專利名稱：將多聚核苷酸固定于固體支持物的方法 ,由此獲得的固體固定化支持物 ,從固體支持物 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于制備DNA芯片等的將多聚核苷酸固定化于固體支持物上的方法。另外，本發明涉及通過該方法所制備的固定化有多聚核苷酸的固體支持物，用該支持物檢測多聚核苷酸的方法，以及用于固定化多聚核苷酸的溶液。
背景領域人們已經不單努力構建多種生物的基因結構，而且致力于在基因組水平上對基因功能進行分析，并且有效分析基因功能的技術開發已得到飛速發展。DNA微陣列(也稱為DNA芯片)是一種高密度陣列，其中排列了許多DNA分子并固定化在例如玻璃載片的基質的所有預先確定的區域上，特別適用于確定核酸的堿基序列，也適用于例如基因表達、變異和多態性的同步分析。由于使用DNA微陣列對基因信息的分析作用重大，例如在用于疾病診斷和預防方法的新藥產生和開發中，因而需要對制造DNA微陣列的技術和對所獲數據的分析系統進行更深入的開發。
為了通過使用DNA微陣列檢測例如DNA等核酸，標記有放射性同位素(RI)或者熒光的核酸片段樣品(目的核酸樣品)首先和探針，例如以高密度在固體支持物表面上排列的DNA片段進行雜交。在這種情況下，目的核酸中攜帶有和探針互補的堿基序列的分子和探針互補雜交。隨后，測量已雜交的標記的目的分子的信號以鑒定所雜交的探針多聚核苷酸。具體地，微陣列上的放射性密度或熒光密度通過RI或者熒光圖像掃描儀(器)進行測量并且對所獲圖像進行分析。因此，根據DNA微陣列，成千乃至上萬的分子可以同步進行雜交和檢測，并且可以在短時間內使用微量的樣品獲得大量的基因信息。
制備DNA微陣列包括在固體支持物的表面直接合成寡聚核苷酸(稱為“原位芯片法(on-chip method)”)的方法和將預先制備的DNA片段固定化于固體支持物表面的方法。前者，即原位芯片法是一種使用光電輻射選擇性除去保護性基團，并且使用在半導體制造中所使用的影印平版印刷術和固相合成技術在固體支持物上用許多精細的模具(matrixes)進行組合合成，從而同步地合成多種寡聚核苷酸的方法(Fodor，S.P.A.等人，Science，第251卷，第767-773頁(1991年))。
另一方面，后一種方法是一種將預先制備的探針核苷酸比如DNA片段的樣品點在固體支持物表面上，從而通過使用共價鍵或離子鍵將其鍵合并固定化的方法。此類方法包括，例如一種通過使用配置在DNA微陣列制造儀上的點樣設備將探針多聚核苷酸點至經過多聚陽離子(多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺等)表面處理后的固體支持物表面，并且利用多聚核苷酸樣品的電荷將其靜電偶聯和固定化至固體支持物的方法(Schene，M.等人，Science，第270卷，第467-470頁(1995年))，一種預先合成引入了活性反應基團的寡聚核苷酸，通過點樣設備將其點至經過表面處理的固體支持物的表面并且通過共價鍵方式將其固定化的方法(“Protein-Nucleic Acid-Enzyme”，第43卷，第2004-2011頁(1998年)；Lamture，J.B.等人，Nucl.Acids Res.，第22卷，第2121-2125頁(1994年)；Guo，Z.等人，Nucl.Acids Res.，第22卷，第5456-5465頁(1994年))，以及一種引入如活性酯基團的與多聚核苷酸形成共價鍵的活性反應基團，并通過共價鍵將多聚核苷酸固定化的方法(國際公開物WO00/22108單行本，國際公開物WO01/75447單行本和國際公開物WO02/12891單行本)，等等。
為了通過固定化探針多聚核苷酸在固體支持物表面上形成多個點，使用過多種類型的點樣裝置，有將針尖機械化地和固體支持物的表面接觸的針式系統，利用噴墨式打印機原理的噴墨系統等。由此固定化的點經常形狀擴散。例如，點呈月牙形或者炸面圈形，或者點形外溢。在點的形狀不確定的情況下，信號密度也會發生變化從而降低數據的可靠性。因此，為了盡可能地提高對作為目標物的核苷酸片段樣品的檢測精確度從而提高對微陣列分析的精確度，需要在固體支持物上形成點從而使探針分子牢固地固定化在表面上，使點的形狀和大小盡可能的統一并且有利于實現重復性。
本發明的目的即為提供一種將多聚核苷酸點樣到固體支持物上且均勻并且形狀一致地固定化多聚核苷酸的方法。
發明公開本發明的發明者們已經為解決以上所描述的目的進行了可信的研究，并發現通過將多聚核苷酸在含有聚醚或者二元醇的溶液中溶解并將所得溶液點樣在固體支持物上能獲得一致而且均勻的點，從而實現了本發明。
也就是說，本發明包含以下發明。
(1)將含有聚醚或二元醇以及多聚核苷酸的溶液點樣到固體支持物上從而將多聚核苷酸固定化于固體支持物上的方法。
(2)如(1)所描述的方法，其中的固體支持物具有能和多聚核苷酸共價結合的功能性基團。
(3)如(2)所描述的方法，其中的固體支持物具有用于靜電吸引基質上的多聚核苷酸的靜電層。
(4)如(1)至(3)中任一所描述的方法，其中多聚核苷酸為DNA。
(5)如(1)至(4)中任一所描述的方法，其中聚醚或二元醇為二甘醇或聚乙二醇。
(6)通過(1)至(5)中任一所描述的方法在其上固定化有多聚核苷酸的固體支持物。
(7)檢測目的多聚核苷酸的方法，包括將標記的多聚核苷酸與通過(1)至(5)中任一所描述的方法固定化于固體支持物上的多聚核苷酸雜交并且讀取來自于所標記的多聚核苷酸的信號。
(8)用于固定化多聚核苷酸的溶液，其特征在于含有聚醚或二元醇。
示圖簡述圖.1出示通過在固體支持物上點樣并溫育含不同組成的熒光標記的DNA溶液，并然后使用FLA8000將其成像所獲得的熒光圖像。圖.2出示通過在固體支持物上點樣并溫育含不同組成的熒光標記的DNA溶液并然后使用FLA8000將其成像所獲得的熒光圖像。
P7本發明的最佳實施模式本發明描述了在固體支持物上固定化探針多聚核苷酸(例如DNA片段)的方法。
本發明中，固定化多聚核苷酸的固體支持物并無特別限制并且優選那些具有靜電層用來靜電吸附基質上的多聚核苷酸的，以及具有能和多聚核苷酸共價結合的功能性基團的固體支持物。
本發明中用作基質的材料包括，例如，硅、玻璃、纖維、木質材料、紙張、陶瓷、塑料(例如，聚酯樹脂，聚乙烯樹脂，聚丙烯樹脂，ABS樹脂(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(共聚)樹脂)，尼龍，丙烯酸樹脂，氟化樹脂，聚碳酸酯樹脂，聚氨基甲酸乙酯樹脂，甲基戊烯樹脂，酚樹脂，三聚氰胺樹脂，環氧樹脂和氯乙烯樹脂)。
在使用上述描述的材料作為基質的情況下，盡管不一定使用表面處理層但是優選施用表面處理，用于在基質上強效固定化化合物以引入能與多聚核苷酸共價結合的功能性基團。
在表面處理中優選使用合成鉆石，高壓合成鉆石，天然鉆石，軟質鉆石(例如，鉆石樣碳)，不定形碳，碳質材料(例如，石墨，富勒烯，或碳納米管)中的任何一種，及其混合物或其薄片。另外，也可以使用碳化物，例如碳化鉿、鈮碳、碳化硅、碳化鉭、碳化釷、碳化鈦、碳化鈾、碳化鎢、碳化鋯、碳化鉬、碳化鉻、碳化釩。軟質鉆石泛指不完全的鉆石結構，為鉆石和碳的混合物，如所謂的鉆石樣碳(DLC)，并且其混合比例并無特定限制。
經表面處理的基質例子包括在載片玻璃上形成軟質鉆石薄膜層的基質。這種基質優選那些通過離子化蒸氣沉積法在含有占總體積的0到99％的氫氣和總體積剩余的100至1％的甲烷的氣體混合物中制備的鉆石樣碳。
表面處理層的厚度優選從1納米至100微米。
基質的表面處理層可以通過已知方法形成，例如，微波等離子體CVD(化學蒸氣沉積)法、ECRCVD(電回旋加速器共振化學蒸氣沉積)法、ICP(感應耦連等離子體)法，直流噴鍍法、ECR(電回旋加速器共振)噴鍍法、離子電鍍法、電弧離子電鍍法、EB(電子束)蒸氣沉積法、歐姆加熱蒸氣沉積法、離子化蒸氣沉積法、電弧蒸氣沉積法、激光蒸氣沉積法等。
本發明中所使用的基質不僅包括那些如上所描述形成有表面處理層的構造物，還包括那些獲自于合成鉆石、高壓合成鉆石、天然鉆石，軟質鉆石(例如，鉆石樣碳)，不定形碳的材料；例如金、銀、銅、鋁、鎢、鉬的金屬；塑料(例如，聚酯樹脂，聚乙烯樹脂，聚丙烯樹脂，ABS樹脂，尼龍，丙烯酸樹脂，氟化樹脂，聚碳酸酯樹脂，聚氨基甲酸乙酯樹脂，甲基戊烯樹脂，酚樹脂，三聚氰胺樹脂，環氧樹脂和氯乙烯樹脂)；那些將上述金屬粉末和陶瓷粉末與上述樹脂作為粘合劑混合并鍵合所形成的物質；或者例如將上述金屬粉末或陶瓷粉末經過壓力塑型機器擠壓而且在高壓下燒結所形成的材料。另外，還可以是材料的薄片或者復合體(例如，鉆石和其他物質(例如，二相體(2-phase body))).
基質的形狀和大小并無特別限制，形狀可包括，例如，平板形、線形、球形、多邊形和粉末狀。在使用平板形的情況下，通常寬度為0.1至100毫米，長度為0.1至100毫米，厚度為0.01至10毫米。
另外，由鈦、金、鉑、鈮、鉻、碳化鈦、氮化鈦等制成的單層或者其復合層可以制成基質表面或背面的反射層。由于反射層的厚度要完全一致，優選10納米或者更厚，更優選時為100納米或更厚。
本發明中優選的固體支持物帶有用于靜電吸附多聚核苷酸的靜電層。
靜電層沒有特別的限制，只要其靜電吸引多聚核苷酸并提高多聚核苷酸固定化的量即可，并且可以通過例如使用帶有正電荷的化合物，比如含氨基的化合物來形成。
含有氨基基團的化合物包括那些含有非取代氨基基團(-NH2)或者由含一至六個碳原子的烷基一取代的氨基基團(-NHRR被取代)的化合物，例如，亞乙二胺，環己二胺，正丙胺，一甲基胺，二甲基胺，一乙基胺，二乙基胺，烯丙胺，氨基偶氮苯，氨基醇(例如，乙醇胺)，acrinole，氨基苯甲酸，氨基蒽醌，氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸，脯氨酸，胱氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，賴氨酸，精氨酸和組氨酸)，苯胺，或者其多聚物(例如，多聚芳胺，多聚賴氨酸)和其共聚物以及例如4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷，氨苯蝶啶，亞精胺、精胺和腐胺的多胺。
靜電層可以不通過與基質或者表面處理層共價結合形成，或者也可以通過與基質或者表面處理層共價結合形成。
在不通過與基質或者表面處理層共價結合形成靜電層的情況下，通過例如在形成表面處理層時將含有氨基的化合物引入到薄膜層制備設備中來形成含有氨基的碳質薄膜層。在將化合物引入薄膜層制備設備中時，還可以使用氨氣。另外，表面處理層還可以為通過例如形成緊密黏附層及隨后形成含有氨基的薄膜層而形成的復合層，該過程也可以在含有氨氣的氛圍中進行。另外，在不通過與基質或者表面處理層共價結合形成靜電層的情況下，優選在基質上用蒸氣沉積含有非取代或一取代的氨基基團的化合物和碳化合物，并然后引入能夠和多聚核苷酸共價結合的功能基團。此處所用的碳化合物沒有特別限制，只要它能以氣態形式供給，并且優選例如在常溫下呈氣態的甲烷，乙烷或丙烷。優選的蒸氣沉積法為離子化蒸氣沉積法，并且離子化蒸氣沉積法的優選條件為在操作壓范圍在0.1至50帕斯卡，且加速電壓為200至1000伏特的范圍內。
在通過與基質或者表面處理層共價結合形成靜電層的情況下，靜電層可以如下形成，通過例如在氯氣中對基質或涂布了表面處理層的基質用UV射線照射從而氯化其表面，然后用上述含有氨基基團的化合物反應，例如，聚丙烯胺，聚賴氨酸，4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷，氨苯蝶啶等多價胺，從而將氨基基團引入到不與基質結合的側面的末端。還可以通過氯化基質表面然后在氨氣中照射UV射線而引入氨基基團。
另外，在溶液中對涂有靜電層的基質進行引入能和多聚核苷酸共價結合的功能性基團(例如，使用二元羧酸或多元羧酸引入羧基基團)的反應的情況下，優選將基質浸入含有具有非取代或一取代氨基基團的化合物溶液中，然后引入能和多聚核苷酸共價結合的功能性基團。該溶液的溶劑包括，例如水，N-甲基吡咯烷酮和乙醇。
在對涂有靜電層的基質使用二元羧酸或多元羧酸引入羧基基團的情況下，優選用N-羥基琥珀酰亞胺或/和碳二亞胺預先活化而進行，或者在存在N-羥基琥珀酰亞胺或/和碳二亞胺的條件下進行反應。
當使用聚丙稀胺作為含氨基基團的化合物將基質浸在該非取代或一取代氨基化合物的溶液中形成靜電層時，其與基質緊密鍵合的能力十分出色，從而提高多聚核苷酸的固定化量。
靜電層的厚度優選為1納米至500微米。
如上所述，對涂有靜電層的基質表面進行化學修飾是為了引入能和多聚核苷酸共價結合的功能性基團。
功能性基團包括例如，羧基基團，活性酯基團，鹵甲酰基團，羥基基團，硫酸基團，氰基基團，硝基基團，硫醇基團和氨基基團。用于引入作為功能性基團的羧基的化合物包括，例如由分子式X-R1-COOH(其中X代表一個鹵原子，R1代表具有1至12個碳原子的二價烴基團)代表的鹵代羧酸，例如氯乙酸，氟乙酸，溴乙酸，碘乙酸，2-氯丙酸，3-氯丙酸，3-氯丙稀酸和4-氯苯甲酸；由分子式HOOC-R2-COOH(其中R2代表一個單鍵或具有1至12個碳原子的二價烴基團)代表的羧酸，例如草酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸(順式丁烯二酸)，富馬酸(反式丁烯二酸)和鄰苯二甲酸；例如聚丙稀酸，聚甲基丙烯酸，1，2，4-苯三甲酸和丁烷四羧酸的多元羧酸；由分子式R3-CO-R4-COOH(其中R3代表一個氫原子或1至12個碳原子的二價烴基團，R4代表具有1至12個碳原子的二價烴基團)代表的酮酸或醛酸；由分子式X-CO-R5-COOH(其中X代表鹵原子，R5代表單鍵或具有1至12個碳原子的二價烴基團)代表的二元羧酸的一鹵化物，例如，一氯化琥珀酸和一氯化丙二酸；以及例如鄰苯二甲酸酐，琥珀酸酐，草酸酐，馬來酸酐和丁烷四羧酸酸酐的酸酐。
按上述引入的羧基基團可以通過例如氨腈或碳二亞胺(例如，1-[3-(去甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺)以及例如N-羥基琥珀酰亞胺的化合物的脫水試劑形成活性酯。
用于引入鹵甲酰基團作為功能性基團的化合物包括，例如，由分子式X-CO-R6-CO-X代表的二元羧酸的二鹵化物(其中X代表鹵原子且R6代表單鍵或具有1至12個碳原子的二價烴基團)，例如氯化琥珀酸和氯化丙二酸。
用于引入羥基基團作為功能性基團的化合物包括，例如，由分子式HO-R7-COOH(其中R7代表具有1至12個碳原子的二價烴基團)代表的羥基酸或酚酸。
用于引入氨基作為功能性基團的化合物包括，例如，氨基酸。
上述化合物的羧基基團和靜電層中的氨基基團縮合形成酰胺偶聯。
上述化合物中，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、1，2，4-苯三甲酸和丁烷四羧酸的多元酸可以用于提高親水性。
上述步驟中，用含氨基化合物的處理，引入功能性基團的處理或者是形成活性酯的處理優選重復多次進行。
本發明中為形成探針而固定化于固體支持物上的多聚核苷酸還包括DNA和RNA的寡聚核苷酸。多聚核苷酸可以含單鏈或雙鏈。對于基因檢測基因表達時，通常使用例如cDNA，cDNA或EST的一部分的DNA片段(多聚核苷酸)。多聚核苷酸的序列和功能可以未知，但是通常用cDNA或基因組庫作為模版，根據數據庫中所注冊的序列，通過PCR方法擴增來制備(后文中指為“PCR產物”)。還可以使用不通過PCR方法擴增的DNA片段。
同時，為了檢測基因變異或多樣性，還可以針對變異和多樣性合成并使用以已知序列為標準的各種多聚核苷酸。另外，在檢測堿基序列的情況下，合成并使用4n(n堿基長度)種多聚核苷酸。優選使用已知堿基序列的多聚核苷酸。通常，所固定化的多聚核苷酸優選為從2聚到200聚體，并且特別優選10到120聚體。
另外，本發明中的多聚核苷酸還包括通過將DNA的磷酸二酯鍵轉換成肽鍵形成的人造核苷酸，即肽核苷酸(PNA)。
上述探針多聚核苷酸用含有聚醚或二元醇的溶劑溶解或稀釋以制備用于固定化多聚核苷酸的溶液。含有聚醚或二元醇的溶劑包括含有聚醚或者二元醇之一的溶劑以及同時含有聚醚和二元醇的溶劑。
本發明中的二元醇指帶有兩個羥基的二羥基醇。本發明中，二元醇優選直鏈二羥基醇，更優選在主鏈上含有1至3,000,000個氧原子的直鏈二羥基醇并且特別優選主鏈上含有1至30,000個醚鍵的直鏈二羥基醇。通常認為對于固定化目的二元醇是一種優良的溶劑，因為它不阻礙基質上功能性基團與要固定化的物質(DNA，等)之間的反應。
二元醇的特定例子包括，烷撐二醇，二烷撐二醇和三烷撐二醇并且優選二烷撐二醇。烷撐基團為2至6,000,000個碳原子的烷撐基團，優選2至60,000個碳原子，例如，乙撐，丙撐和丁撐。本發明中，特別優選使用二甘醇作為二元醇。二元醇可以單獨使用或者多種混合使用。
溶液中的二元醇濃度通常為5至30％的質量比，優選5至20％的質量比并且更優選5至15％的質量比。二元醇溶液的pH值通常為4至12，并且優選pH6至8。
本發明中聚醚指主鏈上含有醚鍵的直鏈高分子聚醚。聚醚包括，例如，聚乙二醇，例如聚氧雜環丁烷，聚丁撐氧和聚戊撐氧以及聚氧亞甲基的聚烯化氧。優選聚烯化氧并且特別優選聚乙二醇。另外，優選平均分子量為100至2,000,000的聚醚并且更優選平均分子量為200至20,000的聚醚。特別地，優選平均分子量為200至2000的聚乙二醇并且更優選平均分子量為200至400的聚乙二醇。在本說明書中，平均分子量指重量平均分子量。通常認為對于固定化目的聚醚是一種優選溶劑，因為它不阻礙基質上功能性基團與要固定化的物質之間的反應。
本發明中，聚乙二醇還包括聚乙二醇的一烷基醚并且烷基為1至50個碳原子的烷基，例如，聚乙二醇一癸基醚和聚乙二醇一辛基醚。另外，本發明中，不以一烷基醚形式存在的其中兩個末端均有羥基基團的聚乙二醇也包含在二元醇中。聚醚可以單獨使用或者多種混合使用。
具體地，其包括聚乙二醇200(平均分子量為190至200)，聚乙二醇300(平均分子量為285至315)，聚乙二醇400(平均分子量為380至420)，聚乙二醇600(平均分子量為570至630)，聚乙二醇1000(平均分子量為950至1050)，聚乙二醇1500(PEG300和PEG1540的等量混合物，平均分子量為500至600)，聚乙二醇1540(平均分子量為1300至1600)，聚乙二醇2000(平均分子量為1800至2200)，聚乙二醇4000(平均分子量為2700至3400)，聚乙二醇6000(平均分子量為7400至9000)，聚乙二醇20000(平均分子量為18000至25000)，聚乙二醇300一癸基醚，聚乙二醇600一辛基醚及其混合物。具有平均分子量150至450的聚乙二醇，例如聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400及其混合物更為有利，因為室溫下它們呈液態并且在點樣后可通過可視觀察，CCD(電荷偶聯設備)和冷卻式CCD可能實現觀測，可以容易地發現例如點漏損等缺陷。
溶液中的聚醚濃度通常為1至100％的質量比，優選1至80％的質量比并且更優選5至40％的質量比。聚醚溶液的pH值通常為2至13，并且優選pH5至9。
用于溶解聚醚或二元醇的溶劑沒有特別限制并且可以使用一種或多種溶劑，其選自水溶劑，例如蒸餾水和SSC(檸檬酸鈉鹽)等，以及能溶解DNA的極性有機溶劑等，例如二甲亞砜，二乙基甲酰胺，四氫呋喃，三氟乙酸，三乙胺，1-甲基-2-吡咯酮，二氧環乙烷和乙酸乙酯。共存二甲亞砜時更為有利，因為可以控制溶液的粘度并保持點的形狀和例如DNA的生物物質對固體支持物的固定化力。
另外，溶劑還可以含有醇，例如一羥基醇如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇以及乙二醇一乙醚和三丙二醇一乙醚等。
將多聚核苷酸溶液分配到例如96孔或384孔型的塑料平板上，并使用點樣設備等將分配好的含水液體滴在固體支持物上進行點樣。作為點樣設備，常使用針式系統，其中探針多聚核苷酸溶液送至針頭，將針和固體支持物表面接觸而將含水液體轉移到固體支持物的表面上形成點狀。針頂端的形狀有各種類型，例如實心針型(特指不帶溝槽)和鵝毛筆針型(如鋼筆一樣的帶溝槽)，兩種均可以使用。優選鵝毛筆針型。另外，除了針式系統，也可以使用利用噴墨打印機原理的噴墨系統，或者利用通過毛細管的毛細管系統的點樣設備。
要點樣的多聚核苷酸優選在相對于固體支持物每平方厘米從102至105種的范圍內。探針核苷酸的量范圍為1至10-5摩爾并且優選重量為幾納克或更少。通過點樣，探針多聚核苷酸以一個點的形式固定化于固體支持物的表面。通過使用根據本發明的方法，每個點的形狀基本為圓形并且確實大小一致，并且這些一致的點沒有形成空白。形狀和大小不發生波動對于基因表達的定量分析或者單個堿基變異的分析至關重要。
每個點的溶液點樣量通常在1pL至1μL范圍內，優選為100pL至100nL的范圍。點的大小通常在直徑為50至300微米的范圍內。而點之間的距離通常在0至1.5毫米范圍內，優選為100至700微米的范圍。
在點樣多聚核苷酸溶液后，通常優選將固體支持物在室溫至120攝氏度進行溫育，優選在60至100攝氏度，通常進行72小時或更短時間，優選為1至3個小時。通過施加上述后處理，多聚核苷酸和固體支持物之間形成穩定的共價鍵。
將多聚核苷酸固定化于固體支持物上后，清洗固體支持物以除去未固定化的多聚核苷酸等。那些在相關技術領域通常使用的溶液可用作清洗溶液，例如，可以使用含有2×SSC，0.2％SDS(十二烷基硫酸鈉)的水溶液。
本發明中通過固定化多聚核苷酸的方法所制備的固定化有多聚核苷酸的固體支持物具有許多點(通常從幾千至幾萬個)，包含了許多探針多聚核苷酸通過共價鍵固定化的區域。
根據多聚核苷酸的固定化方法所制備的微陣列的使用壽命(工作壽命)對于其中固定化了cDNA的cDNA分析微陣列通常為2至6個月，而且對其中固定化了寡聚DNA的寡聚DNA分析微陣列通常為2至6個月。DNA分析型微陣列用于監測基因表達，確定堿基序列，分析變異體，分析多態性等。
然后，對根據本發明使用固體支持物的檢測多聚核苷酸樣品的方法如下所述。首先，提供標記的多聚核苷酸的樣品。通常使用未知序列和功能的DNA片段或者RNA片段作為多聚核苷酸樣品(目的多聚核苷酸)。
為了檢測基因表達，在真核生物的例子中通常通過從細胞或者其組織樣品中提取其mRNA并且通過反轉錄將標記的dNTP(“dNTP”指脫氧核糖核苷酸，其中的堿基為腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鳥嘌呤(G)，或者胸腺嘧啶(T))作為堿基轉化成cDNA，從而獲得標記的多聚核苷酸樣品。在原核生物的例子中如細菌，由于選擇性地提取mRNA存在難度因而提取總RNA。在使用基因組作為樣品的例子中，可以從除了紅細胞以外任選的組織樣品中分離。除了紅細胞以外任選的組織為，例如外周血淋巴細胞，皮膚，毛發，精液等。一次雜交所需mRNA的量根據液體的量或者標記方法而變化并且通常為幾微克或更少。還有一種使用mRNA作為反義mRNA的方法。作為標記的dNTP，出于化學穩定性的考慮優選使用標記的dCTP。另外，在作為探針固定化于固體支持物上的多聚核苷酸為寡聚核苷酸的情況下，將多聚核苷酸樣品的分子量降低是有利的。
為了檢測基因變異或者多態性的目標，通常在含有標記引物或標記dNTP的反應體系中通過對目的區域進行PCR而獲得標記的多聚核苷酸。
作為標記物，已知有RI標記和非RI標記(熒光方法，生物素方法，化學放射法等)并且優選使用熒光標記。熒光標記包括，例如，諸如Cy3和Cy5的Cy染料，FITC，RITC，羅丹明，德州紅，TET，TAMRA，FAM，HEX，ROX等，以及放射性標記包括例如α-32P，γ-32P，35S等。
然后，將標記的多聚核苷酸樣品溶解或分散于含水介質如SSC(檸檬酸鈉鹽)中以制備樣品的水溶液。將水溶液點樣至要固定化多聚核苷酸的固體支持物上，溫育進行雜交。可以通過分配樣品的水溶液進行點樣，例如在96孔或384孔塑料平板上并且通過使用點樣設備滴加樣品。水溶液的點樣量優選在每個點100pL至100nL。優選在室溫至100攝氏度的溫度范圍內以及在時間1至24小時內進行溫育。
在微陣列用于DNA分析的例子中，盡管所使用的DNA片段樣品的量可以很低，但雜交時優化的條件要根據固定化于固體支持物上的探針多聚核苷酸的鏈長度和樣品種類來設定。對于基因表達的分析，優選進行長時間的雜交以使低量表達的基因也足以得到檢測。另一方面，對單個堿基變異的檢測，優選進行短時間的雜交。從而，在固體支持物上的探針多聚核苷酸以及具有和標記的核酸片段樣品中的探針互補的堿基序列的分子雜交形成雜交分子。
完成雜交后，優選使用表面活性劑溶液和緩沖溶液的混合溶液進行清洗以去除未反應的多聚核苷酸樣品。作為表面活性劑，優選使用十二烷基硫酸鈉。盡管作為緩沖液可以使用檸檬酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液，tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液，good緩沖液等，但優選使用檸檬酸鹽緩沖液。
然后，來自于在固體支持物上形成的雜交物的熒光信號通過檢測器檢測。使用熒光掃描裝置作為檢測器，其中熒光激光顯微鏡，冷卻式CCD照相機以及電腦連接在一起，而且可以對固體支持物上的熒光密度進行自動測量。還可以使用共聚焦或者非聚焦型激光代替CCD照相機。從而，獲得圖像數據。從所獲數據中，和固定化于固體支持物上的探針多聚核苷酸互補的目的多聚核苷酸可得以鑒別并且由此作出基因表達特征或者確定多聚核苷酸樣品的堿基序列。另外，利用數據分析軟件或者外部數據庫，可以對基因變異，多態性等進行更為復雜的分析。或者，通過供給多種分別用不同熒光物質標記的多聚核苷酸樣品并同時使用，可以在單個固體支持物上進行表達量的比較和定量檢測。
實施例通過實施例對本發明進行描述，但發明不僅限于此。
(實施例1)固體支持物的制備將25毫米(寬)×75毫米(長)×1毫米(厚)的玻璃載片浸入聚丙烯胺的水溶液以形成靜電層。然后，在含0.1摩爾每升1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺的條件下將聚丙烯酸作為多元羧酸和靜電層中的氨基基團縮合。然后，在由300毫升的0.1摩爾每升的磷酸鹽緩沖液(pH值為6)含0.1M的1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺-鹽酸和20mM的N-羥基琥珀酰亞胺的活化溶液中浸泡30分鐘將其活化。
(實施例2)點樣DNA固定化溶液分別制備含有以下(a)至(e)組成的Cy3標記的DNA水溶液并通過使用點樣設備(SPBI02000，日立軟件工程公司制造)點樣在由實施例1制備的固體支持物上。
(a)0.5微克每微升的Cy3熒光標記的DNA，1×溶液TTM(Takara生物公司制造)，10％甘油。
(b)0.5微克每微升的Cy3熒光標記的DNA，0.05摩爾每升的NaOH，10％乙二醇甘油。
(c)0.5微克每微升的Cy3熒光標記的DNA，10％異丙醇。
(d)0.5微克每微升的Cy3熒光標記的DNA，1×Arraylt(商標由TeleChem國際公司制造)。
(e)0.5微克每微升的Cy3熒光標記的DNA，，10％二甘醇。經點樣后，進行以下工序。
(1)將點樣DNA后的固體支持物置于設置為80攝氏度的烘箱中烘干1小時。
(2)將固體支持物置于固定器。
(3)在500毫升燒杯中裝入清洗緩沖液(2×SSC/0.2％SDS，室溫)，浸沒其中置放于固定器上的固體支持物，且在攪拌器攪動下清洗15分鐘。
(4)用同樣方式，裝入加熱到90攝氏度的清洗緩沖液(2×SSC/0.2％SDS，90攝氏度)，漫沒其中置放于固定器上的固體支持物，且在攪拌器攪動下清洗5分鐘。
(5)用無菌水漂洗固體支持物。
(6)固體支持物表面的溶液用離心機分離甩去。
(7)使用FLA8000(富士膠片公司制造)測量來自固定化于固體支持物上的Cy3熒光標記的DNA發出的熒光。
結果如
圖1所示。
從圖1所示的結果中，在點樣(a)至(d)組成的DNA溶液的情況下，點不規則并且點的形狀不一致，以至于點的大小發生擴大，點的形成不一致，點的形狀不為圓形，或是點出現空白形成炸面圈形。相反的，在將DNA溶解到含有二甘醇的水溶液中并將溶液點樣到固體支持物上的情況下，點的形狀為圓形并且可以點出沒有空白并且形狀統一毫無二致的點樣。另外，從熒光密度值的角度考慮，可以看到在根據本發明的方法進行點樣的情況下每個點的總信號強度高并且每像素的信號強度也高。從以上結果，已經發現通過根據本發明的固定化多聚核苷酸的方法多聚核苷酸牢固并一致地固定化在固體支持物上。
(實施例3)分別制備含有以下(f)至(i)組成的Cy3標記的DNA水溶液并通過使用點樣設備(SPBIO2000，日立軟件工程公司制造)點樣在由實施例1制備的固體支持物上。
(f)5微摩爾每升的Cy3熒光標記的DNA，20％聚乙二醇(分子量300)。
(g)5微摩爾每升的Cy3熒光標記的DNA，10％二甲亞砜，1％聚乙二醇(分子量300)。
(h)5微摩爾每升的Cy3熒光標記的DNA，1×溶液I(商標TaKaRa制造)。
(i)5微摩爾每升的Cy3熒光標記的DNA，3×SSC溶液(生理鹽溶液，濃縮3倍)。
經點樣后，進行以下工序。
(1)將點樣DNA后的固體支持物置于設置為80攝氏度的烘箱中烘干1小時。
(2)將固體支持物置于固定器。
(3)在500毫升燒杯中裝入清洗緩沖液(2×SSC/0.2％SDS，室溫)，浸沒其中置放于固定器上的固體支持物，且在攪拌器攪動下清洗15分鐘。
(4)用同樣方式，裝入加熱到90攝氏度的清洗緩沖液(2×SSC/0.2％SDS，90攝氏度)，浸沒其中置放于固定器上的固體支持物，且在攪拌器攪動下清洗5分鐘。
(5)用無菌水漂洗固體支持物。
(6)固體支持物表面的溶液用離心機甩去。
(7)使用FLA8000(富士膠片公司制造)測量來自固定化于固體支持物上的Cy3熒光標記的DNA發出的熒光。
結果如圖2所示。
從圖2所示的結果中，在點樣(h)和(i)組成的DNA溶液的情況下，點不規則并且點的形狀不一致，以至于點的大小發生擴大，點的形成不一致，點的形狀不為圓形，或是點出現空白形成炸面圈形。相反的，在將DNA溶解到含有20％或1％聚乙二醇(分子量為300)的水溶液中并將溶液點樣到固體支持物上的情況(f或g)下，可以觀察到點的形狀為圓形并且可以點出沒有空白并且形狀統一毫無二致的點樣。另外，從熒光密度值的角度考慮，可以看到在根據本發明的方法進行點樣的情況下每個點的總信號強度高并且每像素的信號強度也高。從以上結果，已經發現通過根據本發明的固定化多聚核苷酸的方法多聚核苷酸牢固并一致地固定化在固體支持物上。
產業化適用性根據本發明的方法，由于可以將多聚核苷酸點樣和固定化在固體支持物上，呈均一毫無二致的圓形點狀并且沒有空白，可以在通過微陣列對多聚核苷酸的檢測中獲得信號強度不分散的具有高可信度的數據。
權利要求
1.一種將含有聚醚或二元醇以及多聚核苷酸的溶液點在固體支持物上從而在固體支持物上固定化多聚核苷酸的方法。
2.根據權利要求1的方法，其中固體支持物具有能和多聚核苷酸共價鍵合的功能性基團。
3.根據權利要求2的方法，其中固體支持物具有用于靜電吸附基質上的多聚核苷酸的靜電層。
4.根據權利要求1至3之任何一項的方法，其中多聚核苷酸為DNA。
5.根據權利要求1至4之任何一項的方法，其中聚醚或者二元醇為二甘醇或者聚乙二醇。
6.固體支持物，其中通過根據權利要求1至5之任何一項的方法固定化有多聚核苷酸。
7.一種檢測目的多聚核苷酸的方法，包括將標記的多聚核苷酸和通過根據權利要求1至5之任何一項的方法固定化于固體支持物上的多聚核苷酸進行雜交，并且讀取來自于標記的多聚核苷酸的信號。
8.用于固定化多聚核苷酸的溶液，其特征在于含有聚醚或二元醇。
全文摘要
本發明提供一種通過將多聚核苷酸以一致且均勻的圓點形點樣在固體支持物上使多聚核苷酸在固體支持物上固定化的方法。也就是說，通過將同時含有多聚核苷酸以及聚醚或二元醇的溶液將多聚核苷酸在固體支持物上固定化的方法。
文檔編號C12N15/09GK1720453SQ20038010474
公開日2006年1月11日 申請日期2003年11月28日 優先權日2002年12月2日
發明者丹花通文, 岡村浩, 山野博文, 大場光芳, 龜井修一, 市原輝久 申請人:東洋鋼鈑株式會社