制造d-絲氨酸的方法

專利名稱：制造d-絲氨酸的方法
技術領域：
本發明關于D-絲氨酸的制造方法以及與該制造方法有關的微生物，其特征在于，在含有DL-絲氨酸的介質中，使已修飾為具有比大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株所具有的L-絲氨酸脫氨酶活性高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物細胞、該細胞的培養物或它們的加工產物和DL-絲氨酸接觸，分解L-絲氨酸，從該介質中提取殘存的D-絲氨酸。D-絲氨酸是一種有用的化合物，可作為D-環絲氨酸等藥物的合成中間體。
背景技術：
關于D-絲氨酸，已知有以下的制造方法。
(i)通過微生物作用，由DL羥基甲基乙內酰脲生成N氨基甲酰基-D-絲氨酸，然后水解，得到D-絲氨酸的方法(特開昭61-152291)。
(ii)在含有DL-絲氨酸的培養基中，培養假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(Torulopsis)、隱球菌屬(Cryptococcus)、復膜孢糖酵母屬(Saccharomycopsis)、漢森酵母屬(Hansenula)、埃希氏桿菌素(Escherichia)、克雷白氏桿菌素(Klebsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、微桿菌素(Microbacterium)或沙雷氏菌屬(Serratia)中同化L-絲氨酸而不同化D-絲氨酸的微生物，從培養液中分離D-絲氨酸的方法(特開昭64-2594)。
(iii)使具有酪氨酸酶活性的微生物和含有DL-絲氨酸和酚的反應液相互作用，將L-絲氨酸轉換成L酪氨酸，提取殘存的D-絲氨酸的方法(特開平5-91895)。
這些制造方法的任何一種，用作工業D-絲氨酸的制造方法都存有難度。即(i)的方法中，從DL羥基甲基乙內酰脲得到N氨基甲酰基-D-絲氨酸的收率低至40％，同時需要大量用作催化劑的菌；(ii)的方法中，反應結束后，仍然殘存有L-絲氨酸，最終需要進行DL-絲氨酸的分離；(iii)的方法中，基質濃度低至1％，同時反應中需要有害的酚，這些方面造成這些制造方法在工業生產中的利用困難。
已知大腸桿菌具有將L-絲氨酸分解成氨、丙酮酸和水的L-絲氨酸脫氨酶活性[J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)，Eur.J.Biochem.，212，777-784(1993)]。可是，據報道，從大腸桿菌中提取的該酶在反應時需要添加鐵和還原劑等復雜的條件[J.Bacteriol.，162，1270-1275(1985)]，而將這種純化酶用于D-制造絲氨酸的的方法也不實用。
此外，已知大腸桿菌還具有分解D-絲氨酸的D-絲氨酸脫氨酶活性[J.Bacteriol.，121，1092-1101(1975)]。因此，使用大腸桿菌利用L-絲氨酸脫氨酶從DL-絲氨酸中生產的D-絲氨酸，由于該D-絲氨酸脫氨酶的作用，發生分解，造成生成效率低下。
因此，按照已知的方法，不能建立從DL-絲氨酸有效生產D-絲氨酸的方法。

發明內容
本發明的目的是提供工業上有利的D-絲氨酸的制造方法。
本發明者發現，在修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株高的L-絲氨酸脫氨酶活性的大腸桿菌中，不提取或純化L-絲氨酸脫氨酶的條件下，使該菌或者菌加工產物和DL-絲氨酸接觸，由此，意外地幾乎沒有減少D-絲氨酸，同時可迅速地將L-絲氨酸分解減少到檢測限以下，可工業制造D-絲氨酸，至此完成了本發明。
本發明關于下面的(1)～(12)。
(1)D-絲氨酸的制造方法，其特征在于，在含有DL-絲氨酸的介質中，使修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物細胞、該細胞的培養物或它們的加工產物與DL-絲氨酸接觸，分解L-絲氨酸，從介質中提取殘留的D-絲氨酸。
(2)D-絲氨酸的制造方法，其特征在于，在含有DL-絲氨酸的培養基中，培養修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物，分解L-絲氨酸，從該培養物中提取殘留的D-絲氨酸。
(3)上述(1)和(2)的D-絲氨酸制造方法，其中經過修飾的微生物是具有L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物經過突變處理后得到的突變微生物。
(4)上述(1)和(2)的D-絲氨酸制造方法，其中經過修飾的微生物是將L-絲氨酸脫氨酶基因引入到微生物中得到的轉化微生物。
(5)上述(1)～(4)中任何一項的D-絲氨酸制造方法，其中經修飾的微生物的L-絲氨酸脫氨酶活性為大腸桿菌DH5α株所具有的L-絲氨酸脫氨酶活性的2倍以上。
(6)上述(1)～(4)中任何一項的D-絲氨酸制造方法，其中經修飾的微生物的L-絲氨酸脫氨酶活性為大腸桿菌DH5α株所具有的L-絲氨酸脫氨酶活性的5倍以上。
(7)上述(4)中的D-絲氨酸制造方法，其中L-絲氨酸脫氨酶基因是來源于大腸桿菌的sdaA基因或sdaB基因。
(8)上述(1)～(7)中任何一項的D-絲氨酸制造方法，其中經修飾的微生物都是大腸桿菌屬微生物。
(9)上述(1)～(8)中任何一項的D-絲氨酸制造方法，其中經過修飾的微生物選自大腸桿菌DH5α/pHIB、大腸桿菌NM522/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA2、大腸桿菌MM294/pHIB以及大腸桿菌ME5 386/pHIA2的微生物。
(10)上述(1)～(9)中任何一項的D-絲氨酸制造方法，其中修飾的微生物是D-絲氨酸脫氨酶活性低或者沒有這種酶活性的微生物。
(11)屬于大腸桿菌屬并修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株的L-絲氨酸脫氨酶活性高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物。
(12)上述(11)中的微生物，選自大腸桿菌DH5α/pHIB、大腸桿菌NM522/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA2、大腸桿菌MM294/pHIB以及大腸桿菌ME5386/pHIA2。
以下對本發明進行詳細說明1.得到修飾為具有比大腸桿菌DH5α株高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物。
本發明所用的修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株(東洋紡制造、以下同)高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物(以下略稱為修飾的微生物)可以按照以下的方法得到。
待修飾的微生物(以下稱為親代株)可以是具有L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物，也可以是不具有L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物。
如果親代株具有L-絲氨酸脫氨酶活性，則可以按以下(1)到(2)的方法得到修飾的微生物。
如果親代株不具有L-絲氨酸脫氨酶活性，則可以按以下(2)所記載的方法得到修飾的微生物。
此外，本發明的制造方法可以高回收率制造D-絲氨酸，因此，即使存在D-絲氨酸脫氨酶造成的D-絲氨酸的水解，也能夠高效率制造D-絲氨酸。
所以，親代株不論是否具有D-絲氨酸脫氨酶活性都可以。
(1)根據突變處理法得到目的菌株修飾的微生物可以由通過對親代株進行誘變處理、發生突變而得到的微生物(以下略稱為突變微生物)中得到。
突變處理法可以采用任何常用的方法。例如使用誘變劑的方法、紫外線照射的方法。
采用誘變劑的方法，優選使用例如N-甲基N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)的方法(微生物試驗手冊，131頁，1986年，講談社サイエンテイフイツク出版社)。
經過突變處理的微生物按照下述的方法進行培養，篩選L-絲氨酸脫氨酶活性比大腸桿菌DH5α菌株高的微生物，由此可得到修飾的微生物。
L-絲氨酸脫氨酶活性至少比大腸桿菌DH5α菌株高即可，優選高2倍以上，更優選高5倍以上。
L-絲氨酸脫氨酶活性的測定可以按照《酶方法》(Meth.Enzymol.)，17B，346(1971)，《酶方法》，17B，351(1971)等記載的方法進行。此外，作為簡便方法，可以按照下述的方法進行。
即，在修飾的微生物和DL-絲氨酸接觸后，測定反應液中殘留的L-絲氨酸的量，可以計算出單位時間內L-絲氨酸減少的量，以此進行測定。
例如從反應開始到反應的某一個時間內，測定L-絲氨酸的減少量即測定分解量，將所得到的分解量的值除以反應時間，計算單位時間L-絲氨酸的分解量，所得到的值為L-絲氨酸脫氨酶的活性。
具體而言，將得到的突變微生物在30℃培養1天，把得到培養液離心分離得到菌。培養基只要是能夠培養該突變微生物的培養基即可，可以采用這樣的任何培養基。將該菌懸浮在50mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.5)中，將離心得到的菌(濕菌重量約2g)用于反應。
于含有50g/LDL-絲氨酸的磷酸緩沖液(pH7.5)中懸浮得到的菌，在37℃反應10～22小時。反應結束后，用HPLC定量測定D-絲氨酸和L-絲氨酸的濃度，計算緩沖液中的含量。
(2)基因重組方法用以下所述的方法得到L-絲氨酸脫氨酶的基因，將該基因引入到宿主細胞中，由此可得到修飾的微生物。
(a)L-絲氨酸脫氨酶基因的獲得在已知的大腸桿菌的L-絲氨酸脫氨酶的基因序列[J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)、Eur.J.Biochem.，212，777-784(1983)]的基礎上，可以進行L-絲氨酸脫氨酶的基因的克隆。下面，舉例說明得到大腸桿菌的L-絲氨酸脫氨酶基因sdaA、sdaB的方法。但L-絲氨酸脫氨酶基因的來源只要是具有L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物即可，不限于大腸桿菌。
例如，可通過以下的方法得到。
在適于培養大腸桿菌的培養基，例如LB培養基(在1升水中含有細菌用胰蛋白胨(Difco公司制造)10g、酵母提取物(Difco公司制造)5g和NaCl5g，并調節pH值至7.2的培養基)，按照常規方法培養大腸桿菌，例如大腸桿菌W3110菌株。培養后，離心分離培養物得到菌。
將得到的菌按照已知的方法[例如Sambrook，J.Etal.，MolecularCloningAlaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)，以下簡稱為分子克隆第3版]分離得到染色體DNA。
利用J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)以及Eur.J.Biochem.，212，777-784(1993)所記載的L-絲氨酸脫氨酶基因的堿基序列信息，采用DNA合成儀，合成含有與sdaA基因和sdaB基因相對應的堿基序列的有義引物和反義引物。
用得到的有義和反義引物以及染色體DNA，根據PCR法，擴增得到DNA片斷。為了能將擴增DNA片斷導入到質粒中去，優選在有義引物和反義引物的5’末端添加適當的限制酶位點，例如BamHI等限制性酶位點。
作為該有義和反義引物的組合，可以列舉例如具有序列號1和序列號2所記載的堿基序列的2種引物的組合，以及具有序列號1以及序列號3所記載的堿基序列的2個引物的組合(用于sdaA)、具有序列號4以及序列號5所記載的堿基序列的2個引物的組合(用于sdaB)。
以染色體DNA作為模板，使用這些引物、TaKaRaLA-PCRTMKitVer.2(寶酒造社制)或ExpandTMHigh-FidelityPCRSystem(BoehringerMannheim社制)，在DNAThermalCycler(PerkinElmerJapan公司制造)中，進行PCR。
作為PCR條件，在上述引物為2Kb以下的DNA片斷時，以由94℃、30秒，55℃、30秒到1分鐘，72℃、2分鐘組成的反應工序作為1個循環，超過2kb以上的DNA片斷時，以由98℃、20秒，68℃、3分鐘組成的反應工序作為1個循環，各自進行30個循環后，在72℃反應7分鐘。
由PCR擴增得到的DNA片斷和可在大腸桿菌中擴增的載體，采用限制性酶，在和上述引物中添加的限制性酶位點相同的位點切斷，然后進行瓊脂糖凝膠電泳、蔗糖密度梯度超離心分離，回收DNA片斷。
采用回收的DNA片斷，按照常規方法，例如《分子克隆》第2版，CurrentProtoclolsinMolecularBiology，Supplement1～38，JohnWiley&Sons(1987-1997)以下，簡稱為分子生理學的現代方法-補篇，DNACloning1CoreTechniques，APracticalApproach，第二版，OxfordUniversityPress(1995)等記載的方法，或市售的試劑盒、例如SuperScriptPlasmidSystemforcDNASynthesisandPlasmidCloning(LifeTechcologies公司制造)和ZAP-cDNASynthesisKit[Stratagene公司制造]制備克隆載體，使用制備的克隆載體，轉化大腸桿菌，例如大腸桿菌DH5α菌株(東洋紡社制)。
作為可用于大腸桿菌轉化的克隆載體，只要是能夠在大腸桿菌K12株中自主復制就可以，可以使用嗜菌體載體、質粒載體等。也可使用大腸桿菌表達載體作為克隆載體。具體有ZAPExpress[Stratagene公司、Strategies，5，58(1992)]、pBluescriptIISK(+)[NucleicAcidsResearch，17，9494(1989)]、LambdaZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11[DNACloning，APracticalApproach，1，49(1985)]、λTriplEx(Clontech公司制造)、λExCell(Pharmacia公司制造)、pT7T318U(Pharmacia公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pMW218(和光純藥工業制造公司)、pUC118、pSTV28(寶酒造社制)、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pHMV1520(MoBiTec公司制造)、pQE-30(QIAGEN公司制造)等。
從得到的轉化菌株中，按照常規方法，例如分子克隆第3版、分子生理學的現代方法-補篇、DNACloning1CoreTechniques，APracticalApproach，第二版，OxforduniversityPress(1995)等記載的方法得到含有目的基因的質粒。
根據上述方法，可以得到含有編碼具有L-絲氨酸脫氨酶活性的蛋白質的基因的質粒。該質粒可以是例如實施例所示的pHIA1、pHIA2、pHIB。
用同樣的方法，可以從基因組的DNA堿基序列公知的生物中得到L-絲氨酸脫氨酶的基因。此外，即使是基因組的DNA堿基序列尚未知的生物，也可以使用適當的載體，建立以大腸桿菌為宿主的染色體DNA文庫，通過檢測文庫中各個菌株的L-絲氨酸脫氨酶的活性，得到含有編碼具有L-絲氨酸脫氨酶活性的蛋白質的DNA的質粒。
(b)L-絲氨酸脫氨酶基因的表達方法為使在上述方法中得到的編碼L-絲氨酸脫氨酶的DNA在宿主細胞中表達，首先，用限制酶或者DNA分解酶切割編碼目的L-絲氨酸脫氨酶的DNA，切成含有編碼區域的適當長度的DNA片斷，然后，將該DNA片斷插入到表達載體啟動子的下游，然后，將插入該DNA的表達載體導入到適合該表達載體的宿主細胞中。
宿主細胞可以是原核生物、酵母、動物細胞、昆蟲細胞等，只要是能夠表達目的基因的都可以使用。
作為表達載體，只要能夠在上述宿主細胞中自主復制并且能夠重組到染色體中，在能夠轉錄上述目的DNA的位置含有啟動子即可使用。
用細菌、放線菌等原核生物作為宿主細胞時，優選的是，用于表達上述DNA的表達載體在該原核生物中能夠自主復制的同時，為由啟動子、核糖體結合序列、上述DNA以及轉錄中止序列構成的重組載體。也可以含有控制啟動子的基因。
作為表達載體，可以示例例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均為BoehringerMannheim公司制造)、pKK233-2(Pharmacia公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(QIAGEN公司制造)、pQE-30(QIAGEN公司制造)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]、pBluescriptIISk+、pBluescriptIISK(-)(Stratagene公司制造)、pTrS30(FFRMBP-5407)、pTrS32(FFRMBP-5408)、pGEX(Pharmacia公司制造)、pET-3(Novagen公司制造)、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18[Gene，33，103(1985)]、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(寶酒造社制)、pSTV29(寶酒造社制)、pUC118(寶酒造社制)、pPA1(特開昭63-233798)、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pQE-30(QIAGEN公司制造)、PHY300(寶酒造社制造)、pHW1520(MoBiTec公司制造)等。
作為啟動子，只要能夠在宿主細胞中進行表達的即可。例如可以是trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子(Plac)、PL啟動子、PR啟動子、PSE啟動子等大腸桿菌和噬菌體等來源的啟動子、SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。此外也可使用2個Ptrp串連的啟動子(Ptrpx2)、tac啟動子、letI啟動子、lacT7啟動子等人為設計修飾的啟動子等。此外，也可以使用用于在芽孢桿菌(Bacillus)屬細菌中表達的xylA啟動子和用于在棒狀桿菌屬細菌中表達的P54-1啟動子。
核糖體結合序列，只要能夠在宿主細胞中表達的就可以。優選使用SD序列(Shine-Dalgarno序列)和起始密碼子間調節為適當距離(例如6～18個堿基)的質粒。
為了有效的進行翻譯和轉錄，可以表達這樣的融合蛋白，所述融合蛋白通過融合具有L-絲氨酸脫氨酶活性的蛋白質的N末端或者其一部分的蛋白質和表達載體編碼的蛋白質的N-末端部分而得。
在表達目的蛋白時，轉錄中止序列并不總是必要的，但是優選在緊接著結構基因的下游處配置轉錄中止序列。
作為宿主細胞，可以采用大腸桿菌屬(Escherichia屬)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、脂環酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚腥藍細菌屬(Anabaena)、組囊藍細菌屬(Anacystis)、節桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azobacter)、著色菌屬(Chromatium)、歐文氏菌屬(Erwinia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、席藍細菌屬(Phormidium)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、Scenedesmus屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、聚球藍細菌屬(Synnechococcus)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)等屬的微生物。
例如可以使用大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、短桿菌(Brevibacteriumimmariophilum)、解糖短桿菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、發根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)、金黃節桿菌(Arthrobacteraurescens)、煙草節桿菌(Arthrobacternicotianae)、硫磺節桿菌(Arthrobactersulfureus)、產脲節桿菌(Arthrobacterureafaciens)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、席藍細菌屬(Phormidiumsp.)、類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)、金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)等。
更具體而言，可以列舉大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene公司制造)、大腸桿菌XL2-Blue(Stratagene公司制造)、大腸桿菌DH1(分子克隆第2版p505)、大腸桿菌DH5α(東洋紡社制)、大腸桿菌MC1000[Mol.Biol.，138，179-207(1980)]、大腸桿菌W1485(ATCC12435)、大腸桿菌JM109(Stratagene公司制造)、大腸桿菌HB101(東洋紡社造)、大腸桿菌W3110(ATCC14948)、大腸桿菌NM522(Stratagene公司制造)、枯草桿菌ATCC33712、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)FERMBP-6030、短桿菌(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068、解糖短桿菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)ATCC14067、乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ATCC13880、發根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC11325、金黃節桿菌(Arthrobacteraurescens)ATCC13344、煙草節桿菌(Arthrobacternicotianae)ATCC15236、硫磺節桿菌(Arthrobactersulfureus)ATCC19098、產脲節桿菌(Arthrobacterureafaciens)ATCC7562、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)ATCC15390、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)ATCC21434、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)DSM1337、席藍細菌屬(Phormidiumsp.)ATCC29409、類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)ATCC21286、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)ATCC11170、金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)ATCC10762、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)ATCC10137、運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)ATCC10988等。
作為D-絲氨酸脫氨酶活性低的微生物或者D-絲氨酸脫氨酶活性缺損的微生物，可以列舉例如大腸桿菌ME5386菌株(可以從國立遺傳研究院得到)。
作為將重組載體導入到宿主細胞的方法，只要能將DNA導入宿主細胞的方法就可以使用。例如可列舉鈣離子法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]、原生質體法(特開昭63-248394)、電穿孔法以及Gene，17，107(1982)和Molecular&GeneralGenetics，168，111(1979)等所記載的方法。
用酵母作為宿主細胞時，作為表達載體可以列舉如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動子，只要能夠在酵母中表達的就可以，例如PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、ga11啟動子、ga110啟動子、熱激蛋白啟動子、MFa1啟動子、CUP1啟動子等啟動子。
作為宿主細胞，可以列舉糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon屬)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia屬)、假絲酵母屬(Candida屬)的微生物，例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporonpullulans)、河岸許旺氏酵母(Schwanniomycesalluvius)、產朊假絲酵母(Candianutilis)等。
作為重組載體的導入方法，只要是能夠將DNA導入到酵母中的方法就可以采用，例如可列舉電穿孔法[MethodsinEnzymol.，194，182(1990)]、原生質球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中記載的方法等。
宿主細胞是動物細胞時，表達載體可以列舉pcDNAI、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107[特開平3-22979；Cytotechnology，3，133，(1990)]、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8[Nature，329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE[J.Biochem.1011307(1987)、pAGE210等。
啟動子只要是可以在動物細胞中進行表達的啟動子就可以使用。例如可列舉巨細胞病毒(人CMV)的IE(立即早期)基因的啟動子、SV40早期啟動子、反轉錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱激啟動子以及SRα啟動子等。此外，也可以把人CMV的IE基因的增強子和啟動子一起使用。
作為宿主細胞，可以列舉Namalwa(ナマルバ)細胞、HBT5637(特開昭63-000299)、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等。
作為向動物細胞導入重組載體的方法，只要能將DNA導入到動物細胞中的方法即可使用，例如可以采用電穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413，(1987)]、Virology，52，456(1973)所記載的方法等。得到以及培養轉化體的方法可以按照特開平2-227075號和特開平2-257891號公報所記載的方法進行。
用昆蟲細胞作為宿主細胞時，例如，根據《桿狀病毒表達載體》(BaculovirusExpressionVectors，ALaboratoryManual，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1992))，《分子生理學的現代方法》(CurrentProtocolsInMolecularBiology，SupplementandBio/Technology，6，47(1988))等所記載的方法，能夠實現蛋白表達。即，將重組基因導入載體和桿狀病毒共同導入到昆蟲細胞中，得到昆蟲細胞培養物上清夜中的重組病毒，再用重組的病毒感染昆蟲細胞，實現蛋白表達。
作為在該方法中使用的基因導入載體，例如可以使用pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均由Invitrogen公司制造)。
作為桿狀病毒病毒，例如可以使用感染夜盜蛾科昆蟲的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)等。
作為昆蟲細胞，可以使用草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)的卵巢細胞Sf9、Sf21[BaculovirusExpressionVectors，ALaboratoryManual，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1992)])、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的卵巢細胞High5(Invitrogen公司制造)等。
為了制備重組病毒，向昆蟲細胞中導入上述重組基因導入載體和上述桿狀病毒的共導入方法可以使用例如磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
作為基因的表達方法，除了直接表達外，還可以按照分子克隆第2版所記載的方法，進行分泌生產、融合蛋白表達等。
用酵母、動物細胞以及昆蟲細胞進行表達的時候，可以得到添加糖或者糖鏈的蛋白質。
2.培養修飾的微生物上述1得到的本發明的修飾的微生物在培養基中培養的方法，可以按照培養宿主細胞常用的方法。當本發明的修飾的微生物是大腸桿菌等原核微生物、酵母菌等真核微生物時，培養這些微生物的培養基可以是天然培養基，也可以是合成培養基，只要它們含有可以被這些微生物同化的碳源、氮源、無機鹽等，并能夠有效培養轉換體。
作為碳源，只要是能夠被修飾的微生物同化的物質就可以。可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有這些糖的糖蜜、淀粉或者淀粉的水解物等碳水化合物、乙酸、丙酸等有機酸、乙醇、丙醇等醇類物質。
作為氮源、可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等各種無機酸以及有機酸的銨鹽、其它的含氮化合物，還可以采用蛋白胨、肉膏、酵母膏、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅、豆餅水解物、各種發酵菌以及其消化物。
作為無機鹽，可以使用磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養可以采用震蕩培養或者深部通氣攪拌培養等的需氧條件。培養溫度可以在15～50℃之間，培養時間通常為16小時～7天。培養時的pH保持在3.0～9.0。可以使用無機酸或者有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨水等調節pH。
此外，根據培養需要，可以添加芐氨青霉素或者四環素等抗生素到培養基中。
在培養采用可誘導的啟動子作為啟動子的表達載體轉化的微生物時，根據需要，可以向培養基中加入誘導物。例如培養使用了lac啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以向培養基中加入異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(thiogalactopyranoside)(IPTG)等，培養使用了trp啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以加入吲哚丙烯酸(IAA)、培養使用xy1A啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以加入木糖。
本發明修飾的微生物是動物細胞時，作為培養修飾的動物細胞的培養基，可以使用一般使用的RPMI1640培養基[TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation，199，519(1967])、Eagle的MEM培養基[Science，122，501(1952)]、DMEM培養基[Virology，8，396，(1959)]、199培養基[ProceedingoftheSocietyfortheBiologicalMedicine，73，1(1950)]或向這些培養基中添加了胎牛血清等的培養基等。
培養通常在pH6～8，30～40℃，5％CO2存在等的條件下進行1～7天。
此外，根據培養需要，可以向培養基中加入卡那霉素、青霉素等抗生素。
當本發明的修飾的微生物是昆蟲細胞時，作為培養修飾的昆蟲細胞的培養基，可使用一般使用的TNM-FH培養基[PharMingen公司制造]、Sf-900IISFM培養基(GIBCOBRL公司制造)、ExCell400、ExCell405[均為JRHBiosciences公司制造]、Grace’sInsectMedium[Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962)]等。
培養通常在pH6～7，25～30℃等條件下進行1～5天。
此外，根據培養需要，可以在培養基中添加慶大霉素等抗生素。
3.D-絲氨酸的制造在含有DL-絲氨酸的介質中，將修飾的微生物與DL-絲氨酸接觸，分解L-絲氨酸，從該介質中提取殘留的D-絲氨酸，由此可制造D-絲氨酸。
轉化體以及突變微生物中的L-絲氨酸脫氨酶活性的增強程度，與大腸桿菌DH5α株相比較活性必須得到增強，比大腸桿菌DH5α株的L-絲氨酸脫氨酶活性強即可，優選為2倍以上，尤其優選為5倍以上。
此外，使用D-絲氨酸脫氨酶活性低的，或者不具有該活性的菌株，也能夠提高D-絲氨酸的制造效率。
L-絲氨酸脫氨酶活性的測定可以按照上述1.(1)的方法。
用這些微生物制造D-絲氨酸可以按照以下的方法進行。
即，將上述方法得到的修飾的微生物細胞、該細胞的培養物或其加工產物(以下稱酶源)在介質中與DL-絲氨酸接觸。
細胞或該細胞的加工產物可以是細胞干燥物、凍干物、表面活性劑加工產物、酶加工產物、超聲破碎物、機械磨碎物、溶劑加工產物等細胞加工產物、培養物的濃縮物、干燥物等培養加工產物、細胞蛋白組分、細胞以及細胞加工產物的固定化物、或者從細胞中得到的純化酶等。
修飾的微生物和DL-絲氨酸的接觸可以是向培養該修飾的微生物的培養基中事先添加DL-絲氨酸的方法，也可是在培養過程中添加DL-絲氨酸的方法。此外，將經培養該修飾的微生物而得到的酶源添加到含有DL-絲氨酸的介質中也可以。
當向培養修飾的微生物的培養基中添加DL-絲氨酸時，在培養開始時以及培養過程中，在每ml培養基中添加1～300mgDL-絲氨酸，優選添加30～100mgDL-絲氨酸。可以按照上述(2)中記載的條件進行培養。
當將從修飾的微生物中得到的酶源與DL-絲氨酸在介質中接觸時，該酶源的量因該酶源的比活性等而有所不同。例如用該修飾的微生物細胞作為酶源時，每1mgDL-絲氨酸和5～1000mg濕菌作用，優選和10～400mg濕菌作用。
優選在20～50℃進行接觸反應，尤其優選在25～37℃進行接觸反應。反應的時間因酶源的用量和比活性不同而有所不同，通常反應2～150小時，優選5～60小時。
作為介質，可以用水或水溶性介質、有機溶劑或水或水溶性介質和有機溶劑的混合物。作為水溶性介質，例如可以用磷酸緩沖液、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)緩沖液、三[(三羥甲基氨基甲烷)]鹽酸緩沖液等緩沖液。作為有機溶劑，只要不妨礙反應的物質就可以，例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。
當向介質中添加DL-絲氨酸時，可將DL-絲氨酸溶解到能溶解DL-絲氨酸的水或水溶性溶劑、有機溶劑、或水或水溶性介質和有機溶劑的混合液中，添加到介質中去，或者保持粉末或者細顆粒狀態直接添加也可以。
從反應介質中提取D-絲氨酸通常采用常規的有機合成化學中所采用的方法，例如用有機溶劑進行抽提、結晶、薄層層析、高效液相層析等。
確認以及定量本發明得到的D-絲氨酸的方法可以采用任何能夠確認或者定量D-絲氨酸的方法。例如13C-NMR譜、1H-NMR譜、質譜、高效液相色譜(HPLC)等方法。
以下所示的是本發明的實施例，不過本發明不限定在這些實施例中。
實施本發明的最佳方式實施例11)L-絲氨酸脫氨酶基因的獲得用白金環將大腸桿菌W3110菌株(ATCC14948)接種到10mlLB培養基中，30℃培養過夜。培養結束后，將得到的培養液進行離心分離(3000rpm、10分鐘)，進而得到菌。從該菌中按照常規方法(分子克隆，第2版所記載的方法)分離純化染色體DNA。
以編碼L-絲氨酸脫氨酶的基因sdaA[J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)]的堿基序列信息為基礎，用DNA合成儀分別合成具有為有義引物和反義引物的組合的序列號1和2所記載的堿基序列的2種引物、序列號1和3所記載的堿基序列的2種引物，并基于和sdaA同樣編碼L-絲氨酸脫氨酶的基因sdaB[Eur.J.Biochem.，212，777-784(1993)]所具有的堿基序列信息，用DNA合成儀合成具有序列號4和5所記載的堿基序列的2種引物。
以染色體DNA為模板，用這些引物、pfupolymerasecloned(Stratagene公司制造)以及pfupolymerse1OXReactionBuffer(standardbuffer)在DNAThermalCycler(PerkinElmerJapan公司制造)中進行PCR。
PCR采用94℃30秒，55℃30秒～1分鐘，72℃2分鐘組成1個循環的反應步驟，30個循環后，72℃反應7分鐘的反應條件。PCR擴增得到的DNA片斷分別用限制酶HindIII和限制酶BamHI處理、將處理后的限制酶處理DNA片斷進行瓊脂糖電泳，獲得各個限制酶處理得到的DN片斷。
(2)重組DNA的制造將具有氨芐西林抗性基因和Trp啟動子的載體質粒pTrS30(按照常規方法從FERMBP-5407中抽提得到)用限制酶HindIII和BamHI消化后，進行瓊脂糖電泳，得到HindIII-BamHI處理pTrS30片斷。
將上述得到HindIII-BamHI處理DNA片斷和HindIII-BamHI處理pTrS30片斷混合后，通過鏈接反應得到重組DNA。
采用該重組DNA，按照常規方法轉化大腸桿菌DH5α菌株中(東洋紡社制)，將該轉化體涂布在含有100μg/mL氨芐西林的LB瓊脂培養基[1升水中含有蛋白胨(Difco公司制造)10g、酵母膏(Difco公司制造)5g、NaCl5g，調整pH7.2，添加1.5％的瓊脂的培養基]上，30℃培養1天。
將在該培養基上生長的轉化體克隆挑取數個分別在含有100μg/mL氨芐西林的10mlLB培養基中30℃培養一天。
離心分離得到的培養液，得到菌，從該菌中按照常規方法分離質粒。
HindIII-BamHI處理DNA片斷(用含有序列號1和2記載的堿基序列的2種引物組合，PCR擴增得到的DNA片斷)和HindIII-BamHI處理pTrS30片斷連接所得到的質粒，定名為pHIA1，HindIII-BamHI處理DNA片斷(用含有序列號1和3記載的堿基序列的2種引物組合，PCR擴增得到的DNA片斷)和HindIII-BamHI處理pTrS30片斷連接所得到的質粒定名為pHIA2，HindIII-BamHI處理DNA片斷(用含有序列號4和5記載的堿基序列的2種引物組合，PCR擴增得到的DNA片斷)和HindIII-BamHI處理pTrS30片斷連接所得到的質粒定名為pHIB1。
3)轉化體的制備將這些得到的質粒按照常規方法導入到大腸桿菌NM522(Stratagene公司制造)、大腸桿菌MM294(ATCC33625)以及D-絲氨酸脫氨酶活性缺失的大腸桿菌ME5386菌株(從國立遺傳研得到)中。
這些菌株中，在平成12年9月28日，將含有pHIA1的大腸桿菌MM294/pHIA1、含有pHIA2的大腸桿菌MM294/pHIA2以及含有pHIB的大腸桿菌MM294/pHIB，按照布達佩斯條約，分別以FERMBP-7309、FERMBP-7310和FERMBP-7311交給獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄托中心日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6(舊工業技術院生命工學工業技術研究所日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號)保存。
實施例2L-絲氨酸脫氨酶的表達以及D-絲氨酸的制造將上述得到的轉化體和具有不含L-絲氨酸脫氨酶基因的質粒pTrS30的大腸桿菌DH5α/pTrS30菌株在含有100μg/mL氨芐西林的100mLLB培養基中于30℃下培養1天。離心分離得到的培養液得到菌，將這些菌在50mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.5)中再次重懸，離心分離，將得到的菌(濕菌重量約5g)用于反應。
用含有50g/LDL-絲氨酸的磷酸緩沖液(pH7.5)懸浮上述菌，在37℃反應10小時～22小時。
用HPLC定量反應開始時、反應過程中以及反應結束后的反應液中的D-絲氨酸以及L-絲氨酸的濃度。
HPLC的條件如下所示柱CRAWNPAKCR(+)(DaicelChemicalIndustries，Ltd.)流動相過氯酸水溶液(pH1.0)流速；0.2mL/分柱溫2℃以采用鄰苯二甲醛(OPA)檢測器的柱后衍生物化法檢測[J.Chromatogr.，33，353-355(1973)]。
結果示于表1表1L-絲氨酸D-絲氨酸L-絲氨酸反應時間 相對活性總分解量濃度濃度菌株 質粒(小時)(g/l) (g/l) (g/l)DH5α pTrS3012 1.41.021 23.2 21.5DH5α pHIB 12 19.8 14.121 24.9 0.0NM522pHIA1 11 21.6 16.821 23.7 0.0ME5386 pHIA2 12 23.525.6 0.0 16.8MM294pHIA1 10 20.3 17.422pHIA2 10 19.4 16.622 24.3 0.0pHIB 10 8.57.322計算反應開始后第10、11以及12小時時反應液中L-絲氨酸的濃度，用和反應開始時反應液中的L-絲氨酸的濃度的差表示L-絲氨酸的總的分解量。
用L-絲氨酸的總分解量除以反應開始后的時間(10、11以及12小時)的比值作為L-絲氨酸脫氨酶的活性，以大腸桿菌DH5α/pTrS30菌株的L-絲氨酸脫氨酶活性為1時各菌株的活性作為各個菌株的相對活性。
從表1中能夠明確的是，經測定大腸桿菌ME5386/pHIA2株在反應開始后第12小時、大腸桿菌DH5α/pHIB株以及大腸桿菌NM522/pHIA1株在反應開始后第21小時、大腸桿菌NM294/pHIA2株在反應開始后第22小時的L-絲氨酸和D-絲氨酸的濃度，可知反應液中殘留的L-絲氨酸量是0，只殘存了D-絲氨酸。
工業應用的可能性根據本發明，從DL-絲氨酸中，能夠有效生成出可以用作D-環絲氨酸等有用藥品的合成中間體物質的D-絲氨酸。
序列表內容序列號1合成DNA序列號2合成DNA序列號3合成DNA序列號4合成DNA序列號5合成DNA
序列表<110>協和發酵工業株式會社<120>制造D-絲氨酸的方法<130>11349WO1<140>
<141>
<150>JP00/334751<151>2000-11-01<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>1ccatcgataa gcttatgatt agtctattcg acatgtttaa gg 42<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>2cgcggatcct ggggaatatt acagcagac 29
<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>3cgcggatcca gaagtattag tcacactgga c 31<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>4cccaagctta tgattagcgt attcgatatt ttc 33<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成DNA<400>5cgggatccat gagaaatcgg gaagaggc 28
權利要求
1.制造D-絲氨酸的方法，其特征在于，在含有DL-絲氨酸的介質中，使修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物細胞、該細胞的培養物或它們的加工產物與DL-絲氨酸接觸，分解L-絲氨酸，從介質中提取殘留的D-絲氨酸。
2.制造D-絲氨酸的方法，其特征在于，在含有DL-絲氨酸的培養基，培養修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物，分解L-絲氨酸，從該培養物中提取殘留的D-絲氨酸。
3.根據權利要求1或2的制造D-絲氨酸的方法，其中經過修飾的微生物是具有L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物經過突變處理后得到的突變微生物。
4.根據權利要求1或2的制造D-絲氨酸的方法，其中經過修飾的微生物是將L-絲氨酸脫氨酶基因引入到微生物中得到的轉化體。
5.根據權利要求1-4之一的制造D-絲氨酸的方法，其中經修飾的微生物的L-絲氨酸脫氨酶活性為大腸桿菌DH5α株所具有的L-絲氨酸脫氨酶活性的2倍以上。
6.根據權利要求1-4之一的制造D-絲氨酸的方法，其中經修飾的微生物的L-絲氨酸脫氨酶活性為大腸桿菌DH5α株所具有的L-絲氨酸脫氨酶活性的5倍以上。
7.根據權利要求4的制造D-絲氨酸的方法，其中L-絲氨酸脫氨酶基因是來源于大腸桿菌的sdaA基因和sdaB基因。
8.根據權利要求1-7之一的制造D-絲氨酸的方法，其中經修飾的微生物都是大腸桿菌屬微生物。
9.根據權利要求1-8之一的制造D-絲氨酸的方法，其中經過修飾的微生物選自大腸桿菌DH5α/pHIB、大腸桿菌NM522/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA2、大腸桿菌MM294/pHIB以及大腸桿菌ME5386/pHIA2的微生物。
10.根據權利要求1-9之一的制造D-絲氨酸的方法，其中修飾的微生物是D-絲氨酸脫氨酶活性低或者沒有這種酶活性的微生物。
11.屬于大腸桿菌屬，并修飾為具有比大腸桿菌DH5α菌株的L-絲氨酸脫氨酶活性高的L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物。
12.根據權利要求11的微生物，選自大腸桿菌DH5α/pHIB、大腸桿菌NM522/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA1、大腸桿菌MM294/pHIA2、大腸桿菌MM294/pHIB以及大腸桿菌ME5386/pHIA2。
全文摘要
本發明關于D－絲氨酸的制造方法以及與該制造方法有關的微生物，其特征在于，在含有DL－絲氨酸的介質中，使已修飾為具有比大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株所具有的L－絲氨酸脫氨酶活性高的L－絲氨酸脫氨酶活性的微生物細胞、該細胞的培養物或它們的加工產物和DL－絲氨酸接觸，分解L－絲氨酸，從該介質中提取殘存的D－絲氨酸。D－絲氨酸是一種有用的化合物，可作為D－環絲氨酸等藥物的合成中間體。
文檔編號C12N1/20GK1531599SQ0182162
公開日2004年9月22日 申請日期2001年10月29日 優先權日2000年11月1日
發明者池田創, 米谷良之, 橋本信一, 一, 之 申請人:協和發酵工業株式會社