用于重組生產抗融合肽的方法

專利名稱：用于重組生產抗融合肽的方法
技術領域：
本發明涉及用于重組生產抑制病毒與靶細胞膜融合的肽的方法。特別地，本發明涉及重組生產慢病毒屬如人免疫缺陷病毒(HIV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(MEV)，流感病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)或人副流感病毒(HPV)的肽抑制劑的方法。
背景技術：
對于有包膜病毒如HIV-I，HIV-II，RSV，麻疹病毒，流感病毒，副流感病毒，埃-巴二氏病毒和肝炎病毒進入到細胞，病毒與細胞膜的融合是一個必需步驟。在已進入細胞后可以引發導致病毒感染的病毒復制級聯。
HIV是慢病毒屬的一種，所述慢病毒屬包括擁有復雜基因組和顯示圓錐狀衣殼核心顆粒的逆轉錄病毒。慢病毒屬的其它實例包括猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，腦膜腦炎病毒和馬傳染性貧血病毒(EIAV)。類似所有逆轉錄病毒，HIV的基因組是由RNA編碼，其在進入新宿主細胞后由病毒逆轉錄酶(RT)逆轉錄為病毒DNA。Bullough，P.A.，等，Nature371(1994)37-43；Carr，C.M.，和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；和Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373描述了流感病毒和它們的細胞進入機制。
所有慢病毒屬是由源于宿主細胞膜的脂雙層包裹。通過與跨膜蛋白質(TM，gp41)的相互作用將曝露的表面糖蛋白(SU，gp120)錨定給病毒。脂雙層還含有幾種源于宿主細胞的細胞膜蛋白，包括主要組織相容性抗原，肌動蛋白和遍在蛋白質(Arthur，L.O.，等，Science 258(1992)1935-1938)。一種含有大約2000個拷貝基質蛋白(MA，p17)的基質殼排列在病毒膜的內表面，并且一種含有大約2000個拷貝衣殼蛋白(CA，p24)的圓錐狀衣殼核心顆粒位于病毒的中心。衣殼顆粒包裹兩個拷貝未剪接的病毒基因組，其被穩定成一種具有大約2000個拷貝核衣殼蛋白(NC，p7)的核糖核蛋白復合體，并且還含有三種基本的病毒編碼的酶蛋白酶(PR)，逆轉錄酶(RT)和整合酶(IN)。病毒顆粒還包裝輔助蛋白，Nef，Vif和Vpr。似乎不包裝在宿主細胞內發揮作用的另外三種輔助蛋白，Rev，Tat和Vpu。
在HIV的情形中，病毒進入是與HIV包膜表面糖蛋白相關(Lawless，M.K.，等，Biochemistry 35(1996)13697-13708；和Turner，B.G.，和Summers，M.F.，J.Mol.Biol.285(1999)1-32)。在HIV-1的情形中，該表面蛋白是作為一種單個的160kD的前體蛋白被合成，所述前體蛋白被一種細胞蛋白酶切割成兩種糖蛋白gp-41和gp-120。gp-41是一種跨膜蛋白質，gp-120是一種保持與gp-41以三聚體或多聚體形式的非共價結合的胞外蛋白(Hammarskjld，M.-L.，等，Biochim.Biophys.Acta 989(1989)269-280)。由于CD4表面蛋白充當HIV-I病毒的細胞受體，因此HIV靶向CD4+淋巴細胞。病毒進入細胞取決于與細胞CD4+受體分子結合的gp-120而gp-41將包膜糖蛋白復合體錨定在病毒膜中并介導膜融合(McDougal，J.S.，等，Science 231(1986)382-385；和Maddon，P.J.，等，Cell 47(1986)333-348)。
gp41是介導病毒和細胞膜融合的跨膜亞單位。gp41胞外域核心是一個由三個螺旋狀發夾結構組成的六螺旋束，每個發夾結構由與反向平行的C螺旋成對的N螺旋組成(Chan，D.C.，等，Cell 89(1997)263-273；Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430；Tan，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)12303-12308)。該N螺旋形成一個具有三個保守疏水溝的內部三聚體卷曲螺旋；一個C螺旋填充于這些溝的每一個之中。該結構可能相當于gp41融合-活性狀態的核心。依照Chan，D.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617，有證據表明在1類HIVgp41的卷曲螺旋中的顯著的空腔是有吸引力的藥物目標。
據假設gp-41介導膜融合的機制可能涉及一種卷曲螺旋三聚體的形成，其被認為是推動從靜止到融合狀態的轉變，如例如對于流感血凝素的描述(Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373；Carr，C.M.和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；Bullough，P.A.，等，Nature 371(1994)37-43)。
有包膜病毒的C肽(對應于C螺旋的肽)，如DP178和C34，有效地抑制HIV-1的適合實驗室的毒株和原始分離株的膜融合(Malashkevich，V.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)9134-9139；Wild，C.T.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國91(1994)9770-9774)。使用C肽DP178的I期臨床試驗提示它具有導致病毒負荷減少的體內抗病毒活性(Kilby，J.M.，等，Nature Medicine 4(1998)1302-1307)。gp41核心的結構特征暗示這些肽通過一種優勢的一負(dominant-negative)調節機制作用，其中C肽結合于gp41中心卷曲螺旋并導致它的失活(Chan，D.C.，等，Cell 93(1998)681-684)。
在每個卷曲螺旋界面內部是一個由一串在N螺旋卷曲螺旋中的殘基形成的深腔，其已被提出成為用于開發抗病毒化合物有吸引力的目標。源于C螺旋的三個殘基(Trp-628，Trp-631，和Ile-635)插入到該空腔中并造成廣泛的疏水接觸。突變分析說明包含該空腔的N-螺旋殘基中的兩個(Leu-568和Trp-571)對于膜融合活性是關鍵性的(Cao，J.，等，J.Virol.67(1993)2747-2755)。因此，以高親和力與該空腔結合并抑制正常的N和C螺旋配對的化合物可能是有效的HIV-1抑制劑。在不同的HIV-1分離株中該空腔中的殘基是高度保守的。而且，含有空腔結合區域的C肽比缺少該區域的DP178對抗性病毒的進化更不敏感得多(Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-993)。這些觀察暗示以高度保守的卷曲螺旋表面，尤其它的空腔為目標的高親和性配體將具有對不同HIV分離株的廣泛活性并更不可能被逃避藥物的突變體回避。
從流感病毒，莫洛尼鼠類白血病病毒和猿猴免疫缺陷病毒(在Chan，D.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617中引證)，人呼吸道合胞病毒，埃博拉病毒，人T細胞白血病病毒，猿猴副流感病毒顯示了包膜融合蛋白的融合結構。它說明在正粘病毒科，副粘病毒科，逆轉錄病毒科和其它類線狀病毒科各科之間的一種緊密關系，其中類跨膜糖蛋白如HIV-1的gp41，流感的血凝素，埃博拉病毒的GP2及其它使得病毒能夠進入靶細胞(Zhao，X.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177)。
在技術水平方面，描述了用于制備肽抑制劑(C-肽)的方法(參見，例如，Root，M.J.，等，Science 291(2001)884-888；Root等描述了來源于HIV-1.HXB2和含有殘基625-661的肽C37-H6)。它是作為帶有GGR-接頭和組氨酸標記的N40-節段被重組表達，其是在大腸桿菌中表達并從細菌裂解物的可溶性級分來純化。Zhao，X.等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177中描述了一種recRSV-1(人呼吸道合胞病毒)的合成基因，其編碼殘基153-209，一個富含G的接頭，殘基476-524，Xa因子切割位點和一個組氨酸標記。Chen.，C.H.，等，在J.Virol.69(1995)3771-3777中描述了重組表達被作為融合蛋白合成的gp41胞外結構域，殘基540-686，融合至MBP。
已知了這類膜融合相關事件的許多肽抑制劑，其也稱為抗融合肽，所述相關事件包括例如抑制逆轉錄病毒傳染未感染細胞。例如Lambert，D.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191，美國專利號6,013,263；6,017,536；和6,020,459和WO 00/69902，WO 99/59615，WO96/40191中描述了這類肽。在美國專利號6,093,794；6,060,065；6,020,459；6,017,536；6,013,263；5,464,933；5,656,480中和在WO 96/19495中描述了另外的抑制融合相關事件的肽來源于抑制病毒融合的HIV-Igp-41胞外域的線性肽的實例是DP-107和DP-178。DP-107是靠近N-末端融合肽的gp-41的一部分并已經顯示為螺旋狀的，它以與卷曲螺旋結構一致的方式強烈寡聚化(Gallaher，W.R.，等，Aids Res.Hum.Retrovirus 5(1989)431-440，Weissenhom，W.，等，Nature387(1997)426-430)。DP-178是源于gp-41胞外域的C-末端區域。(Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430)。盡管在溶液中沒有可辨別的結構，該肽和從此約束的類似物采取一種螺旋狀結構，與gp41 N-末端卷曲螺旋三聚體的一個溝結合并且因而防止gp41轉化為融合態(Judice，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)13426-13430)。
該短鏈肽通常是通過化學合成制備。例如Mergler，M.，等，TetrahedronLetters 29(1988)4005-4008和4009-4012；Andersson，L.，等，Biopolymers 55(2000)227-250；和由Jones，J.H.，J.Pept.Sci.6(2000)201-207描述了化學合成。在WO 99/48513中描述了另外的方法。
然而，化學肽合成經受幾個缺點。最重要的是外消旋化，其導致不充分的光學純度。在肽化學中，外消旋化也就意味著在幾個手性中心中的一個處的差向異構化。如果對于單個偶聯步驟僅僅發生1％的外消旋化，那么在100個偶聯步驟將收到僅僅61％的目標肽(Jakubke，H.D.，肽，Spektrum Akad.Verlag，Heidelberg(1996)，198頁)。明顯的是雜質的數量隨增長的鏈長增大并且它們的去除是越來越困難和昂貴。
高費用和作為原材料的保護氨基酸衍生物實用性的缺乏限制了大規模化學合成。一方面，這些原材料應該過量使用以使完成反應，另一方面，由于成本原因，安全性和環境方面它們的使用應該是均衡的(Andersson等，Biopolymer 55(2000)227-250)。
Lepage，P.，等，在Analytical Biochemistry 213(1993)40-48中描述了用于生產HIV-1Rev肽的重組方法。該肽表達為具有金黃色葡萄球菌蛋白A的合成免疫球蛋白類型G(IgG)結合結構域的融合蛋白。該肽具有大約20個氨基酸的長度，而Ig-G結合部分具有大約170個氨基酸的長度，所以表達的融合蛋白具有大約190個氨基酸的總長。表達該融合蛋白，以可溶的形式分泌在培養基中，并通過親和層析純化。作者報道使用該方法可能以每升培養物幾百毫克的數量生產重組蛋白。然而，由于在信號肽序列中的備選處理和融合蛋白及切割肽中的幾種翻譯后修飾導致該方法體系是受限制的。假定一個氨基酸的平均分子量為110道爾頓，期望的肽具有大約2,000-5,000道爾頓的分子量，然而如果將金黃色葡萄球菌蛋白A的IgG結合域用作該融合尾部，則融合尾部具有至少170個氨基酸的長度(大約19,000D)。因此，只有10-25％的重組生產的蛋白是想要的肽。
Uhlen，M.，和Moks，T.，Methods Enzymol.185(1990)129-143，T.J.R.Expression of eukaryotic genes in E.coli.InGenetic Engineering(Williamson，R.編輯)，Academic Press，London，4卷，127-185(1983)；和Kopetzki，E.，等，Clin.Chem.40(1994)688-704.Ningyi，L.，等，Gaojishu Tongxun 10(2000)28-31描述了在大腸桿菌中重組表達p24 gag基因。
國際申請WO 02/103026描述了在原核宿主細胞中生產作為大約14至70個氨基酸長度的融合肽的抗融合肽的方法，其特征在于，在該條件下形成所述融合肽的內含體，在所述宿主細胞中表達編碼所述融合肽的核苷酸，所述融合肽包括N-末端與另一個4-30個氨基酸長度的肽連接的長度約為10-50個氨基酸的所述抗融合肽；培養所述宿主細胞；形成所述內含體，將其回收和溶解；分離所述融合肽。

發明內容
本發明的目的是提供一種方法，其通過內含體的途徑高產率重組生產抗融合肽，并且適合這類肽的大規模工業生產。
本發明因此提供一種通過在微生物宿主細胞中，優選在原核宿主細胞中，將編碼所述抗融合肽的核苷酸表達為重復肽，分離含有所述重復肽的內含體，溶解該內含體，和在切割后分離抗融合肽而重組生產抗融合肽的方法，其特征在于使用一種變性劑在pH6.5或低于pH6.5的pH值下洗滌內含體，在至少pH9的pH值下溶解含有重復肽的所述內含體和切割所述重復肽以獲得所述抗融合肽。
令人驚奇地發現，具有抗融合活性的重復多肽內含體(下文也稱為融合多肽)在6.5和低于6.5的pH值下具有對變性條件的抵抗力。基于此，可通過按照本發明的條件以一種高效方式從宿主細胞多肽和其它源于宿主細胞的雜質中純化含有這類重復肽的內含體，因為在該變性條件下包含在內含體中的所有物質的大多數是易于溶解的，因而可以通過在這類變性條件下簡單洗滌內含體而去除。
在隨后步驟中，為了回收可溶的重復肽，在9和更高的pH值下將內含體溶解，由此不需要加入去污劑或變性劑。在溶解后，化學切割或酶切割重復以獲得想要的抗融合肽。
在本發明的一個優選實施方案中，切割序列位于重復的抗融合肽之間，并且該重復肽包含于融合多肽之中，所述融合多肽的特征在于該重復用優選大約1-10個氨基酸長度的所述切割序列連接在一起。抗融合肽本身具有10-100個氨基酸的長度，由此(關于穩定表達和形成內含體)融合多肽長度優選是至少大約50個氨基酸。
因此，本發明提供由內含體途徑通過簡單洗滌內含體和隨后在不同pH值下將它們溶解來重組生產抗融合肽的一種極其簡單的方法。
發明詳述在此使用的“抗融合”和“抗膜融合”指相對于膜融合的水平，肽抑制或降低在兩種或更多結構，例如細胞膜或病毒包膜或菌毛之間的融合事件水平的能力，所述膜融合是在不存在該肽時在所述結構之間發生。關于這個的實例是慢病毒屬如人免疫缺陷病毒(HIV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(HPV)，麻疹病毒(MEV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的肽抑制劑。這類抗融合肽是來源于慢病毒屬病毒包膜融合蛋白的跨膜亞基C螺旋，并且結合于各個病毒跨膜亞基的中心卷曲螺旋。
特別優選HIV-1抗融合肽，優選gp41 C-肽的片段。表1描述源于gp41C-肽的HIV-1抗融合肽實施例。這些抗融合肽和其片段在本發明中特別有用。
表1

*對于N-末端乙酰化和/或C-末端酰胺化肽；T-20(與DP178同義)和T-1249是源于I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，T-118源于呼吸道合胞病毒(RSV)，T-257源于麻疹病毒(MV)1)WO 99/596152)Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-9933)Lambert，D.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191抗融合肽的長度不是關鍵性的。然而優選使用大約10-100個氨基酸的長度。該長度必須足以提供在酸性pH值下抗變性劑的穩定性。最大長度主要取決于在溶解，切割和純化過程中融合多肽的適當處理。
在本發明的一個優選實施方案中，按照本發明的重復肽在它的N-末端與另一個大約4-30個氨基酸的肽連接。另一個肽的目的是賦予抗融合肽以另外的性能，例如改善表達(例如具有高表達率的多肽如干擾素-α-2a的N-末端片段)，純化(例如組氨酸標記；參見例如，Zhang，J.-H.，等，Nanjing Daxue Xuebao，Ziran Kexue 36(4)(2000)515-517)或允許隨后類似乙酰化或聚乙二醇化(PEGylation)的N-末端修飾。
另一個肽是一段包含至少四個氨基酸(用于切割和/或表達目的的蛋氨酸和三個其它氨基酸)至大約30個氨基酸，優選10至約20個氨基酸(關于核苷酸密碼子水平)的短肽序列。另一個肽的長度對于本發明不是關鍵性的。然而，為了提高抗融合肽的產率優選另一個肽是非常短的。特別優選另一個肽包含一些適于高水平表達或促進切割蛋白酶接近(避免空間位阻)的氨基酸的適當切割位點和/或一些氨基酸如純化或固定標記如組氨酸標記(對于純化方法；Hengen，P.，Trends Biochem.Sci.20(1995)285-286))和必需的和由起始密碼子編碼的蛋氨酸。
按照本發明的另一個肽也優選在融合肽中使用以在表達、溶解、純化和肽修飾過程中保護抗融合肽的N-末端。這類融合肽在用于生產N-末端修飾的抗融合肽的方法中特別有價值。該方法涉及形成重組多肽作為一種融合肽，其融合部分保護N-末端。然后可以用化學保護試劑與重組融合肽反應以選擇性保護活性側鏈基團。接著使用至少一種切割試劑在肽和融合部分之間切割融合肽以形成一個未保護的末端氨基酸活性基團。此后，為了N-末端乙酰化可以使用一種化學修飾試劑如乙酐或N-羥基琥珀酰亞胺乙酯修飾未保護的末端氨基酸的活性基團。然后選擇性地將側鏈去保護以形成N-末端修飾的肽。例如在WO 94/01451；美國專利號5,635,371；和美國專利號5,656,456中描述了這類方法。
另一個肽部分優選具有一種結構以促進融合肽的純化和/或固定化。為了這個目的另一個肽優選含有一種“親和標記”(參見Pandjaitan，B.，等，Gene 237(1999)333-342)，如聚組氨酸(約6個組氨酸殘基)等。另外，另一個肽優選含有一個N-末端蛋氨酸(由ATG編碼)和C-末端編碼切割位點的一個或多個氨基酸。
特別優選按照本發明的另一個肽是人干擾素-α-2a的N-末端片段，優選具有一個包括的組氨酸標記(標準單字母代碼形式的氨基酸)
MCDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO5)MSDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO6)MSDLPQTHHHHHHSLGSR (SEQ ID No7)按照本發明，融合多肽含有一個或多個切割位點，其在內含體溶解后可被專一性切割蛋白酶(限制性蛋白酶)酶切或通過化學方法切割。考慮待生產的抗融合肽的氨基酸序列來選擇蛋白酶。如果可能，必須注意限制性蛋白酶的識別/切割序列不出現在抗融合肽之中，并且優選也不在另一個肽中，即，它應該只出現在切割區域(接頭區域)。合適的專一性切割內切蛋白酶是，例如Xa因子，凝血酶，枯草蛋白酶，枯草蛋白酶的BTN變體，遍在蛋白蛋白酶，凝乳酶，腸激酶，膠原酶，精確蛋白酶(precision protease)，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，內切蛋白酶Lys-C，激肽釋放酶(Carter，P.在Ladisch，M.R.；Willson，R.C.；Painton，C.C.；Builder，S.E.，編輯.，Protein PurificationFrom Molecular Mechanisms toLarge-Scale Processes；ACS Symposium Series No.427，American ChemicalSociety，181-193頁(1990)，TEV蛋白酶(Parks，T.D.，等，Anal.Biochem.216(1994)413-417)，IgA蛋白酶(Pohlner，J.，等，Nature 325(1987)458-462)，Kex2p蛋白酶(EP-A 0 467 839)或金黃色葡萄球菌V8蛋白酶。
另一個肽的序列可優選采用其它設計策略，其促進在預選的切割環境中的有效切割。具體地如果預選切割試劑是一種內肽酶，優選另一個肽在含水的環境中是可溶的。因此，優選具有帶電側鏈基團和親水性質的氨基酸包含在另一個肽中以增進溶解性或促進切割蛋白酶接近的任何其它氨基酸。這類氨基酸是，例如，Glu和Asp(陰離子)，Arg和Lys(陽離子)，和Ser和Thr(中性，親水性的)。如果使用精氨酸和/或賴氨酸，必須考慮到精氨酸和賴氨酸構成胰蛋白酶切割位點。
典型地選擇切割位點以使切割結果產生沒有附加序列的游離的和所需的抗融合肽(例如，胰蛋白酶在Arg后切割，然后通過羧肽酶B去除Arg)。因此，切割位點位于每個重復的一個末端，優選在肽重復的N-末端。這在融合多肽不包含如上定義的另一個肽的情形下同樣優選，因為該切割位點在肽的化學修飾過程中可用于N-末端的中間保護。例如在WO92/01707和WO 95/03405中描述了化學和酶切割位點以及用于實現靠近位點中一個的肽鍵的切割的相應試劑。
在下面表2中描述關于切割酶和切割序列的實例表2

化學切割

1)單字母代碼的氨基酸優選使用胰蛋白酶，其在精氨酸和賴氨酸的C-末端專一性地切割蛋白和肽。這類酶已知是例如來源于豬，牛或人的胰腺或重組酵母或大腸桿菌(WO 99/10503)。如果賴氨酸殘基被保護，胰蛋白酶特別適合產生所需的多肽。
在本發明的意義中將能夠被內切蛋白酶切割的肽序列理解為一條短鏈肽序列，其優選包含1-20個氨基酸，優選1-3個氨基酸，并且含有一個適于期望內切蛋白酶的C-末端切割位點。這個另外的肽優選在N-末端和期望的內切蛋白酶識別序列之間另外含有幾個氨基酸的組合(第一部分)，優選選自親水性氨基酸如Gly，Thr，Ser，Ala，Pro，Asp，Glu，Arg和Lys。優選將其中兩至八個這些另外的氨基酸是帶負電的氨基酸Asp和/或Glu的一種氨基酸一段序列用作第一部分。
只要抗融合肽不含蛋氨酸可使用BrCN切割(化學切割)。
在本發明的另一個優選實施方案中，抗融合肽在它的C-末端含有一個甘氨酸。該甘氨酸用于隨后的酶促C-末端酰胺化的目的(Bradbury，A.F.，和Smyth，D.G.，Trends Biochem.Sci.16(1991)112-115)。
因此，融合多肽的元件優選是-抗融合肽，-切割位點，-用于促進表達和/或純化的另一個肽，-在C-末端的甘氨酸。
切割位點對于抗融合肽從融合多肽的其它元件的釋放是必需的。因此切割位點位于在融合多肽中的抗融合肽之間，優選作為一個N-末端保護基團。
按照本發明，抗融合肽重復在形成含有所述肽和其它多肽的不溶性蛋白的內含體的條件下在微生物，如原核生物中過量表達。用抗融合肽的單重復(兩段相同的抗融合肽序列)已經發現按照本發明的性質。然而，還可使用具有多于一個重復的融合多肽，即，五個，十個或高達二十個相同的抗融合肽序列。待生產的融合肽必須具有適于在宿主細胞中穩定表達和形成內含體的足夠的長度。通常，編碼至少約80個氨基酸，優選＞100個氨基酸的基因是以穩定的方式表達，不降解并且作為內含體沉淀。沒有真正的重復上限。然而，表達編碼多于3,000個氨基酸的基因是困難的并且實際上是不常見的。
埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，鏈霉菌屬或芽孢桿菌屬例如作為原核宿主生物是合適的。酵母(例如酵母菌屬，畢赤酵母屬，漢遜酵母屬，克魯維酵母菌屬，裂殖酵母)是優選的真核宿主生物。為了生產按照本發明的融合多肽，以通常方式用含有編碼該肽的DNA的載體轉化微生物并且隨后以通常方式發酵。
內含體發現在胞質中存在并且含有在水中不溶的聚集形式的重復肽。通常，這類內含體蛋白是變性的形式(例如，隨機連接的二硫鍵)。例如通過在細胞裂解后離心將這類內含體與其它細胞組分分離。
按照本發明，在pH值低于6.5，優選在約pH3-5下，在變性條件下洗滌內含體。該變性條件奇怪地不能使融合多肽溶解到相當大的程度，但是能夠溶解很多包括多肽的其它源于宿主細胞的雜質。這類變性劑在技術水平上是眾所周知的，并且例如是高度濃縮的鹽酸胍溶液(例如大約6mol/l)或脲(例如大約8mol/l)。將變性劑優選用作緩沖溶液。
在洗滌后，優選不加去污劑或變性劑，在大約pH9或更高的堿性pH值下溶解內含體。另外令人驚奇地發現該堿性條件能夠以充分的方式溶解融合多肽。在溶解后，可以切割融合多肽以回收抗融合肽。
在溶解后，可以以一種簡單的方式，例如通過大小排阻層析，離子交換層析或反相層析純化融合肽或抗融合肽。
構建合適表達載體和基因表達的方法中的所有另外的步驟是當今技術水平的并且對于本領域的技術人員是熟悉的。例如在Sambrook等，分子克隆實驗手冊(1989)，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國中描述了該方法。
存在大量的描述通過內含體途徑在微生物/原核生物中重組生產蛋白的出版物。該綜述的實例是Misawa，S.，等，Biopolymers 51(1999)297-307；Lilie，H.，Curr.Opin.Biotechnol.9(1998)497-501；Hockney，R.C.，TrendsBiotechnol.12(1994)456-463。
按照本發明的肽在微生物/原核生物中過量表達。過量表達導致內含體的形成。由起始密碼子編碼的和在上述實例中提及的蛋氨酸主要在宿主細胞中表達/翻譯過程中去除。用于在微生物/原核生物中過量表達蛋白的常規方法在當今技術水平已經眾所周知很長時間。在該領域中的出版物的實例是Skelly，J.V.，等，Methods Mol.Biol.56(1996)23-53；Das，A.，Methods Enzymol.182(1990)93-112；和Kopetzki，E.，等，Clin.Chem.40(1994)688-704。
在原核生物中過量表達意味著使用具有啟動子如tac或lac啟動子(EP-B 0 067 540)的優化的表達盒(美國專利號6,291,245)。通常，通過使用含有化學誘導啟動子或通過溫度改變誘導的啟動子的載體可以進行過量表達。適于大腸桿菌的有用啟動子是溫度-敏感的λPL啟動子(參見EP-B 0 041 767)。另一個有效的啟動子是tac啟動子(參見美國專利號4,551,433)。這類用于原核生物如大腸桿菌的強調節信號通常來源于攻擊細菌的噬菌體(參見Lanzer，M.，等，Proc.Natl.，Acad.Sci.美國85(1998)8973-8977；Knaus，R.，和Bujard，H.，EMBO Journal 7(1988)2919-2923；對于λT7啟動子Studier，F.W.，等，Methods Enzymol.185(1990)60-89)；對于T5啟動子EP-A 0 186 069；Stüber，D.，等，System for high-levelproduction in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；InImmunologicalMethods IV(1990)121-152)。
通過使用該過量生產的原核生物細胞表達系統，在至少構成細胞總表達蛋白的10％，典型地30-40％，偶爾高達50％的水平上生產按照本發明的肽。
在此使用的“內含體”(IBs)指在微生物/原核生物中過量表達編碼核苷酸之后重組生產的一種不溶形式的多肽。該現象在本領域中是廣泛了解的并且例如由Misawa S.，和Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307)；Guise，A.D.，等，Mol.Biotechnol.6(1996)53-64；和Hockney等，Trends Biotechnol.12(1994)456-463綜述。
優選通過使用具有大約9或更高pH值的水溶液進行內含體的溶解。最優選的是10.0或更高的pH值。對于溶解不需要加入去污劑或變性劑。按照實施例7可以容易地確定優化的pH值。因為強堿條件可使多肽變性，明顯的存在一個優化的pH值范圍。發現這個優化的范圍在pH9和pH12之間。
按照在本領域已知的方法可以制備編碼融合肽的核酸(DNA)。更優選用另外的調節和轉錄元件擴展核酸序列以優化在宿主細胞中的表達。優選通過化學合成生產適合表達的核酸(DNA)。該方法對于本領域的技術人員是熟悉的，并且例如在Beattie，K.L.，和Fowler，R.F.，Nature 352(1991)548-549；EP-B 0 424 990；Itakura，K.，等，Science 198(1977)1056-1063中描述。修飾按照本發明的肽的核酸序列也可能是有利的。
該修飾是例如-為了引入限制性酶的各種識別序列以易化連接，克隆和突變的步驟而修飾核酸序列；-修飾核酸序列以引入適于宿主細胞的優選的密碼子；-為了優化在宿主細胞中的基因表達使用另外的調節和轉錄元件擴展核酸序列。
提供下列實施例，參考文獻，圖1和序列表以幫助理解本發明，其真正的范圍在后附的權利要求中闡明。應當理解可以在未背離本發明的精神的條件下對闡明的程序進行修改。


圖1顯示表達載體pBRori-URA3-LACI-RFN-Edel。
原材料在美國專利號6,291,245中描述了用于表達按照本發明的多聚體肽前體蛋白的大腸桿菌宿主/載體系統(大腸桿菌宿主菌株和基本載體)。常規方法重組DNA技術如在Sambrook，J.，等，分子克隆實驗手冊；冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989中所描述使用標準方法來操作DNA。按照制造廠商的說明書使用分子生物學試劑。
蛋白測定使用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數[T-重復ε＝148680cm2/mol；IFN-α-2a；ε＝18020cm2/mol；F9a＝44650cm2/mol]，通過測定在280nm處的光密度(OD)測定多聚體T-重復融合蛋白的蛋白濃度。
具體實施例方式
實施例1合成T-重復融合基因1.1T-重復融合基因的基因設計人工T-重復融合基因編碼具有27,242D分子量的217個氨基酸的融合蛋白。該融合蛋白由人干擾素-α-2a N-末端的13個氨基酸(MCDLPQTHSLGSR｜SEQ ID NO5)；載體肽)和通過胰蛋白酶可切割的肽接頭(GR)連接的5個拷貝的抑制性HIV肽T-1357(WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO1)，目標肽)組成。
為了將T-重復結構基因插入大腸桿菌表達質粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel(生產和描述參見實施例2)，在5’末端上游插入一個合成的核糖體RBSII結合位點和單個EcoRI內切酶切割位點并在3’末端上游插入單個的CelII限制性內切核酸酶切割位點。
1.2T-重復融合基因的基因合成通過化學合成從寡核苷酸制備RBSII T-重復基因，其是大約690bp長并被單個EcoRI和CelII限制性內切核酸酶切割位點側接。通過寡核苷酸的退火和連接裝配雙鏈RBSII T-重復基因并隨后作為一個長度為691bp的EcoRI/CellI片段克隆于一種大腸桿菌質粒中。將想要的質粒命名為pT-重復。通過DNA測序證實克隆的RBSII T-重復基因預先確定的DNA序列。
實施例2大腸桿菌表達質粒的構建2.1起始質粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel的構建質粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel是用于在大腸桿菌中表達干擾素-α-2a(IFN-α-2a)的一種載體。它是基于IFN-α-2b的表達質粒OripBR-URA3-EK-IFN(美國專利號6,291,245)。pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel與OripBR-URA3-EK-IFN區別在一個另外存在的lacI抑制基因和一個IFN-α-2a基因而不是一個IFN-α-2b基因。IFN-α-2a和IFN-α-2b只區別在位置21處的一個氨基酸(Lys21Arg交換)。lacI抑制基因來自質粒pUHA1(Stüber，D.，等，System for high-level production in Escherichia coli andrapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152)。使用引物N1(SEQ ID NO12)和N2(SEQ ID NO13)，NotIN1 5′-AAAAAAGCGGCCGCGACAATTCGCGCGCGAAGGCG-3′NotIN2 5′-AAAAAAGCGGCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG-3′按照由Mullis，K.B.，和Faloona，F.A.，在Methods Enzymol.155(1987)335-350中描述的方法，通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增它，并且隨后作為大約1210bp長度的NotI片段連接于OripBR-URA3-EK-IFN單一的NotI切割位點中。
2.2表達載體pBRori-URA3-LacI-T-重復的構建從質粒pT-重復(參見實施例1.2)分離作為大約690bp長度的EcoRI/CelII片段的T-重復基因，并隨后連接至用EcoRI和CelII消化的大約3.1kbp長的pBRori-URA3-LacI-RFN載體片段中。通過限制性酶切圖譜鑒定期望的質粒pBRori-URA3-LacI-T-重復，并且通過DNA測序再次證實亞克隆的T-重復基因。
實施例3在大腸桿菌中表達T-重復基因為了表達按照本發明的融合基因，采用一種大腸桿菌宿主/載體系統，其通過互補大腸桿菌營養缺陷型(PyrF)(美國專利號6,291,245)能夠進行不含抗生素的質粒選擇。
3.1轉化和通過在選擇性培養基中互補一種pyrF營養缺陷型的細胞培養為了表達T-重復基因，用在實施例2.2中描述的表達質粒pBRori-URA3-LacI-T-重復轉化大腸桿菌K12菌株[命名為UT5600(ΔpyrF)]。轉化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重復細胞首先在37℃下在瓊脂平板上生長，隨后在含有0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培養基中振蕩培養直至在550nm處的光密度(OD550)為0.6-0.9，然后用IPTG(1-5mmol/l的最終濃度)誘導。在37℃誘導4-16小時后，通過離心收獲細胞，用50mmol/l的磷酸鉀緩沖液，pH6.5，洗滌，并儲存在-20℃直至進一步的處理。
3.2表達分析為了表達分析，將源于3OD550nm單位(1OD550nm＝在550nm處OD為1的1ml細胞懸浮物)離心培養基的細胞沉淀重懸浮在0.25ml 10mol/ml的磷酸鉀緩沖液，pH6.5中，并且通過超聲處理(在50％強度兩個30秒的脈沖)使細胞裂解。沉淀不溶的細胞成分(14,000rpm，5min)并且將上清液與1/5體積(體積)5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍)混合。將不溶解的細胞殘渣部分(沉淀)重懸浮在0.3ml 1×SDS樣品緩沖液中，將樣品在95℃溫育5min并再次離心。隨后，通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)(Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685)分離蛋白并用考馬斯亮藍R染料染色。
合成的T-重復融合蛋白是均一的并且發現是以不溶解的蛋白聚集體，所謂的內含體(IBs)的形式全部在不溶解的細胞殘渣部分中。在所有克隆中表達產率在測量準確范圍內是可比較的并且是相對于總大腸桿菌蛋白的30-60％。
實施例4為重組生產T-重復的大腸桿菌101高細胞密度發酵預培養物為了制備預培養物，在一個1000ml的三角燒瓶中用1ml大腸桿菌UT5600ΔpyrF pBRori-URA3-LacI-T-重復甘油儲存物接種于300ml M9+培養基(用0.5％酪蛋白氨基酸和每個0.9g/l的Trp，Pro和Leu補充的M9培養基)。培養物在150rpm的外心搖床上在37℃溫育大約6小時直至OD578nm達到3.0。
101補料分批主發酵在發酵開始，將預培養物轉移至10升發酵罐中。主要培養物在限定的M9鹽培養基中生長直至OD578nm達到20，所述限定的M9鹽培養基含有1.4％甘油而不是葡萄糖，2％酪蛋白氨基酸和每個0.1％的氨基酸Trp，Leu和Pro。隨后，開始使用一個甘油酵母劑量(母液30％酵母提取物和33％甘油)進料培養物，根據培養物pH值的發展其流速在0.8-3.5ml/min之間變化，從而避免了任何另外的校正助劑(H3PO4，KOH)的加入。pH保持在pH7.0，通過控制rpm將pO2保持在50％。
在OD578nm為70時加入1.5mmol/l的IPTG，并誘導基因/蛋白表達。整個發酵耗費大約36小時并且在OD578nm為160-180時終止。
收獲生物量用無逆流離心機(13,000rpm，13l/h)將發酵罐的內容物離心，并將收獲的生物量儲存在-20℃直至進一步處理。
實施例55.1標準方法細胞裂解和制備IBs在0℃將200g大腸桿菌細胞(濕重)懸浮在110.1mol/l Tris-HCl，pH7.0中，加入300mg溶菌酶并在0℃溫育20分鐘。隨后，通過高壓分散的方法將細胞完全機械裂解并通過加入2ml 1mol/l MgCl2和10mgDNAse在25℃消化DNA 30分鐘。此后，將500ml 60mmol/l EDTA，6％Triton X-100和1.5mol/l NaCl，pH7.0與裂解溶液混合并在0℃溫育另外30分鐘。隨后，通過離心沉淀不溶解的組分(細胞殘渣和IBs)。
將沉淀懸浮在110.1mol/l Tris-HCl，20mmol/l EDTA，pH6.5中，25℃溫育30分鐘并通過離心分離IB制劑。
5.2按照本發明的方法細胞裂解和制備IBs將200g大腸桿菌細胞(濕重)懸浮在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0中，加入300mg溶菌酶并在0℃溫育20分鐘。隨后，通過高壓分散的方法將細胞完全機械裂解，通過加入2ml 1mol/l MgCl2和10mgDNAse在25℃消化DNA 30分鐘，并且通過離心沉淀不溶解組分(細胞殘渣和IBs)。
此后，用0.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0，洗滌沉淀兩次。為此，將沉淀在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.5中懸浮兩次，在攪拌同時在25℃溫育30分鐘，并且通過離心分離。
5.3按照本發明的方法細胞裂解和制備高純度IBs。
在0℃將200g大腸桿菌細胞(濕重)懸浮在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0之中，加入300mg溶菌酶并在0℃溫育20分鐘。隨后，通過高壓分散的方法將細胞完全機械裂解，通過加入2ml 1mol/l MgCl2和10mg DNAse在25℃消化DNA 30分鐘，并且通過離心沉淀不溶解組分(細胞殘渣和IBs)。
此后，用5.5mol/l鹽酸胍(和8mol/l脲，分別地)和10mol/l EDTA，pH3.0洗滌細胞兩次。為此，將沉淀在5.5mol/l鹽酸胍(和8mol/l脲，分別地)和10mol/l EDTA，pH3.0中懸浮兩次，在攪拌同時在25℃溫育10-30分鐘，并且通過離心分離。
此后，用0.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0洗滌細胞兩次至三次。為此，將沉淀在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.5中懸浮兩至三次，在攪拌同時在25℃溫育30分鐘，并且通過離心分離。
實施例6在酸性范圍內在變性劑存在的條件下T-重復IBs的溶解度與“標準”IBs(IFN-α-2a和F9a)的比較將待測的IBs[IFN-α-2a如在實施例2.1，3.1，4和5.1中描述制備，然而使用UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel細胞而不是UT5600(△pyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重復細胞；F9a如在WO 97/47737中所描述制備；T-重復如在實施例2.2，3.1，4和5.2中所描述制備]在攪拌的同時在室溫下以1g/20ml的濃度各自重懸浮于a)5.5mol/l鹽酸胍和10mmol/l EDTA，pH3.0和
b)8mol/l脲和10mmol/EDTA，pH3.0在12-24小時后，在各種情形中取200μl樣品，通過離心(Eppendorf5415離心機，14.000rpm，10min)沉淀不溶解組分，并且用20μl 5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍)與80μl上清液混合。在SDSPAGE前將含有5.5mol/l鹽酸胍的上清液對8mol/l的脲透析。用200μl磷酸鉀緩沖液，pH5.0洗滌不溶解的沉淀一次，然后重懸浮于250μl1×SDS樣品緩沖液中。在通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)的方法分離蛋白并用考馬斯亮藍R染料染色前將所有的樣品在95℃溫育5分鐘。此后，為了測定多肽的含量光密度分析相關的凝膠帶(表3)。
表3a5.5mol/l鹽酸胍，10mmol/l EDTA，pH3

表3b8mol/l脲，10mol/l EDTA，pH3

實施例7
在堿性范圍內在含水溶液中T-重復IBs的溶解度與“標準”IBs(IFN-α-2a和F9a)的比較在攪拌的同時室溫下在待測試的pH值(8.0，9.0，10.0，11.0和12.0)下，將待溶解的IFN-α-2a，F9a-和T-重復IBs(依照實施例6中的描述生產)分別溫育于a)50mmol/l Tris HCl和b)50mmol/l NaHCO3。
4小時后，在各種情形中取200μl樣品，通過離心(14.000rpm，15min)沉淀不溶解組分。用20μl 5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍)與80μl上清液混合。用200μl 50mmol/l的磷酸鉀緩沖液，pH6.5洗滌不溶解的沉淀一次，并重懸浮于250μl 1×SDS樣品緩沖液中。在通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)的方法分離蛋白并用考馬斯亮藍R染料染色前將樣品在95℃溫育5分鐘。此后，為了測定多肽的含量光密度分析相關的凝膠帶(表4)。
表4aIFN-α-2a

表4bF9a

表4cT-重復

實施例88.1標準方法在變性條件下溶解IBs通過在25℃攪拌兩小時將20g IB沉淀(濕重)懸浮在200ml 50mmol/lTris-HCl緩沖液，6mol/l鹽酸胍(和8mol/l脲，分別地)，10mmol/l EDTA，pH7.0之中。通過離心分離不溶解的組分并且進一步處理透明的上清液。
8.2按照本發明的方法將IBs溶解于含水微堿性緩沖液中通過在25℃攪拌4-16小時將10g IB沉淀(濕重)懸浮在200ml 50mmol/l Tris-HCl緩沖液，pH9(和50mmol/l NaHCO3緩沖液，pH9-10，分別地)之中。通過離心分離不溶解的組分并且通過用胰蛋白酶酶切進一步處理[任選地，在用檸康酸酐衍生化T-重復融合蛋白的伯氨基基團(賴氨酸的ε-氨基基團)之后]透明的上清液。
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<141>
<150>EP02025618.6<151>2002-11-19<150>EP03000988.0<151>2003-01-17<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽T1357<400>1Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽T680<400>2
Tyr Thr Ser Leu I1e His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>3<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽RSV118<400>3Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu1 5 10 15Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly20 25 30Lys Ser Thr35<210>4<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽MY257<400>4Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp1 5 10 15Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys20 25 30Glu Leu Leu35<210>5
<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽<400>5Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>6<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽<400>6Met Ser Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>7<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽<400>7Met Ser Asp Leu Pro Gln Thr His His His His His His Ser Leu Gly1 5 10 15Ser Arg<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列
<400>8Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列<400>9Ile Glu Gly Arg1<210>10<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列<400>10Gly Pro Arg1<210>11<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列<400>11His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物N1<400>12aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg35<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物N2<400>13aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg3權利要求
1.用于通過在微生物宿主細胞中表達一種編碼作為重復肽的所述抗融合肽的核酸，分離含有所述重復肽的內含體，溶解所述內含體，并在切割后分離所述抗融合肽來重組生產一種抗融合肽的方法，其特征在于在pH6.5或低于pH6.5的pH值下使用一種變性劑洗滌所述內含體，在至少pH9的pH值下溶解含有所述重復肽的所述內含體并切割所述重復肽以獲得所述抗融合肽。
2.依照權利要求1的方法，其特征在于洗滌是在pH3-5的條件下進行。
3.依照權利要求1或2的方法，其特征在于所述重復肽是在溶解所述內含體過程中或之后被切割。
4.一種編碼一種融合多肽的核酸，所述融合多肽包括(在N-末端至C-末端方向)a)一種作為至少兩個相同抗融合肽序列的重復肽的抗融合肽；b)一個位于所述抗融合肽之間的切割位點。
5.依照權利要求4的核酸，其特征在于所述抗融合肽包括10-100個氨基酸。
6.依照權利要求4或5的核酸，其特征在于所述重復包括2-20個相同的抗融合肽序列。
7.一種含有一種融合多肽的內含體制劑，所述融合多肽包括(在N-末端至C-末端方向)a)一種作為大約10-100個氨基酸長度的重復肽的抗融合肽；b)一個位于所述抗融合肽之間的切割位點。
全文摘要
用于通過在微生物宿主細胞中表達一種編碼作為重復肽的所述抗融合肽的核酸，分離含有所述重復肽的內含體，溶解所述內含體并在切割后分離所述抗融合肽來重組生產一種抗融合肽的方法，其特征在于在pH6.5或低于pH6.5的pH值下使用一種變性劑洗滌所述內含體，在至少pH9的pH值下溶解含有所述重復肽的所述內含體并切割所述重復肽以獲得所述抗融合肽。
文檔編號C12P21/00GK1502698SQ200310116190
公開日2004年6月9日 申請日期2003年11月19日 優先權日2002年11月19日
發明者卡奇馬雷克·亞歷山德拉, 科佩茨基·埃哈德, 尚茨·克里斯蒂安, 澤貝爾·斯特凡, 斯特凡, 克里斯蒂安, 卡奇馬雷克 亞歷山德拉, 基 埃哈德 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司