阿考霉素,其生產方法及其作為藥物的用途的制作方法

專利名稱：阿考霉素,其生產方法及其作為藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及名稱為阿考霉素(Amycomycin)的化合物、其可藥用鹽和衍生物，該化合物可以通過培養擬無枝酸菌屬(Amycolatopsissp.)微生物ST101170(DSM 12216)制得。本發明還涉及生產阿考霉素的方法、阿考霉素及其可藥用鹽和衍生物作為藥物、特別是抗生素的用途，以及含有阿考霉素或其可藥用鹽或衍生物的藥物組合物。
甲氧西林抗藥性的金黃色葡萄球菌(MRSA)感染在許多感染性病癥例如傷口和燒傷中是非常常見的。萬古霉素和替考拉寧(屬于糖肽類)是臨床上用于治療MRSA感染的僅有的兩種抗生素。但是，由于最近出現的萬古霉素和替考拉寧抗藥性的菌株，這些感染已經變成危險和致命性的。因此，人們開始廣泛尋找對這些萬古霉素和替考拉寧抗藥性菌株有活性的不同結構類型的化合物。例如，曾報道了對萬古霉素和替考拉寧抗藥性菌株具有抗生素活性的甲基硫霉素I(一種環狀的硫肽)[EP-A-0818539，1996年7月11日申請]。
現已發現，名稱為阿考霉素的新化合物具有抗生素活性。因此，本發明涉及下式的化合物及其可藥用鹽和衍生物，例如酯、醚和其它顯而易見的化學等同物，包括所有的立體異構體形式和所有的互變異構體形式
阿考霉素具有特征性的tetramic acid部分，有高度氧合的C45-側鏈。其分子式為C65H115NO18，可以通過在需氧條件下、在含有碳和氮源的營養培養基中培養擬無枝酸菌屬微生物ST101170(DSM 12216)，然后以常規方式分離和純化制得。微生物ST101170屬于放線菌目擬無枝酸菌屬，于1998年6月4日在德國微生物和細胞培養物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)，Braunschweig，Deutschland保藏，保藏號為DSM No.12216。
本發明還提供了在需氧條件下、在含有一種或多種碳源和一種或多種氮源以及選擇性的營養無機鹽和/或微量元素的營養培養基中，從擬無枝酸菌屬ST101170、其突變體和變異體生產名稱為阿考霉素的化合物，然后分離所述化合物并以常規方式進行純化的方法。
微生物ST101170的突變體和變異體也可以合成本發明的化合物。所述突變體可以以已知的方式、通過物理方法例如用紫外線或X射線輻射或用化學誘變劑例如甲基磺酸乙酯(EMS)、2-羥基-4-甲氧基-二苯酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)進行生產。
對于可生產本發明化合物的適宜突變體和變異體的篩選可以通過測定培養肉湯中積聚的活性化合物的生物學活性來證實，例如，測試抗菌作用、特別是對萬古霉素抗藥性菌株的抗菌作用(參見下表2)。
適于需氧發酵的優選的碳源是可同化的碳水化合物和糖醇例如葡萄糖、乳糖或D-Mannit以及含有碳水化合物的天然產物例如麥芽汁。適宜的氮源是，例如氨基酸、肽和蛋白質，包括其降解產物例如胨或胰胨、肉膏、研碎的玉米、白豆、大豆或棉樹等的種子、生產酒的蒸餾殘渣、肉和酵母提取物，以及銨鹽和硝酸鹽。營養溶液中可以含有的適宜的無機鹽是，例如堿金屬或堿土金屬、鐵、鋅、鈷或錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。
阿考霉素的形成在例如含有約0.5至5％淀粉(可溶性的)、優選1至2％，約0.5至5％葡萄糖、優選1至3％，約0.5至5％甘油、優選1至2％，約0.1至0.5％玉米漿、優選0.2至0.3％，約0.2至1％胨、優選0.4至0.6％，約0.1至0.5％酵母提取物、優選0.2至0.4％，約0.05至0.2％氯化鈉、優選0.1至0.2％和約0.1至0.5％CaCO3、優選0.2至0.3％的營養培養基中進行的特別好。這些含量是以整個營養培養基的重量計的。
ST101170的培養在需氧條件下進行，例如，在振蕩或攪拌下、在振動燒瓶或實驗室發酵罐中浸沒培養，并可以選擇性地通入空氣或氧氣。發酵培養可以在例如各種容積的無菌廣口瓶或圓底燒瓶中、在玻璃發酵罐或V2A-鋼罐中進行。
ST101170的培養可以在20℃至約35℃、優選約25℃至約30℃的溫度下和4至10、優選6至8的pH下進行。在這些條件下將微生物培養20至200小時、優選24至150小時。
培養優選分多個階段進行。首先，可以在液體營養培養基中制備一種或多種預培養物。然后將主要培養物(實際的生產培養基)用預培養物以例如1∶10的體積比接種。通過將營養培養基用生成孢子的菌絲體接種并使其生長約20至約120小時、優選24至90小時得到預培養物。生成孢子的菌絲體可以通過例如使微生物在固體或液體營養培養基例如酵母-麥芽瓊脂或土豆-葡萄糖瓊脂上生長約1至約40天、優選5至12天制得。
發酵和形成阿考霉素的過程可以通過技術人員已知的方法進行監測，例如，通過在生物測定中測定培養肉湯的生物學活性或者通過色譜方法例如薄層色譜(DC)或高壓液相色譜(HPLC)進行監測。
化合物阿考霉素存在于培養物的濾液以及菌絲體中。通常主要是存在于菌絲體中。可將化合物用已知的分離技術進行分離。因此，可將其通過例如過濾或離心從培養物的濾液中回收。可將濾液用與水不相混溶的溶劑例如1-丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等萃取，優選丁醇或乙酸乙酯。
還可將活性物質通過用可與水混溶的溶劑例如甲醇、丙酮、乙腈、正丙醇或異丙醇、優選甲醇或丙酮，或與水不相混溶的溶劑例如叔丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等、優選丁醇或乙酸乙酯萃取從菌絲體回收。
對培養物濾液的萃取可以在寬的pH值范圍內進行。但優選在中性或弱酸性的介質中、優選在pH 4到9的條件下進行萃取。可將有機萃取液真空濃縮然后干燥得到活性粗品物質。
化合物阿考霉素的分離或純化可以根據天然化合物的化學、物理和生物學性質以已知的方式進行。
本發明的一種分離阿考霉素的方法是以已知的方式進行溶液分配。
另一種純化阿考霉素的方法是在吸附樹脂例如DiaionHP-20(Mitsubishi Casei Corp.，Tokyo)、AmberliteXAD 7(Rohm和Haas，USA)、AmberchromCG(Toso Haas，Philadelphia，USA)或類似的樹脂上進行色譜分離。分離可以在寬的pH值范圍內進行。優選的pH值范圍是1到9，更優選2到8。還可以采用各種反相載體，例如在關于高壓液相色譜(HPLC)的文章中所公開的RP8和RP18。另一種純化本發明化合物的方法包括以已知的方式使用所謂的正相色譜載體例如硅膠或Al2O3(氧化鋁)等，或其它已知的載體。有許多洗脫劑適用于該目的，例如二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚或其組合。可以通過例如加入三乙胺改變pH值。
另一種分離化合物阿考霉素的方法是以已知的方式使用分子篩例如FractogelTSK HW-40、SephadexLH-20等。此外，還可以通過結晶從粗品物質中回收化合物阿考霉素。適宜的溶劑是例如無水或含水的有機溶劑及其混合物。
另一種分離和純化本發明化合物的方法是使用陰離子交換劑(優選在7到10的pH范圍內)和陽離子交換劑(優選在3到7的pH范圍內)。特別優選使用加有一定量有機溶劑的緩沖溶液。
此外，也可以通過使用由兩種或多種溶劑(例如水、甲醇、乙醇、丁醇、異丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或石油醚)組成的兩相洗脫劑系統的反流色譜法進行純化。
化合物阿考霉素或其化學衍生物可以通過本領域技術人員已知的方法轉化成相應的可藥用鹽。
本發明化合物的可藥用鹽是無機鹽或有機鹽，例如雷明頓藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第17版，1418頁(1985))中所描述的那些。可以使用的鹽是堿金屬鹽、銨鹽、堿土金屬鹽、與生理可接受的胺形成的鹽以及與無機或有機酸例如HCl、HBr、H2SO4、馬來酸和富馬酸形成的鹽。
本發明化合物的顯而易見的化學等同物是那些有微小的化學差異但具有相同或相似活性的化合物，或者是可以在溫和條件下轉化成本發明化合物的化合物。顯而易見的化學等同物的例子是酯、醚、氨基衍生物、本發明化合物的復合物或加合物。
酯可以通過例如將阿考霉素與羧酸在試劑例如二環己基碳二亞胺(DCC)的存在下反應，或通過將化合物與酰化試劑例如酰氯反應來制備。
醚可以通過例如將阿考霉素與烷基化試劑在堿性條件下反應來制備。
在文獻例如有機合成進展(Advanced Organic Synthesis)，第4版，J.March，John Wiley & Sons.，1992中給出了制備酯和醚的其它方法。
化學等同物可以是與金屬離子例如過渡金屬如La3+、Sm3+、Eu3+、Gd3+的穩定的復合物，這是tetramic acid衍生物的特點，并且可以通過文獻(K.Tanaka等，化學藥物通報(Chem.Pharm.)Bull.1979，27，1901；K.Matsuo，Chem.Pharm.Bull.1980，28，2494)中給出的方法進行制備。
烷基側鏈的雙鍵可以通過文獻例如P.N.Rylander，“氫化方法”，Academic Press，New York(1985)，第2章中給出的方法進行還原，或者通過H.O.House在“現代合成反應(Modern SyntheticReactions)”，W.A.Benjymin，Inc.，New York(1972)，pp 446-452中描述的方法氫鹵化。羥基化的衍生物可以通過將雙鍵與試劑例如OsO4按照文獻例如Chem.Rev.1980，80，187中的描述反應進行制備。
還可以通過用例如MCPBA按照有機合成進展(Advanced OrganicSynthesis)，第4版，J.March，John Wiley & Sons.，1992中的描述進行氧化將雙鍵轉化成環氧化物來形成衍生物。
本發明的化合物阿考霉素的物理化學以及光譜學性質如下外觀無色固體，可溶于甲醇、DMSO、吡啶分子式C65H115NO18HPLC(高壓液相色譜)柱Purospher Star RP.18e(Merck)，55×4mm，3μm洗脫劑CH3CN/0.01％H3PO4(85％)梯度時間(分鐘) ％CH3CN0.00 5.03.00 95.05.00 95.06.00 5.010.005.0流速2ml/分鐘溫度40℃檢測210nm，254，280，320，380tR2.67分鐘分子量1198.64 DaHR-FAB-MS1220.801187[M+Na]+1H-和13C-NMR參見表1UV/VISMeOH，max(log)＝229nm(3.29)，281(3.16)表1阿考霉素在MeOD中在300K下的化學位移。

b)寬信號c)這些信號看不到。C60和C69只能用HMQC-波譜指定。
阿考霉素具有突出的抗菌活性，特別是對革蘭氏陽性菌例如葡萄球菌和腸球菌。下表2中給出了阿考霉素對各種細菌的最低抑制濃度。這些菌株最近已逐漸成為問題菌株，即，這些微生物已經開始對現有的抗生素具有抗藥性了。在對萬古霉素-和替考拉寧抗藥性菌株如糞腸球菌、屎腸球菌或鶉雞腸球菌的抑制作用中證實了本發明化合物與其它抗生素相比的優越性。表2最低抑制濃度(mg/L)(微量稀釋試驗)革蘭氏陽性菌株 代碼 阿考霉素萬古霉素金黃色葡萄球菌 011HT3 oxa S ery S0.08 0.3金黃色葡萄球菌 011HT18 ATCC 13709 Smith 0.08 0.3表皮葡萄球菌 012G020 oxa S ery S tet R 0.3 0.6金黃色葡萄球菌 011HT1 nov R ＜＝0.04 0.08金黃色葡萄球菌 011DU5 nov R tet R 0.08 0.15金黃色葡萄球菌 011CB20 oxa R ery Rc tet R 0.08 0.15金黃色葡萄球菌 011G071 ofl S oxa R ery S tet R 0.15 0.6金黃色葡萄球菌 011G064 ofl R oxa R ery Rc tet R0.3 1.2表皮葡萄球菌 012G042 oxa R 0.3 1.2Staph.coag.negative012HT5 ofl R oxa R tet R 0.15 0.6金黃色葡萄球菌 011GR91 pri R oxa R ery R nov R 1.2 1.2化膿性葡萄球菌 02A1SJ1 van S ery Rc0.3 0.15化膿性葡萄球菌 02A1UC1 van S ery S 0.6 0.15化膿性葡萄球菌 02A1F16 ery R 0.6 0.08Strepto gr.G 02G0CB2 tet R rif R nov R 0.6 0.15肺炎鏈球菌 030812 ery R 0.15 0.15米氏鏈球菌 02milGR12ery S van S 1.2 0.3緩癥鏈球菌 02mitGR16ery Ri van S1.2 0.3
屎腸球菌 O2D3AP9 nov S van R ery S tei R 0.6＞40屎腸球菌 O2D3HT12tei R van R ery R tet R 0.6＞40屎腸球菌 O2D31P2 tei R van R ery R tet R ND ＞40屎腸球菌 O2D3HM3 nov S van A ery R tei R 1.2＞40鶉雞腸球菌 O2D0HM8 van C tet R ery S 1.2＞40糞腸球菌 O2D2HM9 nov R van B ery R tei S 2.5＞40糞腸球菌 O2D2UC5 ATCC 29212 nov R2.52.5糞腸球菌 O2D2DU18tet R nov R 1.20.3糞腸球菌 O2D2HT10nov R van S tet R 1.20.6革蘭氏陰性菌 代碼大腸桿菌 DB10 2501P5 ery S fuc S nov SND＞40銅綠假單胞菌 1771 391HT2 ＞40 ＞40銅綠假單胞菌 1771m 391HT3突變體滲透性的 ＞40 ＞40阿考霉素及其可藥用鹽和衍生物可以作為藥物單獨、以相互之間的混合物以及可以通過胃腸外或其它給藥方式給藥的藥物組合物的形式向動物、優選哺乳動物、特別是人給藥。因此，本發明還涉及阿考霉素及其可藥用鹽和衍生物用作藥物以及阿考霉素及其可藥用鹽和衍生物在生產具有抗菌活性的藥物中的用途。本發明還涉及含有有效量的阿考霉素和/或它的一種或多種可藥用鹽和/或衍生物以及可藥用載體的藥物組合物。
阿考霉素可以腸內(口服途徑)、胃腸外(靜脈內或肌肉內)、直腸或局部給藥。含有阿考霉素或其可藥用鹽或衍生物以及其它藥物活性物質的藥物組合物可以通過如下方法制備將活性化合物與一種或多種藥理學可耐受的輔劑和/或賦形劑混合，將該混合物轉化成適于給藥的適當藥物形式例如溶液劑、散劑(片劑、膠囊，包括微膠囊)、軟膏(霜劑或凝膠)、脂質體制劑、脂類復合物、膠態分散液或栓劑。
可用于該類型制劑的輔劑和/或賦形劑是制藥中常用的液體或固體填充劑和填料、溶劑、乳化劑、潤滑劑、矯味劑、著色劑和/或緩沖物質。
通常，適于具體情況的蓋倫制劑和給藥方法以及劑量范圍取決于所治療的物種以及各病癥或疾病的狀態，并且可以用本領域已知的方法使其最佳化。例如，對于體重約為75kg的患者，適宜的劑量是0.001-10mg，優選0.1-5mg，更優選1.0mg。該劑量應至少能夠產生所需的效果。
以下是本發明的說明性實施例，該實施例并不限定本發明的范圍。
將含有100ml營養培養基(10g/l淀粉溶液，10g/l葡萄糖，10g/l甘油99％，2.5g/l玉米漿，5g/l胨，2g/l酵母提取物，1g/l NaCl和3g/l CaCO3)的無菌的Erlenmeyer燒瓶用菌環量的生長培養物(相同的營養溶液，但含有2％的瓊脂)或1ml甘油培養物(參見實施例1)接種然后在28℃和180rpm下在搖動器上培養。在72小時后，化合物阿考霉素的產量達到最大。
培養了72小時的浸沒培養物(按照實施例1描述的搖動培養的方法生產，但采用如下培養基15g/l葡萄糖，15g/l大豆粉，3g/l CaCO3和5g/l NaCl，pH7.5)足以以10％的接種量接種10和200L的發酵罐中。實施例3化合物阿考霉素的生產采用如下參數運行200L的發酵罐營養培養基 10g/l淀粉10g/l葡萄糖10g/l甘油99％2.5g/l玉米漿5g/l胨2g/l酵母提取物7g/l NaCl3g/l CaCO3pH 7.2(滅菌前)接種物10％發酵罐體積培養時間 60至80小時培養溫度 28℃攪拌 50rpm換氣150升/分鐘通過加入1至2ml多元醇的乙醇溶液，可以抑制泡沫的形成。在69小時后達到產量最大值。實施例4化合物阿考霉素的分離將200升實施例3制得的培養物溶液離心并用甲醇將菌絲體提取完全。將甲醇提取液濃縮至約十分之一得到無色沉淀，濾出沉淀。重復該過程直至在濾液中不再能夠檢測到阿考霉素(HPLC)。將殘余物冷凍干燥然后通過HPLC純化1.柱Fractogel TSK-HW 40(4L，500×100mm)洗脫劑MeOH
流速20ml/分鐘檢測204和236nm。
富含阿考霉素的級份在125分鐘后洗脫。根據HPLC(條件如上所述)收集級份。將合并的含有所需化合物的活性級份真空濃縮然后冷凍干燥。2.柱硅膠60(Merck)；Erimatech(300×20mm，100ml)洗脫劑A)CH2Cl2B)CH2Cl2∶MeOH 9∶1 C)MeOH。梯度 分鐘 ％A ％B％C0 1000 015 1000 035 0 100045 0 100065 0 0 100流速25ml/分鐘檢測236和288nm活性化合物阿考霉素在42分鐘后洗脫。根據HPLC(條件如上所述)收集級份。將合并的含有所需化合物的活性級份真空濃縮然后冷凍干燥。3.柱Fractogel TSK-HW 40(1L，500×50mm)洗脫劑MeOH流速5ml/分鐘檢測204和236nm活性成分阿考霉素在112分鐘后洗脫。
按照上述方法，可以從200L發酵肉湯中回收110mg阿考霉素。
權利要求
1.下式化合物 及其可藥用鹽、酯、醚和其它顯而易見的化學等同物，包括它們的所有立體異構體和互變異構體形式。
2.分子式為C65H115NO18的化合物，以及該化合物的可藥用鹽和衍生物，包括它們的所有立體異構體和互變異構體形式，該化合物可以通過在需氧條件下、在含有碳和氮源的營養培養基中培養擬無枝酸菌屬微生物ST101170(DSM 12216)，然后以常規方式分離和純化得到。
3.生產權利要求1或權利要求2所述化合物的方法，該方法包括，在需氧條件下、在含有碳和氮源的營養培養基中培養擬無枝酸菌屬微生物ST101170(DSM 12216)，然后以常規方式分離和純化化合物。
4.權利要求3所述的方法，進一步包括將得到的化合物轉化成藥理學上可耐受的鹽、酯、醚或其它顯而易見的化學等同物。
5.權利要求1或權利要求2所述的化合物或其可藥用鹽、酯、醚或其它顯而易見的化學等同物用作藥物。
6.藥物組合物，含有有效量的權利要求1或權利要求2所述的化合物和/或其可藥用鹽、酯、醚或其它顯而易見的化學等同物以及可藥用載體。
7.權利要求1或權利要求2所述的化合物或其可藥用鹽、酯、醚或其它顯而易見的化學等同物用作抗生素。
全文摘要
本發明涉及名稱為阿考霉素的式(I)化合物及其可藥用鹽和衍生物,包括其所有的立體異構體和互變異構體形式,該化合物可以通過培養擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis sp.)微生物ST101170(DSM 12216)制得,并可用作藥物、特別是抗生素。
文檔編號C12R1/04GK1377341SQ00813520
公開日2002年10月30日 申請日期2000年11月25日 優先權日1999年12月8日
發明者C·霍普曼, M·庫爾茲, H·戴克爾, D·里柏勒, J·阿斯佐迪 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司