專利名稱：豬瘟病毒感染性cDNA及其構建方法
技術領域：
本發明涉及豬瘟病毒感染性cDNA及其構建方法，特別是適合豬瘟病毒疫苗開發的豬瘟病毒感染性cDNA及其構建方法。
背景技術：
豬瘟是嚴重危害養豬業的重要傳染病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類傳染病。豬瘟病毒的感染，可導致各生長階段豬的死亡，這不僅會造成巨大的經濟損失，而且也阻礙了我國豬肉制品走向國際市場。豬瘟病毒屬于黃病毒科瘟病毒，其基因組為長約12.3kb的單股正鏈RNA，編碼4個結構蛋白和7個非結構蛋白。豬瘟病毒與宿主細胞的相互關系比較復雜，對其致病機理的研究進展緩慢。感染性cDNA是指通過RT-PCR(反轉錄-聚合酶鏈式擴增反應)擴增RNA病毒基因組的cDNA片段，然后利用其限制性酶切位點，將cDNA片段順次相連并克隆于合適的載體，獲得基因組全長cDNA克隆，以其轉染適宜宿主細胞，全長cDNA在細胞內轉錄并包裝成感染性病毒粒子。感染性cDNA是研究病毒的復制、病毒的基因產物的功能和闡明病毒致病機理等方面極具價值的工具。如通過對病毒基因組進行定點突變以產生特定的突變體病毒，也可以缺失或替換基因組的任意部分以產生突變體在分子水平上直接特定的病毒基因對病毒的復制、毒力和免疫等生物學功能。另外，從cDNA得到的感染性轉錄體，也將為研究病毒適應細胞及其致弱的分子基礎提供幫助，借此可以制造有效的弱毒疫苗而無毒力反強的危險，為研制新型的基因工程苗提供新的思路。雖然目前國外已經報道有數個感染性cDNA構建成功(Moormann RJM et al.，J. Virol.70763-770，1996；Meyers G etal.，J.Virol.701588-1595，1996；Ruggli N et al.，J.Virol.703478-3487，1996)，并用于研究病毒單個蛋白的功能，取得了一些可喜的進展，但是，由于基因功能、致病機理、遺傳變異的復雜性，這些感染性cDNA并不適合我國豬瘟病毒疫苗的開發。
發明內容
本發明的目的在于建立一個適合我國豬瘟病毒情況的豬瘟病毒的基因操作技術平臺，加快我國豬瘟的研究和防制步伐，深入的開展豬瘟病毒的基因功能、致病機理、遺傳變異和新型疫苗的研制等方面的研究。
為了達到上述目的，實施以下技術方案一種豬瘟病毒cDNA，是以豬瘟病毒RNA為模板，反轉錄合成的cDNA；該cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動子，3’末端具有單一的限制性酶切位點。
所述限制性酶切位點可以是SrfI(購自德國Stratagene公司)酶切位點或Sal I酶切位點；所述5’端上游最好具有Not I酶切位點；所述RNA最好是從感染豬瘟病毒的兔脾組織中提取的C-株RNA一種構建豬瘟病毒感染性cDNA的方法，其步驟包括根據豬瘟病毒RNA設計反轉錄用帶有酶切位點的特異性引物；以所述RNA為模板，反轉錄合成cDNA，同時，使cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動子，3’末端具有單一的限制性酶切位點；利用PCR(聚合酶鏈式擴增反應)和nPCR(多巢聚合酶鏈式擴增反應)技術分段擴增所述cDNA各片段；將擴增后的cDNA各片段分別克隆入質粒載體；將所述cDNA各片段連接，構成帶有基因組全長cDNA的質粒載體；純化回收全長cDNA。
本發明的豬瘟病毒cDNA，因在5’端導入了Not I酶切位點和T7 RNA聚合酶啟動子序列，3’末端具有單一的限制性酶切位點，能產生精確的3’末端，從而能夠在分子水平上通過突變、插入、缺失和替換來研究豬瘟病毒的復制機理、毒力及其決定因素和致弱機制、致病機理、基因產物的功能、宿主嗜性以及核酸疫苗、標記疫苗等新型疫苗的研究開發，是進一步研究和防制豬瘟的極有價值的工具。
圖1是表示覆蓋基因組的7個cDNA片段；圖2是表示構建全長cDNA的技術流程圖。
具體實施例方式
實施例首先，根據豬瘟病毒RNA設計用于反轉錄的帶有酶切位點的特異性引物，各引物如下P15’ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTAGTTCATTCTC3’1-23N1’5’CTAGTCGACTTTACTCCTTCCACCACGATC3’998-1018N15’AGGTACATAGCATGCTGGATACC3’1218-1240P25’ATGAGAAGGACAGCAGAACTAGGCC3’961-985P2’5’ACAGCAGAACTAGGCCACCTGA3’970-991N2’5’ATGTCGACGCCCAATCTTTCATCTGATGCATGC3’3236-3260N25’CTTTAGGTCTGCATGGCATAGGG3’3260-3282P35’TAACACGACTGTCAAGGTGCATGCAT3’3218-3243P3’5’TCAAGGTGCATGCATCAGATG3’3229-3249N3’5’TAGTCGACACATAACACCTAGCTCCTTCC3’5471-5491N35’ATGGCTCCTTTAGTCCCTGATATGT3’5512-5536P45’TACACACACCAAGGTGGCATCAGTT3’5313-5337P4’5’ATCAGTTCAGTGGACCATGTC3’5331-5351N4’5’ATGTCGACGTAACACCTGATTCTATCGCG3’6497-6517N45’CAATCGTGACAGCCATTCTCTTCAG3’6609-6633P55’AGAGTACTTGGACATTGCTGG3’6287-6307P5’5’ATGCGGCCGCGGCAGTGGAGACAGCAAAGAAATTG3’6371-6395N5’5’GTAACCGTAGCAGCGGGAATCTCTT3’9094-9118N55’TTAGTCCCTGGATATTGGCCT3’9377-9388P65’CTCAAAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’8997-9021P6’5’ATTAGCGGCCGCAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’9002-9021N6’5’CTTCTCATTCTTTGGGATCGC3’10692-10712N65’TCGTTGACGTCCCTCTTCTCATTCT3’10702-10726P75’AACTGGAGAGAGGAATAAACAGG3’10546-10568P7’5’TAGCGGCCGCATAAACAGGAAGGGTGCTGCT3’
10560-10580N75’ATGTCGACGCCCGGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTCC3’12286-12310。
其中，P表示正向，N表示反向，各引物后的數字表示酶切位置。
從感染豬瘟病毒的兔脾組織(豬瘟C-株毒，為中國獸藥監察所的兔脾淋組織毒第480代，系中國農科院蘭州獸醫研究所保存)中提取豬瘟病毒(C-株)基因組RNA(使用TRIzol(R)Reagent Total RNA Isolation Reagent試劑盒，GIBCOBRL公司出品)，用上述特異性引物分7段反轉錄cDNA各片段。然后，利用PCR和nPCR技術分7段擴增cDNA各片段，如圖1所示，5’端至3’端依次分別命名為F1、F2……F7，其中各片段在基因組中的位置為F11-1028，F2970-3260，F33229-5491，F45497-6633，F56371-9118，F69002-10712，F710530-12310。如圖2所示，利用圖1所示的工具酶分別將所得片段克隆入質粒pMD18-T(購自Taraka公司)或pGEM-T Easy(購自Promega公司)載體中并測序，其中F3和F4克隆入質粒pMD18-T，形成質粒pMD1 8-T/F34；再采用圖2所示的限制性內切酶(購自Promega和Taraka公司)和T4 DNA連接酶(購自上海生工公司)，將F1、F2、F 34片段連接并克隆于pGEM-5Zf(+)后，得到重組質粒pGEM-5ZF(+)/F1-4；將片段F5、F6和F7連接并克隆于pGEM-5ZF(+)中，得到重組質粒pGEM-5Zf(+)/F5-7；最后將連接片段F1-4和F5-7連接并克隆于pGEM-5Zf(+)中，得到基因組全長cDNA pGEM-5Zf(+)/F1-7，經測序驗證正確。
用限制性內切酶SrfI將全長cDNA pGEM-5Zf(+)/F1-7線性化(即將環形質粒用酶切開，成為線形)，并用低熔點瓊脂糖凝膠回收；用MEGAscript T7kit(購自Ambion Inc公司)體外轉錄，并用RNA電泳分析轉錄出的全長基因組RNA占的比例大小。用無RNA酶的DNA核酸酶RQ1(購自Promega公司)去除DNA模板，經蛋白酶K(購自Taraka公司)處理后，進行RNA純化(RNA純化試劑盒，購自QIAGEN公司)，分成小份，置-70℃備用。轉染時，先用OPTI-MEMI培養基(購自GIBCOBRL公司)清洗SK-6細胞(約70％融合度，蘭州獸醫研究所病毒室保存)，再用DMRIE-C(購自Invitrogen公司)進行轉染；轉染細胞傳代數次后，采用直接熒光抗體染色(豬瘟熒光素標記抗體購自中國獸藥監察所)和夾心ELISA(Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit，IDEXX)等方法鑒定其具有感染性。
權利要求
1.一種豬瘟病毒cDNA，是以豬瘟病毒RNA為模板，反轉錄合成的cDNA；該cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動子，3’末端具有單一的限制性酶切位點。
2.根據權利要求1所述的豬瘟病毒cDNA，其特征在于，所述限制性酶切位點是Srf I酶切位點或Sal I酶切位點。
3.根據權利要求1或2所述的豬瘟病毒感染性cDNA，其特征在于，所述5’端上游具有Not I酶切位點。
4.根據權利要求1或2所述的豬瘟病毒cDNA，其特征在于，所述RNA是從感染豬瘟病毒的兔脾組織中提取的C-株RNA。
5.一種構建豬瘟病毒cDNA的方法，其步驟包括1)根據豬瘟病毒RNA設計反轉錄用帶有酶切位點的特異性引物；2)以所述RNA為模板，反轉錄合成cDNA，同時，使cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動子，3’末端具有單一的限制性酶切位點；3)利用PCR和nPCR技術分段擴增所述cDNA各片段；4)將擴增后的cDNA各片段分別克隆入質粒載體；5)將所述cDNA各片段連接，構成帶有基因組全長cDNA的質粒載體；6)純化回收全長cDNA。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述特異性引物及其酶切位置如下P15’ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTAGTTCATTCTC3’1-23N1’5’CTAGTCGACTTTACTCCTTCCACCACGATC3’998-1018N15’AGGTACATAGCATGCTGGATACC3’1218-1240P25’ATGAGAAGGACAGCAGAACTAGGCC3’961-985P2’5’ACAGCAGAACTAGGCCACCTGA3’970-991N2’5’ATGTCGACGCCCAATCTTTCATCTGATGCATGC3’3236-3260N25’CTTTAGGTCTGCATGGCATAGGG3’3260-3282P35’TAACACGACTGTCAAGGTGCATGCAT3’3218-3243P3’5’TCAAGGTGCATGCATCAGATG3’ 3229-3249N3’5’TAGTCGACACATAACACCTAGCTCCTTCC3’ 5471-5491N35’ATGGCTCCTTTAGTCCCTGATATGT3’ 5512-5536P45’TACACACACCAAGGTGGCATCAGTT3’ 5313-5337P4’5’ATCAGTTCAGTGGACCATGTC3’ 5331-5351N4’5’ATGTCGACGTAACACCTGATTCTATCGCG3’ 6497-6517N45’CAATCGTGACAGCCATTCTCTTCAG3’ 6609-6633P55’AGAGTACTTGGACATTGCTGG3’ 6287-6307P5’5’ATGCGGCCGCGGCAGTGGAGACAGCAAAGAAATTG3’6371-6395N5’5’GTAACCGTAGCAGCGGGAATCTCTT3’ 9094-9118N55’TTAGTCCCTGGATATTGGCCT3’ 9377-9388P65’CTCAAAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’ 8997-9021P6’5’ATTAGCGGCCGCAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’ 9002-9021N6’5’CTTCTCATTCTTTGGGATCGC3’ 10692-10712N65’TCGTTGACGTCCCTCTTCTCATTCT3’ 10702-10726P75’AACTGGAGAGAGGAATAAACAGG3’ 10546-10568P7’5’TAGCGGCCGCATAAACAGGAAGGGTGCTGCT3’ 10560-10580N7 5’ATGTCGACGCCCGGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTCC3’12286-12310；其中，P表示正向，N表示反向。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述分段擴增是分成7個片段進行擴增的，其中各片段的位置依次為1-1028、970-3260、3229-5491、5497-6633、6371-9118、9002-10712、10530-12310。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述純化回收全長cDNA是采用限制性內切酶Srf I將帶有全長cDNA的質粒載體線性化，并用低熔點瓊脂糖凝膠回收。
9.根據權利要求5～7之一所述的方法，其特征在于，所述質粒載體采用pGEM-5Zf(+)。
10.根據權利要求5～7之一所述的方法，其特征在于，所述RNA是從感染豬瘟病毒的兔脾組織中提取的C-株RNA。
全文摘要
本發明的目的在于建立一個適合我國豬瘟病毒情況的豬瘟病毒的基因操作技術平臺。為了達到該目的，本發明的豬瘟病毒cDNA，是以豬瘟病毒RNA為模板，反轉錄合成的cDNA；該cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動子，3’末端具有單一的限制性酶切位點。構建豬瘟病毒感染性cDNA的方法步驟包括根據豬瘟病毒RNA設計反轉錄用帶有酶切位點的特異性引物；以所述RNA為模板，反轉錄合成cDNA；分段擴增所述cDNA各片段；將擴增后的cDNA各片段分別克隆入質粒載體；將所述cDNA各片段連接，構成帶有基因組全長cDNA的質粒載體；純化回收全長cDNA。
文檔編號C12N15/34GK1539976SQ20031010341
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月31日 優先權日2003年10月31日
發明者劉湘濤, 胡建和, 謝慶閣, 尚佑軍 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所