專利名稱：中藥伊貝母分子生物學鑒定方法
技術領域：
本發明涉及中藥材種質的品質鑒定技術領域。
背景技術：
中藥伊貝母為百合科植物伊犁貝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鱗莖，具有清肺、化痰、散結之功效，用于肺熱咳嗽，胸悶痰粘，瘰疬，癰腫等癥的治療。伊貝母療效好，生物堿含量高，毒性低，具有很好的市場前景。目前，除原產地新疆外，伊貝母在我國北方部分省份的引種栽培已獲得成功。由于伊貝母毒性低，市場價格較高，為防止用毒性較高的其它種類貝母冒充伊貝母的不良市場行為，需要尋找可靠的將伊貝母與其它貝母相區別的鑒別方法。然而，用通常的型態及顯微等鑒定方法難以將伊貝母與其它種類的貝母區別開來。通過比較各種貝母的一段DNA的堿基序列，找到了伊貝母與其它種類貝母DNA序列的差別，這種差別可通過以下兩種方法加以區別(1)鑒別性PCR鑒別方法；(2)聚合酶鏈反應(PCR)與限制性內切酶反應的片段多態性(RFLP)鑒別方法。但這兩種鑒別對于不同的物種，其所用的引物、限制性內切酶的種類及鑒別方法都不相同。
發明內容
本發明的目的是提供二種準確鑒別伊貝母的鑒別性PCR分子鑒定方法(方法1)、PCR-RFLP分子鑒定方法(方法2)，方法1包括伊貝母的特征DNA堿基序列、一對通用PCR引物、一對鑒別性PCR引物及其鑒定方法。方法2包括伊貝母的特征DNA堿基序列、一對PCR引物、一種限制性內切酶酶切位點及其鑒定方法。
本發明的技術方案如下首先從各藥材中提取總DNA，然后利用方法1或方法2進行鑒別。
方法1本發明設計的伊貝母聚合酶鏈反應的鑒定引物DNA序列為引物1FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′
引物2FpdPb5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進行合成，即可得到鑒定引物的白色粉未結晶。
中藥材伊貝母聚合酶鏈反應鑒定的方法為(1)藥材DNA提取按常規進行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調節至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA質量的鑒定用另一對通用引物鑒別模板DNA的質量，該對引物可擴增各種植物的nrDNAITS區序列。引物的DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’(Takaiwa F，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25Sspacer region from rice rDNA.Plant Mol Biol，1985，4355-364)；引物濃度為30pmol/μl，除將反應體系中引物1、引物2改為ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除復性溫度改為53℃外，擴增反應條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴增，則表明模板合格，可進行后續步驟的檢驗；若無擴增條帶，則需改進DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進行后續步驟的檢驗。
(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應體系均以30μL為參考點，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環在PCR儀上，95℃予變性2～4min，然后按下列參數進入30循環變性95℃ 20～40秒復性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循環結束后在72℃保持2～4分鐘補齊。
(5)電泳觀察取出PCR反應液4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。
如總的反應體積不為30μl，反應物品的用量以30μl反應劑量的比例為參考點，相應地增加或減少。
若有陽性擴增，則供試品為伊貝母；若為陰性，即無擴增條帶，則供試品不為伊貝母。
方法2利用一對引物，用PCR方法擴增一段DNA片段，該片段中伊貝母的特征DNA堿基序列為5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’，針對伊貝母與其它種貝母DNA序列的差異，選擇合適的DNA限制性內切酶酶切位點，通過分析聚合酶鏈反應產物的限制酶切圖譜差異，達到快速、準確鑒別伊貝母目的。對需要鑒定的貝母樣品，提取其總DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(ITS-P1、ITS-P3)進行PCR擴增，供試品能夠擴增出一段DNA片段；用限制性內切酶Eco81 I或其同切酶對供試品的PCR擴增產物進行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，伊貝母會出現126，178bp的條帶，而其它種類的貝母不出現上述兩條帶。當供試樣品經用本法進行PCR擴增，并對PCR產物進行限制性內切酶酶切后，經瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準確地鑒定伊貝母或非伊貝母藥材。本發明設計的用于鑒別伊貝母PCR-RFLP分子鑒定方法是采用以下步驟(1)藥材DNA的提取按常規進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節至0.2～0.5μg/μl；(2)擴增DNA片段，即進行聚合酶鏈反應，用于聚合酶鏈反應的一對引物的DNA序列為ITS-P15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’ITS-P35’-GCT ACG TTC TTC ATC GAT-3’(3)PCR擴增產物中加入限制性內切酶Eco81 I或其同切酶進行酶切，限制性內切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位點為CCTNAGG；(4)瓊脂糖凝膠電泳分析；(5)鑒定結果的判斷，若出現126，178bp條帶則供試品為伊貝母。
本發明的效果是可解決伊貝母與其它種貝母相區別的鑒定難題，方法1提供伊貝母的特征DNA堿基序列、一對通用PCR引物、一對鑒別性PCR引物及其鑒定方法；方法2提供鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應條件、伊貝母的特征DNA堿基序列、一種限制性內切酶。與伊貝母相比，其它種類的貝母所含的有效成分有明顯差別，伊貝母毒性小，因此市場上伊貝母的價格較高。然而，伊貝母與其它種貝母難以通過形態、顯微等特征來加以區別，因此，需要找到一種可靠的鑒別方法。本發明利用伊貝母與其它種貝母藥材DNA序列的差異，建立了快速、便捷、可靠的鑒別性PCR及PCR-RFLP鑒別方法，對于保證伊貝母的藥材質量，打擊假冒伊貝母的市場行為具有重要的價值。
具體實施例方式方法1首先從貝母類藥材不同種的原植物中提取總DNA，用PCR方法擴增多個基因片段并分別純化，對各純化片段進行DNA序列分析，建立伊貝母及其近緣種、混淆種的DNA序列數據庫，在比較數據庫的基礎上，選擇合適的DNA片段，針對藥材偽、混品出現的情況，設計一對鑒別性PCR引物引物1FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′引物2FpdPb5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進行合成，即可得到鑒定引物的白色粉未結晶。
采用上述引物對伊貝母的真偽進行鑒別，以反應體系30μl為例，采用以下步驟進行浙貝母的鑒別性聚合酶鏈反應(1)藥材DNA提取按常規進行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調節至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA質量的鑒定用另一對通用引物鑒別模板DNA的質量，該對引物可擴增各種植物的nrDNA ITS區序列。引物的DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’；引物濃度為30pmol/μl，除將反應體系中引物1、引物2改為ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除復性溫度為53℃外，擴增反應條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴增，則表明模板合格，可進行后續步驟的檢驗；若無擴增條帶，則需改進DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進行后續步驟的檢驗。
(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應體系均為30μL為參考點，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環在PCR儀上，95℃予變性2～4min，然后按下列參數進入30循環變性95℃ 20～40秒復性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循環結束后在72℃保持2～4分鐘補齊。
(5)電泳觀察取出PCR反應4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。
若有陽性擴增，則供試品為伊貝母；若為陰性，即無擴增條帶，則供試品不為伊貝母。
方法2(1)DNA的提取按常規進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節至0.1～0.3μg/μl；(2)聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應以30μl為參考，各種物品的用量分別為10×PCR緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(各10mM) 0.6μl引物ITS-P1、ITS-P3(30pmol/μl)各0.5μl供試品DNA模板 1～2μlTaqDNA聚合酶 1U(0.2μl)無離子水 補齊至30μl混勻后高速離心數秒PCR反應條件反應在PCR儀上進行，反應條件為95℃予變性3min，然后按以下條件進行30循環變性95℃20～40秒復性53℃20～40秒延伸72℃20～40秒循環結束后在72℃保持2～4分鐘補齊，反應結束后在4℃保存。
PCR產物的電泳檢測取上述反應液4μl，與1μl載樣緩沖液混合，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μL溴化乙錠，即EB)電泳檢測擴增結果，各種DNA樣品均能擴增出一條約304bp的DNA條帶；(3)聚合酶鏈反應產物的限制性內切酶酶切反應DNA限制性內切酶酶切反應反應液參考體積為20μl，其中各種物品的用量為PCR產物 5～10μL10×Y+限制性內切酶緩沖液 2μL限制性內切酶Eco81 I 5U無離子水補齊至20μL將反應液置37℃保溫3～4小時，反應結束后置于65℃水浴10分鐘，使酶失活；(4)電泳觀察酶切結果酶切產物用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μl的溴化乙錠，即EB)，在4V/cm電場強度下電泳30～50分鐘，觀察電泳結果；(5)測定結果的判斷，使用限制性內切酶Eco81 I或其同切酶對聚合酶鏈反應擴增產物進行酶切，產生對伊貝母與非伊貝母具有鑒別性特征的酶切DNA片段長度圖譜。若供試品出現126，178bp的兩個片段，則為伊貝母；若不出現上述兩個片段，則不為伊貝母。中藥伊貝母分子生物學鑒定方法<110>中國藥科大學<120>中藥伊貝母分子生物學鑒定方法<160>6<210>1<211>23<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1accgtgttca cgattgcctc agg<210>2<211>22<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1tccgggtctc ttgagcccct tg<210>3<211>30<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1ttcgcgattg cctcagggcg ctccggacac<210>4<211>24<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1cgtaacaagg tttccgtagg tgaa<210>5<211>26<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1ttattgatat gcttaaactc agcggg<210>6<211>18<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1gctacgttct tcatcgat
權利要求
1.一種中藥伊貝母聚合酶鏈反應鑒定引物，其特征在于鑒定引物DNA序列為FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′，FpdPb5′-TCCGGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進行合成，即得到鑒定引物的白色粉未結晶。
2.根據權利要求1所述鑒定引物鑒定中藥伊貝母的方法，其特征在于中藥材伊貝母聚合酶鏈反應(PCR)鑒定步驟為(1)藥材DNA提取按常規進行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調節至0.2～0.5μg/μL。(2)模板DNA質量的鑒定用另一對通用引物鑒別模板DNA的質量，該對引物擴增各種植物的nrDNAITS區序列。引物的DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTAAAC TCA GCG GG-3’；引物濃度為30pmol/μl，除將反應體系中引物改為ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除復性溫度改為53℃外，擴增反應條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴增，則表明模板合格，可進行后續步驟的檢驗；若無擴增條帶，則需改進DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進行后續步驟的檢驗。(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應體系均為30μL為參考點，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物FpdPa、FpdPb各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環在PCR儀上，95℃予變性2～4min，然后按下列參數進入30循環變性95℃ 20～40秒復性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循環結束后在72℃保持2～4分鐘補齊。(5)電泳觀察取出PCR反應液4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。如總的反應體積不為30μl，反應物品的用量以30μl反應劑量的比例為參考點，相應地增加或減少。若有陽性擴增，則供試品為伊貝母；若為陰性，即無擴增條帶，則供試品不為伊貝母。
3一對聚合酶鏈反應擴增引物的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P35’-GCT ACGTTC TTC ATC GAT-3’；一種伊貝母特有的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’。；一種伊貝母聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜，其特征在于能夠識別伊貝母特有DNA堿基序列的限制性內切酶Eco81 I及其同切酶對聚合酶鏈反應產物消化后的瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜。
4根據權利要求3所述鑒定引物、特有DNA堿基序列及聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜鑒定中藥伊貝母的方法，其特征在于中藥伊貝母聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜(PCR-RFLP)鑒定步驟為(1)、藥材DNA的提取按常規進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節至0.2～0.5μg/μl；(2)、擴增DNA片段，用引物ITS-P1、ITS-P3進行聚合酶鏈反應(PCR)，得到聚合酶鏈反應擴增產物(3)、PCR擴增產物中加入限制性內切酶Eco81 I或其同切酶進行酶切，限制性內切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位點為CCTNAGG；(4)、瓊脂糖凝膠電泳分析；(5)、鑒定結果的判斷若出現126，178bp的兩個片段，則供試品為伊貝母，若不出現上述兩個片段，則供試品不為伊貝母。
全文摘要
本發明屬于中藥鑒定技術領域，是用于鑒定伊貝母分子鑒定方法。發明方法設計的伊貝母聚合酶鏈反應的鑒定引物DNA序列為FpdPa5′－ACC GTG TTCACG ATT GCC TCA GG－3′，FpdPb5′－TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G－3。伊貝母的聚合酶鏈反應－限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR－RFLP)所用的PCR擴增引物序列為ITS－P15’－CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA－3’，ITS－P35’－GCT ACG TTC TTC ATC GAT－3’；伊貝母的特征DNA堿基序列為5’－TTCGCGATTG CCTCAGGGCGCTCCGGACAC GG－3’；限制性內切酶Eco81 I及其同切酶可識別并切割該序列。本發明能夠實現伊貝母的快速、準確地鑒別。
文檔編號C12P19/00GK1487092SQ03131799
公開日2004年4月7日 申請日期2003年7月30日 優先權日2003年7月30日
發明者李萍, 王沖之, 李 萍 申請人:中國藥科大學