臨床診斷方法

專利名稱：臨床診斷方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定母體樣本(如血或陰道樣本)內胚胎細胞核及其遺傳物質(如DNA或染色體)的方法。然后將此方法中鑒定的胚胎遺傳物質用于如產前診斷中。
染色體疾病是人類最常見的遺傳疾病。結構性染色體疾病占懷孕的前三個月期間與流產有關致死率的50％以上，并且約占宮內或圍產期死亡的5％。另外，0.5％新生兒患有結構性染色體異常。
染色體異常可能是數目上的或結構上的。數目異常，即體細胞組織中46個正常二倍體染色體數目發生變化，包括三體性(多一個染色體)、單體性(丟一個染色體)和多體性(整個多一套染色體)。由染色體斷裂、接著異常部位斷裂的染色體節端愈合而引起的結構性重排包括所稱的易位、翻轉和插入。
染色體結構性重排可出現平衡形式，在這種情況下，所述遺傳物質保持與正常狀態相同。結構性染色體異常的攜帶者通常并不呈現出任何癥狀(除非在斷裂點處出現基因損傷)。結構性染色體異常還可出現非平衡形式，在這種情況下，某些遺傳物質缺失和/或復份。這一般導致發育遲緩，包括帶有身體和心理殘障的新生兒。
以個體存在于人群中的最常見染色體異常是與Down氏綜合癥有關的三體性21。現普遍接受的是大約有1/650新生兒童患有特征為不同程度嚴重心理運動發育遲緩的21三體Down氏綜合癥。世界不同國家中21三體Down氏綜合癥的發病率無明顯差別。
對兒童和成人的21三體Down氏綜合癥的診斷一般通過在體外培養血液淋巴細胞，然后進行染色體分析。該細胞培養過程需要2-3日，以在細胞周期的分裂中期聚集足夠的細胞，而使染色體濃縮至足以通過標準染色體顯帶法技術進行單個鑒定的程度。
一般21三體Down氏綜合癥的兒童的唯一明確確證的臨床風險因素與母體的年齡有關。因此，一般認為懷有三體性21兒童的風險性隨母體年齡的增長增加，在超過45歲的最高年齡組中，風險性高出10％。目前存在鑒別孕婦很可能懷有三體性21兒童的篩選程序。這些篩選程序包括分析母血樣本的生化特征以及對胎兒進行超聲波掃描，后者目的在于觀察頸部皮膚的厚度，在患有Down氏綜合癥和某些其它染色體疾病的胎兒中，該厚度顯著增加。
超過某個年齡(通常為35歲)的孕婦以及經篩選被確定為風險性高的婦女一般要進行侵襲性處理(絨毛膜絨毛取樣和/或羊膜穿刺術)，以對胎兒細胞樣本進行染色體分析。這些侵襲方法，除使母體感到不舒適外，還使流產風險性增加。因此需要提供一種更有效地進行產前診斷的方法，而并不依靠這種侵襲取樣的方法。
眾所周知，在懷孕期間，可在母血中檢測出胚胎細胞，其約以百萬分之一至千萬分之一量存在。這可為產前“非侵襲性”診斷胎兒病癥，如最常見的21三體Down氏綜合癥，提供可能性，這一點也被廣泛認知。
Down氏綜合癥和某些其它胚胎細胞遺傳性疾病以及孕婦并發癥，如先兆子癇和早產以及自身免疫疾病的產后發展，特點在于胎兒母體轉輸增加，從而導致母血中胚胎細胞水平增高(參見Pertl和Bianchi Semin Perinatol 23，5，393-402，1999；Bianchi Eur J ObstetGynecol Reprod Biol 92，1，103-8，2000)。
采用特別的免疫學檢測系統，然后利用與特定染色體探針原位雜交(FISH)產生的熒光，對染色體數目計數，對鑒定母血中的胚胎細胞進行了許多努力和大量工作(參見Hahn等，Mol Hum Repr 4，6，515-521，1998，評論)。
利用較少侵襲方法從孕婦母體中得到的樣本一般包含一定的母體細胞和相對少量胚胎細胞。目前分離胚胎細胞的方法包括利用抗體、梯度分級分離、母體細胞優選分解以及細胞分選法。但是，母體細胞依然超出任何分離的胚胎細胞(見Al-Mufti等Amer J Med Genet85，1，66-75，1999)。雖然這種可能技術的任何指標產生的意義非常大，但是利用這些樣本進行產前非侵襲性診斷仍然存在著明顯困難(見Hulten，The Lancet，357，963-4，2001)。
眾所周知端粒構成覆蓋染色體末端的重復DNA序列，其量是變動的，年輕人比年老人具有更高數量的重復序列。認為在端粒復制的終末期不發生DNA復制。這就意味著在每個細胞分裂中，該端粒都比以前變得更短。現還認為這種縮短最終導致細胞死亡(參見DeLange，Science 279，334-335，1998)。
所有人體染色體得端粒都包含相同的DNA重復核心。端粒長度隨個體年齡的變化是在所有染色體中觀測到的普遍現象。根據個體年齡的不同，端粒重復長度的變化估計約為2-30Kb的DNA。
可采用特定軟件和對端粒探針雜交的染色體進行顯微鏡像分析來測定染色體特異性端粒長度(Poon等，Cytometry 36，267-278，1999)。這些研究表明在各染色體端粒含量內的個別細胞核之間可能存在一些變化。盡管如此，如以上所述，端粒長度隨主體年齡顯著降低。以此為基礎，胚胎細胞中各染色體的端粒長度應比新生兒長，也比成人的長(見De Pauw等，Cytometry 32，3，163-1690)。因此，說明胚胎細胞比母體細胞具有更長的端粒，即每個染色體具有更高的的端粒DNA重復序列(Friedrich等，Pediatr Res 49，2，256-6，2001)。
本申請人發現，可利用這種特性為基礎區分母體組織樣本(如血液或血清樣本)中存在的母體和胚胎細胞核和/或其中的遺傳物質，尤其是染色體和DNA。
因此本發明提供一種鑒定母血(包括血清或血漿成分)或陰道樣本內胚胎細胞核、染色體和DNA的方法，該方法包括(a)將該樣本中的細胞核的染色體經酶核酸外切消化以切出各染色體的末端區段，然后(b)檢測作為所述消化過程結果保留的胚胎細胞核DNA中但不存在于母體細胞核DNA中的DNA序列。
實際上，本發明以胚胎和母體DNA內端粒重復數目的差別為基礎，對母體組織樣本中的胚胎細胞核直接進行鑒別。在步驟(a)中，從末端區段內部消化細胞核內的染色體DNA。在這個過程中，首先將樣本中存在的所有的染色體的端粒片段進行消化。然后進行一段時間的外切核酸酶消化，該時間足以除去至少所有母體端粒DNA序列。
如果此刻停止消化，胚胎染色體將保留某些端粒DNA。然后采用例如對端粒DNA具有特異性的標記探針，檢測該DNA，在這種情況下所述探針只對胚胎DNA雜交。
該方法優選采用母血樣本(包括血清和/或血漿成分)進行。本文所用表述“血液樣本”包括全血、血清或血漿，通過標準技術從中分離出具核細胞。
該方法可在細胞原位進行。在這種情況下，通過核膜，將外切核酸酶引入到細胞核中。為實現該目的，例如可通過利用酶，如溶血卵磷脂、皂苷或Triton X 100，將細胞核膜透化處理進行。
在開始步驟中，通過標準技術，采用固定方法，如卡諾依氏液(乙酸∶甲醇，3∶1)或甲醛，將所述細胞中染色體固定，以用于分析。
當步驟(b)中檢測的序列是標記染色體時，優選它是臨近端粒(亞端粒或端粒)的染色體標記，因此使得將標記物本身用于產前診斷成為可能。在任何情況下，都可將包含染色體和DNA的胚胎細胞核的鑒定作為“非侵襲性”產前診斷的初始步驟。
在特別優選的實施方案中，將消化后樣本中存在的DNA用對該DNA序列(如端粒序列)具有特異性的初級標記探針雜交。最優選，用可見標記物(尤其是熒光標記物)將該初級探針標記，然后檢測樣本中的熒光。這一步可原位進行，例如在細胞載玻片上進行，或者另外可用流式分選方法從母體細胞核中分離出胚胎細胞核(已被熒光標記)。
進行外切核酸消化的適當的酶包括BAL31。為保證更能控制消化過程，優選采用僅消化DNA特定區段的酶。更詳細地講，可以三個階段方法進行消化，其中在第一階段，除去DNA的3’突出端，在第二階段，切除3’-5’ss區段，在第三階段，消化ss區段。完成第一和第三階段的適當的酶包括綠豆核酸酶，第二階段的適當的酶包括外切核酸酶III。
為提供可靠的消化以區分包含染色體和DNA的母體和胚胎細胞核所需的條件，如酶濃度、緩沖液系統、溫度和培養時間需要小心選擇，并且這些條件根據因素(如所用的特定酶)而變。
作為不同染色體末端之間的端粒DNA序列重復數目變異的結果，優選以一種染色體特異性方式，先將這些酶系統“校準”比較理想。通過分析各種條件下的染色體外切核酸酶端粒消化的結果，可實現該類型的校準。
另一種校準具體酶系統的方法是獲得母體和胚胎組織樣本中各個具體染色體的端粒長度上的基線信息。該方法可通過在細胞周期的分裂中期，對端粒DNA序列熒光原位雜交(FISH)進行。采用端粒與亞端粒DNA探針結合的FISH，可將各染色體末端的具體端粒突出顯示。通過顯微鏡像分析，采用對比基因組雜交(CGH)軟件程序，可進行端粒序列測定。
還可利用胚胎臍帶穿刺術(cordocentesis)的血液樣本和送遞中的臍血樣本，以獲得母體和胚胎組織樣本中各個具體染色體臂的端粒DNA序列長度正常變異的另外基線信息。一經采用本發明方法鑒定，即可對胚胎DNA、染色體或細胞核進行產前診斷，以確定染色體/DNA異常(如Down氏綜合癥、Edward氏綜合癥和Klinefelter氏綜合癥)的存在或者其它信息(如胎兒的性別)。
另外，采用本發明方法可獲得的信息，尤其是有關母體樣本中胚胎細胞濃度量的信息，用于產前篩選/診斷以及多種母體癥狀的診斷。包括妊娠并發癥如先兆子癇、預測早產風險以及自身免疫疾病的產后發展。
染色體異常的產前診斷的具體方法，可通過將所述樣本與二級標記的探針接觸進行，該探針在可與樣本中的DNA雜交的條件下，對DNA的特定染色體或診斷區段具有特異性。因此，對源于胚胎的已識別的核、染色體或DNA中該二級探針的檢測，將能提供有關胎兒的信息。根據具體診斷目的的不同，如果該二級探針對染色體18、21或13和/或X或Y染色體具有特異性，即是有用的。
據推測X/Y、13、18和21的FISH探針組合可檢測目前可通過對未選擇孕婦中羊水樣本的全染色體分析(核型)確定的所有異常中的約70％。排除高風險的孕婦外(通過如父母是已知的結構染色體異常(如易位)攜帶者的家族病史確認，或者已通過超聲波檢測出胎兒結構異常確認)，檢測率可增加到99％以上。還應指出的是可使用對不同類型異常具有特異性的探針。
優選該二級探針帶有可見性標記物，如熒光標記物。在本發明方法的特別優選實施方案中，在步驟(b)中，采用初級熒光標記的探針測定所述胚胎DNA序列，所述二級探針帶有與所述初級探針不同波長處熒光的熒光標記物，其中通過檢測該初級標記物中的熒光，檢測胚胎DNA。鑒定后，立即將所檢測的熒光波長變為所述二級探針的波長，并觀察兩種探針中的熒光是否發射于相似的細胞核、染色體或DNA中。這可很容易通過改變所用熒光檢測器上的濾器實現。
在優選方案中，上述亞端粒標記物應位于每個染色體臂內特有的染色體DNA序列中盡可能遠的位置上。這些標記物被相對于各位置的各染色體末端預先選定。所選擇的適宜的DNA標記物在戰略上位于包含特異性染色體的獨特DNA的亞端粒染色體位置。這個位置是優選的一個主要原因。
應用亞端粒或端粒染色體/DNA標記物不僅便于對染色體畸形(如三體性)數目定量，并且還可對某些相對普通的不平衡結構的染色體重排(如不平衡易位)定量。根據染色體所涉及的易位不同，不平衡易位被視為一種特異性染色體亞端粒或端粒標記物的復制與另一種特異性染色體亞端粒或端粒標記物的缺失的結合。另外，其它相對普通的染色體畸形可按該方法或類似的方法識別。它們包括與胚胎畸形和/或心理運動發育遲緩有關的特別標記染色體，如胚胎iso 12p、iso 18p或isodic 15，以及可產生與正常狀況有關的4種特別標記。
通過適當選擇產前胚胎診斷所用的熒光DNA標記物，可采用這種方法測定大多數導致胚胎發育障礙的染色體異常。這些異常包括以下說明的Down氏綜合癥、Klinefelter氏綜合癥和Edward氏綜合癥。
在本發明一實施方案中，取得母體組織樣本如血液樣本(包括血漿或血清成分)，然后通過常規方法，如Lymphoprep(Sigma)或Percoll(Amersham Pharmacia)方法，從其中分離出非分裂的具核細胞。
然后采用標準技術，如暴露于化學試劑溶血卵磷脂、皂苷或TritonX中，將細胞核膜透化處理。
在下列步驟中，通過常規技術，如暴露于卡諾依氏液(乙酸∶甲醇，3∶1)或甲醛，將細胞核染色體固定。
然后將該細胞核涂布于顯微鏡用載玻片上，與外切核酸酶(如BAL 31)一起溫育一定時間，該時間足以消化母體端粒，但留下某些胚胎端粒DNA。
向所述細胞中加入全端粒標記的探針，如熒光標記探針。該探針粘附于胚胎細胞核中的染色體的端粒片段上，但并不與失去其端粒片段的母體細胞核的染色體相互作用。
如果此刻對載玻片進行檢測，胚胎細胞核具有熒光，而母體細胞核不具熒光。或者，可用本領域已知的流式細胞計方法，從母體細胞中分離出熒光胚胎細胞。
在具體的實施方案中，分離后，將二級不同標記的探針引入到所述細胞中。適當的不同標記的探針也可帶有可見標記物，如不同的熒光標記物(熒光團)。無論該胚胎細胞的DNA是否與所述二級探針結合，都可采用本領域熟知的熒光顯微鏡檢術和分離濾器進行測定。
一般常用的熒光團包括DAPI、熒光素、FITC、Cy3、Cy5、羅丹明染料和德克薩斯紅。
本發明另一方面提供一種鑒定母體血或陰道樣本內胚胎細胞核、染色體和DNA的試劑盒，該試劑盒包括一種能消化DNA末端區段的外切核酸酶以及一種用于檢測在染色體末端區段中發現的特定DNA序列的標記探針，如熒光標記探針。
該試劑盒可包含一或多種實現以上所述方法所需的其它的試劑或物品。更詳細地講，該試劑盒還可包含二級標記探針，如不同的熒光標記探針，該探針對特定的染色體片段的某些DNA序列具有特異性，因此能診斷不同的染色體病癥。
所述試劑盒還包含核細胞分離劑(如Percoll或Lymphoprep)和/或核膜穿孔劑(如溶血卵磷脂、皂苷或Triton X100)和/或用于端粒消化的外切核酸酶(如BAL31)。
應重點指出的是對胚胎細胞核本身的獨立鑒別是進行可靠的非侵襲性產前診斷所必需的(見Hulten，The Lancet，357，963-4，2001)。本發明提供達到這種要求的方法。
另一方面，還應指出的是對不同FISH顏色信號，可使用多種熒光團組合(直接或間接標記)以鑒別端粒序列和染色體特異性序列，這一點在本領域是眾所周知的。FISH本身是目前發展迅速的領域。
最后重點指出的是，如其它研究者說明的一樣，所述FISH-FISH方法本身簡單、快速，尤其與其它技術相比來看。所有富集和制備的處理時間，包括原位雜交，一共大約6小時。某些步驟可適于自動化操作。應用市場現有的計算機軟件，對顯微鏡分析自動化也同樣適用，其中目前本身已存在自動熒光點計數。
現通過實施例并參考附帶的圖示，詳細地說明本發明。


圖1用示意圖說明在母體和胚胎染色體/DNA中存在的端粒差別以及對其的酶促消化作用；
圖2用示意圖說明采用本發明的母體和胚胎細胞混合群方法，應用(a)端粒特異性FISH探針和(b)染色體Y特異性FISH探針進行分析的結果；圖3用示意圖說明采用本發明的母體和胚胎細胞混合群方法，應用(a)端粒特異性FISH探針和(b)染色體21特異性FISH探針進行分析的結果；實施例1從成年女性血樣和羊水樣本(含胚胎帶核細胞)中分離帶核細胞。在含有范圍為1/10和1/100至1/1000體積百分比的不同比例的胚胎和成人細胞的混懸液中，兩種類型的細胞混合在一起。
然后將混懸液暴露于溶血卵磷脂中以誘發細胞/細胞核的膜的透化作用，接著固定、制備顯微術載玻片，隨后暴露進行核酸外切DNA消化。然后將這些細胞先用全端粒探針、再用染色體特異性探針雜交以進行熒光顯微鏡分析。1)細胞制備將裝于EDTA管中的10ml新鮮血液與10ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混合。然后將10ml Lymphoprep(Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)置于50ml管中，然后慢慢在頂部加上一層10ml的所述稀釋血液。
以2000rpm速度，將所述試管離心30分鐘。然后通過傾斜該試管，采用精密移液管吸出細胞層(3-5ml)，移出血漿下的薄淋巴細胞層。之后，將分離的淋巴細胞用PBS稀釋使得最終體積達到20ml。隨后以2000rpm速度，將這些細胞離心15分鐘。棄去上清液，將細胞沉淀溶解于5ml PBS中。
以2000rpm速度，將男性三體性21妊娠的羊水樣本離心15分鐘。小心棄去上清液，將細胞沉淀再混懸于5ml PBS中。2)細胞混合液將各種成年女性細胞和男性胚胎細胞樣本的混合物制成終體積為10ml的溶液。胚胎與成人細胞的比例在1/10、1/100和1/1000體積百分比的范圍之內。3)細胞/細胞核的膜的透化作用將溶血卵磷脂(5μg/ml的乙酸鈉溶液)加入到淋巴細胞和羊水樣本的混合液中。在4℃下，將這些細胞溫育2分鐘。加入2.5ml多聚甲醛終止該反應。然后以2000rpm速度，將這些細胞旋轉15分鐘，用含有1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS洗滌2次。4)載玻片的制備和固定將200μl細胞混懸液置于干凈的載玻片上，放置干燥。然后將細胞用加入該載玻片上的200μl 2％甲醛固定，放置10分鐘。隨后將所述載玻片在PBS中洗滌，再通過一系列乙醇脫水。5)核酸外切酶消化在加熱板(40℃-50℃)上，將載玻片老化2小時。在每片載玻片50μl緩沖液中，用1-5單位的Bal 31酶(NeW England Bio labs)進行酶消化。將載玻片置于37℃加熱板上10分鐘。室溫下，通過在2xSSC中洗滌所述載玻片，終止酶促反應。然后將載玻片通過一系列乙醇脫水，空氣干燥。6)端粒的PAN FISH根據制造商的全端粒DNA試劑盒(Dako，Glostrup，Denmark)的使用說明，將所述載玻片在Tris-緩沖鹽溶液(TBS)、3.7％甲醛和預處理溶液中洗滌。然后將載玻片通過一系列乙醇脫水，空氣干燥。向各載玻片上加入10μl FITC標記的探針，然后蓋上一片玻璃蓋玻片。在80℃下，將這些載玻片溫育3分鐘，然后在室溫下暗處溫育30分鐘。將所述載玻片通過漂洗和沖洗溶液，通過一系列乙醇脫水。將這些載玻片空氣干燥，然后用包括DAPI的Vectashield(VectorLaboratories，Peterborough，UK)進行復染色，隨后用蓋玻片覆蓋、密封。7)采用Vysis非整倍性檢測試劑盒，與染色體21、13、18、X和Y特異性的探針雜交通過將所述載玻片浸入丙酮中2分鐘，從載玻片上移去蓋玻片。然后將載玻片脫水，干燥。采用金剛石尖頭劃痕，在載玻片上標記兩個雜交區段。通過浸入73℃下70％甲酰胺30％2xSSC中5分鐘，將靶DNA變性。向靶區段1中加入10μl CEP 18/X/Y探針混合物，向靶區段2中加入10μl LSI 13/21探針混合物(Vysis，US)，將蓋玻片放在所述探針溶液上。用橡膠膠水將蓋玻片密封，將載玻片放入預熱的濕化容器中，在37℃溫箱中放置16小時或過夜。移去蓋玻片，將載玻片在73℃下0.4xSSC/0.3％NP-40溶液中洗滌2分鐘。然后將載玻片置于室溫下2xSSC/0.1％NP-40溶液中1分鐘。當完全干燥后，將10μl DAPI II復染劑(Vysis，US)加入到所述靶區段內，在蓋玻片下密封。8)顯微鏡檢術采用100倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當的濾器觀測信號，采用帶有SmartCapture軟件(Vysis，US)的CCD照相機獲得圖象。載玻片的掃描從蓋玻片的上部左角開始，從頂部到底部移動。
采用FITC濾器，開始對端粒熒光進行分析。使用England Finder(Graticules Ltd，Kent，UK)記錄陽性和陰性細胞的位置。然后用Orange濾器(Vysis，US)，對區段1和2上的細胞核再檢測，以分別對染色體Y和21進行鑒定和計數。9)結果采用FITC濾器的熒光顯微鏡檢術表明在某些細胞核中有端粒信號，而在其它細胞核中沒有或幾乎沒有信號。顯示這些端粒信號的細胞核比例對應于所制備和分析的胚胎和成人細胞核的混合物的預期比例。因此，胚胎細胞的濃度越低，非熒光細胞核的比例越高，反之如此。記錄適當細胞核群的圖象，并記錄它們的位置。(圖2A和3A)。
接著，采用Orange濾器(Vysis，US)，分析所述相同的細胞群，以鑒定胚胎男性三體性21核，該核被認為帶有一個Y染色體和三個染色體21信號。對每類細胞混合物(1/10，1/100，1/1000百分體積的胚胎與成人細胞)的總共1000個細胞核進行分析，分析該載玻片區域1的Y信號，載玻片區域2的染色體21信號。
發現具有端粒熒光性(即被認為是胚胎細胞)的細胞核和Y信號的出現具有97.3％的一致性。Y熒光性的結果與根據制造商手冊對純胚胎細胞群(95-100)的對應分析結果一致。(圖2B)。
發現具有端粒熒光性(即被認為是胚胎細胞)的細胞核和三種染色體21信號的出現具有稍低的一致性。在重復試驗中，該值在83-90％之間。但是這些結果與我們在帶有胚胎三體性的羊水樣本中常規記錄的結果一致，并且在制造商手冊記錄的范圍之內。(圖3B)。10)說明這些結果表明采用端粒和染色體特異性探針的雙重FISH分析，以及隨之在一時間過程內的端粒酶促消化，可能在胚胎和成人細胞之間進行區分。實施例2用母血對胚胎47、XY+21 Down氏綜合癥的產前診斷1.妊娠和血樣在獲準Ethical Approval from the Local Ethical Committee的同意通知書后，通過靜脈穿刺從妊娠期16周的懷孕婦女取血12ml，加入到2個乙二胺四乙酸(EDTA)管中。2.胚胎細胞的富集根據(Ganshirt等，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999 R.-D.Wagner，Fetal Cells In Maternal Blood，pp401-415)中說明的稍加改變的方法，采用三密度梯度進行母血血漿內胚胎帶核細胞的富集。
將12ml該EDTA血液加入到12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，倒轉試管混合。用移液管將6ml該血液/PBS混合物加入到4個15ml聚苯乙烯管中。采用連有注射器的長細插管，放入三層PercollR(AmershamPharmacia)。開始放入下層3ml 40％的Percoll，接著3ml 45％的Percoll，然后3ml 50％的Percoll。然后以500g速度，將該混懸液離心30分鐘。移出血漿層，轉移至清潔的試管中，再在500g速度下離心10分鐘。將該細胞沉淀在PBS中洗滌，然后根據細胞遺傳學制備常規使用的標準技術，用3∶1甲醇∶乙酸固定。3.載玻片的制備和固定將固定細胞混懸液置于硅烷化的顯微鏡檢術載玻片上，放置干燥。然后在玻片染色缸中，再將該細胞混懸液甲醛固定10分鐘(50mlPBS，0.5g MgCl2，1.3ml甲醛)，通過一系列乙醇(70％，95％，100％)脫水，空氣干燥。4.核酸外切酶消化按實施例1(第5段)中說明的方案，用3單位的Bal 31酶進行酶消化。5.采用全端粒、Y和21探針組合進行FISH將0.5μl全端粒毛地黃毒苷元標記的探針(Appligene Oncor)、1μl LSI染色體21光譜橙探針(Vysis Ltd.)和1μl CEP(III)光譜水探針(Vysis Ltd.)與7.5μl的Hybrisol VI(Oncor Appligene)一起混合，作為每個載玻片的用量。將10μl該探針混合物置于含有所述靶細胞的顯微載玻片上。然后在75℃下的加熱板上，將該載玻片變性5分鐘，用橡膠溶液密封，在37℃濕化箱中雜交過夜。
次日進行雜交后清洗。將載玻片在43℃下50％甲酰胺中洗滌15分鐘，在37℃下2xSSC中洗滌8分鐘，然后置于室溫下的1xPBT中。在該載玻片上加上30μl標記熒光素的抗毛地黃毒苷元抗體，在37℃下保持5分鐘。最后，將該載玻片在1xPBT中洗滌3次，每次2分鐘，空氣干燥，用DAPI復染。6.顯微鏡檢術分析采用40倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當的濾器觀測信號，采用帶有SmartCapture圖象獲得系統和分析系統(Vysis/Applied Imaging)的CCD照相機獲得圖象并儲存相關圖象。
對共計1000個細胞核進行測定。大多數，如995/1000(99.5％)，不包含端粒(綠)信號，它們被認為是源于母體的核。用FITC、光譜橙和光譜水濾器，對其余5個細胞核捕獲圖象。這些5/1000細胞核可同時包含綠色端粒信號和水Y信號，因此被認定為是源于男性胚胎的細胞核。但是，當這5個細胞核還包含三個紅信號時，即表明該胚胎可能具有Down氏綜合癥的核型47、XY+21。概述和結論在通過Percoll梯度富集血漿部分胚胎細胞后，通過采用探針混合物Tel/Y/21對存在的端粒序列識別并對Y和染色體21信號計數，進行FISH研究。
該實施例表明根據所用的探針混合物，以及體外酶促消耗后通過其保留的端粒熒光診斷Y/21源于胚胎細胞核，可鑒定該染色體的組成。這種組合能夠確定該胚胎是否是男性以及是否具有21三體Down氏綜合癥。實施例3用母血對胚胎47、XX、+21 Down氏綜合癥的產前診斷1.妊娠和血樣在獲準Ethical Approval from the Local Ethical Committee的同意通知書后，通過靜脈穿刺從妊娠期16周的懷孕婦女中取血12ml，加入到2個乙二胺四乙酸(EDTA)管中。2.胚胎細胞的富集根據(Ganshirt等，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999 R.-D.Wagner，Fetal Cells In Maternal Blood，pp401-415)中說明的稍加改變的方法，采用三密度梯度進行母血血漿內胚胎帶核細胞的富集。
將12ml該EDTA血液加入到12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，倒轉試管混合。用移液管將6ml該血液/pBS混合物加入到4個15ml聚苯乙烯管中。采用連有注射器的長細插管，放入三層PercollR(AmershamPharmacia)。開始放入下層3ml 40％的Percoll，接著3ml 45％的Percoll，然后3ml 50％的Percoll。然后以500g速度，將該混懸液離心30分鐘。移出血漿層，轉移至清潔的試管中，再在500g速度下離心10分鐘。將該細胞沉淀在PBS中洗滌，然后根據細胞遺傳學制備常規使用的標準技術，用3∶1甲醇∶乙酸固定。3.載玻片的制備和固定將固定細胞混懸液置于硅烷化的顯微鏡檢術載玻片上，放置干燥。然后在玻片染色缸中，再將該細胞混懸液甲醛固定10分鐘(50mlPBS，0.5g MgCl2，1.3ml甲醛)，通過一系列乙醇(70％，95％，100％)脫水，空氣干燥。4.核酸外切酶消化按實施例1(第5段)中說明的方案，用3單位的Bal 31酶進行酶消化。5.采用全端粒、X/Y、13、18和21探針組合進行FISH將0.5μl全端粒毛地黃毒苷元標記的探針(Appligene Oncor)與0.5μl生物素標記的StarFISH人染色體全端粒探針(Cambio)混合。然后將該端粒混合物加入到10μl MultiVysionTMPGT(Vysis Ltd.)中。將該探針混合物置于含有所述靶細胞的顯微載玻片上。然后在75℃下的加熱板上，將該載玻片變性5分鐘，用橡膠溶液密封，在37℃濕化箱中雜交過夜。
次日進行雜交后清洗。將載玻片在43℃下50％甲酰胺中洗滌15分鐘，在37℃下2xSSC中洗滌8分鐘，然后置于室溫下的1xPBT中。將30μl預混合的雙重顏色檢測試劑(Oncor Appligene)加到該載玻片上，在37℃下保持5分鐘。最后，將該載玻片在1xPBT中洗滌3次，每次2分鐘，空氣干燥，用DAPI復染。6.顯微鏡檢術分析采用40倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當的濾器觀測信號，采用帶有SmartCapture圖象獲得系統和分析系統(Vysis/Applied Imaging)的CCD照相機獲得圖象并儲存相關圖象。
對共計1000個細胞核進行測定。大多數，如995/1000(99.5％)，不包含端粒(黃)信號，它們被初步認為是源于母體的核。用FITC、光譜橙、光譜水和光譜金濾器，對其余5個細胞核捕獲圖象。這些5/1000細胞核包含黃端粒信號，因此被認定為是源于胚胎的細胞核。
這些細胞核可以例如還含有染色體13的兩個紅信號、染色體21的兩個綠信號、染色體X的兩個水信號以及對應于染色體18的三個藍信號，但沒有Y染色體的金信號。這種圖譜表明該胚胎具有核型47、XY+18，表明為Edward氏綜合癥。概述和結論在通過Percoll梯度富集血漿部分胚胎細胞后，通過采用探針混合物Tel/13/18/X/Y/21對存在的端粒序列識別并對13、18、X、Y和染色體21信號計數，進行FISH研究。
該實施例表明通過體外酶促消耗后其余端粒熒光，而診斷為源于胚胎本身的細胞核，可鑒定該細胞核染色體的組成(對應于探針混合物13/18/X/Y/21)。這組合能夠確定該胚胎是否是女性以及是否具有Edward氏綜合癥。實施例4用母血對胚胎47、XXY Klinefelter氏綜合癥的產前診斷1.妊娠和血樣在獲準Ethical Approval from the Local Ethical Committee的同意通知書后，通過靜脈穿刺從妊娠期16周的懷孕婦女中取血12ml，加入到2個乙二胺四乙酸(EDTA)管中。2.胚胎細胞的富集根據(Ganshirt等，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999R.-D.Wagner，Fetal Cells In Maternal Blood，pp401-415)中說明的稍加改變的方法，采用三密度梯度進行母血血漿內胚胎帶核細胞的富集。
將12ml該EDTA血液加入到12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，倒轉試管混合。用移液管將6ml該血液/PBS混合物加入到4個15ml聚苯乙烯管中。采用連有注射器的長細插管，放入三層PercollR(AmershamPharmacia)。開始放入下層3ml 40％的Percoll，接著3ml 45％的Percoll，然后3ml 50％的Percoll。然后以500g速度，將該混懸液離心30分鐘。移出血漿層，轉移至清潔的試管中，再在500g速度下離心10分鐘。將該細胞沉淀在PBS中洗滌，然后根據細胞遺傳學制備常規使用的標準技術，用3∶1甲醇∶乙酸固定。3.載玻片的制備和后固定將固定細胞混懸液置于硅烷化的顯微鏡檢術載玻片上，放置干燥。然后在玻片染色缸中，再將該細胞混懸液甲醛固定10分鐘(50mlPBS，0.5g MgCl2，1.3ml甲醛)，通過一系列乙醇(70％，95％，100％)脫水，空氣干燥。4.核酸外切酶消化按實施例1(第5段)中說明的方案，用3單位的Bal 31酶進行酶消化。5.采用全端粒和18/X/Y探針組合進行FISH將9.5μlAneuvysion CEP 18/X/Y(Vysis Ltd.)和0.5μl全端粒毛地黃毒苷元標記的探針(Oncor)加在載玻片上，蓋上蓋玻片。然后在75℃下的加熱板上，將該載玻片變性5分鐘，用橡膠溶液密封，在37℃濕化箱中雜交過夜。
次日進行雜交后清洗。將載玻片在43℃下50％甲酰胺中洗滌15分鐘，在37℃下2xSSC中洗滌8分鐘，然后置于室溫下的1xPBT中。在該載玻片上加上30μl標記熒光素的抗毛地黃毒苷元抗體，在37℃下保持5分鐘。最后，將該載玻片在1xPBT中洗滌3次，每次2分鐘，空氣干燥，用一滴4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，VectashieldLtd.)復染。6.顯微鏡檢術分析采用40倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當的濾器觀測信號，采用帶有SmartCapture圖象獲得系統和分析系統(Vysis/Applied Imaging)的CCD照相機獲得圖象并儲存相關圖象。
對共計1000個細胞核進行測定。大多數，如995/1000(99.5％)，不包含端粒(綠)信號，它們被認為是源于母體的核。另一方面，5個核包含端粒信號以及Y信號，被認定為是源于胚胎的細胞核。
這5個核中的4個可能有兩個X信號，這種組合信號與胚胎核型47、XXY，即Klinefelter氏綜合癥一致。余下的一個細胞具有一個X和一個Y信號，被認為是正常的46、XY男性細胞核。這5個細胞都具有兩個染色體18信號。
在這種情況下，可得出結論該胚胎具有與Klinefelter氏綜合癥一致的核型47、XXY。但是應注意把帶有代表X雜交失敗的工藝人工產物(假的陰性胚胎細胞)的XY染色體成分的單細胞核或者另一種胚胎實際是一種核型47、XY[1]/47、XXY[4]的Klinefelter嵌合體的存在可能性區分開來，是不可能的。概述和結論在通過Percoll梯度富集血漿部分胚胎細胞后，通過采用探針混合物X/Y/18(Vysis Ltd)對X、Y和染色體18計數，并應用全端粒毛地黃毒苷元標記的探針(Appligene Oncor)進行端粒序列識別，從而進行FISH研究。
該實施例表明根據所用的探針混合物，采用全端粒探針，以及體外酶促消耗后通過其余端粒熒光診斷為源于胚胎的細胞核中的X/Y/18，可鑒定胚胎細胞核染色體的組成。基于帶有XXY和XY細胞核與端粒熒光的一致性，我們可以確定該胚胎具有非嵌合型或嵌合型Klinefelter氏綜合癥。
權利要求
1.一種鑒定母體血或陰道樣本內包含染色體和DNA的胚胎細胞核的方法，該方法包括(a)用酶使該樣本中的細胞核染色體進行核酸外切消化以除去各染色體的末端區段，然后(b)檢測作為所述消化過程的結果而仍然存在于胚胎染色體中但是不存在于母體DNA中的DNA序列。
2.根據權利要求1的方法，其中將所述酶引入所述細胞中，這樣可使細胞核的染色體和所述DNA組分在該細胞內原位進行核酸外切消化。
3.根據權利要求2的方法，其中通過給予如溶血卵磷脂、皂苷或Triton X 100試劑，可使所述核膜能透過所述酶。
4.根據權利要求1的方法，其中在初始步驟中，通過標準技術如暴露于卡諾依氏液(乙酸∶甲醇，3∶1)或甲醛，固定細胞核染色體。
5.根據任一項前述權利要求的方法，其中胚胎染色體保留的所述DNA序列是端粒序列。
6.根據任一項前述權利要求的方法，其中采用所述序列特異性的初級標記探針，測定所述DNA序列。
7.根據權利要求6的方法，其中所述標記物是熒光標記物。
8.根據任一項前述權利要求的方法，其中通過流式細胞分選方法，將鑒定的胚胎細胞核從母體細胞核中分離出來。
9.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中采用熒光原位雜交測定(FISH)鑒定包含染色體和DNA的胚胎細胞核。
10.根據任一項前述權利要求的方法，其中所述酶為BAL31。
11.根據權利要求1-12中任一項的方法，其中按以下各階段完成核酸外切消化，其中第一步除去3’突出端，第二步切除3’-5’ss區段，第三步消化ss區段。
12.根據權利要求11的方法，其中采用綠豆核酸酶完成所述第一步驟。
13.根據權利要求11或12的方法，其中采用外切核酸酶III進行所述第二步驟。
14.根據權利要求11-13中任一項的方法，其中采用綠豆核酸酶進行所述第三步驟。
15.根據任一項前述權利要求的方法，其中將鑒定的包含染色體和DNA的胚胎細胞核進行產前診斷。
16.根據權利要求15的方法，其中所述診斷檢測染色體異常。
17.根據權利要求15或16的方法，其中通過將所述樣本與一種或多種二級標記探針接觸進行所述診斷，所述探針是特定染色體特異性的或者特定染色體節段DNA特異性的。
18.根據權利要求17的方法，其中所述二級探針帶有熒光標記物。
19.根據權利要求17或18的方法，其中采用初級熒光標記的探針測定所述胚胎染色體節段和DNA序列，所述二級探針帶有與所述初級探針不同波長處熒光的熒光標記物，其中通過檢測所述初級標記物的熒光，對胚胎染色體節段和DNA序列進行檢測，鑒定后，將所檢測熒光波長變為所述二級探針的波長，并觀察兩種探針的熒光是否發射于所述同一細胞核，但是鑒定不同染色體節段和DNA序列。
20.根據權利要求17-19中任一項的方法，其中所述二級探針是染色體18、21、13、X或Y特異性的。
21.根據權利要求17-20中任一項的方法，其中所述二級探針是一種或多種特定染色體節段特異性的。
22.根據權利要求1-15中任一項的方法，所述方法可用于診斷母體病癥。
23.根據權利要求22的方法，其中所述病癥是先兆子癇、預測早產風險以及自身免疫疾病的后期發展。
24.根據權利要求15、22或23的方法，其中測定母體樣本中胚胎細胞的數量和濃度。
25.一種鑒定母體血或陰道樣本內包含染色體和DNA的胚胎細胞核的試劑盒，該試劑盒包括能夠消化染色體末端節段的外切核酸酶以及用于檢測在染色體末端節段中存在的特異性DNA序列的標記探針。
26.根據權利要求25的試劑盒，其中所述標記探針是熒光標記探針。
27.根據權利要求25或26的試劑盒，它還包括二級標記探針，后者能診斷染色體/DNA病癥。
28.根據權利要求27的試劑盒，其中所述二級標記探針是熒光標記探針。
29.一種鑒定母體血或陰道樣本內包含染色體和DNA的胚胎細胞核的方法，它基本上如本發明上文有關實施例所述。
30.一種鑒定母體血或陰道樣本內包含染色體和DNA的胚胎細胞核的試劑盒，它基本上如本發明上文所述。
全文摘要
本發明涉及一種鑒定母體血或陰道樣本內包含染色體或DNA的胚胎細胞核的方法，該方法包括(a)將該樣本中的細胞核的染色體經酶核酸外切消化以除去各染色體的末端區域，然后(b)檢測作為所述消化過程結果的保留在胚胎DNA中但不存在于母體DNA中的DNA序列。鑒別后，可對胚胎DNA進行例如檢測染色體異常的診斷。
文檔編號C12Q1/68GK1436247SQ01811237
公開日2003年8月13日 申請日期2001年4月20日 優先權日2000年4月20日
發明者M·A·胡爾藤 申請人:賽姆格有限公司