恢復細胞的甲基化狀態的制作方法

專利名稱：恢復細胞的甲基化狀態的制作方法
技術領域：
本發明涉及改變細胞特征以及通過評價DNA甲基化標記監控改變的方法。
背景技術：
編碼諸如動物(或植物)生物體所有基因產物的結構所需的所有信息都儲存在四個脫氧核苷酸腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)的其脫氧核糖核酸(DNA)的序列中。然而在DNA中存在第5種脫氧核苷酸，由一些C脫氧核苷酸復制后的甲基化(mC)作用產生，(Millar，D S.，Holiday，R.以及Grigg，W.2003，in；The Epigenome，eds，Beck，S以及Olek，A，WILEY VCH VerlagGmbH&Co Weinheim)。mC的一種功能是作為確定特定基因是否活化以及是否能轉錄從而產生基因產物的發育信號，(Li E.，1999，Nature Genetics，23，5-7；CoffignyH.等，1999，Cytogenetics and Cell Genetics，87，175-181)。通常，甲基化狀態顯示不同組織類型細胞基因的沉默，(Lunyak，V V.，2002，Science，298，1747-1752)并且未甲基化的狀態顯示基因激活，Moreau P.等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，100，1191-1196)。甲基化可以在完全成熟個體從受精卵開始的發育過程中在不同階段依照遺傳控制的模式改變配對的方式，(Monk M.，1995，Dev Genet.，17，188-197)。其發生的方式，原因以及如何控制這些過程還有待于發現。
在不同細胞類型的分化的成熟細胞中甲基化標記彼此不同。通常這些不同的甲基化標記在許多細胞分裂的過程中是相當穩定的但是在某種情況下可以被修飾。例如，DNA甲基化作用被認為是參與動物克隆的過程的一部分，其中來自成年人完全分化的細胞(諸如上皮細胞)的核被插入去核胚胎干細胞的細胞質中。上皮細胞核被改編程序以便利用胚胎干細胞細胞質的發育潛能。這個過程被認為是涉及上皮細胞核基因組的DNA甲基化作用標記的程序改編。通常認為上皮細胞核的異常后生程序改編是克隆低成功率的原因，(Pennisi，2001，Science，293，1064-1067；Dean W等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，13734-13738；Bourc′his，D等，Current Biology，11，1542-1546；Humphreys D等，2001，Science，293，95-97；Kang，Y-K.，2001，NatureGenetics，28，173-177；Mann MR W以及Bartolomei，M S.，2002，GenomeBiology，3，1003.1-1003.4)。基因組中正常甲基化標記的修飾對個體的健康常常是有害的并且對人類而言可以導致危急生命的疾病諸如癌癥，(Jones，P A，1996，Cancer Research，56，2463-2467；Paz等，2003，Human Molecular Genetics，12，2209-2219；Baylin等，2001，Human Molecular Genetics，10，687-692；Wei等，2003，Ann N Y AcadSciences 983，243-250；Toyota等，2003，Proc.Natl.Acad Sci.USA，100，7818-7823)，以及多種其它的問題諸如神經系統紊亂，脆性X綜合征等等，(Kriaucionis and Bird，2003，Human Molecular Genetics，12，R221-R227；Robertson，K D and Wolffe，A p，2000，Nature ReviewsGenetics，1，11-19；Esteller M，等，2002 Clinical Immunology，103，213-216；Feinberg，A P等，2002，Cancer Research，62，6784-6787)。這已經引起某些方法的臨床應用，所述方法已知修飾組織培養中細胞的甲基化，諸如用抑制甲基化酶5-轉甲基酶功能以及之后的DNA復制循環的5-氮胞苷或5氮脫氧胞嘧啶處理細胞，引起基因組中許多基因的普遍去甲基化，(Pietrobono R等，2002，Nucleic Acids Research，30，3278-3285)。雖然它在治療某些類型的癌癥中獲得了有限的成功，但是同時也具有毒副作用。
迄今為止尚未證實可以對活細胞基因組進行選擇性以及協調的去甲基化或甲基化特異性Cs。老年或者患病細胞以協調的方式程序改編甲基化狀態以便恢復正常或年輕人的甲基化標記的目標還僅僅是夢想。
當個體細胞老化或者暴露于各種類型的環境干擾時，它們的基因組可以被損傷，(Richardson B，2003，Ageing Research Reviews，2，245-261；Nakajima，T.等人2001，Int J Cancer，94，208-211；Issa，JP 2003，in；The Epigenome，eds，Beck，S以及Olek，A，WILEY-VCH Verlag GmbH&Co Weinheim)。通常，這種損傷是可修復的。然而，修復過程發生差錯引起細胞DNA中遺傳密碼的改變以及如果修飾限于四個編碼核苷酸A，G，T或者C的一個或者其他四個的改變引起突變。然而如果修飾包括基因控制或者調節區5′甲基胞嘧啶(5mc)核苷酸標記的改變，如果特定的5mc被C取代可以引起基因表達的活化，如果C被5mC取代基因表達沉默。DNA損傷試劑諸如某些藥物或者電離輻射可以在基因組中產生這種甲基胞嘧啶(mC)標記的修飾，(Nyce，JW，1997，Mutation Research，386，153-161)。此外，隨著時間的推移，細胞在DNA腫聚集這種甲基化/去甲基化改變，這種聚集對以有害方式改變正常細胞功能具有影響。這可以引起老化個體疾病程度的增強或者具有這種損傷細胞的個體可能傾向于患諸如各種癌癥的疾病。
本發明者已經設計了一種通用并且特異性定向程序改編細胞中的mC標記的方法，以便克服或者改變細胞中mC標記的聚集的異常甲基化改變的有害效應。

發明內容
第一方面，本發明提供了改變細胞特性或者狀態的方法，包括如下步驟用能夠改變細胞特性或者狀態的試劑處理第一細胞型；以及通過測定處理的細胞基因組中的甲基化標記確定處理的細胞改變的程度，其中給定的甲基化標記顯示處理細胞特性或者狀態的改變。
第二方面，本發明提供了改變細胞特性或狀態的方法，包括如下步驟
用來自具有期望特性或狀態的第二細胞型的提取，裂解物或細胞組分在適宜的條件下以及時間段下處理具有非期望的特性或狀態的第一細胞類型；以及通過測定細胞基因組內DNA甲基化標記確定處理細胞類型的改變程度，其中給定甲基化標記顯示細胞中期望的特性或狀態。
方法此外包括預處理第一細胞類型以使細胞能夠滲透高分子。
所述方法還包括培養或培育處理的細胞以獲得多拷貝的處理細胞。
第一細胞類型可以是任一人造血系統存在的細胞類型，(包括從出生到死后約48小時的細胞以及源自臍帶，胎盤的細胞或來自上述細胞類型衍生物的細胞系的細胞)或任一其它取自人體別處并且改編程序變成造血系統的細胞。
術語細胞基因組內DNA甲基化標記被定義為人基因組區域內具有對應于特異性細胞型的特性甲基化標記的一組胞嘧啶。可以通過確定一種或者多種與一或多種基因組DNA區域相關的胞嘧啶的特異性甲基化分布圖或模式確定給定細胞類型或細胞亞型中的標記。例如，標記可以是與DNA中一種或多種編碼區相關的胞嘧啶甲基化模式。這種標記可以診斷例如CD14+單核細胞，或CD34+干細胞，或諸如老人或年輕人干細胞的細胞類型內的徑跡。修飾的胞嘧啶的這種標記指示該細胞類型，不依賴于諸如細胞表面分子，細胞內蛋白質的組合，mRNA表達，代謝產物濃度，細胞的內含物，在不同微觀水平(光或電子顯微鏡)確定的形態特征或上述組合的細胞類型特征。
優選地，第一細胞類型選自來源于患老化相關病，或諸如癌癥的疾病，自身免疫病，(van Laar，J M and Tyndall，R，2003，Cancer Control，10，57-)，或諸如心肌梗死或者局部缺血的心血管問題(Perin E C等，2003，Circulation，107，2294-2302)的個體的細胞。更優選地，第一細胞類型為干細胞。然而應該理解可以處理其它細胞類型，諸如免疫以及造血系統的T細胞或單核細胞，(Abbas A K，2000，Cellular andMolecular Immunology，4 Edition，W B Saunders and Company；vonAdrian U H，等，2000，New Engl.J Med，343，1020-1034)，尤其是患病的細胞類型。
試劑可以是化學試劑，藥物，核酸，適體，抗體，抗原，插入核酸(INA)，肽核酸(PNA)，鎖核酸(LNA)，己糖醇核酸(HNA)，阿卓糖醇核酸(ANA)，環己基核酸(CNA)，寡核苷酸，修飾的寡核苷酸，單鏈DNA，RNA，蛋白，肽，其組合及其嵌合形式。
在優選的方案中，試劑是具有期望特性或狀態的第二細胞類型的提取物，裂解物或細胞組分。
第二細胞類型可以源自任一種類或者種類組合，其中細胞DNA甲基化分布圖是第一細胞類型改編程序的目的終點。優選地，第二細胞類型是來源于細胞類型類似于第一細胞類型的正常或健康的個體。更優選地，第二細胞類型是干細胞，(Orkin，S H，Zon，L I.，2002，NatureImmunology，3，323-328；Gage，F H.，and Verma，I M，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，11817-11818；Prockop D J，等，2003，Proc Natl.Acad.Sci.USA，100，11917-11923)。第二細胞類型可以來自于患由第一細胞類型不希望的特性引起的病癥或狀態的亞成熟或個體。應該理解，諸如骨髓干細胞，其它的干細胞以及上皮細胞的其它細胞類型也可以用作第二細胞類型。
在一個優選的方案中，第一細胞類型以及第二細胞類型是來自相同種類的相同細胞類型。在另一個優選的方案中，第一細胞類型以及第二細胞類型不是相同的細胞類型或者不是相同的種類。第二細胞類型的實例包括但不限于兩棲動物卵細胞或生殖細胞，用在人或其它哺乳動物第一型細胞上。
干細胞是指包括所有的成熟干細胞尤其是那些骨髓細胞系，(Verfaillie，CM.，2002，Nature Immunology，3，314-317；Orkin，S H.，Zon，L L，2002，Nature Immunology，3，323-328；Gage，F H.，和Verma，I M，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，11817-11818；Prockop D J，等，2003，Proc Natl.Acad.Sci.USA，100，11917-11923)。
如果需要，第一細胞類型可以通過任一合適的方法處理以使其能夠滲透大分子。處理包括但不限于電穿孔法，低溫熱休克或諸如鏈球菌溶血素O的酶。更優選地，治療使得細胞可以瞬間滲透。
可以通過本領域公知的任一合適方法獲得提取物，裂解物或細胞組分。實例包括但不限于Hakelien等描述的(2002)Nature Biotechnology20460-466。應該理解無細胞提取物可以進行進一步的處理或分餾以獲得來自第二細胞類型的組分或高分子，當在第一細胞類型中時將改變第一細胞類型基因組內的DNA甲基化標記。
暴露時間可以從幾分鐘到幾小時，取決于細胞類型，提取物，裂解物或細胞組分以及處理條件。可以在生理學溫度或任一其它不會引起細胞死亡的溫度下進行處理。
處理或改編程序的細胞可以在適于細胞生長以及分裂的條件下培養在本領域公知的任一合適的培養基或宿主中。本發明可以產生或選擇通過其在其基因組DNA中的甲基化標記證實的具有所期望特性的穩定處理或改編程序的細胞。
宿主可以是動物，脊椎動物或無脊椎動物。當細胞適當地培養在宿主中時，可以通過已知的方法從宿主取出，從而使細胞保持完整。在一個優選的方案中，宿主為選自牛，綿羊，馬，家禽或豬的家畜。
優選地，細胞基因組內的甲基化標記通過宿主內存在的可擴散因子進行確定。
甲基化標記優選地通過本領域已知的亞硫酸氫鹽處理分析或本申請人開發的分析進行確定。
在優選的方案中，例如從老齡細胞到年輕狀態的改編程序，成功處理的證明就是基因組的至少一部分或者全部的DNA甲基化標記被恢復成“正常的”年輕人的標記。也應該理解還可以僅僅一部分基因組DNA發生甲基化。
本發明的方法可用于提供第一細胞類型期望的特性或狀態使得一種細胞亞型的DNA甲基化標記特性可以轉換為另一個亞型的特性。例如，從一種淋巴細胞T細胞亞型到另一種淋巴細胞T細胞亞型，或老年造血干細胞可被修飾為年輕人造血干細胞。
或者，本發明的方法可用于提供混合種群內選擇的細胞群期望的特性或狀態。例如，如果具有混合種群的細胞，假定癌細胞以及正常細胞，細胞的混合種群可以通過本發明方法進行處理或靶向使得僅僅正常細胞被改變，響應以及分裂。通過確定處理細胞的DNA甲基化標記，可以證實標準電細胞已經適當地改變到具有預期效果。雖然未將癌細胞改變到正常，該方法可用于提高所期望的細胞類型的比例超高另一種的比例。
此外，在混合種群細胞中，諸如正常細胞以及癌細胞中，可被處理或改編程序進入休眠的或細胞凋亡或自殺狀態。在兩種細胞類型，或兩種細胞亞型或多種細胞型或多細胞型的通常情況下，可以處理或改編任一型或亞型的程序以提供優于任一其它細胞型的競爭優勢。
所述細胞可引起單一細胞類型的修飾甲基化標記的程序改編到相應相同細胞類型的正常細胞的標記(內部細胞類型改編程序)。
所述方法可用來程序改編老化細胞的甲基化標記到年輕人細胞的標記(Geiger，H以及Zant，G V.，2002，Nature Immunology，3，329-333)。例如，年長成熟干細胞的甲基化標記可被程序改編為年輕人干細胞的標記。患病干細胞基因組的甲基化標記可以被改變為正常干細胞，并且其它患病細胞，諸如免疫系統的T細胞的基因組的甲基化標記可被改變為非患病的T細胞。
干細胞可以為通過懷孕期間暴露于諸如化療藥物，或普遍的藥物的藥物，或損傷電磁輻射，或不充分供給諸如葉酸的標準化學試劑，DNA已經破壞的細胞，例如(Waterland R A and Jirtle，R L，2003，Molecular and Cellular Biology，23，5293-5300；Fenech M，2003；in；TheEpigenome，eds，Beck，S and Olek，A，WILEY-VCH Verlag GmbH&CoWeinheim)。
第三方面，本發明提供了根據本發明第一或第二方面的方法獲得的分離改變或程序改變的細胞。
優選地，處理或程序改編的細胞為干細胞處理或改編程序的細胞可被用作用于隨后處理的第二細胞類型，所述隨后處理將排除獲得來自進行一次處理的個體的新鮮的第二細胞類型的需要。處理或改編程序的細胞也可作為研究或其它醫學應用諸如細胞治療或移植的細胞系。
第四方面，本發明提供了處理患具有不希望的特性或狀態的具有引起的病癥的個體的方法，所述方法包括從個體獲得細胞；在至少一些細胞上實施本發明第一或第二方面的方法，以獲得具有期望特性或狀態的處理或改編程序的細胞；以及將處理或改編程序的細胞返回個體，其中細胞繁殖并且取代至少一些具有不希望的特性的細胞以便治療病癥。
細胞可以是異種細胞群或給定的細胞類型。細胞可以是不希望的類型諸如癌癥或期望的類型諸如正常細胞。
優選地，個體患諸如與老年或癌癥或自身免疫病相關的疾病。
在優選的方案中，細胞為干細胞。處理或改編程序的干細胞可因此在受試者體內分化從而有助于處理。應該理解諸如癌細胞或與其它疾病相關的其它細胞類型也可以被處理。
本發明尤其是可用于恢復具有由于DNA甲基化標記的不希望的特性或狀態的異常功能細胞的特性，所述DNA甲基化標記通過暴露于藥物或更多隨機事件由于老年相關過程已經修飾。
本發明的優點為，處理或改編程序后個體細胞返回(移植)給個體。因此，不應該存在排斥問題需要使用免疫抑制藥物或藥物治療。
所述方法根據受試者以及條件可用于個體或人格化治療。
已經可以瞬間滲透高分子的細胞可用相同表型的正常細胞的無細胞提取物，裂解物或細胞組分進行處理。這種細胞可以來源于處理的宿主個體或更優選地來源于從年輕個體細胞提取或獲得的提取物，裂解物或細胞組分，所述年輕個體沒有暴露于引起問題的相同的環境干擾(諸如老化)。
本發明也可通過只將第二細胞類型的提取物，裂解物或細胞組分用作獲得可使人細胞通過新的途徑從一種細胞類型到另一種細胞類型的分子特定組合的方式進行應用。總之，癌細胞高度非整倍體并且具有大概重排的基因組，因此一些基因高度擴增。此外，癌細胞不相應于任一已知的細胞類型因為每個癌細胞都可能是獨一無二的。
因此它們可提供從中提取分子，假定高水平特定蛋白的提取物來源。此外，因為癌細胞常常含有染色體易位，它們常常具有融合基因產生新的蛋白產物。這些新的蛋白產物可用于以比利用來自現存正常細胞類型的提取物更好的方式處理或程序改編細胞。
同樣地，許多生物體具有可用于從他們的細胞群獲得新蛋白質或RNAs的這些目的的重排基因組。因此小鼠，突變小鼠，轉基因小鼠，感染病毒的小鼠的株系都將具有獨特地適于提取物的細胞群體。
同樣大范圍的果蠅突變體，C.elegans突變體，酵母突變體，E.coli突變體等等以及它們的轉基因衍生物全部可提供在提取物中的新的基因產物，融合基因，獲得功能突變的諸如新變體，新形式的小RNAs等等。這種不但來自自然進化譜而且來自龐大的突變菌株庫的新蛋白質和RNAs的有效性，可通過本發明被利用。
在第五方面，本發明提供了根據治療方法的第三方面的分離改變細胞的應用。
優選地，療法是細胞治療。
在第六個方面，本發明根據第三個方面的用于療法的藥物制備提供了分離改變細胞的應用。
在說明書全文中，除非上下文另有要求，術語“comprise”，或變化的形式諸如“comprises”或“comprising”，應被理解為包含所述元件的內含物，總體或步驟，或元件組，總體或步驟，而不排除任意其它的元件，總體或步驟，或元件組，總體或步驟。
包含在本申請說明書論述中的任一文獻，作用，原料，裝置，商品等等僅僅是為了提供本發明背景的目的。其不應因為其在此申請的各權利要求的優先權日期之前已存在于澳大利亞而被認為任意或所有的這些物質構成現有技術基礎的一部分或是與本發明有關的公知常識。
為了更清楚地理解本發明，以下參考下列的圖和實施例描述優選的方案。
附圖的簡要描述

圖1顯示了分離自成人外周血液干細胞的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳分離，以便在Affymetrix微陣列平臺分析之前測定RNA的高的質量。泳道M表示分子量標記。泳道SE488和泳道SE489表示來自兩個個體的。兩個顯著的條帶表示18S和28S核糖體RNA。
圖2表示進一步加工之前RNeasy純化樣品來測定RNA質量的瓊脂糖凝膠電泳分離。泳道M表示分子量標記。泳道SE488表示RNA來自一個來自兩個個體的混合物。兩個顯著的條帶表示18S和28S核糖體RNA。結果與高質量的RNA一致。
圖3表示純化cRNA的瓊脂糖凝膠電泳分離。泳道M表示分子量標記。泳道SE488表示cRNA來自一個來自兩個個體的混合物(SE-488)。
圖4表明通過瓊脂糖凝膠電泳證實了cRNA的片段化。泳道M表示分子量標記。泳道SE488表明片段化的cRNA來自一個兩個個體的混合物。
圖5顯示利用Atlas 8K微陣列對年輕干細胞與老的干細胞的表達分布圖進行的微陣列分析。每個陣列上的探針用于與來自人基因的轉錄本雜交且每個探針被點樣兩次，因此為雙聯體斑點。來自細胞群體的放射性-標記的RNA雜交于陣列且雙聯體斑點的信號強度表示這些特定細胞類型中的特定基因的表達水平。
圖6表示來自人基因組區域的DNA序列，其停泊七個稱為ABCB1，IRF7，ESR1B，GZMA，CDX1，MAGEA2和THY1的選擇位點且通過由改編程序之前和改編程序之后的細胞提取的DNA的亞硫酸氫鹽修飾后進行DNA測序測定它們的甲基化狀況。第一細胞類型(待處理或改編程序的細胞)表示任一處理之前的細胞類型。第二細胞類型表示第一細胞類型需要轉變為的目的終點細胞。“Reprog”，表示來自已用第二細胞類型的提取物處理的細胞的基因組DNA的甲基化狀況。DNA水平的變化是處理的結果。
本發明的實施方式方法細胞甲基化標記的測定DNA的亞硫酸氫鹽處理2μg的DNA，其如果期望可用合適的限制性內切酶預降解，2μl(1/10體積)的3M NaOH(6g在50ml水中，新近制備)添加到20μl的終體積中。混合物在37℃溫育15分鐘。在高于室溫的溫度下溫育可用于增加變性作用的效率。
溫育之后，連續添加208μl的2M焦亞硫酸鈉(7.6g在具有416ml10N NaOH的20ml水中；BDH AnalaR#10356.4D；新近制備)以及12μl的10mM對苯二酚(0.055g在50ml水中，BDH#103122E；新近制備)。樣品用200μl的礦物油覆蓋。然后55℃溫育樣品過夜。任選地，樣品可在熱循環儀中進行如下循環溫育約4小時或如下過夜步驟1，PCR儀中55℃/2hr；步驟2，95℃/2分鐘。步驟1可在從約37℃至約90℃的任一溫度下進行且在5分鐘到8小時的時間范圍內變化。步驟2可在從約70℃至約99℃的任意溫度下進行且在約1秒鐘至60分鐘或更長的時間范圍內變化。
用焦亞硫酸鈉處理之后，除去油，并添加1μl的tRNA(20mg/ml)或2μl糖原，如果DNA濃度較低。這些添加的成分是任選的且可用于增加通過與靶向DNA共-沉淀獲得的DNA的產量，尤其當DNA以低濃度存在時。
如下進行清除異丙醇的處理將800μl的水添加到樣品中，混合然后添加1ml的異丙醇。樣品再次混合并在-20℃維持至少5分鐘。在離心機中旋轉10-15分鐘并用80％ETOH，沖洗顆粒兩次，各渦流一次。此洗滌處理除去任意的與核酸形成沉淀的殘留的鹽。
顆粒進行干燥然后再懸浮在合適體積諸如50μl的T/E(10mM Tris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5中。緩沖液在pH 10.5處已被認為是尤其有效的。樣品在37℃至95℃下溫育1分鐘至96hr，根據需要懸浮核酸。
用1μl的處理的DNA進行PCR擴增。對含有1μl亞硫酸氫鹽-處理的基因組DNA的25μl反應混合物進行PCR擴增，利用Promega PCR主要混合物，6ng/μl的每一引物。1μl的1st循環擴增產物被轉入含有引物的第二循環擴增反應混合物中。在Clark等.Nucleic Acids Res.1994Aug 11；22(15)2990-7中描述的條件下利用ThermoHybaid PX2熱循環儀擴增PCR產物的樣品。
在每50μl瓊脂糖含有1滴溴化乙錠(CLP#5450)的1％TAE中制備瓊脂糖凝膠(2％)。將5μl的PCR產物與1μl的5X瓊脂糖裝載緩沖液混合并在X1TAE中利用水下水平的電泳槽以125mA進行電泳。標記是低的100-1000bp類型。
凝膠在UV照射下利用Kodak UVldoc EDAS 290系統顯像。
處理或改編程序方法用于制備提取物的第二細胞類型即Jurkat T-細胞系(1×滾瓶1,700cm2)待處理或改編程序的第一細胞類型即293T成纖維細胞(改編程序之前已分開的2×T75瓶)。
細胞DMEM生長培養基胰蛋白酶/EDTA(0.25％)細胞裂解緩沖液即50mM NaCl，5mM MgCl2，20mM Hepes pH8.2的堿溶液可冷凍貯存為50ml等分。隨后的緩沖液添加成分為PMSF(100mM原料的ETOH溶液)，DTT(1M原料)和蛋白酶抑制劑混合物，等分試樣并冷凍(Sigma P8340)。
鏈球菌溶血素O(Sigma S0149)原料等分試樣并以65單位/l冷凍在H2O中(冷凍原料在1個月后應丟棄)。
HBSS(Hanks平衡鹽溶液，無-Ca2+)1×500ml瓶的PBS(無-Ca2+/Mg2+)200mM CaCl2ATP(200mM原料的水溶液)GTP(10mM原料的水溶液)磷酸肌酸(2M原料的水溶液)肌酸激酶(5mg/ml原料的水溶液)核苷酸(NTP)混合物(ATP，GTP，CTP，UTP；各100mM)葡聚糖，德克薩斯紅(分子探針D-1830)25mg/ml的水溶液。
具有3mm觸點的探針超聲波儀細胞培養多-孔平皿(48孔)一次性的50ml，15ml，1.5ml和0.2ml試管(無菌的)4℃離心*用swing-out buckets對1.5ml試管離心*通過15000g自旋對1.5ml試管進行離心*以800g對15ml和50ml試管離心載玻片和蓋玻片Cell Chamber玻片37℃水浴標準共焦顯微鏡具有綠熒光過濾器的落射熒光(Epifluorescence)顯微鏡提取物的制備I.收集第二細胞類型Jurkat T-細胞系并轉入50ml試管中，4℃下800g旋轉(～1200rpm)10分鐘II.在冷的1×PBS中沖洗細胞2次，4℃下800g旋轉10分鐘。在第一次沖洗過程中將細胞收集到一個具有刻度線的15ml試管中。當進行第二次沖洗時取出一個小的等分試樣用于細胞計數。
III.在10ml添加下述成分的冰冷細胞溶解緩沖液中沖洗細胞顆粒1×1μl的1M DTT/ml的緩沖液和10μl的100M PMSF/ml的緩沖液。
IV.4℃下800g旋轉10分鐘。添加裂解緩沖液后保持在冰上是很重要的。
V.估計細胞顆粒的體積并將顆粒再懸浮在稍微小于1×體積的具有DTT，PMSF和蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液(10μl混合物/ml緩沖液)中。
*注意細胞懸液非常濃；力求不引入氣泡。
利用移液管來觀察是否最終的體積為2x細胞顆粒以及是否不用加入更多的緩沖液。不要稀釋細胞顆粒超過2x的最初顆粒體積。
VI.保持在冰上45分鐘使細胞溶脹。
VII.將細胞等分200μl到1.5ml試管中。超聲波處理直到所有的細胞和細胞核裂解(在顯微鏡下檢查)。35％功率，0,4s間隔，大約1分15秒每試管。(針對每一細胞類型的超聲波條件已被優化)VIII.將裂解物集中到1.5ml試管中，在4℃15000g旋轉15分鐘。
IX.去除上層清液(提取物)以及保留3×20μl等分試樣的提取物用于測定蛋白濃度，pH和毒性。將殘余物等分到200μl-PCR管中，使其為100μl提取物/試管。
X.利用提取物直接或快速在液氮或干冰和ETOH中冷凍并-80℃貯存。
細胞處理或改編程序I.收集目的293T成纖維細胞(第一細胞類型)并在冷1×PBS中沖洗2x。沖洗過程中保持細胞冷卻。在第二次沖洗過程中取出一等分試樣進行計數。測定細胞數量。
II.在冷HBSS中沖洗細胞1x。
III.再懸浮細胞在1.5ml管中產生用于各反應的20,000細胞/100μl HBSS的濃度。由于在5x的各反應中的細胞數很低，因此當混合到最終的平皿孔中時每孔將有100,000個細胞。這個也用作對照。
IV.4℃下在swing-out bucket旋轉器中1200rpm旋轉5分鐘V.移去上清液(注意不要除去細胞)VI.向各管中添加15.5μl HBSS。
VII.制備SLO作用溶液解凍原料的等分試樣(65.8單位/μl)，保持在冰上。在HBSS中1∶100稀釋。一直保持在冰上VIII.將管放置在37℃的水浴中。添加SLO之前預熱樣品幾分鐘。
IX.添加4.5μl SLO/管(1∶100稀釋，產生2.9單位的最終SLO濃度)，輕彈管來混合SLO與細胞懸浮液。
X.37℃溫育50分鐘，XI.制備用于改編程序的提取物
→通過以1∶1∶1∶1的比率混合ATP，GTP，肌氨酸激酶，磷酸肌酸原料來制備ATP生成系統(原料可維持在-20℃)。
25mM可被冷凍的原料，一旦解凍繼續維持在冰上，被以1∶1∶1∶1的比例混合來產生100mM NTPs。
XII.對各100μl的提取物來說需要添加51的上述新近混合的ATP生成系統和4μl的NTP混合物。保持提取物在冰上直到使用。
XIII.放置管(具有細胞在SLO中)在冰上并添加200μl的冰冷HBSS到各管中(來終止SLO反應)。在swing-out bucket旋轉器中4℃1200rpm旋轉5分鐘。將管放回在冰上。
XIV.除去上層清液。注意不要移去細胞。
XV.添加20μl提取混合物/管的細胞(或20μlHBSS與德克薩斯紅葡聚糖來用于吸收調節)XVI.輕彈管進行混合。在37℃(水浴)溫育1小時。轉移管到管架(室溫)并添加具有2mM CaCl2的培養基。
XVII.轉移細胞到多孔細胞培養平皿中，收集5個反應到一個孔中。
XVIII.在CO2培養箱中溫育細胞2小時。
XIX.用常規的培養基替換CaCl2培養基并放置過夜。
成年個體的表達分布圖微陣列分布方法；幼年和成年個體干細胞的表達分布圖利用標準的G-CSF規程將成人CD34+干細胞輸入到外圍血流中(Filgrastim；de al Rubia等，2002，Transfusion，42，4-9)，廣泛應用的，(Anderlini P等.，1997，Transfusion，37，507-512；Kang，E M.，2002，Blood，99，850-855)，通過標準的白細胞分離法收集CD34+細胞以及通過標準的磁珠技術分離CD34+干細胞(健康的第一細胞類型)，(Dynal)。冷凍細胞直到使用并通過標準方法提取RNA。RNA被適當地轉化，標記，與微振列平臺雜交以及通過適當的激光掃描或通過放射性檢測方法推斷RNA的表達水平。產生數據的Bioinformatic分析提供了基因組的相對基因活性的瞬態圖，用Affymetrix平臺，U133A在平臺上具有超過20，000個充分注釋的人基因，(或部分基因)。
利用Atlas塑料8K陣列規程對人CD34+造血干細胞進行微振列分析純化取自49歲男性患者的CD34+造血干細胞純化來自全血的CD34+細胞樣品獲自悉尼皇家北岸醫院(Royal North Shore Hospital)的遭受重度白血病的患者。獲取樣品前得到了道德委員會的批準。利用FicollPaque plus(Amersham Biosciences#17-1440-03；Piscataway NJ)按照生產商的說明收集白血球。分別按照生產商的說明由白血球群體CD34祖細胞選擇系統(Dynal#113.01)分離CD34+細胞。
Atlas RNA提取方法I.將1ml的Trizol直接添加到磁珠/細胞復合物中并將樣品-70℃儲存。
II.將樣品由-70℃取出并在冰上解凍。
III.充分混合樣品并在室溫下放置5分鐘來分離核蛋白復合物。
IV.將0.5ml的磁珠/細胞移至干凈的無RNase的1.5ml離心管中并將管置于磁性分離機上60秒以及將無磁珠的上清液移至干凈的管中。
V.然后在4℃下12000Xg旋轉10分鐘來除去高分子量的DNA及其它雜質。
VI.將上清液移至干凈的管中并加入100μl的100％氯仿，手工強烈混合樣品15秒然后室溫下溫育2-3分鐘。
VII.然后在4℃12000Xg旋轉樣品10分鐘來分離相。
VIII.上層水相被移至干凈的管中確保移液管末端遠離接觸面并添加1μ1的20mg/ml糖原以及渦流樣品。
IX.添加等體積的100％(0.25ml)至渦流的管中然后室溫放置10分鐘。
X.然后在4℃12,000xg旋轉樣品10分鐘使RNA顆粒化。
XI.除去上清液并用0.75ml的80％乙醇沖洗以除去DNA合成反應的抑制劑，簡單地渦流然后在4℃下7,500Xg旋轉5分鐘來使RNA顆粒化。
XII.重復步驟11一次。
XIII.顆粒然后在微離心機中旋轉10秒除去殘留的乙醇且將顆粒立即再懸浮在25μl的無RNase的水中。
注意，如果顆粒變干則很難再懸浮RNA且260/280比率將小于1.6。
XIV.然后記錄OD 260/280/310。
cDNA合成I.制備下述的試劑用于的0.5ml無RNase薄壁管中的各cDNA合成反應。
添加的μlCD34+細胞 T-細胞 對照RNARNA 3.5(200ng)1(243ng)1(1000ng)cDNA引物(10μM) 1 1 1SMART Oligo(10μM)1 1 1去離子水2.5 2.5II.混合內容物并在微離心機中短暫地旋轉。
III.樣品在70℃溫育8分鐘使RNA變性。
IV.當RNA被變性時，制備下述的主要混合物添加的μl每反應 3.5反應5x第一鏈緩沖液2 7DTT(20mM) 1 3.550x dNTP混合物1 3.5總體積4μl14μlV.從PCR儀中取出管并在冰上冷卻2分鐘然后短暫地旋轉收集內容物。
Vl.然后在42℃下溫育樣品持續2分鐘。
VII.每反應中添加0.5μl的Powerscript逆轉錄酶(1.75μl)并通過移液管充分混合主要的混合物。
VIII.4.5μl的完全主要混合物被添加到各樣品和對照管中且然后42℃溫育樣品60分鐘然后轉至冰上。
IX.40μl的10mM Tris/1mM EDTA pH7.6被添加給各樣品。
X.72℃加熱管7分鐘然后-70℃貯存直到使用。
通過長距離PCR進行Atlas cDNA擴增注意應確定各樣品的循環數以確保反應不會停滯不前。針對各樣品一式三份(2個試驗和1個對照)進行擴增反應且對照胎盤(placenta)為一式兩份(1個試驗和1個對照)。
I.熱循環儀預熱到95℃。
II.在0.5ml薄壁管中，將5μl的第一鏈cDNA與37μl的去離子水混合。
III.制備下列主要的混合物每rxn 8.5rxn10x PCR緩沖液 5μl42.5μl50X dNTP混合物(10mM) 1μl8.5μlPCR引物(10μM) 1μl8.5μl優勢聚合酶 1μl8.5μlPCR混合物總體積8μl68μlIV.渦流主要混合物然后在微離心機中短暫地旋轉。
V.8μl的混合物添加到合適的管中并通過移液管充分混合樣品。
VI.用55μl的礦物油覆蓋管。
VII.開始如下的熱循環Hybaid PCR儀95℃1分鐘x循95℃15秒65℃30秒68℃3分鐘VIII.所有的管如上所述進行15個循環的PCR然后除去試驗樣品(即x2CD34+/x2T-細胞/x1對照)且將這些管置于冰上。
IX.10μl的各對照樣品移至干凈的管中且殘余混合物如上所述進行另外的三個PCR循環。
X.步驟9重復另外的兩次來產生最終24個循環的PCR。
XI.在1.2％瓊脂糖凝膠上利用1kb DNA大小的標記分析這些樣品。
Atlas旋轉柱純化PCR產物注意利用Nucleospin系統而不是Chroma旋轉系統。
I.28ml的95％乙醇被添加到緩沖液NT3中。
II.用50μl的TE緩沖液pH 7.5調整PCR產物的體積為100μl并通過移液管充分混合樣品。
III.400μl的NT2緩沖液被添加到樣品并充分混合樣品。
IV.將Nucleospin柱置入2μl收集管中并將樣品吸取到過濾器上。然后14,000rpm離心樣品1分鐘并丟棄收集管。
V.將柱放置在新收集管中并添加500μl的緩沖液NT3。然后14,000rpm離心樣品1分鐘并丟棄收集管。
VI.重復步驟5兩次。
VII.將柱置入新的收集管中且然后14,000rpm離心樣品1分鐘以除去殘留的乙醇。
VIII.將柱置入干凈的1.5ml離心管中并直接添加50μl的緩沖液NE到過濾器上(注意確保移液管不接觸過濾器表面)。
IX.浸潤樣品2分鐘然后14,000rpm離心1分鐘來洗脫純化的PCR片段。
X.測定OD260/280/310。
Atlas旋轉柱純化T-細胞PCR產物#2注意重復純化以增加PCR產物的產率。
1.用50μl的pH 7.5TE緩沖液將PCR產物的體積調整到100μl并通過移液管充分混合混合物。
II.將400μl的NT2緩沖液添加到樣品中并充分混合混合物。
III.將Nucleospin柱放置在2ml收集管中并將樣品移取到過濾器上。然后14,000rpm離心樣品1分鐘并丟棄收集管。
IV.將柱置入新的收集管中并添加NT3緩沖液500μl。然后14,000rpm離心樣品1分鐘并丟棄收集管。
V.重復步驟IV額外的兩次。
VI.將柱置入新的收集管中且然后14,000rpm離心樣品1分鐘以除去殘留的乙醇。
VII.將柱置入干凈的1.5ml離心管中并將50μl的緩沖液NE直接地添加到過濾器中(注意確保移液管不接觸過濾器表面)。
VIII.浸潤樣品2分鐘然后14,000rpm離心1分鐘來洗脫純化的PCR片段。
IX.測定OD260/280/310。
Atlas SMART cDNA探針標記I.需要標記500ng的各樣品以產生合適的探針。注意探針的最終特異性活性應為107。
II.預熱熱循環儀至97℃。
III.在單獨的0.5ml薄壁管中添加1μl的隨機引物混合物以及適當體積的PCR產物和去離子水(參見下文)。
CD34+T-細胞 對照純化的PCR產物23μl18.9μl 11.9μl去離子水 10μl14.4μl 21.1μlIV.樣品在97℃變性8分鐘V.當樣品變性時制備下列的主要混合物
CD34+/T-細胞 對照10x標記緩沖液 11μl10x標記緩沖液 5.5μl用于dA的10x dNTP混合物11μl用于dA的10x dNTP混合物 5.5μl33P-dATP 11μl33P-dATP 5.5μl混合物總體積 33μl16.5μlVI.變性后通過移液管和短暫地旋轉管充分混合樣品。
Vll.將熱循環儀溫度降至50℃，50℃溫育管3分鐘。
VIII.向每一反應的主要混合物中添加1μl的克列諾酶并通過移液管充分混合。
IX.溫育后將16μl的主要混合物添加到合適的管中，混合內容物并將樣品立即放回熱循環儀。
X.50℃下溫育管30分鐘并通過添加2μl的0.5M EDTA終止反應。
Atlas旋轉柱純化33P-dATP PCR產物1.將NT2緩沖液(350μl的緩沖液)添加到終體積為400μl的樣品中并充分混合樣品。
II.將Nucleospin柱置入2ml收集管中并將樣品移取到過濾器上。然后14,000rpm離心樣品1分鐘并丟棄收集管。
III.將柱置入新的收集管中并添加350μl的緩沖液NT3。然后14,000rpm離心樣品1分鐘并丟棄收集管。
IV.重復步驟3額外的兩次。
V.將柱置入干凈的1.5ml離心管中并將100μl的NE緩沖液直接添加到過濾器上(注意確保移液管不接觸過濾器表面)。
VI.浸潤樣品2分鐘，然后14,000rpm離心1分鐘來洗脫純化的PCR片段。
VII.測定純化探針的CPM。
VIII.將2μl的純化物質添加到5ml的閃爍體上并記錄32P通道上的CPM。
Atlas陣列雜交I.雜交瓶裝有80％的去離子水并加熱至60℃。同時在50ml的falcon管中將2×25ml的plastichyb升溫至60℃。
II.將陣列置于預升溫的溫水中，且使其印刷側面(非-發光)向里。
III.將10ml的plastichyb(x2)置于新的容器中。50μl的20xSSC與50μl的劇烈阻斷試劑結合并95℃加熱5分鐘然后在冰上維持兩分鐘急速冷卻。此溶液然后與plastichyb結合。
IV.排干陣列中的水并添加plastichyb以及在60℃預雜交陣列30分鐘。
V.50μl的20xSSC與50μl的劇烈阻斷試劑結合并添加于純化的探針。煮沸探針10分鐘并在冰上冷卻2分鐘。
VI.上述溶液與剩余的2×15ml的plastichyb結合，徹底地混合溶液，丟棄prehyb并將雜交溶液添加到合適的瓶中。
VII.陣列在60℃雜交過夜，確保它們水平的恒定。
Atlas沖洗和曝光I.雜交溶液被丟棄在50ml falcon管中并用預加溫的(60℃)高鹽緩沖液(2xSSC/0.1xSDS)裝滿80％的雜交瓶以及在58℃溫育樣品5分鐘來除去殘留的輻射。
II.除去沖洗緩沖液并重復步驟I。
III.用低鹽沖洗緩沖液(0.1xSSC/0.1％SDS)裝滿80％的瓶并在58℃溫育陣列5分鐘。
IV.重復步驟III一次。
V.雜交恒溫箱溫度降低至30℃并用室溫的低鹽緩沖液再次裝滿80％的瓶并溫育另外的5分鐘。
VI.然后將陣列由雜交瓶移至500ml的裝有低鹽沖洗緩沖液的燒杯中。
VII.陣列在燒杯通過浸洗沖洗若干次然后最后非常緩慢地移出確保沒有大的液滴粘附在陣列表面。
VIII.徹底風干陣列，向內部粘入熒光體盒并將篩子直接與陣列接觸。陣列在第1天和第7天暴光。
來自不同年齡個體的干細胞的Affymetrix微陣列分析用Affymetrix基因芯片陣列進行基因-表達分析獲得的支持本發明的數據包括來自在獨立微陣列平臺上進行基因表達分析的。利用Affymetrix基因芯片技術進行基因表達分析。具體的信息，參見Affymetrix網頁(www.affymetrix.com)。
RNA分離和純化方法，cRNA合成和片段化，雜交，染色，陣列掃描的所有步驟-已利用設備和Affymetrix建議的規程來進行。數據分析的軟件為Microarray Suite 5.0(Affymetrix)。關于統計算法的詳細信息可在Affymetrix網頁中找到(www.affymetrix.com)。
Affymetrix樣品處理由包含在RNAlater中的細胞樣品開始進行基因-表達分析。這些樣品的內部處理編碼顯示在下述表1中。
表1

用TRlzol試劑(Life Technologies)按照生產商的說明書分離總RNA。將各樣品再懸浮在22μl的無RNase的水中。通過瓊脂糖凝膠電泳分析級分(圖1)。
純化之前混合二樣品且混合物稱為SE488。
用RNeasy試劑盒(Quiagen)進行純化。RNA在35μl的無RNase的水中洗脫，并在快速真空儀上濃縮至終體積為12μl。通過光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢驗純化RNA的量和質量(圖2)。
生物素標記cRNA的Affymetrix合成由純化的總RNA開始，利用SuperScript選擇系統試劑盒(Teehnologies)按照Affymetrix表達分析技術操作指南來合成cDNA。通過Enzo BioArray HighYield RNA Transcript Labeling(T7)試劑盒由cDNA合成cRNA a用Affymetrix GeneChip樣品Cleanup Moduke試劑盒純化cRNA并在22μl的無RNase水中洗脫(圖3和表2)。
純化cRNA的濃度和純度。高純度RNA應具有＞1.9的OD值。因此來自集中樣本的RNA進一步處理具有充分的純度。
表2

純化的cRNA在陣列上雜交之前被片段化(圖4)。
Affymetrix U133A陣列的雜交和掃描-對照的分析用于評價雜交混合物質量的兩個基本參數峰值對照的存在，和管家基因的3′/5′比率。
峰值對照為包含在雜交混合物中的對照寡核苷酸。通過掃描檢測這些寡核苷酸表明雜交，沖洗，染色和掃描步驟正確地進行。所使用的峰值對照為BioB，BioC，BioD和Cre。BioB為在混合物中具有最低分子數的峰值對照，此特點使其成為評價試驗敏感性的優選對照。
管家對照為在所有組織以及在任何情況下組成型表達的基因的探針。陣列上的probes被設計與管家基因的3′，中間和5′區域雜交。3′/5′比率是合成的cRNA的完整性的指標，其反過來反映最初RNA的完整性。因此，3′/5′比率為1是指起始RNA和合成cRNA的總完整性。此比率變化取決于來源組織和RNA處理的條件。Affymetrix建議使用具有3′/5′比率＜3的RNA制備物。
管家基因的組成型表達因組織以及實驗條件的不同而變化，如文獻中所反映的。
Affymetrix強烈地建議GAPDH作為正確的管家基因。
表3.來自樣品SE488的GAPDH3′/5′比率和BioB峰值對照值。

選擇典型的基因用于甲基化分析。應注意到現在沒有高通量的技術來直接地測定全部人基因組的基因組-廣泛的甲基化狀況，(此方法處于初期；Adorjan等，2002，Nucleic Acids Research，30，e21；Yan PS等，2000，Clinical Cancer Research，6，1432-1438)；Gitan RS等，2001，Genome Research，12，158-164)，且因此原因我們在RNA表達分布圖的基礎上對老化基因組應用了最初的過濾。
來自Atlas和Affymetrix基因表達分布圖的組合數據分析利用Affymetrix和Atlas平臺進行微陣列分析測定老化細胞中上調和下調的基因的實例。這些表達分布圖提供了在年輕和老化干細胞群體中活性的基因組-廣泛的分析因此產生了老化過程中重要基因的概念。這樣的基因然后進行甲基化分析來證實老化細胞的最優改編程序-恢復為年輕的表現型(參見圖6的如何進行此種分析的詳述)。
老化過程中活性顯著改變的一些基因顯示在表4中。
利用Affymetrix和Atlas平臺進行微陣列分析測定的老化細胞中上調和下調基因的實例顯示在表4中。這些表達分布圖提供了在年輕和老化干細胞群體中mRNA活性基因組-廣泛分析并提供了在老化過程中變化的重要基因的測定。然后選擇這樣的基因區域用于DNA甲基化分析且隨后用于證實老化細胞的改編程序恢復為年輕表現型。
表4

結果改編程序本領域的技術人員應能理解處理或改編程序以及隨后特定成人干細胞的移植需要滿足嚴格的倫理原則和不同國家的廣泛法律的全面要求。此外，技術上的阻礙為成人造血干細胞離體細胞分裂較少。干細胞需要活體內移植到相同的個體，其中它們靶向骨髓并進行細胞分裂。因此假定成年人干細胞改編程序的DNA甲基化狀態的在大量的活體內細胞分裂過程中穩定地遺傳的原則性證據，具有大量來自倫理和技術上的目前難以克服的障礙。我們因此提供了不同人系統中穩定的遺傳甲基化變化的原則性證據，所述人系統利用其中成纖維細胞甲基化狀態被改編程序為免疫系統T細胞的甲基化狀態的細胞。
選擇老化過程中改變的基因為測定老化過程中DNA甲基化特征變化的基因，我們根據表達分布圖的變化建立了最初的分子過濾器，(基因的RNA表達水平)。因為，通常，增加甲基化導致基因活性的關閉，而脫甲基化導致基因活性的增加，我們已進行研究來發現其活性在老化過程中變化的基因。對本領域的技術人員而言，我們利用來自不同老化個體的流動外周血液中的成人CD34+干細胞，從他們的早20歲到它們的晚60歲變化，(de la Rubia，J.，等，2002，Transfusion 42，4-9)。我們利用商業的Affymetrix微陣列，(www.affymetrix.com)，以及其它的商業平臺，Atlas，用于測定青年和老年個體之間改變的RNA表達分布圖。我們選擇了其表達水平在老化過程中下調或上調的基因。此種選擇后，可測定合適的調控或基因對照區域的甲基化狀況。
第一細胞類型(成纖維細胞)和第二細胞類型(T細胞)采取具有特定的DNA甲基化標記基因組的成纖維細胞并且將細胞暴露于來源于細胞系的T細胞或來自健康個體外圍血液的T細胞一段時間。將細胞轉移到新鮮培養基中并且允許細胞進行多次細胞分裂。監控改編程序細胞的變化的表型狀況，其中改編程序細胞分子修飾由成纖維細胞的變化為T細胞的，(細胞表面分子提供了對表型狀況的操作)。由細胞分離基因組DNA并測定基因組的甲基化標記，將其與第一細胞類型和第二細胞類型基因組的進行比較。
血液來源的干細胞得到合適的倫理許可后，對于干細胞改編程序應用類似的操作。
從老年的第一細胞類型或其已經用DNA損傷劑處理的第一細胞類型采集血液來源的骨髓干細胞。這些干細胞已顯示出在他們的基因組中具有破壞的甲基胞嘧啶(MC)標記。將細胞暴露于獲自年輕健康的第二細胞類型的干細胞樣品的無細胞提取物一段時間(幾分鐘到幾小時)，然后轉移暴露的細胞到新鮮培養基中并在將處理的干細胞轉移回具有損傷干細胞的宿主之前溫育細胞一段時間。
第一細胞類型表示任一改編程序治療之前的細胞類型。第二細胞類型表示第一細胞類型需要移向的目的細胞。“改編程序的”表示已經用來自第二細胞類型的裂解物，提取物或化合物處理的細胞，且其目前處于沿著由第一細胞類型到第二細胞類型的特征的徑跡的某處。
細胞類型。在人類有至少300個細胞類型來自在前的受精作用且根據在光學顯微鏡下的形態被傳統定義。因此造血系統的成員，諸如嗜堿性白細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，巨核細胞和血小板彼此之間或與內皮細胞，皮膚細胞，和神經系統細胞諸如神經元和膠質細胞之間很容易被區分。細胞類型的分子分類學顯示識別細胞表面蛋白質和/或細胞內部的蛋白質的抗體允許在細胞類型之間被精細地區別。利用微陣列-型技術的基因表達分布圖，(其測定細胞內mRNA分子的數量和類型)，還可以用于產生細胞類型之間的區別。
由一種細胞類型到另一種的改編程序。細胞類型是可利用適當的方法互相轉換的，(第一細胞類型可被改編程序為第二細胞類型)。在現有技術中所有這些改編程序的不清楚之處在于是否可利用的細胞標記是充分穩定的以及足以顯示是否改編程序細胞具有由第一細胞類型到第二細胞類型的徹底轉變，是否其僅僅部分地改編程序，是否改編程序是穩定的，或是否用于改編程序的方法引入了損害改編程序細胞在其新環境中的正常行使功能的能力的不需要的變化。關于改編程序細胞的確切知識在為干細胞改編程序情況下是特別關鍵的，因為干細胞是許多隨后細胞類型的組細胞。此外，在現有技術用于描述細胞類型的標記，諸如mRNA或蛋白，可能僅僅被短暫表達。相反，本發明人發現了甲基化標記是變化的穩定指示劑，當然在時間框架內被認為是。
不同細胞類型基因組的甲基化特性。本發明涉及我們所稱的“細胞徑跡”。這些徑跡由一個細胞類型通向另一種類型(第一細胞類型到第二細胞類型)且測定沿著改編程序細胞群體位于的徑跡的距離。本發明人利用來自改編程序細胞的基因組區域的甲基化標記來測定改編程序細胞在徑跡上的位置。例如，人基因組中1000個核苷酸的DNA片段具有大量的胞嘧啶，每一個可能以甲基化(M)或未甲基化的(u)狀態存在。在第一細胞類型中的胞嘧啶可能是MMMMM，而在第二細胞類型中可能是uMuMu。這些特性標記對于每一細胞類型而言是獨特和穩定的，因此可測定正在被由第一細胞類型改編程序為第二細胞類型的細胞是否事實上已成為期望的第二細胞類型，或是否其僅僅部分地沿著徑跡。因此，如果改編程序細胞具有uMuMu的一個甲基化標記然后其成為第二細胞類型。如果，然而，處理的細胞是uMMMu然后其僅僅部分地沿著徑跡。然而，如果是uuuMu然后存在一個問題，因為第二位置已達到新的狀態也就是說第一細胞類型或第二細胞類型中不存在的狀態。
標記的水平。選擇的基因組甲基化標記顯示其中沿著改編程序細胞位于任一特定時間的徑跡的位置，可被描述在許多水平上。例如，可使用在基因組的編碼或非編碼區的DNA的連續延伸。任選地，可使用來自基因組不同部分的DNA的延伸，來自23對染色體的每一對的延伸，或來自單一染色體的多重延伸。
我們通過利用在7個基因(稱為ABCB1，IRF7，ESR1 B，GZMA，CDX1，MAGEA2和THY1)附近的DNA的延伸舉例說明了本發明的數據，且僅僅這些鄰接于鳥嘌呤的胞嘧啶，也即CG雙聯體被使用。
DNA甲基化標記優于任一其它沿著細胞徑跡距離的指示劑。現有技術中分子細胞類型的定義是不精確的，因為如果抗體被用于抗細胞表面蛋白，也許發現，例如T細胞受體復合物存在于細胞的表面上，但是存在不充分的其它蛋白種類來將那些細胞分類作為免疫系統的功能性T細胞。同樣地在mRNA表達分布圖中，基因可在不同水平的不同細胞類型中表達，且測定是否表達水平充分地高來描述特定類型的那些細胞是極端困難的。此外，最重要的，mRNA和蛋白分布圖可以是瞬變的，因為每一個受到降解酶降解，螯合在細胞內的多亞基復合物中，且每個mRNA轉錄本和蛋白在不同遺傳背景中具有不同的半衰期。相反，本發明人已經發現甲基化標記在細胞分裂過程中是穩定遺傳地。
測定DNA甲基化標記克服指定的細胞類型同一性的問題且有力地顯示改編程序中產生的不適當改變。首先，DNA甲基化本身是特定細胞類型內的活性或無活性的指示劑。因此在由第一細胞類型轉變為第二細胞類型時，特定選擇基因組區域中的甲基化標記，(諸如基因的啟動子或調節區)，將顯示是否基因在處理或改編程序細胞中已被不適當地沉默。如果其已被沉默，則由此位點不能產生mRNA或蛋白產物。通過傳統方法測定是否mRNA或蛋白產物存在于細胞中是非常困難的，特別是如果mRNA或蛋白的量很低時。用DNA甲基化標記則不存在這些問題，因為它們基本上是二元的特定的胞嘧啶被甲基化，或者其沒有被甲基化。此外例如，如果甲基化標記是新的，且不屬于第一細胞類型或第二細胞類型，然后處理的或改編程序的細胞類型被認為不適用于臨床應用。
實驗DNA序列選自人基因組的七個區域。通過亞硫酸氫鹽修飾DNA后的DNA測序測定區域的甲基化狀況。第一細胞類型表示任一改編程序處理之前的細胞類型。第二細胞類型表示第一細胞類型需要移向的目的細胞。“改編程序的”表示細胞已被用獲自第二細胞類型的提取物處理的細胞和它們DNA序列的甲基化狀況；標記是作為改編程序處理結果的DNA水平發生的變化的指示物。
圖6表明通過分析已被改編程序的細胞的DNA甲基化標記，可產生對此改編程序的細胞已經轉為期望的第二細胞類型狀態的程度的測定。通過比較改編程序細胞的甲基化標記與未經處理的第一細胞類型的以及目的終點第二細胞類型的甲基化標記，可測定改編程序細胞已經按照由第一細胞類型轉變為目的第二細胞類型的徑跡前進的程度。因為DNA甲基化分布圖在細胞分裂過程中穩定地復制，改編程序細胞將遺傳以及隨后精確地復制其新的改編程序標記。如果改編程序細胞的甲基化標記不同于目的終點的第二細胞類型的，然后改編程序是不完全的且改編程序細胞不能以與目的終點細胞類型相同的方式作用。因此，改編程序細胞不是用于移植目的或其它目的應用的最佳選擇。只有當改編程序細胞已經符合終點第二細胞類型甲基化分布圖時，改編程序細胞可被用于移植或其它的目的。
圖表明通過分析已被處理或改編程序的細胞的DNA甲基化標記，可產生對此處理或改編程序的細胞已經轉為期望的第二細胞類型狀態的程度的測定。通過比較處理或改編程序細胞的甲基化標記與未經處理的第一細胞類型的以及目的終點第二細胞類型的甲基化標記，可測定處理或改編程序細胞已經按照由第一細胞類型轉變為目的第二細胞類型的徑跡前進的程度。因為DNA甲基化分布圖在細胞分裂過程中穩定地復制，處理或改編程序細胞將遺傳以及隨后精確地復制其新的改編程序甲基化標記。如果處理的改編程序細胞的甲基化標記不同于目的終點的第二細胞類型的，然后處理或改編程序是不完全的且處理的或改編程序細胞不能以與目的終點細胞類型相同的方式作用。因此，例如處理的或改編程序細胞不是用于移植目的應用的最佳選擇。只有當處理的或改編程序細胞已經符合終第二細胞類型或任一其它的目的細胞類型的甲基化標記或分布圖時，改編程序細胞可被用于移植目的。
從上述結果可清楚地看出第一細胞類型的處理或改編程序后，四個測試基因(ABCB1，IRF7，ESR1 B和MAGEA2)在甲基化水平被精確地改編程序而基因CDX1顯示出部分的后成改編程序。然而，THY1和GZMA兩個基因沒有被成功地改編程序。GZMA是T細胞-和自然殺傷細胞-特異性絲氨酸蛋白酶，因此不正確的改編程序表明這些細胞不是用于移植目的的最佳選擇。
改編程序細胞中GZMA的甲基化標記是基因沉默的指示物。利用常規的基因表達分布圖或蛋白組學研究來檢測是極端困難的，因為基因產物不再存在。然而甲基化結果是改編程序細胞中任一潛在問題的清楚的指示物。
此方法證明了甲基化分析正確地區別改編程序的細胞類型的可能性，以及允許選擇用于移植方法的最佳細胞的有效方式。這些方法對于優化與移植無關的細胞改編程序流程也是理想的。
從圖6的結果可清楚地看出第一細胞類型改編程序后，四個測試區域(ABCB1，IRF7，ESR1 B和MAGEA2)在甲基化水平被精確地改編程序，而一個區域，CDX1，顯示出部分的改編程序。然而，THY1和GZMA兩個基因沒有被成功地改編程序。GZMA是T細胞-和自然殺傷細胞-特異性絲氨酸蛋白酶，因此不正確的改編程序表明這些細胞不是用于移植目的的最佳選擇。
我們的方法證明了DNA甲基化分析正確地區別改編程序的細胞類型的可能性，且提供選擇用于移植方法的最佳細胞的有效方式。這些方法對于優化與移植無關的細胞改編程序流程也是理想的。
細胞類型內甲基化標記的變化。當分析相同細胞類型的細胞群體時可實現甲基化標記流程的效率，且其中轉錄組學和蛋白組學分析是非常難的。優選的例子是將老的造血干細胞改編程序為年輕的干細胞以及將免疫系統的老的T細胞改編程序為免疫系統的年輕細胞。在這些例子中，mRNA和蛋白水平的變化可預期是細微的且可利用常規技術展開。利用選自人基因組的位點的甲基化標記能夠檢測是否老化至年輕的改編程序已經成功，且最重要地，是否避免了不恰當的變化。
本領域的技術人員可以理解如特定的實施方案中所顯示的可不違背本發明的精神或范圍對本發明進行大量的變化和/或修飾。本發明的實施方案因此應被認為是例證性的而并非是限制性的。
權利要求
1.改變細胞特性或者狀態的方法，包括如下步驟用能夠改變細胞特性或者狀態的試劑處理第一細胞型；以及通過測定處理的細胞基因組中的甲基化標記確定處理的細胞改變的程度，其中給定的甲基化標記顯示處理細胞特性或者狀態的改變。
2.根據權利要求1的方法，其中第一細胞型選自來源于患老化相關病，諸如癌癥的疾病，自身免疫病，諸如心肌梗死或者局部缺血的心血管問題的個體的細胞，干細胞，免疫以及造血系統的T細胞或單核細胞，正常細胞及其混合物。
3.根據權利要求2的方法，其中第一細胞型為干細胞。
4.根據權利要求1到3任一項的方法，其中所述試劑選自化學試劑，藥物，核酸，適體，抗體，抗原，插入核酸(INA)，肽核酸(PNA)，鎖核酸(LNA)，己糖醇核酸(HNA)，阿卓糖醇核酸(ANA)，環己基核酸(CNA)，寡核苷酸，修飾的寡核苷酸，單鏈DNA，RNA，蛋白，肽，來自具有期望特性或者狀態的第二細胞型的提取物，裂解物或細胞組分，其組合及其嵌合形式。
5.根據權利要求4的方法，其中所述試劑為來自具有期望特性或者狀態的第二細胞型的提取物，裂解物或者細胞組分。
6.根據權利要求5的方法，其中第二細胞型為任一細胞型或者細胞型的組合。
7.根據權利要求6的方法，其中第一以及第二細胞型選自人造血系統的細胞，其它干細胞以及上皮細胞。
8.根據權利要求7的方法，其中第二細胞型源于細胞型類似于第一細胞型的正常或者健康個體。
9.根據權利要求8的方法，其中第二細胞型為干細胞。
10.根據權利要求1到9任一項的方法，其中第一細胞型細胞以及第二細胞型細胞是來自相同種類的相同細胞型。
11.根據權利要求1到9任一項的方法，其中第一細胞型細胞以及第二細胞型不是相同的細胞型。
12.根據權利要求1到9任一項的方法，其中第一種細胞型以及第二細胞型不是相同的種類。
13.根據權利要求12的方法，其中第二細胞型為兩棲動物細胞并且第一細胞型為人或者其它哺乳動物細胞。
14.根據權利要求1到13任一項的方法，其中對第一細胞進行預處理以使細胞能夠滲透高分子。
15.根據權利要求14的方法，其中通過電穿孔法，低溫熱休克或者諸如鏈球菌溶血素O的各種酶對細胞進行預處理。
16.根據權利要求15的方法，其中預處理可以使細胞瞬間滲透。
17.根據權利要求1到16任一項的方法，進一步包括培養或者培育處理的細胞獲得多拷貝的處理細胞。
18.根據權利要求17的方法，其中處理的細胞在適合于細胞生長和分裂的條件下培養在任一適合的培養基或者宿主中。
19.根據權利要求18的方法，其中宿主為選自牛，綿羊，馬，家禽和豬的家畜。
20.根據權利要求1到19任一項的方法，其中甲基化標記為基因組區域內具有對應于特異性細胞型的特征性甲基化標記的一組胞嘧啶。
21.根據權利要求1到20任一項的方法，其中通過亞硫酸氫鹽修飾以及隨后的DNA序列分析確定甲基化標記。
全文摘要
一種改變細胞的特性或狀態，或細胞改編程序的方法，包括用能夠改變細胞或特性或狀態或細胞改編程序的試劑處理第一細胞類型，并通過測定處理細胞基因組內的甲基化標記測定處理細胞的改變程度，其中的甲基化標記顯示處理細胞的改變的特性或狀態。用于處理第一細胞的優選物質為來自第二細胞類型的細胞提取物，裂解物或組分，第二細胞類型具有目的的特性，或是第一細胞類型欲改編程序轉化的目的細胞類型。實施例顯示成纖維細胞的甲基化狀態被改編程序為免疫系統T細胞的甲基化狀態。
文檔編號C12N15/01GK1717477SQ200380104473
公開日2006年1月4日 申請日期2003年11月26日 優先權日2002年11月27日
發明者道格拉斯·斯潘塞·米拉爾, 約翰·羅伯特·梅爾基, 杰弗里·W·格里格, 喬治·L·加博爾·米克洛斯 申請人:人類遺傳標記控股有限公司