改變化學治療劑的活性的丁酰膽堿酯酶變體的制作方法

專利名稱：改變化學治療劑的活性的丁酰膽堿酯酶變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及丁酰膽堿酯酶變體，更特別地，還涉及其生產和治療性用途。
背景技術：
癌癥是美國死亡的主要原因之一。每年，50萬以上的美國人死于癌癥，并且一百萬以上的人被新近診斷患有該疾病。在癌癥中，贅生性細胞逃脫它們的正常生長調節機制并以失控的方式增殖，導致惡性腫瘤形成。如果原發性腫瘤的治療不完全或者未在該疾病的實質惡化之前啟動，那么腫瘤細胞可以轉移到另一部位。因此惡性腫瘤的早診斷和有效治療是幸存所必需的。
當前治療癌癥的方法包括手術、放射療法和化學療法。這些治療每一種的一個主要問題是它們缺乏對癌細胞的特異性和許多副作用。例如，由于對正常組織的毒性，可以安全使用的放射或化學治療劑的量通常不足以殺死所有贅生性細胞。甚至少許殘留的贅生性細胞也可以是致命的，因為它們可以快速增殖并轉移到其他部位。不幸的是，與放射和化學療法相關的毒性表現為讓人不愉快的副作用，包括惡性和脫發，它們嚴重降低了經歷這些治療的癌癥患者的生活質量。顯然，需要更具選擇性和更有效的治療方法。
最近，已經發現了多種化學治療劑，它們可以在體內被活化而產生代謝性產物，該產物對癌細胞具有毒性。這些化療劑有時被稱為“前藥”，因為它們在體內被轉化成活性藥物。這些化學治療劑包括紫杉醇(paclitaxel)前藥和喜樹堿(CPT-11)。這些治療劑被內源羧酸酯酶，如丁酰膽堿酯酶代謝而分別產生活性藥物如紫杉醇和SN-38。不幸的是，盡管這些化學治療劑具有良好的體外抗腫瘤活性，但是已經報導了這些藥物在患者中的嚴重副作用，如腹瀉、脫發、惡心、嘔吐和膽堿能癥狀。
這些化學治療劑的低治療指數限制了它們在癌癥治療中的用途。因為這些治療劑的更高劑量導致更大副作用，所以需要不同方法以使得這些治療劑更有效。一種方法是增加這些治療劑在體內向活性藥物的轉化效能。許多天然發生的人丁酰膽堿酯酶以及物種變體是公知的，然而，這些酶沒有一種表現出增強的前藥水解活性。此外，已經試驗了來自非-人物種的酶和細胞間酶將前藥向活性藥物轉化的能力。然而，來自非-人物種的酶和細胞間酶都是免疫原性的，這嚴重限制了它們的用途。有利地，人丁酰膽堿酯酶位于血漿中并且免疫原性較低。
從而，需要丁酰膽堿酯酶變體，該變體能夠比野生型丁酰膽堿酯酶更有效地改變化學治療劑的活性。本發明滿足了該需求并且還提供了相關的優點。
發明概述本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其具有選自SEQ ID NOS4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列，或者該丁酰膽堿酯酶變體的功能片段。
此外，本發明提供了通過將喜樹堿衍生物與選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸，將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法。
此外，本發明提供了通過對個體施用有效量的選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段治療癌癥的方法，該丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段與丁酰膽堿酯酶相比表現出將喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的能力增強。
附圖簡述

圖1顯示了代表性乙酸鄰硝基苯基酯試驗，該試驗顯示了羧酸酯酶活性增加的丁酰膽堿酯酶變體。
圖2顯示了CPT-11和SN-38的化學結構和通過羧酸酯酶活性使CPT-11向SN-38的轉化。
圖3顯示了對SN-38形成的高效液相層析(HPLC)測定。圖3顯示來自模擬-轉染的細胞的條件培養基。條件培養基被暴露于CTP-11并通過HPLC分析SN-38的形成。標出CPF-11和SN-38峰。
圖4顯示了對用F227A變體轉染的細胞的條件培養基形成的SN-38的高效液相層析(HPLC)測定。條件培養基被暴露于CTP-11并通過HPLC分析SN-38的形成。CTP-11和SN-38峰被標記。
圖5顯示了對用F227A/L286S變體轉染的細胞的條件培養基形成的SN-38的高效液相層析(HPLC)測定。條件培養基被暴露于CTP-11并通過HPLC分析SN-38的形成。CTP-11和SN-38峰被標記。
圖6顯示了MTT細胞毒性測定的結果。將CPT-11與野生型丁酰膽堿酯酶、6-6變體、或F227A/L286Q變體孵育以激活CTP-11。顯示了暴露于活化的CPT-11時被殺死的SW38結腸癌細胞的百分數并將其與沒有用丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶變體(標記為“模擬”的道)孵育的CTP-11比較。
圖7顯示了ELISA試驗，該試驗展示表達的抗-EGFR-BChE L530與抗-κ捕獲抗體的結合并通過丁酰硫代膽堿酯的水解測量結合的丁酰膽堿酯酶的活性。
圖8顯示了ELISA試驗，該試驗測量特異地與含有EGFR抗原的細胞膜制品結合的抗-EGFR-BChE L530的丁酰膽堿酯酶酶活性。
圖9顯示了小鼠抗-EGFR可變輕鏈的核苷酸和氨基酸序列(SEQ IDNOS17和18)。
圖10顯示了L530的小鼠抗-EGFR可變重鏈和恒定重鏈鉸鏈區的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS19和20)。
圖11顯示了人丁酰膽堿酯酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS21和22)。F227、T284、L286和S287的位置以粗體和下劃線標記。
圖12的表格顯示了對丁酰膽堿酯酶變體4-1轉化SN38的定量。
圖13顯示了丁酰膽堿酯酶變體4-1水解CTP-11的Hofstee圖。
圖14顯示了抗體-丁酰膽堿酯酶融合蛋白與固定化SKW腫瘤細胞的結合。
圖15顯示了抗-CD20-丁酰膽堿酯酶融合蛋白對SKW腫瘤細胞的靶定的細胞毒性。
圖16顯示了給出丁酰膽堿酯酶變體F227A(SEQ ID NO2)的結構和功能特征的表格。
圖17顯示了給出被指定為SEQ ID NOS24到176的丁酰膽堿酯酶變體的結構和功能特征的表格，所有這些變體都是雙突變，其中包括作為兩個氨基酸改變之一的F227A改變。
圖18顯示了給出被指定為SEQ ID NOS178到196的丁酰膽堿酯酶變體的結構和功能特征的表格，所有這些變體都包括F227A改變作為氨基酸改變之一。
圖19顯示了抗-CD20 VH-CH1鉸鏈cys L530 BChE.4-1重鏈構建體的氨基酸序列(SEQ ID NO202)和相應核苷酸序列(SEQ ID NO201)。這是融合蛋白重鏈，其由抗-CD20抗體可變重鏈區與含有半胱氨酸的鉸鏈區及被指定為SEQ ID NO180的丁酰膽堿酯酶變體的L530片段(SEQ IDNO204)組成，其摻入4-1變體氨基酸(H77F/F227A/P285N/V331A)。
圖20顯示了抗-CD20輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO198)和相應核苷酸序列(SEQ ID NO197)。
發明詳述本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其表現出將化學治療劑前藥轉化成活性藥物的能力增強。表現出將化學治療劑前藥轉化成活性藥物的能力增強的丁酰膽堿酯酶變體的鑒定為癌癥提供了治療選擇。
在一個實施方案中，本發明提供了治療患有癌癥癥狀的個體的方法。本發明的丁酰膽堿酯酶變體具有重要的臨床價值，因為它們能夠比任何公知的天然發生的野生型丁酰膽堿酯酶以更高的速度將前藥轉化成活性藥物。正是前藥轉化活性的增加使得可以更有效地治療癌癥并且具有更小的副作用，這使得本發明的丁酰膽堿酯酶變體與其他治療方案區別開來。
在一個實施方案中，本發明提供了通過將喜樹堿衍生物與選自SEQ IDNOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸，將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法。
如此處所用的，術語“丁酰膽堿酯酶”旨在指具有天然發生的丁酰膽堿酯酶的序列的多肽。天然發生的丁酰膽堿酯酶可以是任何物種來源，例如，人、靈長類、馬或鼠來源。因此，丁酰膽堿酯酶可以是，例如，脊椎動物或無脊椎動物丁酰膽堿酯酶，例如，哺乳動物丁酰膽堿酯酶。此外，本發明的丁酰膽堿酯酶可以是天然發生的丁酰膽堿酯酶的多態性變體或者任何其他等位基因變體。編碼本發明的丁酰膽堿酯酶的核酸編碼具有任何天然發生的丁酰膽堿酯酶的序列的多肽。因此，編碼丁酰膽堿酯酶的核酸可以編碼任一物種來源，例如，人、靈長類、馬或鼠的丁酰膽堿酯酶。此外，編碼丁酰膽堿酯酶的核酸包括任何天然發生的等位基因或多態性。人丁酰膽堿酯酶的GenBank記錄號為M16541。
如此處所用的，術語“丁酰膽堿酯酶變體”旨在指結構上類似于丁酰膽堿酯酶，但是與丁酰膽堿酯酶至少有1個氨基酸不同的分子。丁酰膽堿酯酶變體具有如丁酰膽堿酯酶的氨基酸序列并且表現出將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的代謝能力增強。關于這一點，丁酰膽堿酯酶變體可以具有，例如，與丁酰膽堿酯酶相比，將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的降低或增強的能力。例如，本發明的丁酰膽堿酯酶變體的轉化能力可以增加2、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、4000、5000倍、或更多倍。
丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比可以具有單個氨基酸改變以及多個氨基酸改變。丁酰膽堿酯酶變體的一個特定實例是在227位為丙氨酸的丁酰膽堿酯酶，其氨基酸序列和編碼核酸序列分別被指定為SEQ IDNOS2和1。另一實例是在77位為苯丙氨酸、227位為丙氨酸、285位為天冬酰胺、331位為丙氨酸的丁酰膽堿酯酶變體，其氨基酸序列和編碼核酸序列分別被指定為SEQ ID NOS180和179，并且其與丁酰膽堿酯酶相比將喜樹堿衍生物CTP-11轉化成拓撲異構酶抑制劑SN-38的能力增加至少3000倍。該術語還旨在包括含有例如，天然發生的氨基酸的修飾形式諸如D-立體異構體、非天然發生的氨基酸、氨基酸類似物和模擬物的丁酰膽堿酯酶變體，只要這些變體具有與丁酰膽堿酯酶基本相同的氨基酸序列并且表現出將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力。本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以具有一個或多個氨基酸改變，這些改變位于被確定或預測為對于此處將喜樹堿衍生物轉化為拓撲異構酶抑制劑的能力重要的區域之外。此外，本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以具有一個或多個額外的修飾，這些修飾不顯著改變其將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑活性的能力。本發明的丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比還可以具有增強的穩定性。
如此處所用的，本發明的丁酰膽堿酯酶變體包括與參比氨基酸序列基本相同的序列，從而丁酰膽堿酯酶變體旨在包括具有相同氨基酸序列的多肽、片段或節段，或者具有類似的、不相同的序列的多肽、片段或節段，該類似但不同的序列被本領域中技術人員認為是功能上等價的氨基酸序列。與參比丁酰膽堿酯酶基本相同的氨基酸序列或者本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以與參比丁酰膽堿酯酶具有至少70％、至少80％、至少81％、至少83％、至少85％、至少90％、至少95％或以上的同一性。基本上相同的氨基酸序列還旨在包括含有例如，天然發生的氨基酸的修飾形式諸如D-立體異構體、非天然發生的氨基酸、氨基酸類似物和模擬物的多肽，只要這些多肽保持如上面定義的功能活性。本發明的丁酰膽堿酯酶變體的生物學活性是如此處描述的能夠將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力。例如，被指定為SEQ ID NO2的丁酰膽堿酯酶變體F227A與丁酰膽堿酯酶相比表現出將喜樹堿衍生物CTP-11轉化成拓撲異構酶抑制劑SN-38的能力增加至少3倍。另一實例是指定為SEQ ID NO180的丁酰膽堿酯酶變體H77E，F227A，P285N，V331A，該變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出將喜樹堿衍生物CTP-11轉化成拓撲異構酶抑制劑SN-38的能力增加至少3000倍。
可以理解多肽中一級氨基酸序列的微小修飾可以導致與本發明的多肽相比具有基本等價的功能的多肽。這些修飾可以是故意的，如通過定點誘變，或者可以是偶然的，如通過自發突變。例如，可以理解，為了實現將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力，可能僅需要丁酰膽堿酯酶變體的全部一級結構的一部分。而且，本發明的丁酰膽堿酯酶變體序列的片段可以類似地被包括在該定義中，只要該片段保留丁酰膽堿酯酶變體的至少一種生物學功能。可以理解各種分子，例如，其他多肽、糖類、脂質或化學部分可以附著到本發明的多肽上。
本發明的核酸分子包括與本發明的參比核酸分子基本相同的核酸序列或者其片段，并且旨在包括與參比序列相比具有一個或多個添加、缺失或置換的序列，只要該核酸分子保留在中等嚴格條件，或者高度嚴格條件下與主題核酸分子選擇性雜交的能力。中等嚴格條件旨在包括等價于將濾膜-結合的核酸在50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃雜交，然后在0.2×SSPE、0.2％SDS中50℃洗滌的雜交條件。如此處所用的，高度嚴格雜交條件是等價于將濾膜-結合的核酸在50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃雜交，然后在0.2×SSPE、0.2％SDS中65℃洗滌的條件。其他適宜的中等嚴格和高度嚴格雜交緩沖液和條件是本領域技術人員熟知的并且在例如，Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1992)和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1998)中描述。從而，不必兩個核酸表現出基本上互補的序列同一性，只要它們能特異雜交或者使得它們能特異雜交而沒有與其他類似序列的可檢測的交叉反應性即可。
通常，與參比序列具有基本上相同的核苷酸序列的核酸分子將與參比序列具有大于約60％的同一性，如大于約65％、70％、75％同一性，如在所比較的兩個序列的全長上與參比序列具有大于約80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。本領域技術人員基于例如，BLAST 2.0計算機比對，使用默認參數可以確定任何兩個核酸序列的同一性。BLAST 2.0搜索可以在ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html.得到，如Tatiana等人，FEMSMicrobiol Lett.174247-250(1999)所描述。
如此處所用的術語“片段”當與編碼本發明多肽的核酸相關時，旨在表示具有與編碼本發明多肽的核酸或者其節段的一部分基本相同的序列的核酸。核酸片段在長度和序列上足夠與丁酰膽堿酯酶變體編碼核酸或者丁酰膽堿酯酶變體編碼核酸的互補核苷酸序列選擇性雜交。因此，片段旨在包括用于測序和聚合酶鏈式反應(PCR)的引物以及用于核酸印跡或溶液雜交的探針。
類似地，術語“功能片段”當用于編碼丁酰膽堿酯酶或者丁酰膽堿酯酶變體的核酸時，旨在指編碼丁酰膽堿酯酶或者丁酰膽堿酯酶變體的一部分的核酸的一部分，該丁酰膽堿酯酶或者丁酰膽堿酯酶變體的一部分仍然保留親本多肽的一些或者全部代謝轉化能力。表現出功能活性的本發明多肽的功能片段可以具有，例如，本發明多肽的至少6個連續氨基酸殘基，本發明多肽的至少8、10、15、20、30或40個氨基酸，或者常具有至少50、75、100、200、300、400或更多個氨基酸，直到全長多肽減去一個氨基酸。本發明的丁酰膽堿酯酶變體的功能片段的一個實例是在530位被截短的變體，野生型丁酰膽堿酯酶中530位為亮氨酸殘基。盡管L530截短對于相應全長變體的功能活性沒有影響，但是該截短防止四聚體形成，從而增強了該變體的生物活性和藥物動力學性質。因此，本發明的丁酰膽堿酯酶變體包括L530截短，其被認為是參比變體的功能片段。
如此處所用的，關于本發明多肽的術語“功能片段”指參比多肽的一部分，該部分能夠表現或實施參比多肽的功能活性。表現出功能活性的本發明多肽的功能片段可以具有，例如，本發明多肽的至少6個連續氨基酸殘基，本發明多肽的至少8、10、15、20、30或40個氨基酸，并常具有至少50、75、100、200、300、400或更多個氨基酸，直到全長多肽減去一個氨基酸。本領域技術人員根據功能片段的計劃用途可以確定本發明多肽的功能片段的氨基酸序列及適宜長度。例如，丁酰膽堿酯酶或者丁酰膽堿酯酶變體的功能片段旨在指丁酰膽堿酯酶或者丁酰膽堿酯酶變體的一部分，該部分仍然保留親本多肽的一些或全部的代謝轉化能力。
如此處所用的，術語“抗體”旨在指應答抗原而產生的多肽，該多肽能夠特異結合誘導其形成的抗原。抗體包括，例如，單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能或雙特異抗體、人源化抗體、人抗體，和互補決定區(CDR)-嫁接的抗體，包括含有CDR或抗原結合序列的化合物，其特異結合本發明的多肽。“抗體片段”指抗體多肽的一部分，其保留完整抗體的部分功能。例如，抗體片段可以保留完整抗體的部分或所有抗原結合能力。抗體片段包括，例如，Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv。用于確定本發明的抗體或抗體片段的結合特異性或排他性的篩選測定法是本領域中熟知的(見Harlow等人(編者)，Antibodies A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))。
使用本領域中熟知的任一種方法，利用本發明的任一多肽或其免疫原性片段可以產生可用于本發明的抗體。例如，用完全人種系構架區可以制備人源化抗體。此外，免疫原性多肽可以從天然來源、從重組宿主細胞分離，或者可以化學合成。合成這些肽的方法是本領域中公知的，例如，如R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.852149-2154(1963)；J.L.Krstenansky，等人，FEBS Lett.21110(1987)中所描述的。
如此處所用的，術語“喜樹堿衍生物”指結構與喜樹堿的結構相同或基本上相同并且可以通過丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶變體水解的化合物。例如，喜樹堿衍生物可被F227A/L286Q變體(SEQ ID NO6)水解。喜樹堿來自中國的一種稱為喜樹(Camptotheca acuminata Decaisne)的樹的樹皮。喜樹堿衍生物可以通過它們的代謝分解產物抑制DNA拓撲異構酶I。一種水可溶的喜樹堿衍生物CPT-11的結構在圖2中顯示。CPT-11的化學名稱是7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶]羰氧基喜樹堿。CPT-11還被稱為CAMPTOSAR和依立替康。喜樹堿的成員包括，例如，拓撲替康、依立替康、9-氨基喜樹堿和9-硝基喜樹堿，它們是植物生物堿20(S)-喜樹堿的類似物。
如此處所用的，術語“拓撲異構酶抑制劑”指可以抑制拓撲異構酶的化合物。一些拓撲異構酶是本領域中公知的。例如，拓撲異構酶抑制劑可以抑制I型拓撲異構酶，如拓撲異構酶I，或II型拓撲異構酶。I型酶通過在DNA的一條鏈中產生暫時斷裂而起作用，II型酶通過導入暫時雙鏈斷裂起作用。一些DNA拓撲異構酶可以松弛或除去僅僅DNA上的負超螺旋，而其他DNA拓撲異構酶可以松弛正的和負的超螺旋，還有的可以導入負超螺旋。拓撲異構酶抑制劑的一個實例是SN-38，其結構在圖2中顯示。
SN-38的化學名是7-乙基-10-羥基喜樹堿。在體外，已經表明SN-38比CPT-11的細胞毒性強1000多倍(Pavillard等人，Cancer ChemotherPharmacol.49329-35(2002))。在人中，認為主要在肝臟中通過兩種羧酸酯酶同工型人羧酸酯酶-1(hCE-1)和人羧酸酯酶-2(hCE-2)的活性發生前藥轉化(Humerickhouse等人，Cancer Res601189-92(2000))。hCE-2和hCE-1的Km值分別為3.4μM和43μM，hCE-2的催化效率比hCE-1的高60倍。在藥物的藥理學相關濃度(～1-10μM)，hCE-2將CTP-11轉化成SN38的速率比hCE-1的高25-30倍(12)。SN-38可以與拓撲異構酶I和DNA相互作用而形成切割復合體，并防止拓撲異構酶I-介導的DNA單鏈斷裂的再次封閉。該相互作用最終導致雙鏈DNA斷裂和細胞死亡，如凋亡。
如此處所用的，術語“喜樹堿轉化活性”或者喜樹堿水解活性旨在指喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑的化學轉化。例如，在圖2中顯示了CTP-11向SN-38的轉化。可以用此處描述的一些測定法(見實施例II、III，和IV)直接或間接測量轉化活性。
如此處所用的，術語“有效量”旨在指可以降低癌癥嚴重性的本發明的丁酰膽堿酯酶變體的量。嚴重性降低包括，例如，癥狀、生理學指標、生化標記或代謝指標的抑制或減小。癌癥的癥狀包括，例如，體重降低、疼痛，和器官衰竭。如此處所用的，術語“治療”旨在表示導致癌癥嚴重性降低。
本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其具有選自SEQ ID NOS4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列，或者該丁酰膽堿酯酶變體的功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO4，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO6，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO8，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO10，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO12，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO14，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO24，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO26，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO28，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO30，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO32，或者其功能片段。
本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO34，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO36，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO38，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO40，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO42，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO44，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO46，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO48，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO50，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO52，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO54，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO56，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO58，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO60，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO62，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO64，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO66，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO68，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO70，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO72，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO74，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO76，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO78，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO80，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO82，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO84，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO86，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO88，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO90，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO92，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO94，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO96，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO98，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO100，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO102，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO104，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO106，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO108，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO110，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO112，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO114，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO116，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO118，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO120，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO122，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO124，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO126，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO128，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO130，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO132，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO134，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO136，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO138，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO140，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO142，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO144，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO146，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO148，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO150，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO152，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO154，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO156，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO158，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO160，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO162，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO164，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO166，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO168，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO170，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO172，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO174，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO176，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO178，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO180，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQID NO182，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO184，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO186，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO188，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ IDNO190，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO192，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO194，或者其功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中氨基酸含有SEQ ID NO196，或者其功能片段。
本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其喜樹堿轉化活性與丁酰膽堿酯酶的相比增加了3000倍，或者該變體的功能片段。本發明還提供了丁酰膽堿酯酶變體，其喜樹堿轉化活性與丁酰膽堿酯酶的相比增加了至少4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300-倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3500倍或以上，或者該變體的功能片段。
本發明還提供了編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，該核酸具有選自SEQID NOS3、5、7、9、11、13、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、1 61、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、和195的核酸序列，或者其片段。此外，本發明提供了編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸或者其功能片段，其中該丁酰膽堿酯酶變體具有選自SEQ ID NOS4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列。此外，本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO3的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO5的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO7的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO9的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO11的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO13的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO23的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO25的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO27的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO29的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO31的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO33的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO35的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO37的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO39的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO41的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO43的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO45的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO47的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO49的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO51的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO53的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO55的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO57的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO59的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO61的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO63的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO65的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO67的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO69的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO71的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO73的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO75的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO77的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO79的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO81的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO83的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO85的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO87的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO89的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO91的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO93的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO95的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO97的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO99的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO101的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQID NO103的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO105的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO107的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO109的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO111的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO113的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO115的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO117的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO119的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO121的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO123的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO125的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO127的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO129的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO131的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO133的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO135的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO137的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO139的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO141的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO143的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO145的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO147的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO149的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO151的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO153的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO155的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO157的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO159的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO161的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO163的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO165的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO167的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO169的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO171的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO173的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO175的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO177的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO179的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO81的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO183的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO185的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO187的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO189的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO191的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO193的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。本發明還提供了含有核酸序列SEQ ID NO195的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸，或者其功能片段。
膽堿酯酶是普遍存在的多態性B型羧化酶，能夠水解神經遞質乙酰膽堿和各種含有酯的化合物。兩種主要的膽堿酯酶是乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。丁酰膽堿酯酶催化許多膽堿酯的水解，如下所示
丁酰膽堿酯酶優選使用丁酰膽堿和苯甲酰膽堿作為底物。丁酰膽堿酯酶在哺乳動物血漿、肝臟、胰腺、腸粘膜和中樞神經系統的白質中發現。編碼丁酰膽堿酯酶的人基因位于3號染色體并且公知丁酰膽堿酯酶的30種以上的天然發生的基因變異。丁酰膽堿酯酶多肽長574個氨基酸并且被1,722個堿基對的編碼序列編碼。三種天然發生的丁酰膽堿酯酶變異是被稱為A變體、J變體和K變體的非典型等位基因。A變體具有D70G突變并且不常見(0.5％等位基因頻率)，而J變體具有E497V突變并且僅在一個家族中發現。K變體具有核苷酸1615位的點突變，其導致A539T突變并且在高加索人中等位基因頻率為約12％。
除了丁酰膽堿酯酶的天然發生的人變異之外，還公知許多物種變異。貓丁酰膽堿酯酶的氨基酸序列與人丁酰膽堿酯酶的具有88％同一性。在不同的70個氨基酸中，三個位于活性部位溝中并且被稱為A277L、P285L和F398I。類似地，馬丁酰膽堿酯酶與人丁酰膽堿酯酶相比在活性部位具有三個氨基酸差異，它們是A277V、P285L和F398I。大鼠丁酰膽堿酯酶的氨基酸序列在活性部位溝中含有6個氨基酸差異，它們是A277K、V280L、T284S、P285I、L286R和V288I。
Xie等人，Molecular Pharmacology5583-91(1999)以前已經描述了天然發生的人丁酰膽堿酯酶變異、物種變異以及重組制備的突變。可以通過本領域中熟知的各種方法制備本發明的丁酰膽堿酯酶變體。如果希望，可以實施隨機誘變以制備本發明的丁酰膽堿酯酶變體。備選地，如此處公開的，可以基于從此處描述的結構、生化和建模方法得到的信息，集中在離散區域實施隨機誘變，以靶定被預測對催化活性重要的那些氨基酸。例如，可以使用丁酰膽堿酯酶活性部位中底物的分子建模基于酶和其底物之間更好的匹配來預測使得具有更高催化效率的氨基酸改變。
此外，可以使用分子建模預測減小酶和底物之間空間位阻的氨基酸改變。基于以可卡因作為底物的實驗，預測對水解活性重要的殘基包括8個疏水性溝殘基和催化性三聯體殘基。此外，可以理解在制備具有水解活性的丁酰膽堿酯酶變體過程中，通常不改變對丁酰膽堿酯酶變體的功能性結構重要的氨基酸殘基，它們包括與鏈內二硫鍵有關的半胱氨酸殘基65Cys-92Cys、252Cys-263Cys、400Cys-519Cys。
丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶變體的誘變后，可以通過本領域中熟知的方法實施丁酰膽堿酯酶變體的純化和功能表征。
本發明的丁酰膽堿酯酶變體表現出喜樹堿轉化或水解活性。如此處公開的，本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以具有增強的喜樹堿轉化或水解活性并且可用于治療癌癥。與本發明的丁酰膽堿酯酶變體相比具有微小改變的多肽可以被本發明包括，只要其保留等價喜樹堿轉化或水解活性。此外，本發明類似地包括丁酰膽堿酯酶變體的功能片段，只要該片段仍然保留親本丁酰膽堿酯酶變體的一些或所有喜樹堿轉化或水解活性。類似地，本發明包括核酸的功能片段，其編碼本發明的丁酰膽堿酯酶變體的功能片段。
可以通過重組方法制備本發明的丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶變體的功能片段，這些方法包括表達編碼丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段的核酸分子，然后通過此處描述的常規生化方法分離該變體或其功能片段。可以理解通過酶或化學切割全長丁酰膽堿酯酶變體也可以制備功能片段。酶和化學切割的方法和所得肽片段的純化方法是本領域中熟知的(見，例如，Deutscher，Methods in Enzvmology，卷182，″蛋白質純化指南，″(Guide toProtein Purification)San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)，其在此處被并入作為參考)。
此外，通過化學合成可以產生丁酰膽堿酯酶變體的功能片段。如果希望，可以修飾這些分子以包括D-立體異構體、非天然發生的氨基酸和氨基酸類似物和模擬物以優化它們的功能活性、穩定性或生物利用度。修飾的氨基酸和它們的用途的實例在Sawyer，Peptide Based Drug Design，ACS，Washington(1995)和Gross和Meienhofer，The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Academic Press，Inc.，New York(1983)中給出，這兩篇文獻都在此處被并入作為參考。
如果希望，可以制備并以此處描述的測定法檢驗丁酰膽堿酯酶變體的隨機片段。可以制備與本發明的參比丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶變體的氨基酸序列相比具有任何希望的邊界和修飾的片段。備選地，可以利用通過此處描述的結構、生化和建模方法得到的可利用信息，僅僅制備丁酰膽堿酯酶變體的這樣一些片段，這些片段可能保留親本變體的喜樹堿轉化或水解活性。如此處描述的，預測對喜樹堿轉化或水解活性重要的殘基包括8個疏水性溝殘基(gorge residues)和催化性三聯體殘基(triad residues)。此外，對丁酰膽堿酯酶變體的功能性結構重要的氨基酸殘基包括與鏈內二硫鍵有關的半胱氨酸殘基65Cys-92Cys、252Cys-263Cys、和400Cys-519Cys。功能片段可以包括非肽結構元件，這些非肽結構元件模擬參比變體的結構上或功能上重要的殘基。
本發明的丁酰膽堿酯酶變體還包括融合蛋白，其通過將丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段與異源蛋白，如治療蛋白連接得到，并包括編碼這些融合蛋白的核酸的融合構建體。可以與丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段雜交的核酸片段可用作例如，雜交探針并且也被本發明包括。
本發明還提供了含有抗體或抗體片段的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段。本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以與抗體或抗體片段融合。例如，本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以與結合腫瘤相關抗原的抗體或抗體片段融合。這樣，丁酰膽堿酯酶變體可被直接遞送到腫瘤，這可導致副作用數目降低。已知一些抗原在腫瘤細胞中過表達或者僅在腫瘤細胞中表達。這些腫瘤相關的抗原包括，例如，Lewis Y(Siegall，C.，Semin.Cancer Biol.6289-295(1995))、癌胚抗原(CEA)(Watine等人，Dis.Colon Rectum441791-1799(2001))、tetraspanin L6(Kaneko等人，Am.J.Gastroenterol.963457-3458(2001))、17-1A(Indar等人，J.R.Coll.Surg.Edinb.47458-474(2002))、mucin-1(MUC-1)(Segal-Eiras和Croce，Allerg.Immunopath.25176-181(1997))、表皮生長因子受體(EGFR)(Bookman，M.，Semin.Oncol.25381-396 (1998))、癌抗原125(CA 125)(Cherry和Vacchiano，Semin.Oncol.Nurs.18167-173(2002))、p97(Srivastava，P.，Curr.Opin.Immunol.3654-658(1991))、黑素瘤抗原基因(MAGE)(Barker和Salehi，J.Neurosci.Res.67705-712(2002))、CD20(Kosmas等人，Leukemia162004-2015(2002))、CD33(Countouriotis等人，Stem Cells20215-229(2002))、神經節苷脂GD2(Ragupathi，G.，Cancer Immunol.Immunother.43152-157(1996))，和神經節苷脂GD3(Ragupathi，G.，如前(1996))。
本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以與內化抗體或者抗體片段或者非內化抗體或者抗體片段融合。當與非內化抗體或者抗體片段融合時，丁酰膽堿酯酶變體可以通過結合到經歷內化的細胞表面多肽上而被內化。例如，本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以與針對經歷內化的受體的抗體融合。
本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中抗體或抗體片段特異結合細胞表面受體。在一個實施方案中，本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中抗體或抗體片段特異結合表皮生長因子受體(EGFR)。公知EGFR在一些腫瘤細胞類型，例如，乳腺癌細胞中被上調。在各種相關的實施方案中，本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中抗體或抗體片段含有選自接頭變體、鉸鏈變體，和合成的接頭變體的氨基酸序列。在一個實施方案中，本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中抗體或抗體片段含有SEQ ID NOS18和20中所示的氨基酸序列。在圖7和圖8中顯示了使用模型抗體得到的ELISA結果。
在另一實施方案中，本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中抗體或抗體片段特異結合CD20。CD20是B細胞表面上一種未糖基化的磷蛋白。CD20-抗體復合體不內化，從而允許細胞表面結合的免疫球蛋白與效應細胞或補體相互作用更長時間。在一個實施方案中，本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，其中抗體或抗體片段含有SEQ ID NOS198和200中所示的氨基酸序列，并且特異結合CD20。公知CD20在一些腫瘤細胞類型，例如，B細胞淋巴瘤，如非何杰金氏淋巴瘤以及各種自身免疫病癥中被上調。使用稱為抗體-定向的酶前藥療法(ADEPT)(Jung，M.，Mini Rev.Med.Chem.1399-407(2001)；Bagshawe，K.D.，Mol.Med.Today1424-431(1995)；和Senter，P.D.，FASEB J4188-193(1990))的方法，丁酰膽堿酯酶變體和抗體或抗體片段之間的融合可用于靶定的、腫瘤細胞特異的、丁酰膽堿酯酶介導的毒性。也可以使用一種相關方法，其被稱為病毒定向的酶前藥療法(VDEPT)。對于用于靶定的腫瘤細胞特異的丁酰膽堿酯酶介導的毒性，丁酰膽堿酯酶變體和抗體或抗體片段之間的融合的一個實例為SEQ ID NO202的氨基酸序列及其相應核苷酸序列(顯示于SEQ ID NO201)，該序列相應于抗-CD20 VH-CH1鉸鏈cys L530 BChE.4-1重鏈構建體。指定為SEQ ID NO202的丁酰膽堿酯酶變體是一種融合蛋白，其含有由抗-CD20抗體可變重鏈區與含有半胱氨酸的鉸鏈區組成的重鏈和指定為SEQ ID NO180的丁酰膽堿酯酶變體的L530功能片段(SEQ ID NO204)，該功能片段摻入4-1變體氨基酸(H77F/F227A/P285N/V331 A)。VDEPT使用病毒載體遞送酶，諸如本發明的丁酰膽堿酯酶變體。使用這些方法，酶的選擇性表達可將腫瘤細胞中無毒或具有溫和毒性的前藥有效活化成高度毒性的代謝產物，導致抗腫瘤活性增強和治療指數提高。為了使這些方法成功，需要酶具有高度活性，例如，可以使用本發明的丁酰膽堿酯酶變體。
本發明的丁酰膽堿酯酶變體來自如實施例1中公開的文庫。可以通過本領域中熟知的各種方法制備足夠多樣化以致含有具有增強的喜樹堿轉化或水解活性的丁酰膽堿酯酶變體的文庫。本領域中技術人員將知道對于計劃的目的，怎樣的大小和多樣性是必需的或足夠的。例如，可以制備丁酰膽堿酯酶變體文庫，其在約573個氨基酸位置的每個位置具有參比丁酰膽堿酯酶中沒有發現的19種氨基酸之每一種，并在所得變體文庫中篩選具有增強的喜樹堿水解活性的丁酰膽堿酯酶變體。
備選地，可以使用如此處描述的丁酰膽堿酯酶的結構、生化和建模信息制備聚焦文庫(focused library)。可以理解，與確定或預測對喜樹堿的轉化或水解活性或者丁酰膽堿酯酶的結構功能重要的殘基或區域有關的任何信息，都可用于設計具有增強的喜樹堿水解活性的本發明丁酰膽堿酯酶變體的聚焦文庫。從而，組成本發明的丁酰膽堿酯酶變體文庫的丁酰膽堿酯酶變體可以含有位于如下區域的氨基酸位置上的氨基酸改變，所述區域被確定或預測對喜樹堿轉化或水解活性是重要的。丁酰膽堿酯酶變體的聚焦文庫可能是所希望的，因為其通過將氨基酸改變靶定到被確定或預測對活性重要的區域而顯著減少了為了鑒定活性增強的丁酰膽堿酯酶變體而需要篩選的變體數。
可以通過本領域中公知的各種方法確定或預測對丁酰膽堿酯酶的喜樹堿轉化或水解活性重要的區域，并且這些區域可用于聚焦合成丁酰膽堿酯酶變體文庫。具有高度序列相似性和生化上類似的催化性質的相關酶，例如，乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶，可提供有關對丁酰膽堿酯酶的催化活性重要的區域的信息。例如，結構建模可以揭示酶的活性部位，該活性部位是由通常在一級結構上相互分開的氨基酸殘基形成的三維結構，如裂縫、溝或裂隙。因此，構成丁酰膽堿酯酶中對喜樹堿轉化或水解活性重要的區域的氨基酸殘基可以包括沿著活性部位溝定位的殘基。關于丁酰膽堿酯酶的結構建模的描述，見例如，Harel等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA8910827-10831(1992)和Soreq等人，Trends Biochem.Sci.17(9)353-358(1992)，它們在此處被并入作為參考。
除了丁酰膽堿酯酶的結構建模，當制備丁酰膽堿酯酶變體的聚焦文庫時，生化數據也可用于確定或預測對喜樹堿轉化或水解活性重要的丁酰膽堿酯酶的區域。關于這一點，對喜樹堿轉化或水解活性改變的天然發生的丁酰膽堿酯酶變體的表征可用于鑒定對丁酰膽堿酯酶的催化活性重要的區域。類似地，定點誘變研究可以提供關于催化上重要的氨基酸殘基的數據，綜述見例如Schwartz等人，Pharmac.Ther.67283-322(1992)，其被并入作為參考。
為了產生本發明的丁酰膽堿酯酶變體文庫，可單獨或聯合使用不同類型的信息以確定或預測對喜樹堿轉化或水解活性重要的丁酰膽堿酯酶的氨基酸序列區域。例如，將基于結構建模的信息和生化數據聯合，確定對喜樹堿轉化或水解活性重要的丁酰膽堿酯酶的氨基酸序列區域。因為可以聯合通過各種方法得到的信息以預測催化活性區，所以本領域中技術人員將明白區域自身是近似性的而不是嚴格限制的。因此，丁酰膽堿酯酶文庫可以含有這樣的丁酰膽堿酯酶變體，這些變體具有位于經確定或預測對喜樹堿轉化或水解活性重要的區域之外的氨基酸改變。類似地，本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以具有位于經確定或預測對喜樹堿轉化或水解活性重要的區域之外的氨基酸改變。此外，本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以具有任何其他修飾，只要該修飾不顯著改變本發明變體的喜樹堿轉化或水解活性。還可以理解基于所用的預測方法，經確定或預測對喜樹堿轉化或水解活性重要的區域的數目可以變化。
一旦通過適于確定對喜樹堿水解重要的區域的任一方法或者方法聯合鑒定了多個區域，那么每個區域都可以在一些或所有氨基酸位置隨機化以產生變體文庫，該變體文庫將在每個區域內一個或多個位置上含有野生型氨基酸加上其他19種天然發生的氨基酸中的一種或多種。在表1中顯示了本發明提供的為丁酰膽堿酯酶變體的聚焦文庫所選的7個丁酰膽堿酯酶氨基酸序列區域。
表1.經預測對催化效率重要的丁酰膽堿酯酶區域

制備含有各種類型分子，如肽、類肽(peptoid)、肽模擬物(peptidomimetise)的不同群體的文庫是本領域中熟知的(見，例如，Ecker和Crooke，Biotechnology13351-360 (1995)，和Blondelle等人TrendsAnal.Chem.1483-92(1995)，和其中引用的參考文獻，它們的每一篇都在此處被并入作為參考；還見，Goodman和Ro，用于藥物設計的肽模擬物，″Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery″卷1(編者M.E.Wolff；John Wiley & Sons 1995)，803-861頁，和Gordon等人，J.Med.Chem.371385-1401(1994)，它們的每一篇都在此處被并入作為參考)。當分子是肽、蛋白質或其片段時，該分子可以體外直接產生或者從核酸表達，該核酸可以在體外產生。合成肽化學的方法是本領域中熟知的。
例如，通過構建編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸表達文庫可以產生丁酰膽堿酯酶變體文庫。產生這些文庫的方法是本領域中熟知的(見，例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)，其在此處被并入作為參考)。編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫可以由DNA、RNA或其類似物組成。例如，通過化學合成RNA分子可以構建含有RNA分子的文庫。
可以通過用戶所希望的任一種方法產生編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫。本領域技術人員將知道可以使用那種方法產生編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫。例如，使用本領域中技術人員熟知的方法(MolecularCloningA Laboratory Manual，Sambrook等人，編者，Cold Spring HarborPress，Plainview，NY(1989))通過對編碼丁酰膽堿酯酶的核酸的誘變可以產生丁酰膽堿酯酶變體。可以將編碼本發明丁酰膽堿酯酶變體的核酸的文庫隨機化以獲得足夠多樣性而含有在丁酰膽堿酯酶的每個氨基酸位置上編碼每一種可能的天然氨基酸的核酸。備選地，可以制備核酸文庫，使得其含有僅在如下位置的每個氨基酸處編碼每種可能的天然氨基酸的核酸，這些位置位于被預測或確定對于喜樹堿轉化或水解活性是重要的丁酰膽堿酯酶區域中。
使用例如，定點誘變(見Wu(編者)，Meth.In Enzymol.卷217，SanDiegoAcademic Press(1993)；Higuchi，″重組PCR″，Innis等人(編者)，PCR Protocols，San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)，每一篇都在此處被完整并入作為參考)可以將一個或多個突變導入編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸分子以產生修飾的核酸分子。這些誘變可以用于導入特定的、所希望的氨基酸變化。從而，可以制備不同文庫，這些文庫在一個或多個被確定對于喜樹堿轉化或水解活性是重要的區域中含有氨基酸改變，還可以制備在一些或所有這樣的區域中含有突變的單一文庫。
使用寡核苷酸-定向誘變可以有效合成和表達丁酰膽堿酯酶變體文庫，如以前被Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，956037-6042(1998)；Wu等人，J.Mol.Biol.，294151-162(1999)；和Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985)所描述的，這些文獻在此處被并入作為參考。寡核苷酸-定向誘變是系統地導入突變的一種熟知且有效的方法，該方法獨立于突變的表型并且因此理想地適用于蛋白質工程的定向進化方法。為了實施寡核苷酸-定向誘變，將編碼所希望的突變的核酸的文庫與野生型序列的含有尿嘧啶的單鏈模板雜交。該方法學是靈活的，允許導入精確誘變而不使用限制酶，并且如果使用基于密碼子的誘變來合成寡核苷酸，該方法是相對廉價的。
基于密碼子的合成或誘變是本領域中熟知的一種方法，其用于避免遺傳冗余而快速有效地在已知氨基酸序列中產生大量改變或者用于產生多樣的隨機序列群體。該方法是美國專利號5,264,563和5,523,388的主題并且也在Glaser等人，J.Immunology1493903-3913(1992)中描述。簡言之，在單獨的反應容器中進行偶聯反應以例如，對規定氨基酸的遺傳密碼的所有20種密碼子進行隨機化，并通過將每個反應容器的產物混合以實現特定密碼子位置的隨機化。混合后，隨機化的反應產物相應于編碼所有20種氨基酸的等量混合物的密碼子，之后將混合物分到單獨的反應容器中以在下一個位置合成每個隨機化密碼子。如果希望，可以用含有等份的20種密碼子的20個容器實現所有20種氨基酸的相等頻率。從而，可以利用該方法產生丁酰膽堿酯酶的全部序列的隨機文庫，或者區域的聚焦文庫，其中所述區域被確定或預測為對于喜樹堿轉化或水解活性是重要的。
此外，還存在上面合成方法的變體方案，其包括，例如，在所希望的位置合成預定的密碼子和在一個或多個密碼子位置上偏向合成預定序列，如Wu，等人，如前引文，1998描述的。偏向合成包括使用兩個反應容器，其中在一個容器中合成預定的或親本密碼子，在第二容器中合成隨機密碼子序列。第二容器可被分成多個反應容器，例如上面描述的用于在特定位置合成規定完全隨機氨基酸的密碼子的反應容器。備選地，諸如通過NNG/T核苷酸或NNX/X的偶聯，其中N是所有四種核苷酸的混合物，可以在第二個反應容器中合成簡并密碼子群體。合成預定的和隨機的密碼子后，將兩個反應容器中的反應產物混合并重新分到另外的兩個容器中以在下一個密碼子位置進行合成。
可以類似使用用于產生各種變體序列的上述基于密碼子的合成方法的改良方案來產生此處描述的丁酰膽堿酯酶變體文庫。該改良方案基于上述兩容器方法，其使合成偏向于親本序列并允許用戶將變體分成含有規定數目的如下密碼子位置的群體，其中所述密碼子位置具有隨機密碼子改變。
簡言之，持續在每個密碼子位置的合成后將反應容器分成兩個新容器，實施該合成。分開后，從第二個容器開始，將來自每一連續的反應容器對的反應產物混合。該混合使得含有相同數目的具隨機改變的密碼子位置的反應產物混合。將第一個和最后一個容器的產物和來自每一連續反應容器對的新近混合的產物分開并再分到兩個新容器中，以繼續合成。在一個新容器中，合成親本密碼子，在另一容器中，合成隨機密碼子。例如，在第一個密碼子位置的合成要求在第一個反應容器中合成親本密碼子和在第二個反應容器中合成隨機密碼子。對于第二個密碼子位置的合成，頭兩個反應容器的每一個被分成兩個容器，產生兩對容器。對于每一對，在一個容器中合成親本容器并在第二個密碼子中合成隨機密碼子。當線性排列時，將第二個和第三個容器中的反應產物混合從而將在單個密碼子位置具有隨機密碼子序列的那些產物合并。該混合還將產物群體減小到3個，這三個群體是下一輪合成的起始群體。類似地，對于第三、第四和每個剩余的位置，將前一位置的每個反應產物群體分開并合成親本和隨機密碼子。
按照上面基于密碼子合成的方法的改良方案，可以方便地分開在1個、2個、3個和4個等位置含有隨機密碼子改變的群體并基于個體的需要使用。此外，該合成方案還允許相對于親本序列富集隨機序列群體，因為僅含有親本序列合成的容器被類似地與隨機密碼子合成分開。
該方法可用于合成編碼如下丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫，這些丁酰膽堿酯酶變體在一個或多個被預測對于喜樹堿轉化或水解活性是重要的區域中具有氨基酸改變。
備選地，使用基因改組也可以產生編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫。基因改組或DNA改組是一種定向進化方法，其通過重組產生多樣性(見，例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；Crameri等人，Nature 391288-291(1998)；Stemmer等人，美國專利號5,830,721，1998年11月3日頒發)。基因改組或DNA改組是使用所選突變基因池的體外同源重組的一種方法。例如，可以使用特定基因的點突變體池。例如，使用DNA酶將這些基因隨機片段化，并通過PCR再裝配。如果希望，可以使用來自不同生物的同源基因實施DNA改組以產生多樣性(Crameri等人，如前，1998)。如果希望，可以進行多輪片段化和再裝配。所得再裝配的基因構成丁酰膽堿酯酶變體的文庫，這些變體可用于本發明的組合物和方法。
可以在各種真核細胞中表達編碼丁酰膽堿酯酶變體的本發明核酸文庫。例如，可以在哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞，和非酵母真菌細胞中表達核酸。用于表達本發明的編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫的哺乳動物細胞系包括，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)、人293T和人NIH 3T3細胞系。通過穩定的或暫時的細胞轉染可以實現本發明編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸文庫的表達(見，實施例III，表5)。
在基因組中相同位點摻入變異核酸或者異源核酸片段可以產生等基因細胞系，這些細胞系僅在特定變體或異源核酸的表達上不同。單個位點上的摻入使得在基因組中多個位點整合的位置效應最小，該位置效應影響核酸編碼的mRNA的轉錄，并且使得由于每個細胞摻入多個拷貝或者表達一種以上的核酸種類而造成的復雜性最小。本領域中公知的用于將變異的或異源的核酸靶向基因組中的特定位置的技術包括，例如，同源重組、逆轉錄病毒靶定和重組酶介導的靶定。
將變異的或異源的核酸靶向基因組中的單個位點的一種方法，使用Cre重組酶將外源DNA靶向插入真核生物基因組中含有特定重組序列的位點(Sauer和Henderson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855166-5170(1988)；Fukushige和Sauer，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.897905-7909(1992)；Bethke和Sauer，Nuc.Acids Res.，252828-2834(1997))。除了Cre重組酶，還可以使用Flp重組酶使外源DNA的插入靶向基因組中特定位置(Dymecki，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.936191-6196(1996))。可以理解本發明方法中可以使用位點-特異的重組酶和相應重組位點的任何組合以將核酸靶向基因組中的特定位點。
可以在一個載體上編碼適宜的重組酶，該載體與含有編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸的載體共轉染。備選地，重組酶的表達元件可被摻入到表達編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸的相同載體中。除了編碼重組酶的核酸與編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸同時轉染，還可以用編碼重組酶的載體轉染細胞，并可以選擇表達重組酶的細胞。可以用編碼丁酰膽堿酯酶變體的核酸隨后轉染穩定表達重組酶的細胞。
Cre重組酶介導的精確的定點DNA重組可用于產生穩定的哺乳動物轉化體，其含有單一拷貝的編碼丁酰膽堿酯酶變體的外源DNA。如下面例證的，使用改良的雙lox策略(doublelox strategy)可以實質性地增加Cre-介導的靶定事件的頻率。雙lox策略是基于如下觀察lox位點的核心區域內的某些核苷酸變化可以改變Cre-介導的重組的位點選擇特異性而對重組效率幾乎沒有影響(Hoess等人，Nucleic Acids Res.142287-2300(1986))。靶定載體和宿主細胞基因組中loxP和改變的loxP位點(稱為lox 511)的摻入導致通過雙交換事件的位點-特異的重組。雙lox方法比單交換插入重組將位點特異的整合體的回收增加20倍，增加位點-特異的重組的絕對頻率，從而其超過了非正常重組的頻率(Bethke和Sauer，Nuc.Acids Res.，252828-2834(1997))。
丁酰膽堿酯酶變體文庫在哺乳動物細胞系中表達后，可以對隨機選擇的克隆測序并篩選增加的催化活性。對所選克隆測序的方法是本領域中技術人員熟知的并且例如，在Sambrook等人，如前，1992，和Ausubel等人，如前，1998中描述。選擇測量丁酰膽堿酯酶變體的喜樹堿轉化或水解活性的適宜方法取決于各種因素，例如，可以利用的丁酰膽堿酯酶變體的量。例如，通過分光光度法，通過基于微量滴定的測定法，使用多克隆抗丁酰膽堿酯酶抗體以均一地捕獲丁酰膽堿酯酶變體和通過高效液相層析(HPLC)可以測量丁酰膽堿酯酶變體的喜樹堿轉化或水解活性。
通過用本領域中公知的和此處描述的測定法確定催化效率，并比較所測催化效率可以確定與丁酰膽堿酯酶相比丁酰膽堿酯酶變體的增強的喜樹堿轉化或水解活性。例如，用乙酸鄰硝基苯基酯測定法(見實施例II)、CPT-11向SN-38轉化的HPLC測定法(見實施例III)、或細胞毒性測定法(見實施例IV)可以確定丁酰膽堿酯酶變體的喜樹堿轉化或水解活性。為了確保已經徹底篩選了丁酰膽堿酯酶變體文庫，可以繼續篩選每個文庫直到編碼相同丁酰膽堿酯酶氨基酸改變的克隆已經多次被鑒定。
表達具有增強的喜樹堿水解活性的丁酰膽堿酯酶變體的克隆可用于建立適于純化大量丁酰膽堿酯酶的大規模培養物。可以將目標丁酰膽堿酯酶變體克隆到表達載體中并用于轉化細胞系，并可以隨后擴大細胞系。本領域技術人員將知道哪種表達載體適于具體應用。可以將表現出增強的喜樹堿轉化或水解活性的丁酰膽堿酯酶變體克隆到例如，表達載體中，該表達載體攜帶賦予對特定化學劑抗性的基因以允許所轉染細胞的陽性選擇。適于轉染例如，哺乳動物細胞系的表達載體可以含有啟動子，如用于在哺乳動物細胞中選擇的巨細胞病毒(CMV)啟動子。如此處所描述的，可將丁酰膽堿酯酶變體克隆到哺乳動物表達載體并瞬時轉染到人293T細胞中。適于表達丁酰膽堿酯酶變體的表達載體是本領域中熟知的和通過商業途徑可得到的。
可以選擇并試驗表達丁酰膽堿酯酶變體的克隆的喜樹堿轉化或水解活性。可以將攜帶表現出增強的喜樹堿轉化或水解活性的克隆的細胞通過常規細胞培養系統擴大以產生更大量的目標丁酰膽堿酯酶變體。可以收獲濃縮的重組丁酰膽堿酯酶變體并通過本領域中熟知的和例如，由Masson等人Biochemistry362266-2277(1997)(其在此處被并入作為參考)描述的方法純化重組丁酰膽堿酯酶變體。
具有增強的血清半壽期的丁酰膽堿酯酶變體可用于檢驗受試者中丁酰膽堿酯酶變體或者治療個體中癌癥。用以增加丁酰膽堿酯酶變體的血清半壽期的有用方法包括，例如，將丁酰膽堿酯酶變體轉化成四聚體；將合成的和天然的聚合物，如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖共價連接到截短的丁酰膽堿酯酶變體；脂質體制劑；或將酶作為Ig融合蛋白表達。如此處所公開的，通過將宿主細胞系以COLQ基因共轉染以及向所轉染細胞的培養基中加入聚-L-脯氨酸可以實現丁酰膽堿酯酶變體向四聚體的轉化。用于增加丁酰膽堿酯酶變體的血清半壽期的這些方法和本領域中公知的其他方法可以用于檢驗動物受試者中丁酰膽堿酯酶變體或者治療個體中癌癥。
本發明提供了通過將喜樹堿衍生物與選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸，將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法。在一個實施方案中，拓撲異構酶抑制劑是SN-38。在另一實施方案中，喜樹堿衍生物是CTP-11。在一個實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加2倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加10倍或以上，或與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加50倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加100倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加200倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加300倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加400倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加500倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加1000倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加5000倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加2000倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加3000倍或以上。
在一個實施方案中，本發明提供了通過將喜樹堿衍生物與具有如SEQID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、或196所示序列或者其功能片段的丁酰膽堿酯酶變體在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸，將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法。例如，在一個實施方案中，本發明提供了通過將喜樹堿衍生物與具有如SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列或者其功能片段的丁酰膽堿酯酶變體在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸，將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在再一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在再一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO10中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO14中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQID NO24中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO26中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO28中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO30中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO32中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO34中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO36中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO38中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO40中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO42中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO44中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQID NO46中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO48中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO50中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO52中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO54中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO56中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO58中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO60中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO62中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO64中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO66中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQID NO68中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO70中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO72中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO74中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO76中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO78中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO80中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO82中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO84中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO86中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO88中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQID NO90中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO92中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO94中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO96中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO98中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO100中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO102中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO104中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO106中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO108中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO110中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO112中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO114中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO116中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO118中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO120中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO122中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO124中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO126中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO128中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO130中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO132中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO134中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO136中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO138中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO140中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO142中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO144中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO146中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO148中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO150中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO152中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO154中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO156中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO158中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO160中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO162中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO164中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO166中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO168中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO170中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO172中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO174中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO178中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO180中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO182中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO184中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO186中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ IDNO188中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO190中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO192中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO194中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體具有SEQ ID NO196中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。
本發明還提供了通過將紫杉醇前藥與選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許紫杉醇前藥向紫杉醇轉化的條件下接觸，將紫杉醇前藥轉化成紫杉醇的方法。在一個實施方案中，丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加2倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加10倍或以上，或與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加50倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加100倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加200倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加300倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加400倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加500倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加1000倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加5000倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加2000倍或以上，與丁酰膽堿酯酶相比轉化能力增加3000倍或以上。
紫杉醇前藥諸如紫杉醇-2-乙基碳酸酯(PC)在人類癌癥的嚙齒動物模型中具有顯著水平的抗腫瘤活性。紫杉醇(也稱作TAXOL)最初從太平洋紫杉(Pacific yew)樹的樹皮中分離并且已經被用于治療一些癌癥，它們包括，例如，乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌和卡波西肉瘤。這類化療劑的作用機理是穩定微管蛋白。血清羧酸酯酶諸如大鼠羧酸酯酶已經被證明可以將紫杉醇前藥，如PC，轉化成紫杉醇。這些血清羧酸酯酶增強了PC對肺癌和黑素瘤細胞系的細胞毒性(Senter等人，Cancer Res.561471-1474(1996))。本發明的丁酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶變體可用于將紫杉醇前藥如PC轉化成活性藥物用以治療癌癥。
如此處描述的，表現出增強的喜樹堿轉化或水解活性的丁酰膽堿酯酶變體可以在體外以及體內轉化或水解底物，如喜樹堿衍生物或紫杉醇。例如，通過將底物加入從丁酰膽堿酯酶變體文庫克隆的培養物分離的上清液，可以在體外將喜樹堿衍生物丁酰膽堿酯酶底物與本發明的丁酰膽堿酯酶變體接觸。備選地，可以在與底物接觸前純化丁酰膽堿酯酶變體。本領域技術人員可以容易地確定適于底物如喜樹堿衍生物底物與本發明的丁酰膽堿酯酶變體接觸的介質條件。如下面描述，使用捕獲劑，如抗體可以將來自培養上清液的丁酰膽堿酯酶變體固定，之后與底物接觸，這使得可以除去培養上清液組分并能夠使固定的變體與底物在無污染物存在下接觸。本發明的丁酰膽堿酯酶變體與底物接觸后，可以測量變體酶的活性。例如，本發明的丁酰膽堿酯酶變體與喜樹堿衍生物接觸后，可以通過本領域中公知的和此處描述的各種方法，如高效液相層析或細胞毒性測定法測量喜樹堿轉化或水解活性。
本發明還提供了通過對個體使用有效量的選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段來治療癌癥的方法，該丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段表現出與丁酰膽堿酯酶相比將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力增加。在一個實施方案中，癌癥是轉移性結腸癌。在另一實施方案中，癌癥是卵巢癌。在另一實施方案中，癌癥是肺癌，例如，小細胞肺癌或非小細胞肺癌。在再一個實施方案中，癌癥是非何杰金氏淋巴瘤。在另一實施方案中，癌癥是中樞神經系統癌。
本發明還提供了通過對個體施用有效量的選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、202和204的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段來治療癌癥的方法，該丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段表現出與丁酰膽堿酯酶相比將CPT-11轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力增加。在一個實施方案中，拓撲異構酶抑制劑是SN-38。
本發明還提供了通過對個體施用有效量的選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、202和204的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段來治療癌癥的方法，該丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段表現出與丁酰膽堿酯酶相比將紫杉醇前藥轉化成紫杉醇的能力增加。在一個實施方案中，癌癥是轉移性結腸癌。在另一實施方案中，癌癥是卵巢癌。在另一實施方案中，癌癥是乳腺癌。在再一實施方案中，癌癥是肺癌。在再一實施方案中，癌癥是卡波西肉瘤。
公知紫杉醇和喜樹堿衍生物是針對各種癌癥的有效化療劑。例如，CTP-11已經被FDA批準用于治療結腸癌。CTP-11向SN-38的水解的改善將有助于該藥物的有用性和減小在患者中的副作用。例如，CTP-11治療的副作用可誘導腹瀉、脫發、惡心、嘔吐、骨髓抑制、高血糖、脫毛癥和膽堿能癥狀(Moertel等人，Cancer Chemo.R.5695-101(1972)；Muggia等人，Ca.Chemother.Rep.56515-521(1972))。除了結腸癌，已經在各種其它癌癥中試驗了這些藥物(見，Hare等人，Cancer Chemother.Pharmacol.39187-191(1997)，其在此處被并入作為參考)。
本發明提供了通過施用治療有效量的丁酰膽堿酯酶變體治療個體中癌癥的方法。可以考慮，通過施用治療有效量的丁酰膽堿酯酶變體治療個體中癌癥的方法可以是施用一種變體，該變體還含有抗體或抗體片段，例如，CD20(SEQ ID NOS198和200)和EGF(SEQ ID NOS18和20)抗體和此處描述的相應片段。丁酰膽堿酯酶變體的有效劑量取決于例如，施用途徑和形式、被施用的分子的效力和生物活性半壽期、個體的體重和狀況，和以前或并存的治療。本領域技術人員使用此處提供的教導和指導可以確定對于本方法的具體應用而言被認為是有效劑量的適宜量。例如，可以從此處描述的體外或體內丁酰膽堿酯酶測定法外推該適宜量。本領域中技術人員將認識到在治療期間需要監視個體的狀況并相應調節所使用的組合物的量。
為了治療癌癥，本發明的丁酰膽堿酯酶變體的治療有效量可以為，例如，約0.1mg/kg到0.15mg/kg體重，例如，約0.15mg/kg到0.3mg/kg，約0.3mg/kg到0.5mg/kg，或約1mg/kg到5mg/kg，這取決于治療方案。類似地，允許丁酰膽堿酯酶變體定時釋放的制劑將使得可以將更小量的丁酰膽堿酯酶變體連續釋放給進行癌癥治療的個體。可以理解，必須基于變體的催化活性調節丁酰膽堿酯酶變體的劑量，從而與具有較低喜樹堿轉化或水解活性的變體的所需劑量相比，可以施用較低劑量的具有顯著增強的喜樹堿轉化或水解活性的變體。
可以系統地，如靜脈內或動脈內遞送丁酰膽堿酯酶變體。用本領域中普通技術人員公知的配制方法以藥學上可接受的制劑中的分離的并基本純化的多肽和多肽片段的形式提供丁酰膽堿酯酶變體。可以通過標準途徑，包括例如，局部、透皮、腹膜內、顱內、腦室內、腦內、陰道內、子宮內、經口、直腸或腸胃外(例如，靜脈內、脊柱內、皮下或肌內)途徑施用這些制劑。此外，丁酰膽堿酯酶變體可被摻入生物可降解的聚合物，該聚合物允許該化合物的持續釋放以治療個體的癌癥癥狀。生物可降解的聚合物和它們的用途在例如，Brem等人，J.Neurosurg.74.441-446(1991)(其在此處被并入作為參考)中描述。
丁酰膽堿酯酶變體可以作為溶液或懸浮液與藥學上可接受的介質一起施用。這種藥學上可接受的介質可以為，例如，水、磷酸鈉緩沖液、磷酸緩沖鹽水、生理鹽水或林格液或其他生理緩沖鹽水，或者其他溶劑或載體，如乙二醇、甘油、油，如橄欖油或可注射的有機酯。藥學上可接受的介質可以還含有生理學上可接受的化合物，它們例如，穩定或增加丁酰膽堿酯酶變體的吸收。這些生理學上可接受的化合物包括，例如，糖類，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑如EDTA，其破壞微生物膜；二價金屬離子例如，鈣或鎂；低分子量蛋白；脂質或脂質體；或者其他穩定劑或賦形劑。
適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性無菌注射液，如上述藥學上可接受的介質。該溶液可以還含有，例如，緩沖劑、細菌抑制劑和使得制劑與目的受體的血液等滲的溶質。其他制劑包括，例如，水性和非水性無菌懸浮液，它們可包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以在單位劑量或者多劑量容器，例如，密封的安瓿和小瓶中給出，并且可以在凍干條件中保存，需要例如，臨使用前加入無菌液體載體。可以從前面描述的無菌粉劑、粒劑和片劑制備現用現制的注射溶液和懸浮液。
本發明的丁酰膽堿酯酶變體可以與其他治療劑用于聯合治療中。包括丁酰膽堿酯酶變體的聯合治療可由分別單獨在適宜制劑中包含變體和其它的治療劑的制劑組成。備選地，聯合治療可以由融合蛋白組成，其中丁酰膽堿酯酶變體連接到異源蛋白，如治療蛋白或抗體或抗體片段上。
施用抗體治療劑的體內模式可包括腹膜內、靜脈內和皮下施用融合多肽抗體或其功能片段。抗體治療劑的劑量是公知的或可由本領域中技術人員常規地確定。例如，典型地施用這些劑量以便實現血漿濃度為約0.01μg/ml到約100μg/ml，約1-5μg/ml或約5μg/ml。按照每體重的量計，這些劑量通常相應于約0.1-300mg/kg，約0.2-200mg/kg或約0.5-20mg/kg。根據需要，在治療期間可以一次或多次施用劑量。通常，劑量將隨著受試者的年齡、狀況、性別和病理程度而變并且應不要太高以導致不利的副作用。此外，治療期間也可以由醫生調節劑量以增強治療或減小副作用的潛在發展。這些方法是公知的并且由本領域中技術人員常規實施。
通過施用編碼多肽或變體的核酸也可以將本發明的丁酰膽堿酯酶變體遞送到個體。本發明丁酰膽堿酯酶變體的編碼核酸可以與本領域中公知的各種基因治療方法結合以遞送治療有效量的多肽或變體。使用此處提供的教導和指導，丁酰膽堿酯酶變體的編碼核酸可以被摻入本領域中公知的載體或遞送系統并用于遞送并表達編碼序列以實現治療有效量。本領域中公知的適宜載體和遞送系統包括，例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒、綴合配體的顆粒和用于靶定的核酸、分離的DNA和RNA、脂質體、聚賴氨酸、和細胞療法，包括肝細胞療法(其使用被修飾而表達丁酰膽堿酯酶變體的細胞的移植)，以及本領域中公知的各種其他基因遞送方法和改良方法，如Shea等人，Nature Biotechnology17551-554(1999)中描述的方法，該文獻在此處被并入作為參考。
通過表達編碼核酸序列遞送丁酰膽堿酯酶變體的方法的具體實例是本領域中熟知的并且在，例如，美國專利號5,399,346、美國專利號5,580,859、5,589,466、5,460,959、5,656,465、5,643,578、5,620,896、5,460,959、5,506,125；歐洲專利申請號EP 0779 365 A2、PCT No.WO 97/10343、PCT No.WO97/09441、PCT No.WO 97/10343中描述，所有這些文獻都在此處被并入作為參考。還存在本領域中技術人員公知的其他方法并且它們可類似用于通過表達編碼核酸序列遞送丁酰膽堿酯酶變體。
可以理解，此處提供的本發明定義中還包括修改方案，它們不會實質性影響本發明的各種實施方案的行為。因此，下面的實施例旨在闡明但不限制本發明。
實施例I丁酰膽堿酯酶變體文庫該實施例描述了合成和表征哺乳動物細胞中表達的丁酰膽堿酯酶變體文庫。通過將被確定為對于丁酰膽堿酯酶的催化活性重要的殘基突變，產生丁酰膽堿酯酶變體的最初文庫。在Silicone Graphics Octane計算機上用Sybyl 6.4軟件中的FlexiDock程序(Tripos Inc.，St.Louis，MO)將底物停靠到丁酰膽堿酯酶的活性部位，以確定丁酰膽堿酯酶內對催化活性潛在重要的殘基。用如此處描述的基于PCR的誘變或者基于密碼子的誘變，突變對催化活性重要的殘基并將它們包裝到文庫中。
例如利用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)通過人丁酰膽堿酯酶DNA的PCR-定點誘變產生丁酰膽堿酯酶變體文庫。用三種寡核苷酸引物實施誘變。誘變引物與一般引物如SP6啟動子測序引物(MBI Fermentas，Amherst，NY)同時使用以擴增丁酰膽堿酯酶cDNA的一端。在QuiaQuickPCR(Qiagen，Santa Clarita，CA)上根據生產商的方案清潔PCR反應產物(巨引物(mega primer))以除去過量引物。所清潔的巨引物在第二個PCR反應中延伸以產生每種變體的完整1.8kb編碼序列。
將組成丁酰膽堿酯酶變體的1.8-kb片段克隆到pGS質粒中并再次測序以確保存在所希望的突變。質粒pGS與pRc/CMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)相同，只是Neo基因已經被大鼠谷氨酰胺合成酶代替。這些變體可以在例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中穩定表達，或者例如，如下面描述的，在293T細胞中瞬時表達。
例如，通過對人丁酰膽堿酯酶DNA的基于密碼子的誘變也產生了丁酰膽堿酯酶變體文庫。基于結構建模或者不同物種之間的序列比對預測的對催化效率重要的丁酰膽堿酯酶區域是誘變的靶標。在表1中顯示了經預測對催化效率重要的7個區域。
被選擇用于聚焦文庫合成的丁酰膽堿酯酶的7個區域所跨越的殘基包括8個芳香族活性部位溝殘基(W82、W112、Y128、W231、F329、Y332、W430和Y440)以及兩個催化性三聯體殘基。保持位于65Cys-92Cys、252Cys-263Cys、400Cys-519Cys之間的鏈內二硫鍵的完整性以確保功能性丁酰膽堿酯酶結構。此外，在文庫合成中通常避開位于殘基17、57、106、241、256、341、455、481、485、和486處的假定的糖基化位點(N-X-S/T)。總體上，7個聚焦文庫跨越79個殘基，代表約14％的丁酰膽堿酯酶線性序列，并導致約1500種不同丁酰膽堿酯酶變體的表達。
通過如上面描述的基于密碼子的誘變，合成相應于所要誘變的人丁酰膽堿酯酶的7個區域的核酸文庫。簡言之，通過如由Glaser等人，如前引文，1992以前描述的β-氰乙基亞磷酰胺化學，用多個DNA合成柱合成寡核苷酸。在第一步中，在一個柱上合成編碼丁酰膽堿酯酶的氨基酸的三核苷酸，而第二柱被用于合成三核苷酸NN(G/T)，其中N是dA、dG、dC和dT氰乙基亞磷酰胺的混合物。使用三核苷酸NN(G/T)導致具有最小簡并性的徹底誘變，這通過所有20種氨基酸在每個位置的系統表達來實現。
合成第一個密碼子后，將來自兩個柱子的樹脂混合在一起，分開，并置于四個柱子中。通過添加針對每個密碼子的額外合成柱并混合柱樹脂，簡并寡核苷酸池將基于誘變的程度分離。基于密碼子的誘變的樹脂混合方面使得該方法快速并且劃算，因為其不需要合成多種寡核苷酸。在本研究中，編碼單氨基酸突變的寡核苷酸池被用于合成聚焦的丁酰膽堿酯酶文庫。使用寡核苷酸-定向的誘變(Kunkel，如前，1985)可以將編碼含有單個氨基酸突變的丁酰膽堿酯酶變體的寡核苷酸克隆到例如，雙lox靶定載體中。當與野生型丁酰膽堿酯酶比較時，發現來自上述文庫的一些丁酰膽堿酯酶變體具有增強的催化活性。使用此處描述的各種測定法，諸如乙酸鄰硝基苯基酯水解測定法和SN-38的HPLC測定法，還測定了來自上述文庫的變體的增強的羧酸酯酶活性。在HPLC測定中，來自這些文庫的一種稱為F227A(SEQ ID NO2)的變體表現出與野生型丁酰膽堿酯酶相比丁酰膽堿酯酶活性增加至少3倍。F227A在人丁酰膽堿酯酶多肽序列中含有單個氨基酸置換，該置換為用丙氨酸代替了227位的苯丙氨酸。在DNA水平上，這是從TTT密碼子向GCG密碼子的改變。
使用F227A變體作為模板，產生了額外的定點突變，導致構建了一些雙突變體。被選擇用于定點突變的區域是如此處描述的預測對催化效率重要的殘基(見，例如，表1)。例如，產生了下面的雙突變(見表2)。作為參考，在圖11中顯示了人丁酰膽堿酯酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS21和22)。
表2

使用293T人胚腎細胞在瞬時系統中表達含有雙突變的丁酰膽堿酯酶變體。簡言之，在第1天，將293T細胞以1.5×105個細胞/孔鋪在BioCoat24-孔板中。然后允許細胞過夜恢復。在第二天，將2μl Lipofectamine2000/孔在50μl Opti-MEM/孔中稀釋并孵育5分鐘。在50μl Opti-MEM/孔中稀釋500ng-1μg DNA/孔。將兩種稀釋的溶液混合，室溫下孵育20分鐘。從細胞除去培養基并用500μl/孔完全生長培養基(沒有青霉素或鏈霉素)代替。隨后向每孔加入100μl稀釋的溶液，并在細胞上孵育4小時。從細胞除去培養基/DNA/Lipofectamine 2000，并每孔用1ml的Ultraculture無血清培養基(Bio Whittaker)代替。允許丁酰膽堿酯酶變體多肽積累48-96小時并直接使用來自細胞的條件培養基。對于其他應用，可以如下述實施例VI中描述的純化丁酰膽堿酯酶變體多肽。
如下描述的測定含有雙突變的丁酰膽堿酯酶變體的活性。例如，使用乙酸鄰硝基苯基酯水解測定法、使用基于HPLC的CTP-11轉化活性測定法，和對癌細胞系的細胞毒性，測定變體的羧酸酯酶活性。
實施例II丁酰膽堿酯酶變體的羧酸酯酶活性該實施例表明了一些丁酰膽堿酯酶變體的羧酸酯酶活性。羧酸酯酶活性的標準測定法是乙酸鄰硝基苯基酯(o-NPA)水解測定法(見Beaufay等人，J.Cell.Biol.61188-200(1974))。如下描述地實施該測定法的一種改良方法，其測量通過用抗丁酰膽堿酯酶的抗體捕獲來標準化的丁酰膽堿酯酶變體的o-NPA活性。
通過乙酸鄰硝基苯基酯確定捕獲的丁酰膽堿酯酶的羧酸酯酶活性的方案1)用PBS(100ml/孔)中的10mg/ml兔抗人丁酰膽堿酯酶(Dako#A0032)在4℃包被96孔Immulon2板過夜。
2)除去包被溶液并用PBS(250ml/孔)中的3％BSA在室溫封閉板2小時。
3)加入200ml丁酰膽堿酯酶變體條件培養基并在室溫孵育2小時。
4)用250ml/孔PBS洗滌板3次。
5)加入85ml/孔0.1M磷酸鉀，pH 7.0。
6)向100ml乙腈中加入13.6mg o-NPA，混合以溶解。向100ml該母液中加入6.3ml水并充分混合。
7)用PBS洗滌板3次。
8)加入15ml稀釋的o-NPA底物。
9)在405nm讀出吸收。
使用上述抗-丁酰膽堿酯酶抗體捕獲/標準化測定法檢驗來自293T細胞中瞬時表達的丁酰膽堿酯酶變體的條件培養基的羧酸酯酶活性。如在圖1中代表性測定法中所示，一些丁酰膽堿酯酶變體表現出羧酸酯酶活性。圖1中所示的第一個變體是F227A(見最左邊的柱)。其他變體的活性水平可以與F227A的活性水平相比較。該測定中野生型丁酰膽堿酯酶的活性水平為用F227A所看到的活性水平的約50％。為了確定該測定中存在的變異(variability)，一些孔含有相同的變體。例如，除了第一個孔之外，還要四個孔被標記為含有F227A變體。所有5個孔中的活性水平是類似的并表明該測定中存在低水平的變異。
通過該方法鑒定的實現羧酸酯酶底物水解的丁酰膽堿酯酶殘基包括F227、A328、Y332、T284、P285、L286。該測定法可用于快速篩選許多變體的活性。在該測定法中測定的活性可以預測CPT-11的活化并可用于鑒定與CTP-11活化有關的BChE的殘基或區域。
實施例III丁酰膽堿酯酶變體的CTP-11轉化活性該實施例表明與丁酰膽堿酯酶相比丁酰膽堿酯酶變體具有增加的CTP-11轉化活性。
如Dodds和Rivory，Mol.Pharmacol.561346-1353(1999)(其在此處被并入作為參考)中描述的，使用高效液相層析(HPLC)檢測SN-38形成來測定丁酰膽堿酯酶變體的CPT-11轉化活性。圖2中顯示了CPT-11向SN-38的轉化。簡言之，來自瞬時表達的BChE變體的條件培養基在37℃暴露于20mM CTP-11 72小時并通過HPLC分析SN-38形成(在約4分鐘的柱存留時間處的峰)。圖3顯示了使用來自模擬-轉染的細胞的條件培養基產生的SN-38的量，模擬-轉染意味著如通常的進行轉染，然而不加入DNA。圖4顯示了使用來自用F227A轉染的細胞的條件培養基產生的SN-38的量，圖5顯示了使用來自用F227A/L286S轉染的細胞的條件培養基產生的SN-38的量。
如圖3-5中所示，F227A變體產生少量SN-38，與模擬和F227A變體條件培養基相比，變體F227A/L286S表現出CPT-11向SN-38的顯著轉化。在該測定中，野生型丁酰膽堿酯酶沒有表現出可檢測的SN-38水平。
通過該方法鑒定的與野生型丁酰膽堿酯酶相比能增強地將CPT-11轉化為SN-38的丁酰膽堿酯酶變體包括F227A(SEQ ID NO2)、F227A/T284A(SEQ ID NO4)、F227A/L286Q(SEQ ID NO6)、F227A/L286S(SEQ ID NO8)、F227A/L286H(SEQ ID NO10)、F227A/L286W(SEQ ID NO12)、和F227A/S287P(SEQ ID NO14)。表3顯示了這些變體中CTP-11向SN-38轉化的大概提高倍數。實際的提高倍數可以比表3中所列的高得多，因為表3中的值是基于與野生型丁酰膽堿酯酶比較的提高倍數。因為野生型丁酰膽堿酯酶的活性在該測定中極低(小于1％轉化)，所以野生型丁酰膽堿酯酶的值傾向于比其他活性值更具可變性。因此，表2中所列的活性值是這些變體的活性的非常保守的值，因此表3中變體具有至少所列的活性值或者更高值。例如，與丁酰膽堿酯酶相比，丁酰膽堿酯酶變體F227A/L268S(SEQ ID NO8)的喜樹堿轉化活性增加至少50倍。換句話說，與丁酰膽堿酯酶相比，丁酰膽堿酯酶變體F227A/L268S(SEQ ID NO8)表現出轉化能力增加50倍或更大。
表3

實施例IV通過丁酰膽堿酯酶變體引起的丁酰膽堿酯酶介導的細胞毒性和增強的CPT-11活化殺傷作用該實施例表明與丁酰膽堿酯酶相比，丁酰膽堿酯酶變體在癌細胞中具有增強的細胞毒性。
用細胞毒性測定法闡明BChE變體活化CPT-I1的水平。將臨床相關濃度的CPT-11(0.5-10mM)在37℃下暴露于BChE變體24-72小時。簡言之，將4mM CPT-11與表達的野生型BChE、6-6變體或F227A/L286Q變體孵育72小時。SW48結腸癌細胞被暴露于濃度為0.5mM的活化的CTP-11 72小時并通過MTT方法測量細胞存活力。MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑)測定法可通過商業途徑得到并且可用于基于細胞還原一種氧化還原敏感染料的能力測量細胞存活力。注意6-6變體是在全文中用于描述變體的命名法中被稱為A328W/Y332M/S287G/F227A(SEQ ID NO16)的四突變體。6-6變體在突變位置處含有下面的密碼子GCG編碼氨基酸位置227處的丙氨酸，GGT編碼氨基酸位置287處的甘氨酸，ATG編碼氨基酸位置332處的甲硫氨酸，TGG編碼氨基酸位置328處的色氨酸。
如圖6中所示，在BChE和BChE變體存在下SW48結腸癌細胞中CTP-11介導的細胞毒性顯著增強了。6-6變體(SEQ ID NO16)和F227/L286Q(SEQ ID NO6)變體都表現出增強的由CPT-11活化介導的腫瘤細胞細胞毒性。
實施例V用于CTP-11靶定活化的抗體-丁酰膽堿酯酶融合多肽該實施例說明了抗-EGF受體-BChE融合多肽的構建和表征，該融合多肽可用于使用CPT-11的抗體定向的酶前藥療法(ADEPT)。
將BChE(截短的L530單體)的N-末端融合到抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體ch225的CH1結構域的C-末端構建模型抗體-BChE融合多肽。兩個結構域通過GGGS接頭或者天然抗體鉸鏈區連接。
產生了模型抗體-酶融合多肽，其表現出抗原結合和催化酶功能。圖9中顯示了小鼠抗-EGF可變輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。圖10中顯示了小鼠抗-EGF可變重鏈和恒定重鏈1鉸鏈區及L530的核苷酸和氨基酸序列。
截短的L530單體在Blong等人，Biochem.J.327747-757(1997)中描述并且該文獻在此處被并入作為參考。該單體含有在C末端截斷的BChE，從而其不裝配成使用野生型BchE時所看到的四聚體。L530單體保留了大部分或所有的丁酰膽堿酯酶(BChE)活性。
圖7中顯示了ELISA試驗，其表明了表達的抗-EGFR-BChE L530與抗-κ捕獲抗體的結合并通過丁酰硫代膽堿水解測量了結合的丁酰膽堿酯酶的活性。這表明完整融合多肽(通過抗體輕鏈結合)表現出丁酰膽堿酯酶活性。
抗-EGFR-L530的抗-κ捕獲的方案如下1)用200ml于PBS中的10mg/ml抗人κ抗體過夜包被96-孔Immulon 2板。
2)用PBS(250ml/孔)中的3％BSA在室溫下封閉板2小時。
3)用250ml/孔PBS洗滌板3次。
4)加入200ml BChE條件培養基并在室溫孵育2小時。
5)通過將5mM DTNB母液在0.1M磷酸鉀(pH7.0)中以1∶10稀釋制備DTNB的工作液。每孔加入180ml。
6)通過將200mM丁酰硫代膽堿(BTC)母液在水中以1∶20稀釋制備工作液。每孔加入20ml。
7)37℃孵育板并在分光光度計上以A405nm讀數。
圖8中顯示了ELISA測定法，其測量了特異結合含有EGFR抗原的細胞膜制品的抗-EGFR-BChE L530的丁酰膽堿酯酶活性。這些結果表明了融合蛋白通過抗體結構域的抗原特異結合和丁酰膽堿酯酶結構域的酶活性。
抗-EGFR與A431膜制品結合的方案如下1)用在10mM HEPES pH 7.4、0.1％Triton X-100中以1/20稀釋的50ml/孔A431細胞裂解物包被96-孔Immulon 2板，并在通風廚中過夜干燥。
2)用PBS(250ml/孔)中的3％BSA在室溫下封閉板2小時。
3)用250ml/孔PBS洗滌板3次。
4)加入200ml BChE條件培養基并在室溫孵育2小時。
5)通過將5mM DTNB母液在0.1M磷酸鉀(pH 7.0)中以1∶10稀釋而制備DTNB的工作液。每孔加入180ml。
6)通過將200mM丁酰硫代膽堿(BTC)母液在水中以1∶20稀釋制備工作液。每孔加入20ml。
7)37℃孵育板并在分光光度計上以A405nm讀數。
實施例VI純化和表征丁酰膽堿酯酶變體該實施例說明了可以怎樣純化丁酰膽堿酯酶變體多肽。這些純化的多肽可用于，例如，此處描述試驗和藥物組合物中。
為了純化丁酰膽堿酯酶變體，將相應于每種變體的培養基通過Buchner漏斗上的Whatman#1濾紙(Whatman Inc.，Clifton，NJ)過濾。將濾液倒入層析柱(XK50/30，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，該層析柱填裝有100ml親和凝膠普魯卡因酰胺-Sepharose 4B。丁酰膽堿酯酶變體在上樣期間粘附到親和凝膠上，從而以前在20升中的20mg酶被濃縮到100ml親和凝膠中。隨后用20mM磷酸鉀(pH 7.0)和1mM EDTA中的.3M氯化鈉洗滌親和凝膠以洗脫污染性蛋白。然后，用含有20mM磷酸鉀和1mMEDTA的緩沖液(pH 7.0)洗滌親和凝膠以減小離子強度。最后，用250ml溶于緩沖液的0.2M普魯卡因酰胺洗脫丁酰膽堿酯酶變體。
為了進一步純化丁酰膽堿酯酶變體并除去普魯卡因酰胺，可以實施另一純化步驟。將在第一個純化步驟中回收的丁酰膽堿酯酶變體用緩沖液(20mM TrisCl，1mM EDTA pH7.4)稀釋10倍以將離子強度減小到約0.02M。將稀釋的酶加到含有400ml弱陰離子交換劑DE52(Whatman，Clifton，NJ)的柱子上。在該低離子強度下，丁酰膽堿酯酶變體粘附到陰離子交換凝膠上。上樣完成后，用含有20mM TrisCl和1mM EDTA的緩沖液(pH7.4)2升洗滌柱子直到洗脫物在280nm處的吸收接近0，表明普魯卡因酰胺被洗除。隨后，用20mM TrisCl(pH7.4)中的0到0.2M NaCl的鹽梯度從柱上洗脫丁酰膽堿酯酶變體。丁酰膽堿酯酶變體洗脫后，用級分收集器為每種變體收集10ml級分。實施活性測定以鑒定含有丁酰膽堿酯酶變體的峰。可以實施SDS凝膠電泳以確定每種丁酰膽堿酯酶變體的純度，通常確定的純度為約90％。
實施例VII抗體-BChE融合蛋白的產生和體外靶定前藥活化和細胞毒性的評價該實施例闡明了在抗體-定向的酶前藥治療模型中BChE變體的優化。通過文庫篩選鑒定了摻入優化的變異殘基的抗體-酶融合蛋白并通過靶定CD20——B淋巴細胞上存在的一種非內化細胞表面抗原——證實了在使用CPT-11的ADEPT中使用優化的BChE的可行性。
CD20是檢驗ADEPT中使用優化的BChE的可行性的有用靶抗原，因為該抗原在人B淋巴瘤細胞系中大量表達(3.2×105個分子/細胞)并且在抗體結合時不經歷顯著的內化。AME133是一種人源化抗-CD20，其具有圖19和20中所示并如SEQ ID NOS198和200所示的完全人種系構架區，其相應核酸序列為SEQ ID NOS197和199。在Applied MolecularEvolution使用該公司的定向進化策略產生了該抗體，并且單價Fab以極高的親和力(1×10-9M)結合CD20。產生并在圖19中顯示了融合蛋白的示例性模型(抗-CD20-BChE.4-1)。抗-CD20-BChE.4-1(SEQ ID NO202)由在CH1重鏈結構域的C-末端與修飾的BChE變體L530(SEQ ID NO204)的N-末端融合的AME 133 Fab組成，修飾的BChE變體L530是參比SEQID NO180的功能片段。BChE變體在氨基酸530處被截斷而不能正常裝配成四聚體。該酶的單體形式表現出與天然四聚體形式的每個亞單位等價的活性，沒有由于如Blong等人，Biochem J327(Pt3)747-57(1997)描述的變構效應而損失活性。
使未貼壁的HEK293細胞適應于在無血清的低蛋白質培養基(UltraCULTURE，Bio Whittaker)中的懸浮培養并用融合蛋白瞬時轉染，產率為2-5mg/L。開發了兩步純化方法，其使用在Sepharose Q上的陰離子交換，然后在苯基Sepharose上的疏水相互作用層析。這導致產物純度＞90％，通過SDS-PAGE檢測到一個主要污染帶。該融合蛋白對CPT-11的Km值保持與單獨BChE.4-1變體的相同。還產生并表達了對照融合蛋白構建體。它們是在CH1重鏈結構域的C-末端與截斷的野生型BChE的N-末端融合的AME133 Fab (抗-CD20-BChE.wt)和與BChE.4-1融合的抗-表皮生長因子受體(EGFR)Fab。
如圖14中所示，與對照抗-EGFR-BChE構建體相比，抗-CD20-BChE融合蛋白表現出對CD20陽性SKW腫瘤細胞的抗原特異結合。通過碘化丁酰硫代膽堿的BChE特異水解檢測結合的融合蛋白。
為了闡明融合蛋白在ADEPT中的效用，證明抗-CD20-BChE融合蛋白在體外緊密結合腫瘤細胞并在CPT-11存在下產生細胞毒性SN38。將抗原陽性SKW 6.4人B淋巴細胞與抗-CD20-BChE.4-1一起孵育并通過洗滌除去未結合的融合蛋白。然后將細胞與濃度遞增的CPT-11孵育4小時并再次洗滌。72小時后評估細胞存活性。用抗-CD20-BChE.4-1孵育后，觀察到相對于用模擬條件培養基處理的細胞，CPT-11的EC50降低了7到10倍(圖15)。簡言之，將活腫瘤細胞與抗-CD20-BChE.4-1或模擬條件培養基預孵育并洗滌，然后暴露于一系列濃度的CPT-11，暴露時間為4小時。結合的融合蛋白導致CTP-11殺傷的EC50的顯著減小。在72小時的MTT測定中評價細胞存活性。使用對照抗-EGFR-BChE.4-1或抗-CD20-BChE.Wt的類似實驗表明沒有比僅用CTP-11時增加的細胞毒性。在這些實驗中，每1×106(1.2mg)SKW細胞定位約0.8單位融合蛋白BTC活性。
在用200mg/m2CPT-11治療的患者中，CPT-11的血漿濃度至少24小時保持高于0.1μM(Ducreux等人，Ann Oncol14 Suppl 2ii17-23(2003))。CPT-11作為單一藥劑給藥，高達500mg/m2，并且血漿峰濃度與劑量成比例(Mathijssen等人，Clin Cancer Res72182-94(2001)；Ducreux等人，如前引文，2003)。這些發現證明了在CPT-11濃度為藥理學相關的并且可以在患者中隨時間維續的濃度時，體外抗-CD20-BChE.4-1對腫瘤細胞的靶定殺傷。
實施例VIII為了提高CPT-11的活化對丁酰膽堿酯酶的優化該實施例闡明了鑒定摻入來自不同文庫區域的有益突變的其它變體，該鑒定導致尤其是H77F，F227A，P285N，V331A變體(SEQ ID NO180)的分離，H77F，F227A，P285N，V331A變體也被稱作4-1變體，其在CPT-11水解方面表現出比野生型BChE增強＞3000倍(圖12)，并且其對于CPT-11的Km提高5-6倍(從40μM到～7μM)。
合成了一系列聚焦的BChE變體文庫，這些文庫對應于被預測沿著酶的活性部位溝(Harel等人，如前，1992)排列的氨基酸。針對7個不同文庫區域(6-15個殘基)使用編碼單氨基酸突變的寡核苷酸的池，用含有尿嘧啶的單鏈DNA作為寡核苷酸-定向誘變(Glaser等人，如前引文，1992)的模板合成文庫。將轉化的文庫鋪在瓊脂上，挑取細菌克隆并以96-孔形式生長以用于DNA質粒制備。
BChE質粒變體在人胚腎細胞系293T中瞬時表達并在轉染后72小時測定活性。通過在SW48結腸癌細胞細胞毒性測定中間接測量CTP-11的酶促活化(圖2)，實施變體的初步篩選。該系統中酶表達的孔間變異小于20％。為了避免鑒定表達變體，僅挑選表現出毒性增加＞2倍的命中物。通過對來自最初制備物的相應DNA的測序分析，表征在這些測定中鑒定的功能性命中物。初步篩選鑒定了該酶的25個不同位置上的65種有益的氨基酸改變。通過熒光檢測反相HPLC(Dodds和Rivory，Mol Pharmacol561346-53(1999)分離的SN38，以定量方式直接測量BChE-介導的CPT-11水解。該方法用于比較由表達的變體與野生型酶形成的SN38并計算變體對于CPT-11的Km。鑒定摻入來自不同文庫區域的有益突變的額外變體，該鑒定導致分離了一種變體，其在CPT-11水解方面表現出比野生型BChE增強＞3000倍(圖12)，并且對于CPT-11的Km提高5-6倍(從40μM到～7μM)(圖13)。圖13顯示了BChE變體4-1水解CPT-11的Hofstee圖。在37℃下將酶與濃度范圍1-80μM的CPT-11孵育24小時。變體表現出的Km為6.9μM，其比天然血清BChE的特征性40μM Km提高5倍以上。速度(v)是在540nm的光吸收單位。底物濃度[s]為μM CPT-11。
為了定量由BChE變體4-1造成的SN38形成，將野生型(20μg)或BChE.4-1(0.05μg)酶與CTP-11在37℃孵育24小時。酸化樣品并通過反相HPLC在NovaPak C18柱上分離以將SN38和未活化的CTP-11分開。SN38峰的曲線下面積(AUC)被用于比較野生型酶和優化的BChE.4-1變體對CTP-11的活化。
在本申請全文中，已經在括號內引用了各種出版物。每一篇出版物的完整公開在此處被并入本申請作為參考，以便更完全地描述本發明所屬領域的狀態。
盡管參考公開的實施方案描述了本發明，但是本領域技術人員將容易理解所詳述的具體實驗僅用于闡明本發明。應該理解可以作出各種修改而不背離本發明的精神。因此，本發明僅被后面的權利要求所限制。
權利要求
1.含有選自SEQ ID NOS4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
2.權利要求1的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少2倍。
3.含有選自SEQ ID NOS24、26、30、32、34、36、38、104、106、108、110、112、116、118、120、122、124、126、128、132、134、136、140、和142的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
4.權利要求3的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少50倍。
5.含有選自SEQ ID NOS36、108、110、112、122、124、134、178、180、182、186、188、190、192和196的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
6.權利要求5的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少100倍。
7.含有選自SEQ ID NOS178、180、182、184、186、188、192和196的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
8.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少500倍。
9.含有選自SEQ ID NOS178、180、182、184、188和192的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
10.權利要求9的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少600倍。
11.含有選自SEQ ID NOS178、180、182、184、和188的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
12.權利要求11的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少800倍。
13.含有選自SEQ ID NOS178、180、184和188的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
14.權利要求13的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少1500倍。
15.含有選自SEQ ID NOS178、180和188的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
16.權利要求15的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少2000倍。
17.含有選自SEQ ID NOS178和180的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
18.權利要求17的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少2500倍。
19.含有SEQ ID NOS180的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體，或者其功能片段。
20.權利要求19的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，其中，該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比喜樹堿轉化活性增加至少3000倍。
21.權利要求1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的丁酰膽堿酯酶變體或其功能片段，還含有抗體或抗體片段。
22.權利要求21的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述抗體或抗體片段特異結合表皮生長因子受體(EGFR)。
23.權利要求22的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述抗體或抗體片段含有如SEQ ID NOS18和20中所示的氨基酸序列。
24.權利要求21的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述抗體或抗體片段特異結合CD20細胞表面抗原。
25.權利要求24的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述抗體或抗體片段含有如SEQ ID NOS198和200中所示的氨基酸序列。
26.權利要求25的丁酰膽堿酯酶變體，其含有如圖19中所示并指定為SEQ ID NO202的序列。
27.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO178。
28.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO180。
29.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO182。
30.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO184。
31.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO186。
32.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO188。
33.權利要求5的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO190。
34.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO192。
35.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO194。
36.權利要求7的丁酰膽堿酯酶變體，其中所述氨基酸序列含有SEQID NO196。
37.編碼丁酰膽堿酯酶變體的含有選自SEQ ID NOS3、5、7、9、11、13、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、和195的核苷酸序列的核酸，或者該核酸的片段。
38.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO177。
39.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO179。
40.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO181。
41.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO183。
42.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO185。
43.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO187。
44.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO189。
45.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO191。
46.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO193。
47.權利要求37的核酸或者該核酸的功能片段，其中所述核酸序列含有SEQ ID NO195。
48.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
49.權利要求48的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加2倍或以上。
50.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS24、26、30、32、34、36、38、104、106、108、110、112、116、118、120、122、124、126、128、132、134、136、140和142的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
51.權利要求50的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加50倍或以上。
52.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS36、108、110、112、122、124、134、178、180、182、186、188、190、192和196的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
53.權利要求52的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加100倍或以上。
54.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS178、180、182、184、186、188、192和196的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
55.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加500倍或以上。
56.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS178、180、182、184、188和192的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
57.權利要求56的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加600倍或以上。
58.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS178、180、182、184和188的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
59.權利要求58的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加800倍或以上。
60.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS178、180、184和188的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
61.權利要求60的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加1500倍或以上。
62.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS178、180和188的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
63.權利要求62的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加2000倍或以上。
64.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有選自SEQ ID NOS178和180的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
65.權利要求64的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加2500倍或以上。
66.將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，該方法包括將所述喜樹堿衍生物與含有SEQ ID NOS180的氨基酸序列的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段在允許喜樹堿衍生物向拓撲異構酶抑制劑轉化的條件下接觸。
67.權利要求66的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比表現出轉化能力增加3000倍或以上。
68.權利要求48、50、52、54、56、58、60、62、64或66的方法，其中所述拓撲異構酶抑制劑是SN-38。
69.權利要求68的方法，其中所述喜樹堿衍生物是CPT-11。
70.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO178中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
71.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO180中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
72.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO182中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
73.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO184中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
74.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO186中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
75.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO188中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
76.權利要求52的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO190中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
77.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO192中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
78.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO194中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
79.權利要求54的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO196中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
80.治療癌癥的方法，該方法包括對個體施用有效量的選自SEQ IDNOS2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段，該丁酰膽堿酯酶變體或者其功能片段與丁酰膽堿酯酶相比表現出將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力增加。
81.權利要求80的方法，其中所述癌癥是轉移性結腸癌。
82.權利要求80的方法，其中所述癌癥是卵巢癌。
83.權利要求80的方法，其中所述癌癥是肺癌。
84.權利要求80的方法，其中所述癌癥是非何杰金氏淋巴瘤。
85.權利要求80的方法，其中所述拓撲異構酶抑制劑是SN-38。
86.權利要求80的方法，其中所述喜樹堿衍生物是CPT-11。
87.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO178中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
88.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO180中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
89.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO182中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
90.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO184中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
91.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO186中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
92.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO188中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
93.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO190中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
94.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO192中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
95.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO194中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
96.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有SEQ IDNO196中所示的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
97.權利要求80的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體還含有抗體或抗體片段。
98.權利要求97的方法，其中所述抗體或抗體片段特異結合表皮生長因子受體(EGFR)。
99.權利要求98的方法，其中所述抗體或抗體片段含有如SEQ IDNOS18和20中所示的氨基酸序列。
100.權利要求97的方法，其中所述抗體或抗體片段特異結合CD20細胞表面抗原。
101.權利要求100的方法，其中所述抗體或抗體片段含有如SEQID NOS198和200中所示的氨基酸序列。
102.權利要求97的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶含有如圖19中所示并指定為SEQ ID NO202的序列。
103.權利要求97的方法，其中所述丁酰膽堿酯酶變體含有指定為SEQ ID NO180的氨基酸序列，或者該序列的功能片段。
104.權利要求103的方法，其中所述功能片段為L530截短(SEQ IDNO.204)。
全文摘要
本發明提供了丁酰膽堿酯酶變體，通過將喜樹堿衍生物與丁酰膽堿酯酶變體接觸將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的方法，還提供了通過對個體施用有效量的丁酰膽堿酯酶變體治療癌癥的方法，其中該丁酰膽堿酯酶變體與丁酰膽堿酯酶相比將喜樹堿衍生物轉化成拓撲異構酶抑制劑的能力增強。
文檔編號C12N9/00GK1720063SQ200380105080
公開日2006年1月11日 申請日期2003年12月4日 優先權日2002年12月4日
發明者J·D·沃特金斯, J·D·潘庫克 申請人:應用分子進化公司