專利名稱：經過密碼子最優化的乳頭狀瘤病毒序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及在治療和預防人類乳頭狀瘤病毒感染以及與其相關的癥狀和疾病中有用的方法和組合物。
已發現在多種物種，包括綿羊，狗，兔子，猴子，牛和人中有乳頭瘤病毒的感染。人乳頭瘤病毒(HPV)已分出超過80個型別(Epideminlogy andBiology of Cervical Cancer.Seminars in Surgical Oncology 1999 16203-211)。如果L1基因與以前鑒定的型別的L1序列的同一性低于90％，那么這種型別可確定為新的型別，如果L1序列同一性是在90到98％之間則為亞型，同一性在98％以上為變體(與原型(親代類型)相比)。乳頭瘤病毒通常感染上皮細胞，但不同型別的HPV引起不同的疾病。例如，1-4，7，10和26-29型的乳頭瘤病毒引起良性皮下疣，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型的乳頭瘤病毒與宮頸癌有關，6和11型的乳頭瘤病毒與尖銳濕疣(生殖道的非惡性濕疣)有關。
大部分尖銳濕疣(＞90％)包含HPV基因型6和11。然而，HPV-6是在單純感染中鑒定出來的最常見的基因型，HPV-6和HPV-11偶爾發生在同一損傷中。疣通常發生在受感染個體的多個部位，并且60％以上的配偶有尖銳濕疣的患者發生損傷，潛伏期平均為3個月。目前對其有多種方法進行治療。然而，它們依賴切除或脫落和/或局部應用凝膠制劑和膏劑。它們引起疼痛，可能需要頻繁就醫，但效力有很大不同。疾病的復發仍是有效控制該種疾病所面臨的顯著問題。
尖銳濕疣可自然退化，退化的主要原因可能是細胞介導的免疫。自然退化高發生率提示宿主的細胞免疫可解決該種臨床疾病，從而使免疫治療成為治療或預防尖銳濕疣的一種選擇。控制該種疾病的目標是特異性針對病毒的治療，所述治療是無痛的，僅需要極少次的診治，具有很高的疾病治愈率和可降低疾病的復發/使疾病極少復發。
已證明HPV在組織培養中很難生長，所以沒有傳統的活的或減毒的病毒疫苗。由于缺乏適當的在其中研究人病毒的動物模型，所以HPV疫苗的開發滯后。因為所述病毒是高度種屬特異性的，所以不可能用人乳頭瘤病毒感染具有免疫力的動物，而這正是疫苗第一次在人體內試用之前進行安全檢測所必需的。
乳頭瘤病毒具有編碼“早期”和“晚期”基因(稱為E1到E7，L1和L2)的DNA基因組。所述早期基因序列已顯示具有如下功能與病毒DNA復制和轉錄有關，與逃避宿主的免疫有關，與正常宿主細胞周期的改變有關以及與其它過程有關。例如E1蛋白是一種ATP依賴的DNA解旋酶，參與病毒DNA復制過程的起始，E2是一種調控蛋白，控制病毒基因的表達和DNA的復制。E2通過其既結合E1又結合病毒復制起點的作用，使E1在所述起點局部聚集，從而，刺激病毒DNA的復制起始。E4蛋白具有多種沒確定的功能，但結合宿主細胞骨架屬于上述功能，E5延遲內體的酸化，導致細胞表面的EGF受體表達增加，已知E6和E7各自都能結合細胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成與宮頸癌有關的HPV型別，是已知的致癌基因。L1和L2編碼兩種病毒結構(衣殼)蛋白。
疫苗在歷史上一直被視為預防病原體感染的一種方式，如果發生感染，疫苗可激發免疫系統，以識別并中和病原體。疫苗包含一種或多種來自病原體的抗原通常是已滅活的或減毒的完整生物體，或者是來自所述生物體的特定抗原肽。當將免疫系統暴露于抗原時，產生使個體終生保持對所述抗原免疫“記憶”的細胞。再次接觸相同抗原(例如感染所述病原體時)刺激特異性免疫應答，從而清除感染的病原體或使感染的病原體失活。
有兩種武器進行免疫應答，即體液(抗體)應答和細胞介導的應答。衍生自細胞內復制的病原體(病毒和某些細菌)的蛋白抗原在受感染的宿主細胞內加工，釋放短肽，然后這些短肽與I類主要組織相容性分子(MHC-I)結合并展示在受感染的細胞表面。當該MHC I肽結合復合物與抗原特異性CD8+T細胞相遇時，所述T細胞被活化，獲得細胞毒活性。這些細胞毒性T細胞(CTLs)能裂解已被感染的宿主細胞，從而限制感染病原體的復制和傳播。免疫應答的另一重要武器受控于CD4+T細胞。衍生自病原體的抗原釋放到細胞外環境，然后被專職抗原呈遞細胞(APCs)攝取，和MHC II類分子結合并共同展示在這些細胞表面。對該復合物中抗原的識別刺激CD4+T細胞分泌可溶性因子(細胞因子)，它們調節其它T細胞的效應機制。B細胞產生抗體。抗原與分泌型抗體的結合可中和病原體的感染性。抗原與B細胞表面膜結合型抗體的結合可刺激B細胞的分裂，從而擴大B細胞的應答。通常，對控制病原體的感染而言，抗體和細胞介導的免疫應答(CD8+和CD4+)都是需要的。
據信，甚至在發生病原體感染之后，利用免疫系統滅活或清除病原體從而控制和消除感染都是可能的。盡管體液和細胞介導的免疫應答都能被激發，但這種免疫治療(也可以稱為“治療性”疫苗或免疫治療物)更需要細胞免疫應答來發揮作用。
已發現(Benvenisty，N and Reshaf，L.PNAS 83 9551-9555)用硫酸鈣沉淀的DNA接種小鼠可引起由該DNA編碼的肽的表達。隨后，觀察小鼠肌肉內注射未經沉淀的質粒DNA，發現所述DNA被攝入到所述肌肉細胞中，并表達所編碼的蛋白。因為DNA的表達導致宿主細胞中所編碼的病原體蛋白的產生(如天然感染的狀況)，這種機制可以刺激免疫治療或治療性免疫接種所需的細胞介導的免疫應答，因此基于DNA的藥物可用作預防性疫苗或免疫治療。對DNA疫苗的描述參考WO 90/11092(Vical，Inc.)。
DNA疫苗除了肌肉內注射外，可用多種機制傳輸。例如可傳輸到皮膚內，該種傳輸利用了在這些作為感染屏障的皮膚和粘膜等組織中免疫機制高度活化的優勢。皮膚內傳輸可通過注射，使用噴射式注射器(在壓力下強迫液體進入皮膚，或下面的組織包括肌肉)或利用粒子轟擊(particlebombardment)，其中將DNA以足夠的密度包被到粒子上以便穿過上皮(美國專利5371015)。例如，將核苷酸序列摻入質粒中，所述質粒被包被到金粒上，然后將該金粒在高壓下給藥到表皮，如Haynes等所述J.Biotechnology4437-42(1996)。將這些粒子發射到皮膚中，導致表皮細胞和表皮朗罕氏細胞的直接轉染。朗罕氏細胞是抗原呈遞細胞(APC)，其攝取DNA，表達所編碼的肽并進行加工，展示在細胞表面MHC蛋白上。被轉染的朗罕氏細胞遷移到淋巴結，在那兒它們將所展示的抗原片段呈遞給淋巴細胞，引發免疫應答。通過粒子介導的皮膚內傳輸僅需要極少量的DNA(少于1μg，通常少于0.5μg)便能誘導免疫應答，這與直接肌肉注射后產生免疫應答所需的毫克量的DNA形成對比。
在轉染后的哺乳動物細胞，如HeLa，293，或CHO細胞中表達和檢測HPV蛋白已證明通常是困難的，為進行那些需要能檢測蛋白表達的生物化學和免疫學研究，或為對純蛋白進行定量，通常使用大腸桿菌，桿狀病毒或酵母蛋白表達系統。在這些系統中，蛋白產量足夠進行功能性分析和純化，以及隨后的生物化學和免疫學研究。然而，直接的蛋白檢測法(例如Western印跡)通常不能檢測感染的哺乳動物細胞中E1蛋白的表達，甚至在使用具有強啟動子如CMV或SV40的載體時也不能如此。對方法進行設計以增加哺乳動物細胞中E1蛋白的表達，所述方法包括克隆E1基因的5’側翼序列(Remm et al.J.Virol 1999 73，3062-3070)和在轉染后擴增轉染的E1質粒載體(Zou et al.J.Virol 1998 72，3436-3441)。通過轉染后的復制來擴增輸入的載體質粒具有增加細胞中E1基因拷貝數的最終作用，如此可提高蛋白水平，從而便于蛋白的檢測(通過Western印跡)。因為E1蛋白在哺乳動物細胞中的表達和檢測是難以解決的，所以有作者已經求助于用兔網織紅細胞系統(Promega)，用35S標記的蛋氨酸，通過體外的轉錄-翻譯檢測所述蛋白的表達(Gopalakrishnan et al.Virology 1999 256，330-339.，Safari et al. Virology1995 211，385-396)。然而，這是一種無細胞系統，其需要應用修飾的啟動子，所述啟動子包含來自噬菌體T7的結合RNA聚合酶的序列。
E1蛋白的表達還可通過檢測體外質粒DNA的復制而間接檢測，所述質粒包含HPV的DNA復制起點。可將包含該復制起點的質粒作為E1(和E2)蛋白表達的替代物來檢測(Gopalakrishnan et al.，Virolugy 1999 256，330-339.，Lu et al.J.Virol 1993 67，7131-7139 and Del Vecchio et al J.Virol1992 66，5949-5958)。HPV起點的復制既需要E1又需要E2，用包含編碼E1和E2基因的質粒對哺乳動物細胞進行轉染，再加入攜帶HPV的DNA復制起點的第三種質粒，如果E1蛋白(和E2蛋白)表達成功(即使不能被標準蛋白檢測法(Western印跡)檢測出來)，將僅僅能使攜帶起點的質粒復制。
DNA代碼有4種(A，T，C和G)，用它們可拼出三個字母的“密碼子”，這些密碼子代表生物體的基因所編碼的蛋白的氨基酸。沿DNA分子線性排列的密碼子被翻譯成所述基因所編碼的蛋白質中氨基酸的線性序列。密碼子有高度的簡并性，61種密碼子編碼20種天然氨基酸，3種密碼子代表“終止”信號。因此，大部分氨基酸由一種以上的密碼子編碼-實際上數種氨基酸由4種或更多種不同的密碼子編碼。
當有一種以上的密碼子編碼一種特定的氨基酸時，已發現生物體密碼子的使用模式是極不隨機的。不同物種在密碼子的選擇方面顯示不同的偏好，且密碼子的使用在單一物種的高水平表達和低水平表達的基因之間也有顯著的不同。這種偏好在病毒，植物，細菌和哺乳動物細胞中是不同的，一些物種比其它物種有更強的偏好。例如，人和其它哺乳動物不如某些細菌或病毒偏好強。基于這些原因，在大腸桿菌中表達的哺乳動物基因或在哺乳動物細胞中表達的病毒基因具有對于有效的表達來說不適當的密碼子分布。然而，具有適合大腸桿菌表達的密碼子使用模式的基因也可在人體中有效表達。可以相信，如果異源DNA序列中存在即將在其中進行表達的宿主中罕見的密碼子簇，那么所述異源基因在所述宿主中的低水平異源表達是可預料的。
已發現數例以下情況將宿主中罕見的密碼子更改為宿主優選的密碼子(“密碼子最優化”)提高了異源表達水平，例如，已有人針對哺乳動物密碼子使用模式而將BPV(牛乳頭瘤病毒)晚期基因L1和L2的密碼子最優化，結果顯示出，在哺乳動物細胞(Cos-1)培養中，表達水平超過了野生型HPV序列(Zhou et al.J.Virol 1999.73，4972-4982)。在該項工作中，每種在BPV中比在哺乳動物中出現頻率高兩倍(使用比例＞2)的BPV密碼子，以及使用比例大于1.5的大部分密碼子被保守替代為優先使用的哺乳動物密碼子。在WO 97/31115，WO 97/48370和WO 98/34640(Merck & Co.，Inc.)中，將已經過密碼子最優化的序列在作為最優化依據的宿主哺乳動物中用作DNA疫苗時，HIV基因或其片段的密碼子最優化使蛋白表達增加，并且提高了免疫原性。在該項工作中，所述序列完全由最優化的密碼子組成(除了會因此引入不期望的限制性位點，內含子剪切位點等的部位)，因為針對所選宿主的優化的密碼子保守取代了每種病毒密碼子。
依照第一方面，本發明提供了一種多核苷酸序列，該序列編碼HPV氨基酸序列，其中多核苷酸序列的密碼子使用模式與高表達的哺乳動物基因的密碼子使用模式相似。優選，所述多核苷酸序列是DNA序列。期望所述多核苷酸序列的密碼子使用模式與高表達的人基因的密碼子使用模式相似。理想的是，所述多核苷酸序列的密碼子使用模式與高表達的大腸桿菌基因的密碼子使用模式也相似。所述多核苷酸序列可以是DNA序列，例如雙鏈DNA序列。優選所述多核苷酸序列編碼與宮頸癌，良性皮疣或尖銳濕疣有關的HPV型或亞型的HPV多肽，所述型別例如1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，優選的型別有6，11，16，18，33或45，它們具體與宮頸癌和尖銳濕疣有關，最優選HPV11，6a或6b。
因此，本發明提供了一種合成基因，該基因包含一組密碼子，它們在一起可編碼HPV氨基酸序列，其中通過選擇使可能用于編碼所述氨基酸序列的密碼子類似哺乳動物的優化密碼子，以使在合成基因中密碼子的使用頻率極類似于高表達的哺乳動物基因，而不是乳頭瘤病毒基因。優選，所述密碼子使用模式實際上與高表達的人類基因相同。
在某些實施例中，所編碼的氨基酸序列是野生型HPV氨基酸序列。在另外的實施方案中，所編碼的氨基酸序列是突變的HPV氨基酸序列，包含具有氨基酸改變的野生型序列，例如所述氨基酸改變是足以使所述多肽的一種或多種天然生物功能減低或失活的點突變。突變的氨基酸序列優選保持野生型多肽的免疫原性。
所編碼的HPV多肽可包含早期基因產物，如E1，E2或E7，或其片段，類似物或融合體，或可以是晚期基因產物如L1或L2，或其片段，類似物或融合體。本發明的多肽可以，例如編碼如下融合體兩種或多種HPV早期基因產物之間，HPV早期基因產物和HPV晚期基因產物之間，或兩種或多種晚期基因產物之間，或HPV基因產物的一種或多種片段之間，或HPV基因產物(或其片段)和衍生自除HPV外的其它來源(例如佐劑或靶向肽，或多肽，如HBV核心肽)的多肽之間的融合體。所述融合體可以是衍生自同一或不同病毒型別或亞型的HPV基因產物之間的融合體。這種融合體將優選保留被融合的肽成分的免疫原性。優選，所編碼的HPV多肽包含早期基因產物的全部或一部分，最優選E1或E2。在一具體的實施方案中，所述多核苷酸序列編碼如
圖1所示的HPV 6b野生型E1多肽，或其片段或類似物。在另外的實施方案中，多核苷酸序列編碼以下一種或多種物質圖2所示的突變的HPV6b E1的氨基酸序列；圖3所示的HPV11或6a或6b的野生型E2氨基酸序列；圖4b所示的突變的HPV6b E2氨基酸序列；圖4a所示的突變的HPV11 E2序列，或其片段，類似物或融合體，其中所編碼的多肽保留免疫原性。
依照本發明，多核苷酸的密碼子使用模式優選排除靶生物體的高表達基因中RSCU值小于0.2的密碼子。相對同義密碼子應用(RSCU，relatvesynonymous codon usage)值是觀察到的密碼子數除以所期望的數(如果該氨基酸的所有密碼子的使用頻率相同)。本發明的多核苷酸對高表達的人基因來說將通常有一個大于0.3的密碼子使用系數(如下定義)，優選大于0.4，最優選大于0.5但小于1。期望所述多肽對高表達的大腸桿菌基因來說也有一個大于0.5的密碼子使用系數，優選大于0.6，最優選大于0.7。
在一個實施方案中，本發明提供了如圖5或圖6所示的多核苷酸序列，或保持了它們的密碼子使用模式的其片段或類似物。在另一實施方案中，本發明提供了互補于圖5或圖6所示的序列的多核苷酸序列。
本發明的第二方面提供了表達載體，其包含本發明第一方面的多核苷酸序列并能夠指導該多核苷酸序列的表達，該多核苷酸序列編碼HPV氨基酸序列，其中所述多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達的哺乳動物基因，優選高表達的人基因。所述載體適合驅動異源DNA在細菌，昆蟲或哺乳動物細胞中表達，特別是在人細胞中表達。在一個實施方案中，所述表達載體是p7313PLc(圖7)。
本發明的第三方面提供了一種宿主細胞，該細胞包含本發明第一方面的多核苷酸序列，或第二方面的表達載體。所述宿主細胞可以是細菌細胞，例如大腸桿菌，可以是哺乳動物細胞，例如人，或者可以是昆蟲細胞。包含本發明載體的哺乳動物細胞可以是體外轉染的培養細胞，或者可以是通過將載體給予哺乳動物而體內轉化的細胞。
本發明第四方面提供了一種藥用組合物，其包含本發明第一方面的多核苷酸序列。優選所述組合物包含本發明第二方面的DNA載體。在優選實施方案中，所述組合物包含一組粒子，優選金粒子，它們用包含編碼多核苷酸序列的載體的DNA包被，所述多核苷酸序列編碼HPV氨基酸序列，其中，多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達的哺乳動物基因，特別是人基因。在另外的實施方案中，所述組合物包含可藥用的賦形劑和本發明第二方面的DNA載體。所述組合物也可以包含佐劑。
本發明另一方面提供了制備上述藥用組合物的方法，其包括如下步驟改變野生型HPV核苷酸序列的密碼子使用模式，或人工合成一種多核苷酸序列，以產生具有如下特征的序列該序列的密碼子使用模式類似于高表達的哺乳動物基因，并且該序列編碼野生型HPV氨基酸序列或突變的HPV氨基酸序列(其包含具有改變的氨基酸的野生型氨基酸序列，所述改變足以滅活所述多肽的一種或多種天然功能)。
本發明還提供了本發明第一方面的多核苷酸，或本發明第二方面的載體在治療或預防HPV感染中的用途，優選所述感染由與宮頸癌，良性皮疣，或尖銳濕疣有關的HPV型或亞型(例如1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型)所致，在某些實施方案中，本發明提供了本發明第一方面的多核苷酸，或本發明第二方面的載體在治療或預防6，11，16，18，33或45型HPV感染中的用途，這些型的HPV具體與宮頸癌和尖銳濕疣有關，最優選HPV11，6a或6b。本發明還提供了本發明第一方面的多核苷酸，本發明第二方面的載體或本發明第四方面的藥用組合物的用途，所述用途是治療或預防皮疣，尖銳濕疣，意義未確定的非典型性鱗狀細胞(ASCUS)，宮頸發育異常，頸上皮內瘤形成(CIN)或宮頸癌。因此，本發明還提供了本發明第一方面的多核苷酸，或本發明第二方面的載體的用途，所述用途是制備治療或預防如下任一種或多種型別的HPV感染或與所述型別有關的任何癥狀或疾病的藥物，所述HPV型別為1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型。
本發明還提供了治療或預防HPV感染，具體是由如下任一種或多種HPV型所導致的感染，或與所述型有關的任何癥狀或疾病的方法，所述HPV型為1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，該方法包含給藥有效量的本發明第一方面的多核苷酸，本發明第二方面的載體或本發明第四方面的藥用組合物。所述藥用組合物可以以一劑或多劑的方式給藥，例如，以“初次免疫-加強免疫(prime-boost)”的治療性接種方案給藥。在某些情況下，“初次免疫”的接種可以通過本發明多核苷酸的粒子介導型DNA傳輸實現，優選本發明的多核苷酸摻入了質粒衍生的載體，所述“加強免疫”通過給藥包含相同多核苷酸序列的重組病毒載體進行。
在本發明的說明書和權利要求中，術語“包含”和“包括”都解釋為包含在內。即這些詞意指可能包含上下文允許但沒有具體描述的其它成分或整體。
術語“類似物”是指一種多核苷酸，它與本發明的另一多核苷酸編碼相同的氨基酸序列，但由于遺傳密碼子的豐余性而具有不同的核苷酸序列，但密碼子使用模式可保持相同，例如具有相同的密碼子使用系數或密碼子使用系數為所述另一多核苷酸的0.1之內，優選在0.05之內。
術語“密碼子使用模式”是指所述核苷酸序列，一個或一類基因(例如高表達的哺乳動物基因)中所有密碼子的平均頻率。可在文獻中找到哺乳動物包括人的密碼子使用模式(參見例如Nakamura et al.Nucleic Acids Research1996，24214-215)。
在本發明的多核苷酸中，人乳頭瘤病毒典型的密碼子使用模式被改變為更接近于靶生物體的偏好，所述生物體例如大腸桿菌或哺乳動物，尤其是人。“密碼子使用系數”是衡量給定多核苷酸序列與目標物種的多核苷酸序列的相似程度的一個指標。密碼子的頻率可參考有關多種物種的高表達基因的文獻(參見例如Nakamura et.al.Nucleic Acids Research 1996，24214-215)。將61種密碼子中每種密碼子的頻率(表示為在所選的一類基因中每1000個密碼子中的出現次數)針對20種天然氨基酸中每種氨基酸進行校對，以便針對每種氨基酸來說，將最常用的密碼子的值設定到1，將不太常用的密碼子的頻率設定在0和1之間。這樣，靶物種的高表達基因的61種密碼子中每種密碼子都設定了一個值，該值是1或低于1。為計算特定多核苷酸相對于該物種的高表達基因的密碼子使用系數，記錄該特定多核苷酸的每種密碼子的設定值，然后計算所有這些值的幾何平均值(是將這些值的自然對數的總和除以密碼子總數，然后取反對數)。所述系數介于0到1之間，系數越高，所述多核苷酸中將有更多的密碼子是頻繁使用的密碼子。如果某一多核苷酸序列的密碼子使用系數是1，對于靶物種的高表達基因來說，所有的密碼子都是“最常用的”的密碼子。
較短的多核苷酸序列也在本發明的范圍內。例如，本發明的多核苷酸可編碼HPV蛋白的片段。編碼長度為至少8個氨基酸，例如8-10個氨基酸，或者20，50，60，70，80，100，150或200個氨基酸的片段的多核苷酸被認為落入本發明的范圍之內，只要所述多核苷酸具有類似于高表達的哺乳動物基因的密碼子使用模式，并且所編碼的寡肽或多肽經證實具有HPV抗原性。具體地，但不是獨有地，本發明的這一方面包括以下情況所述多核苷酸編碼完整HPV蛋白序列的片段，且代表該蛋白的一種或多種不連續的表位。
本發明的多核苷酸在大腸桿菌和哺乳動物細胞中的表達高于編碼同一氨基酸序列的相應的野生型序列。不受任何理論的限制，一般認為這種情況至少有兩種原因。第一，因為所述序列具有與宿主細胞的序列較接近的密碼子使用模式，所以所述序列更容易受到細胞翻譯機制的加工。第二，因為核苷酸序列中多達30％(或更多)的部分與野生型序列不同，所以干擾轉錄或翻譯的位點(如蛋白結合位點)將會被除去或改變。
在一些實施方案中，本發明的多核苷酸的密碼子使用模式類似于大腸桿菌和哺乳動物(例如，人)基因。這特別有利于在哺乳動物接種和在體外用大腸桿菌細胞制備大量抗原蛋白(例如，用于檢測，如免疫檢測以判斷在哺乳動物或人組織中的表達水平)時使用序列的情況。
如上所述，本發明包括包含本發明核苷酸序列的表達載體。所述表達載體按照分子生物學領域的常規來構建，例如，可使用質粒DNA和適當的起始密碼子，啟動子，增強子以及其它元件，例如必要的聚腺苷酸化信號，并且將它們以正確的方向放置，以便實現蛋白的表達。其它適當的載體對本領域技術人員來說是已知的。關于這方面的其它實例可參考Sambrooket.al.，Molecular Cloninga Laborotory Manual.2ndEditon.CSH LaboratoryPress.(1989)。
本發明的多核苷酸，或在本發明載體中應用的多核苷酸，優選可操作地連接于調控序列，所述調控序列能使宿主細胞表達該編碼序列，即所述載體是一種表達載體。術語“可操作地連接”是指一種毗連關系，其中，所述成分所處的關系允許它們以預計的方式起作用。調控序列，例如啟動子“可操作地連接”編碼序列是指，在與調控序列相容的條件下啟動子所處的位置能實現所述編碼序列的表達。
所述載體可以是(例如，質粒，人工染色體(例如BAC，PAC，YAC)，病毒或噬菌體載體，其帶有復制起點，任選還帶有可用于多核苷酸表達的啟動子并任選帶有啟動子的調節物。所述載體可以包含一種或多種可供選擇的標記基因，例如氨芐青霉素或卡那霉素抗性基因(在細菌質粒的情況下)，或真菌載體的抗性基因。所述載體可以體外應用，例如用于制備DNA或RNA或用于轉染或轉化宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)，例如制備由載體編碼的蛋白。也可以修飾所述載體以在體內應用，例如用于DNA接種方法中或用于基因治療方法中。
可選擇啟動子和其它表達調控信號以使其與進行表達的宿主細胞相容。例如哺乳動物啟動子包括金屬硫蛋白啟動子(其能被重金屬例如鎘誘導)，β肌動蛋白啟動子。也可使用病毒啟動子例如SV40大T抗原啟動子，人巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子，勞斯肉瘤病毒LTR啟動子，腺病毒啟動子，或HPV啟動子，特別是HPV上游調控區(URR)。所有這些啟動子都在本領域內有詳細的描述并可很容易地得到。
適當的病毒載體的實例包括單純皰疹病毒載體，痘苗病毒或α病毒載體和逆轉錄病毒載體，包括慢病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。使用這些病毒進行的基因轉移技術是本領域已知的。逆轉錄病毒載體例如可以用于將本發明的多核苷酸穩定地整合到宿主基因組中，盡管所述重組不是優選的。復制缺陷的腺病毒載體是附加體形式，所以可進行瞬時表達。可以使用能在昆蟲細胞中驅動表達的載體(例如桿狀病毒載體)，或在人細胞或細菌中能驅動表達的載體，以產生大量的由本發明多核苷酸所編碼的的HPV蛋白，例如用作亞單位疫苗或在免疫檢測中應用的蛋白。
由于能表達所編碼的蛋白，本發明的多核苷酸可用于制備中，所述表達可在體外，體內或回體(ex vivo)進行。所述多核苷酸因此可參與重組蛋白的合成，例如，能增加產量，或實際上本身可用作治療劑，在DNA接種技術中應用。本發明的多核苷酸用于在體外或回體制備所編碼的蛋白時，可對細胞，例如細胞培養中的細胞進行修飾以使其包含將被表達的多核苷酸。所述細胞包括瞬時的，或優選穩定的哺乳動物細胞系。細胞的具體實例是可通過插入編碼本發明多肽的載體進行修飾的細胞，包括哺乳動物HEK293T，CHO，HeLa，293和COS細胞。優選所選擇的細胞系不僅是穩定的，還可進行成熟糖基化和進行多肽的細胞表面表達。表達可以在轉化的卵母細胞中實現。多肽可以在轉基因的非人動物，優選小鼠的細胞中由本發明的多核苷酸表達。從本發明的多核苷酸表達多肽的轉基因非人動物包括在本發明的范圍之內。
本發明的多核苷酸用作治療劑時，例如在DNA接種中，可將所述核酸給藥將接受接種的哺乳動物，例如人。所述核酸，例如RNA或DNA，優選DNA以可以在哺乳動物細胞中表達的載體(如以上描述的那些)的形式提供。可以任何可利用的技術給藥所述多核苷酸。例如，可以通過針注射將所述核酸導入，優選皮內，皮下或肌肉內。或者，將所述核酸通過核酸傳輸裝置，如粒子介導的DNA傳輸(PMDD)將所述核酸直接傳輸到皮內。在該方法中，惰性粒子(例如金粒)用核酸包被，并被加速至足以能使它們穿過受試者的表面(例如皮膚)，例如利用發射裝置的高壓來加速。(用本發明核酸分子包被的粒子在本發明的范圍內，載有所述粒子的傳輸裝置也在本發明的范圍內)。期望所述組合物包含平均粒徑0.5-5μm的金粒，優選約2μm。在優選實施方案中，將所包被的金粒裝載到管中，用作藥筒，這樣每個藥筒中包含用0.1-5μg，優選約0.5μgDNA/藥筒包被的0.1-1mg，優選0.5mg金。
將裸露的多核苷酸或載體導入患者的適當技術包括適當載體的局部應用。所述核酸可以局部給藥到皮膚，或粘膜表面，例如通過鼻內，口腔，陰道內或直腸內給藥。所述裸露的多核苷酸或載體可以與可藥用賦形劑，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)一起存在。應用促進劑如丁哌卡因(bupivacaine)(或分開應用或包含在DNA制劑中)可進一步促進DNA的攝取。將所述核酸直接給藥于受體的其它方法包括超聲，電刺激，電穿孔和顯微種植(在US-5,697,901中描述)。
多種已知的轉染技術可用來提高核酸構建體的攝取，所述技術例如包括應用轉染制劑的那些技術。所述制劑的實例包括陽離子制劑，例如磷酸鈣和DEAE-Dextran和脂質轉染劑，例如lipofectam和transfectam。核酸的給藥劑量可以改變。通常核酸的給藥劑量在1pg到1mg的范圍內，對于粒子介導的基因傳輸優選的劑量在1pg到10μg，其它的途徑優選的劑量為10μg到1mg。
本發明的核酸序列也可以通過在基因治療中專用的傳輸載體給藥。基因治療的方法描述于例如Verme et al，Nuture 1997，389239-242中。病毒和非病毒載體系統都可以應用。基于病毒的系統包括基于逆轉錄病毒，慢病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒，金絲雀痘病毒和痘苗病毒的系統。基于非病毒的系統包括直接給藥核酸，微球體膠囊化技術(聚(丙交酯-共-乙交酯)和基于脂質體的系統。當初次接種后，期望給予加強注射時可以將病毒和非病毒傳輸系統相結合，例如，用非病毒載體如質粒進行“初次免疫”的DNA接種，然后用病毒載體或基于非病毒的系統進行一次或多次的“加強免疫”接種。
也可將本發明的核酸序列通過轉化細胞的方式給藥。所述細胞包括從受試者收獲的細胞。可將本發明的裸露多核苷酸或載體在體外導入上述細胞中，之后再使所述轉化的細胞返回受試者。本發明的多核苷酸通過同源重組摻入到細胞已有的核酸中。必要時，轉化的細胞可以在體外培養，然后將一或多個所得細胞用于本發明中。可用已知的外科學或顯微外科學技術(例如，移植，顯微注射等)將所述細胞提供到適當的部位。
適當的細胞包括抗原呈遞細胞(APC)，如樹突細胞，巨噬細胞，B細胞，單核細胞和能被改造成有效的APC的其他細胞。可以(但不是必須)將所述細胞進行基因修飾以增強呈遞抗原的能力，改善對T細胞應答的活化和/或維持，具備抗腫瘤，例如抗宮頸癌的作用和/或與受者在免疫學上相容(即HLA單體型匹配)。通常可以從多種生物體液和器官，包括腫瘤和腫瘤周圍組織的任何一種中分離APC，所述APC可以是自體的，同種異體的，同基因的或異種的細胞。
本發明的某些優選實施方案中使用了樹突細胞或它們的先祖作抗原呈遞細胞，用來進行體外轉化并返回給患者，或作為在疫苗中所運輸的核苷酸的體內靶，例如通過粒子介導的DNA傳輸。樹突細胞是高效APC(Banchereau and Steinman，Nature 392245-251，1998)，并且作為一種生理佐劑已顯示出可有效引發預防性或治療性的抗腫瘤免疫(參見Timmermanand Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。樹突細胞具有典型的形狀(原位放射狀(stellate in situ)，具有體外可視的顯著的胞質隆起(樹突))，它們高效攝取、加工和呈遞抗原，它們活化初始T細胞應答，通常可以根據這些對其進行鑒定。當然，可對樹突細胞進行改造，使其在體內或回體表達樹突細胞中不常見的特異性細胞表面受體或配體，例如本發明構建體編碼的抗原，這種修飾的樹突細胞包括在本發明的范圍內。作為樹突細胞的替代物，負載分泌泡抗原的樹突細胞(也稱為外來體)可用在疫苗中(參見Zitvogel etal.，Nature Med.4594-600，1998)。
可從外周血，骨髓，腫瘤浸潤細胞，浸潤腫瘤周圍組織的細胞，淋巴結，脾臟，皮膚，臍帶血或其他適當的組織或體液中獲得樹突細胞和先祖。例如，通過將細胞因子如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNF的組合加入到收獲自外周血的單核細胞培養物中可回體分化樹突細胞。或者，將GM-CSF，IL-3，TNF，CD40配體，脂多糖LPS，flt3配體(在專職抗原呈遞細胞，特別是樹突細胞的產生方面重要的細胞因子)和/或誘導樹突細胞分化，成熟和增殖的其他化合物的組合加入到培養介質中，可使收獲自外周血，臍帶血或骨髓的CD34陽性細胞分化成樹突細胞。
通常用編碼具有抗原性的HPV氨基酸序列的多核苷酸，如本發明密碼子最優化的多核苷酸轉染APC。所述轉染可回體實現，然后可將包含所述轉染細胞的組合物或疫苗用于治療目的，如本發明所述。或者，可將靶向樹突細胞或其他抗原呈遞細胞的基因傳輸載體給藥患者，從而在體內發生轉染。樹突細胞的體內和回體轉染，例如通常可用本領域已知的任何方法進行，參照WO 97/24447所述方法，或Mahvi et al.，Immunology and CellBiology 75456-460，1997描述的粒子介導的方法。
疫苗和藥用組合物可存在于單劑或多劑容器中，如密封的安瓶或小瓶中。所述容器優選密封封閉的，以保持所用制劑的無菌狀態直至使用時。通常，制劑以懸浮液，溶液或乳液的形式儲存在油性或水性載體中。或者，疫苗或藥用組合物以凍干的狀態儲存，僅需在即將使用前加入無菌液體狀載體。包含即將通過粒子介導的傳輸來給藥的核苷酸序列的疫苗可以是適于用壓縮氣體傳輸裝置給藥的藥筒，在這種情況下，所述藥筒由空管構成，其內表面涂有攜帶疫苗核苷酸序列的粒子，選擇地，還存在其他的可藥用成分。
本發明的可藥用組合物可包含佐劑化合物或用來調整或提高由所述DNA編碼的蛋白誘導的免疫應答的其他物質。這些物質可由DNA編碼，為單獨的形式，或與抗原形成的融合體，或作為制劑中的非DNA成分。可包含在本發明制劑中的佐劑類物質的實例包括遍在蛋白，溶酶體相關膜蛋白(LAMP)，乙型肝炎病毒核心抗原，flt3-配體和其他細胞因子如IFN-γ和GMCSF。
市售的其他合適的佐劑如，例如，弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；Imiquimod(3M，St.Paul，MN)；Resimiquimod(3M，St.Paul，MN)；Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；鋁鹽如氫氧化鋁膠(alum)或磷酸鋁；鈣鹽，鐵鹽或鋅鹽；酰化酪氨酸的不溶性懸浮液；酰化糖；陽離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球體；單磷酰脂質A和quilA。細胞因子，如GM-CSF或白細胞介素2，7或12也可用作佐劑。
在本發明的制劑中，優選佐劑組合物誘導以Th1型為主的免疫應答。因此，所述佐劑可用來把對DNA編碼抗原所產生的以Th2型為主的免疫應答向Th1型為主的免疫應答方向調整。Th1-型細胞因子(如IFN-，TNF，IL-2和IL-12)的高水平趨向于對誘導細胞介導的針對所給藥抗原的免疫應答有利。以Th1型為主要應答的優選實施方案中，Th1型細胞因子的水平提高的程度比Th2型細胞因子的水平高。這些細胞因子的水平可用標準檢測法很容易地檢測。對細胞因子家族的綜述可參見Mosnann and Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
因此，引發以Th1型為主的應答所用的適當佐劑包括，例如，單磷酰基脂質A，優選3-脫-O-酰化的單磷酰基脂質A(3D-MPL)與鋁鹽的組合。其他已知的優先誘導Th1型免疫應答的佐劑包括包含CpG的寡核苷酸。所述寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸是非甲基化的。所述寡核苷酸是已知的并描述于，例如，WO 96/02555。對免疫刺激性DNA序列也有描述，例如，Sato et al.，Science 273352，1996。包含CpG的寡核苷酸可在同一或不同的多核苷酸構建體中與乳頭瘤抗原分別編碼，或它們之間是緊鄰的，例如它們是融合體。或者，包含CpG的寡核苷酸可分別給藥，即不作為包含編碼抗原組合物的一部分。CpG寡核苷酸可單獨應用或與其他佐劑聯合應用。例如，增強的系統涉及包含CpG的寡核苷酸與皂苷衍生物的組合，尤其是WO 00/09159和WO 00/62800中公開的CpG和QS21的組合。優選所述制劑另外含有水包油乳劑和/或生育酚。
另一優選佐劑是皂苷，優選QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)，其可單獨應用或與其他佐劑組合應用。例如，一種提高的系統涉及單磷酰基脂質A和皂苷衍生物的組合(如QS21和3D-MPL的組合，描述在WO 94/00153中)，或較弱的反應原性組合物(其中QS21用膽固醇淬滅，這在WO 96/33739中有描述)。其他優選的制劑包括水包油乳劑和生育酚。在水包油乳劑中包含QS 21，3D-MPL和生育酚的特別強效的佐劑制劑描述于WO 95/17210中。
其他優選佐劑包括Montanide ISA 720(Seppic，France)，SAF(Chiron，California，United States)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，Detox(Ribi，Hamilton，MT)，RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其他氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)。
其他優選的佐劑包括通式(I)的佐劑分子通式(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中，n是1-50，A是一種化學鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本發明的一個實施方案由包含通式(I)的聚氧乙烯醚的制劑組成，其中n為1-50，優選4-24，最優選9；R成分是C1-50，優選C4-C20烷基，最優選C12烷基，A是一種化學鍵。聚氧乙烯醚的濃度應在0.1-20％范圍內，優選0.1-10％，最優選在0.1-1％的范圍內。優選聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯基-9-月桂基醚，聚氧乙烯基-9-steoryl醚，聚氧乙烯基-8-steoryl醚，聚氧乙烯基-4-月桂基醚，聚氧乙烯基-35-月桂基醚，聚氧乙烯基-23-月桂基醚。聚氧乙烯基醚如聚氧乙烯基月桂基醚在Merck索引(第12版，查詢號7717)中有描述。這些佐劑分子在WO 99/52549中描述。上述通式(I)的聚氧乙烯醚如果需要可與另一佐劑組合。例如，優選的佐劑組合是優選與正在審理的英國專利申請GB 9820956.2中描述的CpG組合。
當疫苗包括佐劑時，疫苗制劑可以以兩部分給藥。例如，通過皮下或肌肉注射，或通過皮內粒子介導的傳輸首先給藥包含編碼抗原的核苷酸構建體的制劑部分，然后立即或間隔適當時間后給藥包含佐劑的制劑部分，這對疫苗領域有經驗的醫師來說是顯而易見的。在這些情況下，所述佐劑可以與抗原制劑按同樣的途徑給藥或通過另外的途徑給藥。在其他實施方案中，所述制劑的佐劑部分可在抗原部分給藥前給藥。在一個實施方案中，所述佐劑作為一種局部制劑，給藥于編碼抗原的核苷酸序列的粒子介導性傳輸部位的皮膚，可以是在粒子介導的傳輸之前或之后進行。
以下實施例參考附圖用以進一步描述本發明其中圖1顯示來自HPV型11，6a和6b的E1的原型野生型氨基酸序列，來源于Genbank；圖2顯示圖1(6b-e1)所示HPV6b E1的原型野生型氨基酸序列，與包含用于除去生物活性的點突變的HPV6b E1氨基酸序列(6b-e1 mut)的比對；圖3顯示來自HPV型11，6a和6b的E2的原型野生型氨基酸序列，來源于Genbank；圖4a顯示圖3(Hpv-11e2-wt)所示HPV11 E2的原型野生型氨基酸序列，與包括用于除去生物活性的點突變的HPV11 E2氨基酸序列(Hpv-11e2-mut)，以及與圖6(Hpv-11e2-comut)所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列的比對；圖4b顯示圖3(Hpv-6be2-wt)所示HPV6b E2的原型野生型氨基酸序列，與包括用于除去生物活性的點突變的HPV6b E2氨基酸序列(Hpv-6be2-mut)的比對；圖5顯示一種核苷酸序列，該序列具有類似于高表達的人基因的密碼子使用模式，所述核苷酸序列編碼圖2中突變的HPV6b E1氨基酸序列；圖6顯示一種核苷酸序列，其具有類似于高表達的人基因的密碼子使用模式，所述核苷酸序列編碼圖4中突變的HPV11 E2氨基酸序列；圖7顯示DNA載體p7313-PLc；圖8表示來自實施例4的細胞裂解物樣品在丙烯酰胺凝膠上電泳并染色的結果，以此顯示與所表達的E1蛋白結合的抗體；圖9顯示用本發明的多核苷酸免疫小鼠后對抗原攻擊所產生的細胞應答(實施例6)；和圖10表示來自實施例7的細胞裂解物在丙烯酰胺凝膠上電泳并染色的結果，以此顯示與所表達的E2蛋白結合的抗體。
實施例1 HPV6bE1的密碼子最優化HPV6bE1的野生型原型氨基酸序列，從Genbank獲得，顯示在圖1中(底部序列)。該圖顯示HPV病毒11，6a和6b型中所述蛋白的原型序列之間的高度同源性。類似地，圖3顯示HPV11，6a和6b的E2蛋白的野生型原型氨基酸序列。預計用HPV6b序列進行的免疫治療(治療性疫苗)將發生交叉反應，以提供預防或治療性的抗所有三種病毒型別的免疫應答。
將HPV6bE1序列的密碼子使用與高表達的人和大腸桿菌基因進行比較，發現這兩個物種的密碼子使用系數都低。對每個氨基酸殘基來說只應用最豐富的密碼子也會導致不對稱的密碼子使用模式，因為對給定氨基酸來說，沒有生物體僅用其最優選的密碼子。因此，可用統計學方法分配密碼子，從而得到合成基因，并使其密碼子頻率接近于在大腸桿菌和人中高表達的基因的天然密碼子頻率。
用稱為Calcgene的Visual Basic程序(由R.S.Hale和G Thompson撰寫)可分配合成基因中的密碼子(Protein Expression and Purification Vol.12 pp.185-188(1998))。對原始序列中的每一氨基酸殘基，基于其在高表達的大腸桿菌基因中出現的概率來分配密碼子。所述程序在微軟Windows3.1環境下運行的詳細情況可從作者處獲得。因為該程序應用統計學方法給合成基因分配密碼子，所以不是所有得到的密碼子都是靶生物體中最常用的。當然，靶生物體中常用和不常用密碼子的比例通過以正確的比例分配密碼子而反映在合成序列中。然而，因為沒有嚴格的規則確定序列中具體位置上的具體密碼子，所以，盡管每次都使用相同的密碼子使用模式并且每次都編碼同樣的氨基酸序列，但每次運行該程序都會產生不同的合成基因。如果對于給定氨基酸序列和給定靶生物體將上述程序運行數次，將產生數種不同的核苷酸序列，它們在限制性位點的數目，類型和位置方面，內含子剪切信號等方面不同，其中有一些可能是不期望的。在這些特征基礎上，本領域技術人員能選擇適當的序列應用于多肽的表達。
進一步地，因為密碼子是按照統計學計算而隨機分配的，所以在靶生物體中二個或二個以上的相對罕用的密碼子可能(盡管也許未必)極為接近并成簇。據信，這些簇可能會干擾翻譯機制，導致特別低的表達率，所以在最優化基因中選擇密碼子的算法排除了對高表達基因來說RSCU值小于0.2的任何密碼子，目的是防止偶然選擇出任何罕見密碼子簇。然后將剩余密碼子的分布依照高表達的大腸桿菌基因的頻率分派，以使合成基因中總體分布類似于大腸桿菌基因(系數＝0.85)，還類似于高表達的人基因(系數＝0.50)。用類似的過程獲得密碼子最優化的HPV11 E2核苷酸序列，不同的是應用Syngene(Peter Ertl，未公開)，這是Calcgene程序更新的版本，它能排除將被選的罕用密碼子，使用該程序能依照高表達的人基因的密碼子頻率模式分派密碼子。不象為E1選派密碼子，其不排除罕用密碼子。同時，改變一種寡核苷酸，以編碼K111A的氨基酸變更，如下描述。
將突變引入密碼子最優化的E1和E2基因以產生E1(K83G，R84G和G483D)和E2(K111A)氨基酸序列中的點突變。所述突變基因的氨基酸序列顯示在圖2(HPV6bE1)和圖4(HPV6bE2和HPV11E2)中(與野生型原型序列相比對)。HPV6bE1的密碼子最優化的且突變的核苷酸序列顯示在圖5。HPV11E2的密碼子最優化的且突變的核苷酸序列顯示在圖6。圖4給出了通過密碼子最優化的且突變的HPV11E2基因的表達獲得的多肽的氨基酸序列，其與原型野生型和突變的野生型序列相比對，以此顯示核苷酸序列的密碼子最優化不改變所編碼的氨基酸序列(其與突變的野生型序列相同)。
實施例2構建密碼子最優化的HPV6b E1多核苷酸序列基因設計用上述最優化軟件，從最優化的序列中計算出重疊的40體寡核苷酸。包含限制性位點的末端寡核苷酸是60體。所述寡核苷酸從Life TechnologiesLtd定購，濃度是50nmole，是去保護的和非磷酸化的。
寡核苷酸的組裝將每種寡核苷酸溶于雙蒸水中，至最終濃度為100微摩爾(μm)，制備所有96種寡核苷酸的等量混合物，濃度為100微摩爾。用來自RocheBoehringer的Pwo聚合酶(目錄號為1 644 955)如下進行合成。
雙蒸水86μlPwo 10X緩沖液 10μldNTP混合物1μl(100mM dNTP等量混合)寡核苷酸混合物1μl(100μM寡核苷酸等量混合)Pwo聚合酶 2μl在Trio Thermoblock(Biometra)上，用以下條件對上述反應混合物進行聚合酶鏈反應(PCR)1.40℃ 2分鐘2.72℃ 10秒鐘3.94℃ 15秒鐘4.40℃ 30秒鐘5.72℃ 20秒鐘+每個循環2秒鐘6.4℃ 8在第3步和第5步之間循環重復25次。
25個循環之后，從每個管中取出10μl的等份試樣在0.8％的Tris醋酸(TAE)瓊脂糖凝膠上電泳，并在長波的紫外光下觀察。合成的E1 DNA的期望大小應該約2Kb。
基因的回收合成的基因通過用聚合酶進行PCR來回收，所用的兩種末端寡核苷酸為合成的寡核苷酸，其中N末端寡核苷酸包含Not1限制性位點，C末端寡核苷酸包含BamH1位點。
雙蒸水65μlPwo10X緩沖液 10μldNTP混合物1μl(100mM dNTP等量混合)裝配混合物20μl(來自先前的PCR)N末端寡核苷酸 1μl(100μM)C末端寡核苷酸 1μl(100μM)Pwo聚合酶 2μl
1.94℃ 45秒鐘2.72℃ 2分鐘+每500個bp 1分鐘3.72℃ 10分鐘4.4℃ 8在第2步和第1步之間循環重復25次。
然后將PCR產物用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen目錄號為28104)進行純化，之后將DNA重新懸浮在總量為50μl的試劑盒洗脫緩沖液中。將10μl等份試樣用Not1和BamH1限制性內切酶(來自Life Technologies Ltd，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，Scotland)在37℃消化2小時。然后將該消化物在0.8％的TAE瓊脂糖凝膠上進行凝膠純化，切割并用QIAquick Gel提取試劑盒(Qiagen目錄號為28704)提取2Kb的DNA產物。將最終被消化的純DNA片段洗脫在總量為50μl的試劑盒洗脫緩沖液中。
將該PCR片段克隆到載體p7313PLc(圖7)中，(Powderject Vaccines Inc.，參見以下詳述)并轉化到感受態JM109細胞(Promega分類號為P9751)中。用Nco1-BamH1和Nco1-EcoR1消化對來自所選擇克隆的質粒DNA進行限制性酶核對。篩選出5個具有2Kb片段插入片段的正確克隆，對插入片段DNA進行測序。選擇出一個具有僅含3個點突變的插入片段的克隆進一步使用。通過與來自其它克隆的同源小片段進行的連接交換修正三個點突變。
用限制性酶消化對修正后的克隆再次進行核對，并將插入的DNA完全測序。該克隆被稱為p6bE1c/o。同時，為進行比較表達和免疫研究，野生型HPV-6b E1基因和野生型HPV-11 E1基因PCR擴增自HPV-6b基因組克隆(EMBO J，2(12)2314-2318 1983)和HPV-11基因組克隆(Virology 151，124-130 1986)，然后將各自的片段克隆到Not1-BamH1消化的載體p7313PLc中。這些克隆分別稱為p6bE1w/t和p11E1w/t。
將克隆p6bE1c/o和p6bE1w/t中的E1基因進一步突變以引入氨基酸改變K83G，R84G和G438D。經測序的匹配的3’和5’寡核苷酸引物具有核苷酸取代(用于引入所需的突變)，用這些引物以及QuickChange定點突變試劑盒(Stratagene分類號為200518)中的其它制劑一起，按說明書所述方法進行PCR反應。將突變的p6bE1c/o和p6bE1w/t克隆分別命名為p6bE1c/o mut和p6bE1w/t mut。
實施例3 構建密碼子最優化的HPV11 E2多核苷酸序列對E2密碼子最優化的基因的設計，組裝和回收如對E1所描述的那樣，但重疊的寡核苷酸是60個核苷酸的長度，而不是40個核苷酸的長度，具有18個核苷酸的重疊。與E1的過程不同，一個包含K1114A氨基酸突變的克隆密碼子最優化的E2基因克隆同時產生，方式是用2種60體寡核苷酸(它們合并包含產生K111A改變所需的核苷酸取代)取代上述二者的相應野生型序列寡核苷酸。
質粒p7313-PLc的組成該質粒用pUC4K的包含卡那霉素抗性基因的EcoRI片段(Amersham-Pharmacia)取代包含pUC19的包含β-內酰胺酶基因的Eaml 1051-Pst1片段(可從Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.，AmershamPlace，Little Chalfont，Bucks，HP7 9NA獲得)，然后用T4 DNA聚合酶使二種片段鈍端化。人巨細胞病毒IE1啟動子/增強子，內含子A衍生自質粒JW4303(從Dr Harriet Robinson，University of Massachusetts獲得)，作為Xho1-Sal1片段插入到pUC19的Sal1位點，摻入牛生長激素的聚腺苷酸化信號。使所述啟動子的5’Sal1-Banl片段缺失，產生可應用于載體的最小啟動子(WO 00/23592-Powderject Vaccines Inc.)。HBV表面抗原的3’UTR衍生自載體pAM6中的乙型肝炎病毒(adw血清型)(Moriarty et al.，Proc.Natl.Acad.Sxi.USA，78，2606-2610，1981)。pAM6(pBR322基礎上的載體)從美國典型培養物保藏中心獲得，目錄號為ATCC 45020。3’UTR以1.4Kb的BamH1片段的形式插入到聚腺苷酸化信號的5’側，鈍端化以便通過插入以除去BamH1位點。在一系列步驟中(包括用BglI消化，Klenow聚合酶處理，用BstXI消化，用NcoI消化，用綠豆核酸酶處理以除去突出端和用BstXI進一步消化)，對HBV S抗原基因的3’非翻譯區的增強子區和bGHpA信號之間的區域進行修飾，以除去在X基因啟動子和bGHpA信號之間的所有大于5個密碼子的開放讀框。這導致缺失X蛋白可翻譯部分(9個氨基酸)的編碼序列和X基因的起始密碼子。然而，X基因的弱增強子/啟動子區被保留，因為發現該區增強CMV啟動子控制下的HBsAg的表達。用兔β珠蛋白聚腺苷酸化信號取代牛生長激素聚腺苷酸化信號。切出S抗原的5’非編碼和編碼序列，用寡核苷酸接頭取代，以提供所示的多克隆位點，以產生質粒p7313-PL。Hind -- - NotI--- -EcoRV --NdeI- -BamHIAGCTTGCGGCCGCTAGCGATATCGGTACCATATGTCGACGGATCC........ACGCCGGCGATCGCTATAGCCATGGTCTACAGCTGCCTAGGCCGG--NheI --KpnI---SaII-- ΔNotIColE1 cer序列從質粒pDAH212(來自David Hodgeson，WarwickUniversity)的亞克隆獲得，并用引物通過PCR擴增，以便在該序列末端放置EcoRI限制性位點。然后將所述cer序列插入p7313-PL的Eco RI位點，產生質粒p7313-PLc(圖7)。對照Genbank登錄號M11411證實擴增后的cer序列。
實施例4 在哺乳動物293T細胞中表達E1蛋白將哺乳動物293T細胞培養到對數生長期，6孔ComingCostarTM(Coming Science Products，10 The ValleyCentre，Gordon Road，HighWycombe，Bucks，UK)組織培養板的每孔中細胞的最終濃度為2×105，在5％的CO2中37℃過夜。制備如下轉染混合物并混合25分鐘2μg質粒DNA(載體，p6bE1c/o，p6bE1w/t)溶于16μl無菌雙蒸水中其中加入OPTI-memTM(Gibco BRL，Paisley，Scotland) 8μlLipofectamineTM(GibcoBRL)6μl用OPTI-memTM對每孔細胞單層小心洗滌二次。然后將800μlOPTI-memTM加入到每孔中。將200μl OPTI-memTM加入到每種轉染的混合物中，混合并輕輕加入到所述細胞單層。將培養板在5％CO2中37℃溫育5小時，之后將轉染混合物和OPTI-memTM棄掉。用細胞生長培養基輕輕洗滌細胞單層二次，最后將轉染細胞在5％CO2中37℃，在包含10％胎牛血清和29.2mg/ml L谷氨酰胺的Dulbecco’s改良型Eagle培養基中溫育24小時。將所述細胞刮入微量管中，用PBS洗二次，離心后將細胞團重懸在SDS PageLaemmli染料中。將所述細胞團煮沸并上樣至10％的SDS Page凝膠上，在1X Tris甘氨酸SDS緩沖液中電泳。電泳后，將凝膠印跡至硝酸纖維素膜(Amersham)上并進行Westem印跡。用5％MarvelTM(Premier Beverages，Knighton，Adbaston，Stafford，UK)的PBS溶液將硝酸纖維素膜室溫下封閉30分鐘，然后用PBS和0.1％的Tween20洗二次。將在兔中制備的抗HPV6bE1的C末端蛋白序列(蛋白序列CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR)的多克隆抗體在5％MarvelTM的PBS溶液中進行稀釋，然后加到硝酸纖維素膜上。在室溫下輕輕搖動溫育1小時。將所述稀釋的抗體除去，用PBS和0.1％的Tween20洗膜三次。將第二種偶聯物，豬抗兔辣根過氧化物酶(HRP)(DAKO)在PBS和0.1％的Tween20中進行1∶20000稀釋。將其加到上述洗過的膜上并在室溫下輕輕搖動溫育1小時。然后將該膜用PBS和0.1％的Tween20徹底洗滌。用Chemiluminescent HRP試劑盒(Amersham)檢測膜上的轉移蛋白。
結果E1翻譯蛋白的預測大小是68kDa-72kDa。結果(圖8)顯示由包含密碼子最優化的HPV6bE1的p7313-PLc表達的正確蛋白大小(泳道4)。包含野生型E1的載體在泳道3，其顯示在人細胞中沒有檢測到野生型核苷酸序列表達的E1。同樣在泳道2(空載體)和泳道1(未轉染的細胞)沒有檢測到E1。在泳道1-4的大約60kD的帶是一種未確定的細胞蛋白，其與抗E1抗體交叉反應。該帶在各泳道的強度大致恒定，表明各泳道樣品的上樣是一致的。
實施例5構建表達HPVE1和HPVE2蛋白的重組痘苗病毒表達HPV-6bE1蛋白的痘苗病毒在Glaxo Wellcome，Stevenage，UK制備。表達HPV-11 E1和HPV11 E2的痘苗病毒由Jeff Engler，University ofAlabama at Birmingham，US惠贈。
簡言之，將來自p6bE1w/t的E1基因克隆到痘苗病毒載體pTM3中，然后對重組載體進行限制性酶核對和DNA測序并用于轉染HTk-細胞。分離重組痘苗病毒并進行噬斑純化。用肽抗血清通過Western印跡對E1蛋白的表達進行檢測，所述抗血清是在用表達HPV-6bE1的重組病毒和表達噬菌體T7 RNA聚合酶的第二種痘苗病毒(vTF7-3)感染允許細胞后制備的。為直接表達來自HPV-11E1和E2重組痘苗病毒的E1和E2蛋白，需與痘苗病毒vTF7-3共感染細胞。痘苗病毒株WR用在陰性對照試驗中。載體pTM3和病毒vTF7-3來自National Institute of Health，Maryland，US。
實施例6對HPV抗原細胞應答的免疫學檢測除非另有說明，所有試劑都來自Gibco BRL，Paisley，Scotland or Sigma，Poole，Dorset。
A.免疫方案用1.0-2.0μg DNA(或者p6bE1c/o，p6bE1w/t，p6bE1c/o mut，p6bE1w/t mut或者是空載質粒p7313PLc)通過PMDD對雌性C57BL/6小鼠進行免疫，14天后用同樣劑量進行加強免疫。脫頸處死所述動物，取脾研究對HPV抗原的細胞應答。
B.制備脾細胞的單細胞懸液在毛面玻璃片(BDH)之間“搗碎”脾臟，將紅細胞裂解(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA)，并將細胞重懸于完全RPMI(補充了10％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和5×10-5M2-巰基乙醇的RPMI-1640培養基)中。
C.感染MC57靶細胞衍生自HPV抗原的免疫顯性表位仍然未明確，所以在體外對抗原特異性應答的檢測依賴于對靶細胞內產生的整個抗原的加工，所述靶細胞已用表明整個蛋白的cDNA轉染。MC57細胞(Kb陽性)用表達HPV-6bE1，HPV-11E2或HPV-11E1的重組痘苗病毒以感染復數5在37℃感染1小時。將過多的病毒洗掉，并將所述細胞重懸在包含50ng/ml重組人IL-2(GlaxoWellcome，Geneva)的完全RPMI中。
D.ELISPOT用大鼠抗小鼠IFNγ(Pharmingen 1818D)以在PBS中15μg/ml的濃度包被ELISPOT板(96孔，Millipore MAIP S 4510)，4℃過夜，之后添加從試驗組獲得的4×10e5個脾細胞。通過添加1×10e4個重組痘苗病毒感染的MC57細胞實現抗原的呈遞。野生型痘苗病毒WR用作陰性對照。將該分析在37℃溫育過夜(5％CO2)。
在檢測的第2天，用生物素化的大鼠抗小鼠IFNγ(Pharmingen18112D)(以1μg/ml的濃度)，鏈霉親和素堿性磷酸酶偶聯物(TCS BiologicalsSA 1008)(TCS biologicals SA 1008)(在PBS中以1/1000稀釋)檢測斑點形成細胞(blot forming cells)。用堿性磷酸酶底物試劑盒(Biorad 170-6432)觀察并用圖象分析進行定量。所得結果顯示在圖9。
如圖9所示，當用痘苗病毒載體(vacc.E1(11)或vacc.E1(6b))攜帶的E1進行攻擊時，所有三只用編碼HPB-6b密碼子最優化的E1序列的質粒接種的小鼠都可觀察到強細胞應答。當這些小鼠用野生型痘苗病毒(vacc.WT)，或用表達HPV-11 E2的痘苗病毒(vacc.E2(11))進行攻擊時，未觀察到應答。相反，用編碼野生型E1序列的質粒接種小鼠不產生T細胞應答。來自這些小鼠的脾細胞不對攜帶E1基因的痘苗病毒的攻擊產生反應，也不對任何其它的攻擊產生反應(資料未顯示)。E1基因的突變不改變小鼠體內細胞應答。因為用p6bE1c/o和p6bE1c/o mut免疫的小鼠產生抗靶細胞(所述靶細胞用表達來自HPV-11的E1蛋白的痘苗病毒感染)的強細胞免疫應答，所以我們可以推測在HPV-6bE1和HPV-11E1之間有高水平的免疫交叉反應。用空p7313-PLc載體接種的小鼠對任何攻擊顯示無應答。
實施例7 HPV6bE2在哺乳動物293T細胞中的表達用1μg每種質粒(p6bw/t，p6bc/o，p6bw/t mut，p6bc/o mut)轉染24孔培養板中的293T細胞單層(80％匯合)，每次轉染依照標準方法使用2.5μlLipofectamine 2000(Life Technologies)(參見上述實施例4)。轉染24小時后，收獲細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌并用抗HPV-6b N末端氨基酸序列MEAIAKRLDACQEQLLELYEEC的抗E2肽抗血清(#1100)，通過SDS-PAGE和Western印跡進行檢測(圖10)。
結果結果顯示在泳道3(密碼子最優化的E2)和泳道5(密碼子最優化且突變的E2)中有預計大小(40kD-45kD)的強蛋白帶。同樣大小的弱蛋白帶也顯示在泳道4中，這提示突變的野生型E2質粒有極低水平的表達，但在泳道1(陰性對照)，或泳道2(野生型E2蛋白)中無表達。約25kd的交叉反應性蛋白帶出現在所有泳道中，提示所有泳道蛋白裂解物的上樣量相等。E2的突變未顯示損及E2蛋白的表達，該蛋白的表達通過密碼子最優化得到明顯改善。
權利要求
1.一種多核苷酸序列，其編碼人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，其中該多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達的哺乳動物基因的密碼子使用模式。
2.依照權利要求1的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達的人基因的密碼子使用模式。
3.依照權利要求1或2的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列的密碼子使用模式也類似于高表達的大腸桿菌基因的密碼子使用模式。
4.依照權利要求1-3的任一項的多核苷酸序列，其是DNA序列。
5.依照上述權利要求的任一項的多核苷酸序列，其編碼與宮頸癌，良性皮疣或尖銳濕疣有關的HPV型或亞型的HPV多肽。
6.依照權利要求5的多核苷酸序列，其編碼1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型之一的HPV多肽。
7.依照權利要求6的多核苷酸序列，其編碼具體與宮頸癌或尖銳濕疣有關的HPV型或亞型的HPV多肽。
8.依照權利要求7的多核苷酸序列，其編碼6，11，16，18，33或45型之一的HPV多肽，或HPV病毒6，11，16，18，33或45型中一種或多種病毒的兩種或更多種多肽的融合體。
9.依照權利要求8的多核苷酸序列，其編碼選自HPV11，6a或6b的HPV型或亞型的HPV多肽。
10.依照上述權利要求的任一項的多核苷酸序列，其編碼具有降低的生物功能的突變的HPV多肽。
11.依照權利要求10的多核苷酸序列，其編碼突變的HPV多肽，該多肽包含一種或多種點突變，從而使該多肽的一種或多種天然的生物功能被滅活。
12.依照上述權利要求的任一項的多核苷酸序列，其中所編碼的HPV多肽包含HPV早期基因產物的全部或一部分。
13.依照權利要求12的多核苷酸序列，其中所編碼的HPV多肽包含E1或E2的全部或一部分，或E1或E2的全部或一部分與另一種HPV多肽的融合體。
14.依照上述權利要求的任一項的多核苷酸序列，其具有高表達的人基因的密碼子使用系數，該系數大于0.3小于1。
15.依照上述權利要求14的多核苷酸序列，其具有高表達的人基因的密碼子使用系數，該系數大于0.4小于1。
16.依照上述權利要求15的多核苷酸序列，其具有高表達的人基因的密碼子使用系數，該系數大于0.5小于1。
17.依照上述權利要求的任一項的多核苷酸序列，其具有高表達的大腸桿菌基因的密碼子使用系數，該系數大于0.6。
18.如圖5所示的多核苷酸序列或保持了其密碼子使用模式的其片段或類似物。
19.如圖6所示的多核苷酸序列或保持了其密碼子使用模式的其片段或類似物。
20.一種表達載體，其包含依照上述權利要求的任一項的多核苷酸序列，該序列與調控序列可操作連接，所述調控序列能使宿主細胞表達該多核苷酸序列。
21.依照權利要求20的表達載體，其能指導所述多核苷酸序列在細菌，昆蟲或哺乳動物細胞中的表達。
22.依照權利要求20或21的表達載體，其是p7313PLc。
23.一種宿主細胞，其包含依照權利要求1-19的任一項的多核苷酸序列。
24.一種宿主細胞，其包含依照權利要求20-22的任一項的表達載體。
25.依照權利要求23或24的宿主細胞，其是細菌細胞，哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
26.包含權利要求1-19的任一項的多核苷酸序列的藥物組合物。
27.包含權利要求20-22的任一項的載體的藥物組合物。
28.依照權利要求26或27的藥物組合物，其包含一組粒子，優選金粒子，用DNA包被。
29.依照權利要求27的藥物組合物，其包含藥學上可接受的賦形劑和DNA載體。
30.依照權利要求26-29的任一項的藥物組合物，其進一步包含佐劑。
31.依照權利要求30的藥物組合物，其中所述佐劑被編碼為與所述寡核苷酸編碼的HPV多肽的融合體。
32.依照權利要求1-19的任一項的多核苷酸在治療或預防HPV感染方面的用途。
33.依照權利要求20-22的任一項的載體在治療或預防HPV感染方面的用途。
34.依照權利要求26-31的任一項的疫苗組合物在治療或預防HPV感染方面的用途。
35.依照權利要求32-34的任一項的用途，其中HPV感染是HPV6，11，16或18型的感染。
36.依照權利要求1-19的任一項的多核苷酸，依照權利要求20-22的任一項的載體或依照權利要求26-31的任一項的藥物組合物，在治療或預防皮疣，尖銳濕疣，意義未確定的非典型鱗狀細胞(ASCUS)，宮頸發育異常，頸上皮內瘤形成(CIN)或宮頸癌方面的用途。
37.治療或預防HPV感染或與HPV感染有關的任何癥狀或疾病的方法，其包含給藥有效量的依照權利要求1-19的任一項的多肽，依照權利要求20-22的任一項的載體或依照權利要求26-31的任一項的藥物組合物。
38.治療或預防HPV感染或與HPV感染有關的任何癥狀或疾病的方法，其包含以初次免疫-加強免疫的給藥方案，用包含依照權利要求1-19的任一項的多核苷酸的重組病毒載體或基于非病毒的系統，給藥依照權利要求26-30的任一項的所述藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及在治療和預防人類乳頭狀瘤病毒感染以及與其相關的癥狀和疾病中有用的方法和組合物。具體地，本發明涉及編碼人乳頭狀瘤病毒(HPV)氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列中的密碼子使用模式與高表達的哺乳動物基因的密碼子使用模式相似。
文檔編號C12N1/21GK1462309SQ01816108
公開日2003年12月17日 申請日期2001年7月20日 優先權日2000年7月21日
發明者彼得·F·厄特爾, 杰拉爾德·W·高夫, 瓦尼塔·帕馬, 克里斯托弗·J·A·林, 薩拉·M·沃爾科特 申請人:葛蘭素集團有限公司