體再生，然后篩選出無紅霉素抗性和硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，其表明失活型aveC基因的染色體整合但缺失含有ermE基因的游離復制子。鑒定出一個ErmsThios轉化子并命名為SE184-1-13。對SE184-1-13的發酵分析顯示正常除蟲菌素不再產生，且SE184-1-13具有與SE180-11相同的發酵特征。
在第三種使aveC基因失活的方法中，通過用PCR在第471位核苷酸C之后添加兩個G而在染色體aveC基因中引入移碼突變，從而創建一個BspEl位點。工程化的BspEl位點的存在可用于檢測基因取代事件。PCR引物被設計為能在aveC基因中引進移碼突變，所述引物由Genosys Biotechnologies公司提供。右向引物為5′-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3′(SEQ ID NO8)，左向引物為5′-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3′(SEQ ID NO9)。PCR條件如上第7.1.10節所述。666bp的PCR產物用SphI消化，分別得到278bp及388bp的兩種片段。從凝膠中純化所述388bp的片段。
如下構建基因取代質粒穿梭載體pWHM3用EcoRI及BamHI消化。pSE119用BamHI及SphI消化，將消化物電泳，從凝膠中分離出約840bp的片段。pSE119用EcoRI及XmnI消化，通過電泳分辨消化物，從凝膠中純化約1.7Kb的片段。所有四種片段(也即～7.2Kb，～840bp，～1.7Kb及388bp)通過一個4步驟連接反應連接在一起。將該連接混合物轉化進大腸桿菌DH5α的感受態細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析證實正確插入子的存在。將該質粒(命名為pSE185)轉化至大腸桿菌DM1細胞，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA。用該質粒轉化除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的原生質體。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，并通過對發酵產物的HPLC分析來分析。當pSE185轉化入除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株中時，并未明顯改變除蟲菌素B2∶B1的比例(表2)。
用pSE185轉化除蟲鏈霉菌原生質體以在染色體aveC基因中產生一個移碼突變。從硫鏈絲菌肽抗性轉化株制備原生質體，并在RM14培養基上鋪板為單菌落。使原生質體再生，然后篩選無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落。分離硫鏈絲菌肽敏感菌落的染色體DNA并通過PCR篩選整合至染色體中的移碼突變的存在。PCR引物根據aveC核苷酸序列設計，由GenosysBiotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物為5′-GCAAGGATACGGGGACTAC-3′(SEQ ID NO10)，左向PCR引物為5′-GAACCGACCGCCTGATAC-3′(SEQ ID NO11)，PCR條件如上第7.1.10節所述。所獲PCR產物為543bp，當用BspEl消化時，可檢測到三種片段368bp，96bp，及79bp，其表明失活型aveC基因的染色體整合及游離復制子的缺失。
對aveC基因上含有移碼突變的除蟲鏈霉菌突變株的發酵分析顯示，不再產生正常除蟲菌素，且這些突變株具有與SE180-11株及SE184-1-13株相同的發酵產物HPLC特征。鑒定出一個ThioS轉化株并命名為SE185-5a.
此外，在aveC基因上產生一個突變，其使第520位核苷酸由G變為A，從而導致第116位上編碼色氨酸(W)的密碼子變為終止密碼子。攜帶此突變的除蟲鏈霉菌菌株不產生正常除蟲菌素且具有與SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a菌株相同的發酵特征。
此外，在aveC基因中產生突變，其導致(i)第970位核苷酸由G變為A，使第266位氨基酸從甘氨酸(G)變為天冬氨酸(D)，(ii)第996位核苷酸由T變為C，使第275位氨基酸從酪氨酸(Y)變為組氨酸(H)。具有這些突變(G256D/Y275H)的除蟲鏈霉菌菌株并不產生正常除蟲菌素但具有與SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a菌株相同的發酵特征。
除蟲鏈霉菌aveC失活突變株SE180-11、SE184-1-13、SE185-5a，及此處所提的其它菌株，為評估aveC基因中其它突變的影響提供了篩選工具。將含有野生型aveC基因的pSE186轉化入大腸桿菌DM1細胞中，從氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒DNA。用該pSE186DNA轉化除蟲鏈霉菌SE180-11株。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，測定紅霉素抗性的存在，通過HPLC分析發酵產物來分析ThiorErmr轉化體。功能性aveC基因的反位(in trans)存在能將除蟲菌素的正常產量恢復到SE180-11株的水平(圖5B)。
8.2對AveC基因中改變B2∶B1比例的突變的分析如上所述，含有失活的aveC基因的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株通過用含有功能性aveC基因的質粒(pSE186)轉化而補充。SE180-11株也可用作宿主菌株來鑒定aveC基因的其它突變，如下所述。
從1100-SC38菌株中分離染色體DNA，并用作aveC基因進行PCR擴增的模板。通過PCR擴增分離1.2Kb ORF，擴增所用引物根據aveC核苷酸序列來設計。右向引物為SEQ ID NO6，左向引物為SEQ ID NO7(見第7.1.10節所述)。PCR及亞克隆條件如第7.1.10節所述。1.2Kb ORF的DNA序列分析顯示了第337位核苷酸由C變為T的aveC基因突變，第55位的氨基酸由絲氨酸(S)變為苯丙氨酸(F)。將含有S55F突變的aveC基因亞克隆入pWHM3中以產生一個質粒，其被命名為pSE187，并用于轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，以確定紅霉素抗性的存在，通過HPLC分析發酵產物來分析ThiorErmr轉化體。編碼第55位氨基酸殘基之改變(S55F)的aveC基因的存在，能將正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株的水平(圖5C)；但環己基B2∶環己基B2的比例約為26∶1，而用pSE186轉化的SE180-11株的B2∶B1比約為1.6∶1(表3)，表明該單突變(S55F)調節了環己基B2相對于環己基B1的產量。
鑒定出在aveC基因中的另一個突變，其使第862位核苷酸由G變為A，從而第230位的氨基酸由甘氨酸(G)變為天冬氨酸(D)。含有該突變(G230D)的除蟲鏈霉菌菌株產生的除蟲菌素B2∶B1比例約為30∶1。
8.3.能減少B2∶B1比例的突變可以如下構建減少環己基-B2相對于環己基-B1的產量的幾種突變。
鑒定出aveC基因中的一個突變，其使第588位核苷酸由G變為A，從而第139位的氨基酸由丙氨酸(A)變為蘇氨酸(T)。將含有A139T突變的aveC基因亞克隆入pWHM3中，產生一個質粒(命名為pSE188)，用該質粒轉化除蟲鏈霉菌SE180-11株的原生質體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，測定紅霉素抗性株的存在，通過HPLC分析發酵產物來分析ThiorErmr轉化體。編碼氨基酸殘基139改變(A139T)的突變型aveC基因的存在能將除蟲菌素產量恢復至SE180-11株的水平(圖5D)；但B2∶B1的比例約是0.94∶1，這表明該突變減少了環己基B2相對于環己基B1的量。該結果很意外，因為已公布的結果以及上述突變結果僅證明了aveC基因的失活或除蟲菌素B2型相對于B1型的產量增加(見表3)。
由于A139T突變以更利于B1的方向改變了B2∶B1的比例，因此構建一個突變，其編碼第138位氨基酸處的絲氨酸而不是蘇氨酸。為此，pSE186用EcoRI消化并克隆入已用EcoRI消化的pGEM3Zf(Promega)中。該被命名為psE186a的質粒用ApaI及KpnI消化，在瓊脂糖凝膠中分離DNA片段，從凝膠中純化兩種片段～3.8Kb及～0.4Kb。用pSE186的～1.2Kb DNA插入片段作PCR模板，誘導第585位核苷酸的單堿基改變。將PCR引物設計成在核苷酸585位能引進一個突變，該引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物為5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3′(SEQ ID NO12)；左向PCR引物為5′-GGAACCGACCGCCTGATACA-3′(SEQ ID NO13)。使用Advantage GC基因組PCR試劑盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)，在由廠商提供的緩沖液中，在有200μM dNTPs，每種引物各200pmol，50ng模板DNA，1.0M GC-Melt及1個單位的KlenTaq聚合酶混合物的條件下，在終體積50μl中進行PCR反應。第一循環的加熱分布為94℃1分鐘；接下來以94℃30秒鐘及68℃2分鐘進行25個循環；然后以68℃3分鐘進行一個循環。將295bp的PCR產物用ApaI及KpnI消化以釋放一個254bp的片段，其通過電泳進行分辨并從凝膠中純化。所有三種片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)用一個3步驟連接反應(3-way ligation)連接在一起。將該連接混合物轉化入感受態的大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒DNA，正確插入子的存在可以通過限制性分析確認。該質粒被命名為pSE198。
pSE198用EcoRI進行消化，克隆進已用EcoRI消化的pWHM3中，并將其轉化至大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認正確插入子的存在。將該質粒DNA轉化至大腸桿菌DM1，從氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒DNA，通過限制性分析確認正確插入子的存在。將這一命名為pSE199的質粒用于轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化株，確定紅霉素抗性的存在，通過用HPLC法分析發酵產物而分析ThiorErmr轉化株。編碼138位上氨基酸殘基改變(S138T)的突變aveC基因的存在能將正常除蟲菌素產量恢復至SE180-11株的水平；然而，B2∶B1的比例為0.88∶1，表明了該突變減少了環己基-B2相對于環己基-B1的量(見表-3)。該B2∶B1的比例甚至低于0.94∶1(這是用pSE188轉化SE180-11菌株而產生的A139T突變所觀察到的比例，如上所述)。
構建另一個突變以同時在氨基酸位置138及139處引進一個蘇氨酸。用pSE186的約1.2Kb DNA插入片段作PCR的模板。將PCR引物設計成能在核苷酸位置585及588處誘發突變，該引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物為5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3′(SEQ ID NO14)；左向PCR引物為5′-GGAACATCACGGCATTCACC-3′(SEQ ID NO15)。使用本節上述條件進行PCR反應。449bp的PCR產物用ApaI及KpnI消化以釋放254bp的片段，其通過電泳進行分辨并從凝膠中純化。將pSE186a用ApaI及KpnI消化，在瓊脂糖凝膠上分辨DNA片段，從凝膠中純化3.8Kb與0.4Kb的兩種片段。所有這三種片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)以3步驟連接反應進行連接，將該連接混合物轉化至大腸桿菌DH5α的感受態細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析確認正確插入子的存在。該質粒被命名為pSE230。
pSE230用EcoRI消化，克隆至已被EcoRI消化的pWHM3中，轉化至大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認正確插入子的存在。將該質粒DNA轉化至大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析確認正確插入子的存在。用這一命名為pSE231的質粒轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅霉素抗性的存在，然后通過發酵分析ThiorErmr轉化體。雙突變aveC基因(編碼S138T/A139T)的存在能使正常的除蟲菌素生產恢復到SE180-11株的水平；但B2∶B1的比例為0.84∶1，顯示該突變相對于pSE188或pSE199所轉化的SE180-11株所提供的降低作用而言，進一步降低了環己基-B2相對于環己基B1的產量(見表3)。
構建另一突變，以便進一步降低環己基B2相對于環己基B1的產量。由于S138T/A139T突變能使B2∶B1之比向更利于B1的方向改變，因此構建一種突變，使得能在第138位氨基酸處導入一個蘇氨酸并在第139位氨基酸處導入一個苯丙氨酸。用來自pSE186的約1.2kb DNA插入片段作為PCR的模板。將PCR引物設計為能在第585位核苷酸處導入突變(使T變為A)，第588位核苷酸處導入突變(使G變為T)，第589位核苷酸處導入突變(使C變為T)，這些引物可由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。右向PCR引物為5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGAC GTTC-3′(SEQ ID NO25)；左向PCR引物為5′-GGAACATCACGGCATTC ACC-3′(SEQ ID NO15)。PCR反應用Advantage GC基因組PCR試劑盒(ClonetechLaboratories，Palo Alto，CA)在廠家提供的緩沖液中進行，所述緩沖液中有200μM dNTPs，每種引物各200pmol，50ng模板DNA，1.1mM乙酸鎂，1.0MGC-Melt和1個單位的Tth DNA聚合酶，終體積50μl。第一個循環的加熱分布為94℃1分鐘；然后94℃30秒和68℃2分鐘共25個循環；68℃3分鐘進行一個循環。449bp的PCR產物用ApaI和KpnI消化，釋放出一個254bp的片段，將其通過電泳分辨并在凝膠上純化。將所有三種片段(約3.8Kb，約0.4Kb和254bp)通過一個三步驟連接反應連接在一起。將該連接混合物轉化至感受態的大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析證實正確插入子的存在。將該質粒命名為pSE238。
pSE238用EcoRI消化，克隆至已被EcoRI消化的pWHM3質粒中，轉化至大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認正確插入子的存在。將該質粒DNA轉化至大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析確認正確插入子的存在。用這一命名為pSE239的質粒轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅霉素抗性的存在，然后通過對發酵產物進行HPLC分析來分析ThiorErmr轉化體。雙突變aveC基因(編碼S138T/A139F)的存在能使正常的除蟲菌素生產恢復到SE180-11株的水平；但B2∶B1的比例為0.75∶1，表明該突變相對于如上述用pSE188，pSE199或pSE231轉化的SE180-11株所提供的降低作用而言，進一步降低了環己基-B2相對于環己基B1的產量(見表3)。
表3
可利用DNA改組(sbuffling)技術構建另外的突變，以進一步降低環己基B2相對于環己基B1的產量，所述技術如Stemmer，1994，自然370389-391；Stemmer，1994，美國國家科學院學報9110747-10751所述；還可詳見美國專利5605793，5811238，5830721和5837458。
將含有突變型aveC基因的DNA改組質粒轉化至感受態的dam dcm大腸桿菌細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，用于轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，從中篩選以環己基B2∶環己基B1之比為1∶1或更低產生除蟲菌素的那些轉化體。測定以B2∶B1之比為1∶1或更低產生除蟲菌素的那些轉化體中質粒DNA的DNA序列。
鑒定出8株能產生相對于環己基B1減少量的環己基B2的轉化體。這些轉化體中最低B2∶B1之比為0.40∶1(表4)。分離這8種轉化體每一種的質粒DNA，測定其DNA序列以便鑒定aveC基因中的突變。所述突變如下。
pSE290包含4個核苷酸突變，即第317位的核苷酸從T變為A，第353位的核苷酸從C變為A，第438位的核苷酸從G變為A，第1155位的核苷酸從T變為A。第317位核苷酸的改變使得第48位的氨基酸由D變為E，第438位核苷酸的改變使得第89位的氨基酸由A變為T。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.42∶1(表4)。
pSE291包含4個核苷酸突變，即第272位的核苷酸從G變為A，第585位的核苷酸從T變為A，第588位的核苷酸從G變為A，第708位的核苷酸從G變為A。第585位核苷酸的改變使得第138位的氨基酸由S變為T，第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變為T，第708位核苷酸的改變使得第179位的氨基酸由G變為S。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.57∶1(表4)。
pSE292包含與pSE290相同的4個核苷酸突變。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.40∶1(表4)。
pSE293包含6個核苷酸突變，即第24位的核苷酸從A變為G，第286位的核苷酸從A變為C，第497位的核苷酸從T變為C，第554位的核苷酸從C變為T，第580位的核苷酸從T變為C，第886位的核苷酸從A變為T。第286位核苷酸的改變使得第38位的氨基酸由Q變為P，第580位核苷酸的改變使得第136位的氨基酸由L變為P，第886位核苷酸的改變使得第238位的氨基酸由E變為D。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.68∶1(表4)。
pSE294包含6個核苷酸突變，即第469位的核苷酸從T變為C，第585位的核苷酸從T變為A，第588位的核苷酸從G變為A，第708位的核苷酸從G變為A，第833位的核苷酸從C變為T，第1184位的核苷酸從G變為A。此外，第173、174和175位的核苷酸已缺失。第469位核苷酸的改變使得第99位的氨基酸由F變為S，第585位核苷酸的改變使得第138位的氨基酸由S變為T，第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變為T，第708位核苷酸的改變使得第179位的氨基酸由G變為S。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.53∶1(表4)。
pSE295包含2個核苷酸突變，即第588位的核苷酸從G變為A，第856位的核苷酸從T變為C。第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變為T，第856位核苷酸的改變使得第228位的氨基酸由M變為T。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.80∶1(表4)。
pSE296包含5個核苷酸突變，即第155位的核苷酸從T變為C，第505位的核苷酸從G變為T，第1039位的核苷酸從C變為T，第1202位的核苷酸從C變為T，第1210位的核苷酸從T變為C。第505位核苷酸的改變使得第111位的氨基酸由G變為V，第1039位核苷酸的改變使得第289位的氨基酸由P變為L。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.73∶1(表4)。
pSE297包含4個核苷酸突變，即第377位的核苷酸從G變為T，第588位的核苷酸從G變為A，第633位的核苷酸從A變為G，第1067位的核苷酸從A變為T。第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變為T，第633位核苷酸的改變使得第154位的氨基酸由K變為E，第1067位核苷酸的改變使得第298位的氨基酸由Q變為H。攜有該質粒的細胞所產生的B2∶B1之比為0.67∶1(表4)。
表4
9.實施例5′端缺失突變體的構建如上面第5.1節所述，圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈霉菌核苷酸序列在第42、174、177及180位(它們都是潛在的起始位點)含有四種不同的GTG密碼子。本節將要描述aveC ORF(圖1；SEQ ID NO1)5′區多重缺失的構建，以幫助確定這些密碼子中哪個在aveC ORF中用作蛋白表達的起始位點。
帶有5’端不同缺失的aveC基因片段可通過PCR擴增從除蟲鏈霉菌染色體DNA中分離。PCR引物根據aveC DNA序列設計，由GenosysBiotechnologies公司提供。右向引物為5′-AACCCATCCGAGCCGCTC-3′(SEQ ID NO16)(D1F1)；5′-TCGGCCTGCCAACGAAC-3’(SEQ ID NO17)(D1F2)；5′-CCAACGAACGTGTAGTAG-3′(SEQ ID NO18)(D1F3)；及5′-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3′(SEQ ID NO19)(D2F2)。左向引物為5′-CATGATCGCTGAACCGA-3′(SEQ ID NO20)；5′-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3′(SEQ ID NO21)；及5′-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3′(SEQ ID NO22)。PCR反應如上文第8.3節所述。
PCR產物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分辨，所測單一DNA帶為約1.0Kb或1.1Kb。從凝膠中純化PCR產物，并依照操作手冊用25ng線性化pCR2.1載體(Invitrogen)以載體-插入片段為1∶10摩爾的比例進行連接。依照操作手冊用連接混合物轉化One ShotTM感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen)。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，該插入片段的存在通過限制性分析及DNA序列分析確認。這些質粒被命名為pSE190(用引物D1F1獲得)、pSE191(用引物D1F2獲得)、pSE192(用引物D1F3獲得)及pSE193(用引物D2F2獲得)。
將每種DNA插入子用BamHI/XbaI消化，電泳分辨，從凝膠中純化，分別與已用BamHI/XbaI消化的穿梭載體pWHM3在總DNA濃度為1μg的1∶5摩爾比載體-插入片段比例中連接。用連接混合物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，插入片段的存在可通過限制性分析確認。將這些質粒命名為pSE194(D1F1)、pSE195(D1F2)、pSE196(D1F3)及pSE197(D2F2)，分別轉化至大腸桿菌DM1株中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性分析確認正確插入片段的存在。用該DNA轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅霉素抗性轉化體的存在，通過HPLC分析發酵產物來分析ThiorErmr轉化體以確定哪一個GTG位點為aveC表達所必需。結果表明可以消除42位的GTG密碼子而不影響aveC的表達，因為當pSE194、pSE195及pSE196(都缺乏42位的GTG位點，但都在174、177及180位含有三個GTG位點)轉化進SE180-11時，分別都能恢復正常除蟲菌素的產量。只有當SE180-11株用缺少所有這四種GTG位點的pSE197進行轉化時，其才不能恢復正常除蟲菌素的產量(表5)。
表5
10.實施例對來自吸水鏈霉菌和產灰色鏈霉菌的aveC同系物的克隆本發明還允許對來自鏈霉菌屬產除蟲菌素或蜜比霉素的其它菌種的aveC同源基因進行鑒定和克隆。例如，使吸水鏈霉菌(FERM BP-1901)基因組DNA的粘粒文庫與上述除蟲鏈霉菌的1.2Kb aveC探針雜交。鑒定出強雜交的幾個粘粒克隆。從這些粘粒中分離染色體DNA，并鑒定出與aveC探針雜交的4.9Kb KpnI片段。測定該DNA的序列，鑒定出與除蟲鏈霉菌的aveC ORF有很明顯同源性的ORF(SEQ ID NO3)。從吸水鏈霉菌aveC同系物ORF推導出來的氨基酸序列(SEQ ID NO4)如圖6所示。
此外，將產灰色鏈霉菌基因組DNA的粘粒文庫與來自上述除蟲鏈霉菌的1.2Kb aveC探針雜交。鑒定出強雜交的幾寡個粘粒克隆。從這些粘粒中分離染色體DNA，鑒定出與aveC探針雜交的5.4Kb PstI片段。對該DNA進行測序，并鑒定出與除蟲鏈霉菌的aveC ORF有很明顯同源性的aveC同系物的部分ORF。推導的部分氨基酸序列(SEQ ID NO5)如圖6所示。
對吸水鏈霉菌和產灰色鏈霉菌中aveC同系物的DNA和氨基酸序列分析顯示這些區域彼此有明顯同源性(在氨基酸水平上約有50％的序列同一性)或與除蟲鏈霉菌aveC ORF及AveC基因產物也有明顯同源性(圖6)。
11.實施例構建一種質粒，其中aveC基因位于ermE啟動子之后將pSE186的1.2Kb aveC ORF亞克隆至pSE34中，該pSE34是將300bpermE啟動子作為一個KpnI/BamHI片段插入pWHM3的KpnI/BamHI位點的穿梭載體pWHM3(見Ward等，1986，Mol.Gen.Genet 203468478)。用BamHI及HindIII消化pSE186，通過電泳分辨消化物，從瓊脂糖凝膠中分離1.2Kb片段，與已用BamHI及HindIII消化的pSE34連接。依照操作說明，將該連接混合物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過限制性分析確認1.2Kb插入片段的存在。將該質粒(命名為pSE189)轉化至大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA。用pSE189轉化除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的原生質體。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，并通過HPLC分析發酵產物來進行分析。
含有pSE189的除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株轉化體所產除蟲菌素環己基-B2與環己基-B1比例(約3∶1)相對于菌株1100-SC38所產生的上述物質的比例(約34∶1)已經改變，但與用pSE119進行轉化的1100-SC38菌株相比，總的除蟲菌素產量增加了約2.4倍(表6)。
也可將pSE189轉化至野生型除蟲鏈霉菌菌株的原生質體中。分離硫鏈絲菌肽抗性轉化株，并通過HPLC分析發酵產物來進行分析。用pSE189轉化的除蟲鏈霉菌野生型的除蟲菌素總產量與用pSE119轉化的野生型除蟲鏈霉菌菌株相比增加了2.2倍(表6)。
表6
12.實施例含有除蟲鏈霉菌aveC ORF及吸水鏈霉菌aveC同系物序列的嵌合質粒如下所述，構建命名為pSE350的雜合質粒，其用吸水鏈霉菌aveC同系物中的564bp部分取代了除蟲鏈霉菌aveC ORF中的564bp的同系物部分(見圖7)。使用BsaAI限制性位點和KpnI限制性位點構建pSE350，其中BsaAI限制性位點在所述兩序列中保守(aveC 225位)，KpnI限制性位點存在于除蟲鏈霉菌aveC基因中(aveC 810位)。用上述第7.1.10節所述PCR條件，通過PCR將KpnI位點引入吸水鏈霉菌DNA中，其所用的右向引物為5′-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3′(SEQ ID NO23)，左向引物為5′-GAACTGGTACCAGTGCCC-3′(SEQ ID NO24)(由Genosys Biotechnologies公司提供)。將PCR產物用BsaAI及KpnI消化，在1％瓊脂糖凝膠中電泳來分離這些片段，從凝膠中分離564bp的BsaAI/KpnI片段。將pSE179(如第7.1.10節所述)用KpnI及HindIII消化，在1％瓊脂糖凝膠中電泳，從凝膠中分離約4.5Kb的片段。pSE179用HindIII及BsaAl消化，在1％瓊脂糖凝膠中電泳，從凝膠中分離約0.2Kb的BsaAI/HindIII片段。將所述4.5Kb的HindIII/kpnI片段、0.2KbBsaAI/HindIII片段及來自吸水鏈霉菌的564bp的BsaAI/KpnI片段以3步驟連接反應連接在一起，將該連接混合物轉化進感受態的大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離質粒DNA，用KpnI及AvaI限制性分析確認該正確插入片段的存在。該質粒用HindIII及XbaI消化以釋放1.2Kb插入片段，然后與pWHM3(其已經用HindIII及XbaI消化)進行連接。將該連接混合物轉化進感受態的大腸桿菌DH5α細胞中。從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，并用HindIII及AvaI限制性分析確認正確插入片段的存在。該質粒DNA轉化至大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認正確插入片段的存在。該質粒被命名為pSE350，并用于轉化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定有紅霉素抗性存在，并通過HPLC分析發酵產物對ThiorErmr轉化體進行分析。結果顯示出含有除蟲鏈霉菌/吸水鏈霉菌雜合質粒的轉化體的平均B2∶B1比例約為109∶1(參見表7)。
表7
生物材料的保藏
1998年1月29日，下列生物材料保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，保藏號為質粒 保藏號質粒pSE180 209605質粒pSE186 209604以上所引用的全部的專利，專利申請，及公開文獻在此全面引作參考。
本發明并不局限于本文所述具體實施方案的范圍，這些僅為本發明各個方面的個別舉例，功能上相當的方法及組分都屬于本發明的范圍。實際上，除了上述說明及示例外，從上述說明和附圖，本發明的各種變化對于本領域技術人員來說都是很明顯的。這些變化都將落入所附權利要求書的保護范圍之內。
序列表<110>輝瑞產品公司(PFIZER PRODUCTS INC.)<120>介導除蟲菌素B2∶B1比例的除蟲鏈霉菌基因<130>PC10650A<140>PC10650A<141>1999-08-12<150>60,148,645<151>1999-08-12<160>25<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>1229<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<220><221>CDS<222>(174)..(1085)<400>1tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg176Val1gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac 224Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr5 10 15gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg 272Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr20 25 30gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg 320Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val35 40 45gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg 368Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala Trp50 55 60 65ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt 416Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu70 75 80ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg agc tgg cag agc ccg ctc atg aac 464Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met Asn85 90 95tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg 512Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val100 105 110ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt 560Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro Gly115 120 125gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg gct 608Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala130 135 140 145ctg atc gtc acc gtg ctg tgc agc aag gca ctg ggg tgg atc aag gcc 656Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys Ala150 155 160cgc cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc 704Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe Phe165 170 175atc ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg 752Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly180 185 190atc agc gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc 800Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly195 200 205gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc 848Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu Val210 215 220 225tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag 896Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu230 235 240tcg tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg aac 944Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala Asn
245 250 255tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg ttc 992Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe260 265 270ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg 1040Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln Pro275 280 285ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac tga 1085Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr290 295 300gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205acactcctcg gttcagcgat catg1229<210>2<211>303<212>PRT<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>2Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala1 5 10 15Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu20 25 30Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp35 40 45Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala50 55 60Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala65 70 75 80Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met85 90 95Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala100 105 110Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro115 120 125Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser130 135 140Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys145 150 155 160Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe165 170 175Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser180 185 190Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser195 200 205Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu210 215 220Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp225 230 235 240Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala245 250 255Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met260 265 270Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln275 280 285Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr290 295 300<210>3<211>1150<212>DNA<213>吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<220><221>CDS<222>(58)..(990)<400> 3gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg57gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val1 5 10 15ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc 153Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly20 25 30tac cgc atc gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag 201Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu35 40 45cgg atc gcc gat gtg ctg atc ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg 249Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val50 55 60gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg 297Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu65 70 75 80acg ttc gac gcg tcg ctc ttc atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag 345Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln85 90 95agt ccc ttg atg aac tgg atc aat ccg gtg ctc gcg tca aac gtc aat 393Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn100 105 110gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln115 120 125ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg agc 489Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser130 135 140atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met145 150 155 160ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc 585Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile165 170 175gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg 633Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu180 185 190gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg 681Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu195 200 205acc atc tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg 729Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val210 215 220gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc 777Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg225 230 235 240aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro245 250 255gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala260 265 270aac atc agc atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu275 280 285ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe290 295 300cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020Arg Pro Ala Ala Gly Tyr305 310gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140gcggccgggg1150<210>4<211>310<212>PRT<213>吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<400>4Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val1 5 10 15Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly20 25 30Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu35 40 45Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val50 55 60Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu65 70 75 80Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln85 90 95Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn100 105 110Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln115 120 125Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser130 135 140Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met145 150 155 160Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile165 170 175Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu180 185 190Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu195 200 205Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val210 215 220Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg225 230 235 240Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro245 250 255Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala260 265 270Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu275 280 285Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe290 295 300Arg Pro Ala Ala Gly Tyr305 310<210>5<211>215<212>PRT<213>產灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)<400>5Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val1 5 10 15Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp20 25 30Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp35 40 45Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe50 55 60Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala65 70 75 80Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met85 90 95Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala100 105 110Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro115 120 125Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr
130 135 140Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg145 150 155 160Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe165 170 175Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala180 185 190Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg195 200 205Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg210 215<210>6<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>6tcacgaaacc ggacacac 18<210>7<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>7catgatcgct gaaccgag 18<210>8<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>8ggttccggat gccgttctcg20<210>9<211>21<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>9aactccggtc gactcccctt c21<210>10<211>19<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>10gcaaggatac ggggactac 19<210>11<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>11gaaccgaccg cctgatac18<210>12<211>43<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>12gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg43<210>13<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>13ggaaccgacc gcctgataca 20<210>14<211>46<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>14gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc 46<210>15<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>15ggaacatcac ggcattcacc 20<210>16<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>16aacccatccg agccgctc 18<210>17<211>17<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>17tcggcctgcc aacgaac17<210>18<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>18ccaacgaacg tgtagtag 18<210>19<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>19tgcaggcgta cgtgttcagc 20<210>20<211>17<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>20catgatcgct gaaccga17<210>21<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>21catgatcgct gaaccgagga 20<210>22<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>22aggagtgtgg tgcgtctgga 20<210>23<211>19<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>23cttcaggtgt acgtgttcg 19<210>24<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>24gaactggtac cagtgccc 18<210>25<211>46<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>25gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc4權利要求
1.一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因，質粒pSE186(ATCC 209604)上的除蟲鏈霉菌AveC基因產物編碼序列或圖1(SEQID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但該核苷酸序列還包含一或多個突變，所述突變編碼了在對應于SEQ ID NO2中第38，48，89，99，111，136，154，179，228，238，289或298位的一或多個氨基酸殘基上的氨基酸取代，使得除蟲鏈霉菌ATCC53692株中野生型aveC等位基因已失活但能表達含所述突變型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細胞所產生的除蟲菌素中2類∶1類的比例不同于除蟲鏈霉菌ATCC 53692株中僅表達野生型aveC等位基因的那些細胞所產生的比例。
2.權利要求1的多核苷酸分子，其中所述除蟲菌素2類∶1類為除蟲菌素環己基B2∶環己基B1。
3.權利要求2的多核苷酸分子，其中所述不同的除蟲菌素2類∶1類的比例是相對于除蟲鏈霉菌ATCC 53692株中僅表達野生型aveC等位基因的那些細胞所產生的2類∶1類之比例為降低的比例。
4.權利要求3的多核苷酸分子，其中所述除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.8∶1或更低。
5.權利要求3的多核苷酸分子，其中所述除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.68∶1或更低。
6.權利要求3的多核苷酸分子，其中所述除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.53∶1或更低。
7.權利要求3的多核苷酸分子，其中所述除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.42∶1或更低。
8.權利要求3的多核苷酸分子，其中所述除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.40∶1或更低。
9.權利要求1的多核苷酸分子，其中所述核苷酸序列還包括一或多個突變，所述突變在對應于SEQ ID NO2中第138和139位的一個或兩個氨基酸殘基處編碼氨基酸取代。
10.權利要求2的多核苷酸，其中所述氨基酸取代選自下組的一或多項(a)第38位的氨基酸殘基Q被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(b)第48位的氨基酸殘基D被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(c)第89位的氨基酸殘基A被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(d)第99位的氨基酸殘基F被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(e)第111位的氨基酸殘基G被V取代或被相對于V為保守取代的一種氨基酸取代；(f)第136位的氨基酸殘基L被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(g)第154位的氨基酸殘基K被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(h)第179位的氨基酸殘基G被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(i)第228位的氨基酸殘基M被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(j)第238位的氨基酸殘基E被D取代或被相對于D為保守取代的一種氨基酸取代；(k)第289位的氨基酸殘基P被L取代或被相對于L為保守取代的一種氨基酸取代；(l)第298位的氨基酸殘基Q被H取代或被相對于H為保守取代的一種氨基酸取代。
11.權利要求2的多核苷酸分子，其中一種氨基酸殘基的組合已突變，且其中該組合選自下組的一或多項(a)氨基酸殘基D48和A89；(b)氨基酸殘基S138，A139和G179；(c)氨基酸殘基Q38，L136和E238；(d)氨基酸殘基F99，S138，A139和G179；(e)氨基酸殘基A139和M228；(f)氨基酸殘基G111和P289；和(g)氨基酸殘基A139，K154和Q298。
12.權利要求11的多核苷酸分子，其中所述氨基酸取代的組合選自下組的一或多項(a)D48E/A89T；(b)S138T/A139T/G179S；(c)Q38P/L136P/E238D；(d)F99S/S138T/A139T/G179S；(e)A139T/M228T；(f)G111V/P289L；和(g)A139T/K154E/Q298H。
13.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼D48E/A89T的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第317位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第438位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
14.權利要求13的多核苷酸分子，還包括在對應于SEQ ID NO1中第353位的核苷酸位置從C到A的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第1155位的核苷酸位置從T到A的堿基改變。
15.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼S138T/A139T/G179S的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第585位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第708位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
16.權利要求15的多核苷酸分子，還包括在對應于SEQ ID NO1中第272位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
17.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼Q38P/L136P/E238D的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第286位的核苷酸位置從A到C的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第580位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第886位的核苷酸位置從A到T的堿基改變。
18.權利要求17的多核苷酸分子，還包括在對應于SEQ ID NO1中第24位的核苷酸位置從A到G的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第497位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第554位的核苷酸位置從C到T的堿基改變。
19.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼F99S/S138T/A139T/G179S的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第173，174和175位的核苷酸位置有3個堿基對的缺失，在對應于SEQ ID NO1中第469位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第585位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第708位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
20.權利要求19的多核苷酸分子，還包括在對應于SEQ ID NO1中第833位的核苷酸位置從C到T的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第1184位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
21.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼A139T/M228T的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第856位的核苷酸位置從T到C的堿基改變。
22.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼G111V/P289L的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第505位的核苷酸位置從G到T的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第1039位的核苷酸位置從C到T的堿基改變。
23.權利要求22的多核苷酸分子，還包括在對應于SEQ ID NO1中第155位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第1202位的核苷酸位置從C到T的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第1210位的核苷酸位置從T到C的堿基改變。
24.權利要求12的多核苷酸分子，其中所述在aveC序列中編碼A139T/K154E/Q298H的突變包括在對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，在對應于SEQ ID NO1中第633位的核苷酸位置從A到G的堿基改變，以及在對應于SEQ ID NO1中第1067位的核苷酸位置從A到T的堿基改變。
25.權利要求24的多核苷酸分子，還包括在對應于SEQ ID NO1中第377位的核苷酸位置從G到T的堿基改變。
26.一種重組載體，其含有權利要求1的多核苷酸分子。
27.一種宿主細胞，其含有權利要求1的多核苷酸分子或權利要求26的重組載體。
28.權利要求27的宿主細胞，其為鏈霉菌屬的細胞。
29.一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括使除蟲鏈霉菌菌株的細胞中aveC等位基因發生突變，該突變導致在AveC基因產物中對應于SEQ IDNO2中第38，48，89，99，111，136，138，139，154，179，228，238，289或298位的一或多個氨基酸位置上不同氨基酸殘基的取代，使得aveC等位基因已經如此突變了的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例不同于除蟲鏈霉菌相同菌株中那些僅表達野生型aveC等位基因的細胞所產生的比例。
30.權利要求29的方法，其中所述除蟲菌素2類∶1類為除蟲菌素環己基B2∶環己基B1。
31.權利要求30的方法，其中所述不同的除蟲菌素2類∶1類的比例是降低的比例。
32.權利要求31的方法，其中所述由aveC等位基因已經如此突變了的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.8∶1或更低。
33.權利要求31的方法，其中所述由aveC等位基因已經如此突變了的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.68∶1或更低。
34.權利要求31的方法，其中所述由aveC等位基因已經如此突變了的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.53∶1或更低。
35.權利要求31的方法，其中所述由aveC等位基因已經如此突變了的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.42∶1或更低。
36.權利要求31的方法，其中所述由aveC等位基因已經如此突變了的除蟲鏈霉菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.40∶1或更低。
37.權利要求31的方法，還包括在aveC等位基因中引入一或多個突變，所述突變在對應于SEQ ID NO2中第138和139位的一個或兩個氨基酸殘基處編碼氨基酸取代。
38.權利要求30的方法，其中所述氨基酸取代選自下組的一或多項(a)第38位的氨基酸殘基Q被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(b)第48位的氨基酸殘基D被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(c)第89位的氨基酸殘基A被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(d)第99位的氨基酸殘基F被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(e)第111位的氨基酸殘基G被V取代或被相對于V為保守取代的一種氨基酸取代；(f)第136位的氨基酸殘基L被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(g)第154位的氨基酸殘基K被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(h)第179位的氨基酸殘基G被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(i)第228位的氨基酸殘基M被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(j)第238位的氨基酸殘基E被D取代或被相對于D為保守取代的一種氨基酸取代；(k)第289位的氨基酸殘基P被L取代或被相對于L為保守取代的一種氨基酸取代；(l)第298位的氨基酸殘基Q被H取代或被相對于H為保守取代的一種氨基酸取代。
39.權利要求30的方法，其中aveC等位基因已突變從而在氨基酸位置的組合中編碼氨基酸取代，且其中該組合選自下組的一或多項(a)氨基酸殘基D48和A89；(b)氨基酸殘基S138，A139和G179；(c)氨基酸殘基Q38，L136和E238；(d)氨基酸殘基F99，S138，A139和G179；(e)氨基酸殘基A139和M228；(f)氨基酸殘基G111和P289；和(g)氨基酸殘基A139，K154和Q298。
40.權利要求39的方法，其中所述氨基酸取代的組合選自下組的一或多項(a)D48E/A89T；(b)S138T/A139T/G179S；(c)Q38P/L136P/E238D；(d)F99S/S138T/A139T/G179S；(e)A139T/M228T；(f)G111V/P289L；和(g)A139T/K154E/Q298H。
41.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼D48E/A89T的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第317位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第438位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
42.權利要求41的方法，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第353位的核苷酸位置從C到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1155位的核苷酸位置從T到A的堿基改變。
43.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼S138T/A139T/G179S的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第585位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第708位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
44.權利要求43的方法，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第272位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
45.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼Q38P/L136P/E238D的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第286位的核苷酸位置從A到C的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第580位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第886位的核苷酸位置從A到T的堿基改變。
46.權利要求45的方法，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第24位的核苷酸位置從A到G的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQID NO1中第497位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第554位的核苷酸位置從C到T的堿基改變。
47.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼F99S/S138T/A139T/G179S的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第173，174和175位的核苷酸位置有3個堿基對的缺失，在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第469位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第585位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第708位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
48.權利要求47的方法，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第833位的核苷酸位置從C到T的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1184位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
49.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼A139T/M228T的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第856位的核苷酸位置從T到C的堿基改變。
50.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼G111V/P289L的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第505位的核苷酸位置從G到T的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第1039位的核苷酸位置從C到T的堿基改變。
51.權利要求50的方法，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第155位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQID NO1中第1202位的核苷酸位置從C到T的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1210位的核苷酸位置從T到C的堿基改變。
52.權利要求40的方法，其中所述在aveC等位基因中編碼A139T/K154E/Q298H的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQID NO1中第633位的核苷酸位置從A到G的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1067位的核苷酸位置從A到T的堿基改變。
53.權利要求52的方法，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第377位的核苷酸位置從G到T的堿基改變。
54.一種含有突變型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌細胞，所述突變型aveC等位基因編碼一種AveC基因產物，該產物在對應于SEQ ID NO2中第38，48，89，99，111，136，154，179，228，238，289或298位的一或多個氨基酸位置上具有取代，其中所述細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例不同于除蟲鏈霉菌相同菌株中那些僅表達野生型aveC等位基因的細胞所產生的比例。
55.權利要求54的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述除蟲菌素2類∶1類為除蟲菌素環己基B2∶環己基B1。
56.權利要求55的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述不同的除蟲菌素2類∶1類的比例是降低的比例。
57.權利要求56的除蟲鏈霉菌細胞，其產生約0.8∶1或更低的除蟲菌素2類∶1類的比例。
58.權利要求56的除蟲鏈霉菌細胞，其產生約0.68∶1或更低的除蟲菌素2類∶1類的比例。
59.權利要求56的除蟲鏈霉菌細胞，其產生約0.53∶1或更低的除蟲菌素2類∶1類的比例。
60.權利要求56的除蟲鏈霉菌細胞，其產生約0.42∶1或更低的除蟲菌素2類∶1類的比例。
61.權利要求56的除蟲鏈霉菌細胞，其產生約0.40∶1或更低的除蟲菌素2類∶1類的比例。
62.權利要求55的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述aveC等位基因還編碼在對應于SEQ ID NO2中第138和139位的一個或兩個氨基酸殘基處的氨基酸取代。
63.權利要求55的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述氨基酸取代選自下組的一或多項(a)第38位的氨基酸殘基Q被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(b)第48位的氨基酸殘基D被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(c)第89位的氨基酸殘基A被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(d)第99位的氨基酸殘基F被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(e)第111位的氨基酸殘基G被V取代或被相對于V為保守取代的一種氨基酸取代；(f)第136位的氨基酸殘基L被P取代或被相對于P為保守取代的一種氨基酸取代；(g)第154位的氨基酸殘基K被E取代或被相對于E為保守取代的一種氨基酸取代；(h)第179位的氨基酸殘基G被S取代或被相對于S為保守取代的一種氨基酸取代；(i)第228位的氨基酸殘基M被T取代或被相對于T為保守取代的一種氨基酸取代；(j)第238位的氨基酸殘基E被D取代或被相對于D為保守取代的一種氨基酸取代；(k)第289位的氨基酸殘基P被L取代或被相對于L為保守取代的一種氨基酸取代；(l)第298位的氨基酸殘基Q被H取代或被相對于H為保守取代的一種氨基酸取代。
64.權利要求55的除蟲鏈霉菌細胞，其中aveC等位基因已突變從而在一氨基酸位置的組合中編碼氨基酸取代，且其中該組合選自下組的一或多項(a)氨基酸殘基D48和A89；(b)氨基酸殘基S138，A139和G179；(c)氨基酸殘基Q38，L136和E238；(d)氨基酸殘基F99，S138，A139和G179；(e)氨基酸殘基A139和M228；(f)氨基酸殘基G111和P289；和(g)氨基酸殘基A139，K154和Q298。
65.權利要求64的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述氨基酸取代的組合選自下組的一或多項(a)D48E/A89T；(b)S138T/A139T/G179S；(c)Q38P/L136P/E238D；(d)F99S/S138T/A139T/G179S；(e)A139T/M228T；(f)G111V/P289L；和(g)A139T/K154E/Q298H。
66.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼D48E/A89T的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第317位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第438位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
67.權利要求66的除蟲鏈霉菌細胞，還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第353位的核苷酸位置從C到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1155位的核苷酸位置從T到A的堿基改變。
68.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼S138T/A139T/G179S的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第585位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第708位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
69.權利要求68的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼S138T/A139T/G179S的突變還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第272位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
70.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼Q38P/L136P/E238D的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第286位的核苷酸位置從A到C的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第580位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第886位的核苷酸位置從A到T的堿基改變。
71.權利要求70的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼Q38P/L136P/E238D的突變還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第24位的核苷酸位置從A到G的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第497位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第554位的核苷酸位置從C到T的堿基改變。
72.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼F99S/S138T/A139T/G179S的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第173，174和175位的核苷酸位置有3個堿基對的缺失，在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第469位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第585位的核苷酸位置從T到A的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第708位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
73.權利要求72的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼F99S/S138T/A139T/G179S的突變還包括在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第833位的核苷酸位置從C到T的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1184位的核苷酸位置從G到A的堿基改變。
74.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼A139T/M228T的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第856位的核苷酸位置從T到C的堿基改變。
75.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼G111V/P289L的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第505位的核苷酸位置從G到T的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第1039位的核苷酸位置從C到T的堿基改變。
76.權利要求75的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼G111V/P289L的突變還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第155位的核苷酸位置從T到C的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQ IDNO1中第1202位的核苷酸位置從C到T的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1210位的核苷酸位置從T到C的堿基改變。
77.權利要求65的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼A139T/K154E/Q298H的突變包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第588位的核苷酸位置從G到A的堿基改變，在aveC等位基因中對應于SEQID NO1中第633位的核苷酸位置從A到G的堿基改變，以及在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第1067位的核苷酸位置從A到T的堿基改變。
78.權利要求77的除蟲鏈霉菌細胞，其中所述在aveC等位基因中編碼A139T/K154E/Q298H的突變還包括在aveC等位基因中對應于SEQ ID NO1中第377位的核苷酸位置從G到T的堿基改變。
79.一種產生除蟲菌素的方法，包括在允許或誘導除蟲菌素產生的條件下于培養基中培養權利要求55的細胞，并從該培養中回收所述除蟲菌素。
80.一種由除蟲鏈霉菌細胞產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的組合物，在培養了細胞的培養基中含有約0.68∶1或更低的除蟲菌素環己基B2∶環己基B1。
81.一種由除蟲鏈霉菌菌株的細胞產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的組合物，該組合物在培養了細胞的培養基中含有約0.68∶1或更低比例的除蟲菌素環己基B2∶環己基B1，其中所述菌株能表達一種突變的aveC等位基因，該等位基因編碼的產物可使這些細胞產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的2類∶1類比例相對于同樣的除蟲鏈霉菌菌株中僅表達野生型aveC等位基因的那些細胞所產生的2類∶1類之比例為降低。
全文摘要
本發明涉及含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子,該多核苷酸分子可被用于改變除蟲鏈霉菌發酵培養物中所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。本發明進一步涉及除蟲鏈霉菌的載體、宿主細胞和突變菌株,其中aveC基因已失活或突變以改變所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。
文檔編號C12N1/21GK1373809SQ00811747
公開日2002年10月9日 申請日期2000年7月24日 優先權日1999年8月12日
發明者陳燕, 克萊斯·古斯塔夫森, 安克·克雷伯, 杰里米·S·明歇爾, 薩恩·A·雷拉德, 金·J·施圖茨曼-恩格沃爾 申請人:輝瑞產品公司