專利名稱：在原核宿主中生產il－21的制作方法
背景技術：
從人類和其他生物的基因組中可以鑒定并且獲得更多的基因，增加了對于有效表達和純化重組蛋白質的需要。到目前為止在細菌中進行蛋白質的表達是最為廣泛使用的生產克隆基因蛋白質的途徑。由于許多原因，人們優先選擇原核而不是真核細胞進行表達。例如，培養細菌要比培養真核細胞容易得多。更特別的是，由于現在已經有大量復雜精妙的分子遺傳學工具以及上千的突變體，使得大腸桿菌已經成為蛋白質生產中極為有用的表達宿主。但是在大腸桿菌中大量生產有功能的蛋白質，特別是那些真核來源的蛋白質，常常是很困難的。
IL-21(以前被命名為Zalphal 1配基)是IL-2細胞因子家族的一個成員，該家族還包括IL-4，IL-7，IL-9，IL13，和IL-15。已經證明該家族的蛋白質具有抗癌和抗病毒的作用。IL-21由輔助T細胞產生，輔助T細胞是關鍵的免疫調節者。根據IL-21相應受體的表達模式以及使用IL-21給藥，已經證明IL-21激活CD8+殺傷T細胞以及天然殺傷(NK)細胞，它們是兩種清除腫瘤和受病毒感染細胞的淋巴細胞。IL-21還促進B細胞種類的選擇(Parrish et al.，Nature 40857-63，2000)。
已經在原核細胞中，特別是大腸桿菌中表達產生了重組的IL-21。由細菌產生的蛋白質沒有被糖基化，并且是以聚集狀態產生的。從大腸桿菌中制備IL-21要求將聚集狀態的蛋白質被從不溶性的包含體中溶解出來，并且復性或者重折疊。如果沒有復性，則重組蛋白的特異活性會顯著降低。
盡管在細菌宿主中表達重組蛋白質取得了進展，仍然需要有改進的方法用來在原核系統中生產具有生物活性、純化的IL-21蛋白質，因為用原核系統生產蛋白質，產量要高得多。在參閱了下面的詳述之后，就會對本發明的這些方面以及其他方面有清晰明顯的認識。此外下面還有許多不同的參考文獻，這里以它們的整體引用作為參考。
發明概述一方面，本發明提供用于制備IL-21的表達載體，它包含操作性連接的以下元件原核復制起點、轉錄起始DNA元件、如SEQ ID NO27所示的多聚核苷酸序列以及轉錄終止子。另一方面，表達載體是載體pTAP 337。其他實施方案提供的表達載體可以包含選擇性標記。
另一方面，本發明提供轉化了表達載體--包含SEQ ID NO27、編碼SEQ ID NO28所示多肽的多聚核苷酸序列，或者轉化了pTAP337載體的原核宿主細胞。在一個實施方案中，宿主菌株是大腸桿菌W3110菌株或者zGOLDI菌株，它們被保藏于位于弗吉尼亞州Manassas的美國典型培養物保藏中心。
另一方面，本發明提供了在IL-21蛋白被表達的條件下制備IL-21蛋白的方法。在一個實施方案中，此方法包含培養轉化了pTAP337后表達IL-21的宿主細胞。在另一個實施方案中，此方法包含對轉化了包含SEQ ID NO27所示序列的表達載體的宿主細胞進行培養。該方法還包含從生長培養基中回收宿主細胞，然后從宿主細胞中分離出IL-21蛋白。
在其他方面，本發明提供了在補料批量發酵過程中或者批量發酵過程中制備IL-21的方法，這些方法包含了以上所述的步驟。
另一方面，本發明提供了制備IL-21的方法，這些方法包含一下的步驟在搖瓶中用生長培養基培養上述宿主細胞至OD600達到5到20；用含有宿主細胞的搖瓶培養物以比例1-12％(v/v)接種發酵容器；在pH6.2-7.2的生長培養基中培養宿主細胞，在流逝發酵時間(EFT)15小時之前將補料溶液添加到發酵容器內；在20-30小時EFT時向發酵容器內加入誘導劑；在48-56小時EFT時收獲宿主細胞。在一個實施方案中，誘導劑是0.5到2mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。在另一個實施方案中，補料溶液包含選自甘油和葡萄糖的糖，且補料的添加速度是每小時5到15克糖。在另一個實施方案中，補料溶液中的甘油含量是40-70％(v/v)的甘油，或者葡萄糖是40-70％(w/v)的葡萄糖。在另一些實施方案中，甘油含量大約是70％(v/v)，或者葡萄糖含量是60％(w/v)。
一方面，本發明提供了制備IL-21的方法，該方法包含以下步驟在燒瓶內接種接種物，其包含表達SEQ ID NO28所示IL-21多肽的大腸桿菌W3110宿主細胞，或者包含其中有IL-21表達的含有pTAP337載體的大腸桿菌W3110宿主細胞；生長培養基包含大約5克/升的甘油；接種物在大約30攝氏度在生長培養基內培養16-20小時，將培養好的生長培養基中的接種物轉移至批量發酵罐內，濃度為0.5-5％接種物，在大約37攝氏度和pH大約6.8進行發酵，含大約2％的甘油；在大約8小時EFT時引入葡萄糖補料，速度為9.5克葡萄糖/升/小時，且一直補充到一輪發酵過程運行結束；在大約24小時EFT時加入IPTG至終濃度為0.5-2mM，發酵大約28小時的IPTG；從發酵罐中收獲發酵液，加入等體積的水，勻漿，離心收集包含IL-21蛋白物質的細胞沉淀或者細胞漿。
另一方面，本發明提供了一種分離包含SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，該方法包括以下步驟從細胞沉淀或者細胞漿中分離出不溶于水的IL-21蛋白，將不溶的IL-21物質溶解于一種離液序列高的溶劑；稀釋該離液序列高的溶劑并使IL-21蛋白重折疊；并分離IL-21蛋白，其中分離出的IL-21蛋白能具有生物活性。在本發明的一個實施方案中，分離出的IL-21蛋白的純度至少為90％。在另一個實施方案中，分離出的IL-21蛋白的純度至少為90％，且內毒素水平為每毫克IL-21蛋白中的內毒素小于10個內毒素單位。
另一方面，本發明提供了一種分離包含SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，該方法包括以下步驟從發酵液中分離出含有不溶性IL-21物質的細胞沉淀或者細胞漿；勻漿細胞沉淀或者細胞漿收集包含體；將不溶的IL-21物質溶解于包含胍鹽的離液序列高的溶劑；通過加入包含精氨酸鹽以及還原性和氧化性組分混合物的重折疊緩沖液稀釋該離液序列高的溶劑；由過濾去除未折疊的以及聚集的蛋白，分離IL-21蛋白；并用陽離子交換柱純化重折疊的IL-21蛋白，其中分離出的和純化的IL-21能具有生物活性。
另一方面，本發明提供了一種分離包含SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，該方法包含以下步驟從發酵液中分離出含有不溶性IL-21物質的細胞沉淀或者細胞漿；勻漿細胞沉淀或者細胞漿收集包含體；將不溶的IL-21蛋白質物質溶解于包含胍鹽的離液序列高的溶劑；通過加入包含精氨酸鹽以及還原性和氧化性組分混合物的復性緩沖液稀釋該離液序列高的溶劑；由過濾去除未折疊的以及聚集的蛋白，分離IL-21蛋白；用陽離子交換柱純化重折疊的IL-21蛋白；在疏水相互作用柱上純化IL-21洗脫液，其中分離出的和純化的IL-21能具有生物活性。
另一方面，本發明提供了一種分離包含SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，該方法包括以下步驟從發酵液中分離出含有不溶性IL-21物質的細胞沉淀或者細胞漿；將不溶的IL-21蛋白質物質溶解于包含大約6M鹽酸胍、40mM二硫蘇糖醇(DTT)的離液序列高的溶劑中，于室溫作用大約1小時；通過加入包含2mMDTT、4mM胱氨酸氧化還原對的重折疊緩沖液稀釋離液序列高的溶劑至少20倍而使溶解的包含體重折疊；用約20％的乙酸調節pH至大約5.5，并使溶液反應至少5小時，用約1-1.4體積的25mM乙酸鹽緩沖液pH5.5稀釋溶液，過濾，將濾液上樣于用乙酸鈉緩沖液平衡至pH5.5的Tosohaas SP-550C樹脂柱上，用約0.4M的氯化鈉洗樹脂柱，再用大約0.75M的氯化鈉洗樹脂柱以洗脫結合的IL-21蛋白，向洗脫液中加入硫酸銨至濃度約為1.5M并過濾洗脫液，濾液上樣于用含有1.5M硫酸銨、0.05M氯化鈉的乙酸鈉緩沖液平衡的Tosohaas丁基650-M柱上，將洗脫液在用乙酸鈉緩沖液平衡的SP Sepharose HP柱上稀釋，用20倍柱體積的0.3-7M線性梯度氯化鈉洗柱，濃縮IL-21蛋白，并使用切向流超濾將緩沖液交換為制劑緩沖液。在其他實施方案中，上述分離不溶性IL-21蛋白的方法包含使用IL-21受體結合試驗測定生物活性。
另一方面，本發明提供包含IL-21蛋白的組合物，該組合物包含SEQ ID NO28的2-163號氨基酸殘基組成的多肽，在約10mM組氨酸，4.7％甘露醇，pH5.3的溶液中IL-21蛋白濃度為10毫克/毫升。
附圖簡述
圖1圖示了表達質粒pTAP337，該質粒含有密碼子優化了的IL-21核苷酸序列。人的zalphall配基被命名為IL-21。該質粒被保藏于位于弗吉尼亞州Manassas的美國典型培養物保藏中心，專利保藏編號為PTA-4853。
發明詳述提供下面的定義以幫助對本發明的理解。
如這里所使用的，“核酸”或者“核酸分子”是指多聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡聚核苷酸、聚合酶鏈式反應(PCR)產生的片段以及連接、剪切、核酸內切酶作用和核酸外切酶作用中的任何一種所產生的片段。核酸分子可以由天然存在核苷酸的單體組成(例如DNA和RNA)，或者天然存在的核苷酸的類似物(例如天然存在核苷酸的α-光學對映體)或者二者的組合。修飾的核苷酸可以有糖成分的改變和/或嘧啶或嘌呤堿基成分的改變。糖的修飾包裹，例如一個或者更多羥基基團被鹵素、烷基、氨基和疊氮基團取代，或者糖可以被功能化為醚或者酯。而且，整個的糖部分可以被空間排列和電子相似的結構取代，例如氮雜糖以及環狀糖類似物。堿基部分被修飾的實例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、乙酰化的嘌呤或嘧啶、或者其他眾所周知的雜環取代物。核酸單體可以通過磷酸二酯鍵或這種連接的類似物被連起來。磷酸二酯鍵連接的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphoranilidate)、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate，酰基苯胺磷酸酯，氨基磷酸酯等等。術語“核酸分子”還包括所謂的“多肽核酸”，它包含附著在聚酰胺骨架上的天然存在或者修飾的核酸堿基。核酸可以是單鏈或者雙鏈的。
術語“核酸分子的互補物”是指相對于參考核苷酸序列，具有互補核苷酸序列和相反方向的核酸分子。
“增強子”是一類調控元件，它們可以提高轉錄的效率，而無論增強子相對于轉錄起始位點的距離和方向如何。
“異源DNA”是指在給定宿主細胞中不是天然存在的一個或者一群DNA分子。只要宿主DNA與非宿主DNA(即外源DNA)相組合，則對于某個宿主細胞是異源DNA的DNA分子可能含有來自該宿主細胞物種的DNA(即內源DNA)。例如編碼某多肽的非宿主DNA片段，可操作地與包含轉錄啟動子的宿主DNA片段相連，兩片段連接得到的DNA就被認為是一個異源DNA分子。相反，一個異源DNA分子可以包含一個內源基因，可操作地與一個外源啟動子相連。作為另一個例子，包含來自野生型細胞基因的DNA分子如果被引入一個沒有該野生型基因的突變體細胞中，則被認為是異源DNA。
術語“重疊群”是指一個核酸分子，它具有與另一個核酸分子鄰近的一段連續的相同或者互補的序列。認為鄰近序列或者全部或者沿著核酸分子的某部分延伸與該核酸分子的一段給定序列“重疊”。
“互補DNA(cDNA)”是指通過逆轉錄酶從一個mRNA模板合成的單鏈DNA分子。通常使用一個與mRNA中某些部分互補的引物來起始逆轉錄。那些本領域的技術人員還使用術語“cDNA”來指一個由這樣的單鏈DNA分子及其互補DNA鏈組成的雙鏈DNA分子。術語“cDNA”還指從RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
一個“分離出的核酸分子”是指不再整合在生物體基因組DNA中的核酸分子。例如從一個細胞基因組DNA中分離出的編碼一種生長因子的DNA分子就是一個分離出的DNA分子。分離出的核酸分子的另一個實例是沒有整合在生物體基因組中的化學合成的核酸分子。從某個特定物種中分離出的核酸分子小于該物種的染色體完整DNA分子。
“線形DNA”是指具有自由5′和3′端的非環狀DNA分子。線形DNA可以由酶切或者物理破壞而從閉環DNA分子如質粒來制備。
一個“啟動子”是一段指導結構基因轉錄的核苷酸序列。通常，啟動子位于一個基因的5′非編碼區內，靠近結構基因的轉錄起始位點。啟動子內在轉錄起始中起作用的序列元件表征為共有核苷酸序列。這些啟動子包括，例如，但不止限于，可被IPTG誘導型的啟動子、細菌噬菌體T7啟動子和細菌噬菌體λpL啟動子。參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Ha rbor，NY，2001.典型的啟動子具有三個組分，由-35和-10處的共有序列組成，二者之間間隔16-19個核苷酸(Lisset，S.和Margalit，H.，Nucleic Acids Res.211512，1993)。這種類型的啟動子包括lac，trp，trp-lac(tac)以及trp-lac(trc)啟動子。如果啟動子是可誘導型啟動子，則轉錄的速率應答于誘導劑而增加。相反，如果啟動子是一個組成型啟動子，則轉錄的速率不受誘導劑的調控。也已知有可抑制型啟動子。
“核心啟動子”含有啟動子作用(包括轉錄起始)的必需核苷酸序列。根據該定義，在沒有可能提高活性或賦予組織特異活性的特異序列時，一個核心啟動子可能有或者沒有可檢測到的活性。
“調控元件”是一段調節核心啟動子活性的核苷酸序列。例如，一個真核調控元件可能含有一段與細胞內的因子結合的核苷酸序列，這些因子使得僅僅在或者優先在特定的細胞、組織或者細胞器中激活轉錄。這些類型的調控元件通常與具有“細胞特異”、“組織特異”或者“細胞器特異”表達型式的基因相關。細菌啟動子具有與核心啟動子結合并且調節其活性的調控元件，例如與激活因子或者抑制因子分子結合的操縱子序列。
“克隆載體”是一個核酸分子，例如質粒、柯斯質粒或者細菌噬菌體，它們具有在宿主細胞內自主復制的能力。克隆載體通常含有一個或者少量的限制性內切酶識別位點，這些位點允許核酸分子以可確定的方式插入到載體中而載體的基本生物功能不會喪失；克隆載體中還含有編碼標記基因的核苷酸序列，這些序列編碼的標記基因適用于鑒定和篩選被克隆載體轉化了的細胞。標記基因通常包括提供抗生素抗性的基因。
“表達載體”是編碼在宿主細胞內表達的基因的核酸分子。通常情況下，表達載體包含轉錄啟動子、基因、復制起始點、選擇性標記以及轉錄終止子。基因的表達通常是在啟動子的控制下，這樣的基因“可操作地連接在”啟動子上。類似的，如果調控元件調節核心啟動子的活性，則可操作地將調控元件與核心啟動子連接。表達載體還可以被稱作表達構建體。
“重組宿主”是含有異源核酸分子--例如克隆載體或者表達載體--的細胞。
術語“表達”是指一個基因產物的生物合成。例如，對于一個結構基因而言，表達涉及結構基因轉錄為mRNA以及mRNA翻譯成為一個或者更多的多肽。
術語“分泌信號序列”是指編碼一個多肽(“分泌肽”)的一段DNA序列，該肽是一個更大多肽的一部分，它指導這個大的多肽在其被合成的細胞內通過一條分泌途徑。在這個大的多肽通過分泌途徑的轉運過程中分泌肽通常被切割去掉。
“多肽”是由肽鍵連接起來的氨基酸殘基的多聚體，不論它們是天然產生的還是合成的。小于大致10個氨基酸的多肽通常被稱為“肽”。
“蛋白質”是包含一個或者更多多肽鏈的大分子。蛋白質還可能包含非肽組分，例如糖基團。可以在蛋白質中加入糖和其他非肽取代基。在這里蛋白質根據它們的氨基酸骨架結構定義；取代基例如糖基和非肽基團一般不指明，但是它們可能存在。
由非宿主DNA分子編碼的肽或者多肽是“異源的”肽或者多肽。
“分離的多肽”所指的多肽基本上沒有被細胞組分如糖、脂類或者其他天然情況下與該多肽結合的蛋白性雜質污染。通常分離的多肽制備物包含該多肽高度純化的形式，即至少大約80％純、至少約90％純、至少大約95％純、大于95％純或者大于99％純。證明某蛋白質制備物含有分離的多肽的一種方法是對該蛋白質制備物進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，用考馬斯亮藍染色出現單一條帶。但是術語“分離的”并不排除同一多肽以其他物理形式存在，例如二聚體或者其他的糖基化或衍生的形式。
這里使用術語“氨基末端”或“N末端”以及“羧基末端”或“C末端”以指示多肽內部的位置。在上下文允許時，這些術語的使用是指一個多肽的特定序列或者部分，以表明鄰近程度或者相對位置。例如，一個多肽內部相對于參考序列位于其羧基末端指鄰近參考序列的羧基末端，但是并不一定位于整個多肽的羧基末端。
“融合蛋白”是由至少包含兩個基因的核苷酸序列的核酸分子表達出的雜合蛋白質。
這里使用術語“親和標簽”以表示一個多肽片段，該片段可以被連接在第二個多肽上以純化或檢測第二個多肽，或者為第二個多肽與底物結合提供位點。原則上，對于任何肽或者蛋白質只要有抗體或者其他特異結合試劑，則這些肽或蛋白質就可以被用作親和標簽。親和標簽包括多聚組氨酸、蛋白A(Nilsson et al.，EMBOJ.41075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.1983(1991))，谷胱甘肽硫轉移酶(Smith和Johnson，Gene 6731(1988))，谷氨酸-谷氨酸親和標簽(Grussenmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 827952(1985))，P物質，FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology 61204(1988))，鏈親和素結合蛋白或者其他抗原性表位或結合結構域。一般地參見Ford et al.，Protein Expressionand Purification 295(1991)。可以從商品化供應商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)處獲得編碼親和標簽的DNA分子。
術語“等滲的”在這里使用的是其通常含義，即與血液相同的滲透壓，相當于0.9％的氯化鈉溶液。一種鹽類的“等滲量”是指制備等滲溶液或者在重溶凍干制品時產生等滲溶液所需要的量。
這里的濃度規定為液體組合物的摩爾濃度單位或者單位體積內的質量百分含量。當組合物的形式是凍干粉時，各個組分的濃度應該保證凍干粉重溶后得到規定的濃度。
由于標準分析方法的不精確性，我們理解分子量和多聚體的長度為大致的數值。當這樣的一個數值表示為“大約”X或者“大致”X時，所述X數值理解為精確到X±10％。
重組IL-21的表達本發明提供了從原核宿主中生產重組IL-21的表達載體和方法。IL-21；以前被命名為zalphal 1配基，在通常所指的美國專利6,307,024中有詳盡的描述，這里引用作為參考。特別地，本發明的表達載體和方法包含用于大規模生產IL-21的大腸桿菌表達系統，它使用的IL-21編碼序列中有為大腸桿菌中的翻譯而優化密碼子和mRNA的二級結構的核苷酸特異改變。使用本發明的表達載體和方法，在補料批量發酵中IL-21基因在大腸桿菌中的表達水平大于1克/升。本發明的發明者發現使用大腸桿菌OmpT蛋白酶缺陷株UT5600作為生產宿主克服了IL-21met的穩定性問題。IL-21met是在5′端加上一個編碼N末端甲硫氨酸的密碼子的IL-21編碼多聚核苷酸序列。使用這里描述的表達載體顯著提高了從細菌中回收的重組蛋白的產量。使用該生產宿主菌株，從搖瓶培養得到產量大于50毫克/升的IL-21met包含體。在另一個實施方案中，為了有助于開發高細胞密度補料批量發酵，選擇了另外一種大腸桿菌菌株W3110作為IL-21大規模生產的宿主。該宿主菌株沒有病原性，且在最低限度的發酵培養基中可以生長至高細胞密度。使用搖瓶和批量發酵，大腸桿菌菌株W3110中IL-21met的生產能力與大腸桿菌菌株UT5600相當。
本發明還提供在IL-21被原核宿主表達之后在宿主細胞內形成未糖基化的不溶性包含體時，從宿主中回收重組IL-21蛋白的方法。當裂解原核細胞以分離包含體(也被稱為折射體)時，包含體是IL-21的聚集物。因此，必須將包含體解聚并且溶解以分離IL-21蛋白，通常這需要使用具有變性作用的離液序列高的溶劑，結果回收的多肽必須進行重折疊才能具有明顯的生物活性。IL-21蛋白重折疊后，必須對其進行捕獲和純化。因此，本發明提供的方法用于從原核細胞中分離不溶性IL-21蛋白、將不溶性IL-21蛋白溶解于一種離液序列高的溶劑、稀釋離液序列高的溶劑使IL-21蛋白重折疊和分離之。本發明還包括使用陽離子交換層析從稀釋的重折疊緩沖液中捕獲復性的IL-21的方法以及使用疏水相互作用層析純化重折疊的IL-21蛋白的方法。在使用IL-21受體等的結合試驗中使用陰離子交換對IL-21蛋白進一步純化。
人IL-21基因編碼一個162個氨基酸組成的多肽。全序列包括如SEQ ID NO1和2所示的29個氨基酸的信號肽，以及包含氨基酸殘基30號(Gln)到162號(Ser)的共133個氨基酸的成熟蛋白質。使用原核表達系統表達的IL-21序列具有N末端甲硫氨酸，且核苷酸序列以及相應的氨基酸序列由SEQ ID NO27和28表示。SEQ ID NO27的核苷酸序列顯示了經密碼子優化的序列，該序列屬于本發明的范疇。
使用哺乳動物表達系統生產重組人IL-21的產量大致是20毫克/升的蛋白。因此需要更為劃算的表達系統來進行IL-21的大規模生產。大腸桿菌系統是大規模生產的一個更好的選擇。存在一個潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點，但是在使用哺乳動物系統于CHO細胞系中表達蛋白時或者使用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中表達蛋白時該位點不被占據。這一結構特性使IL-21成為進行原核表達的良好候選者。在大腸桿菌中的表達比在其他表達系統中表達有很多優勢，特別是低的開發成本和高的產量。
在大腸桿菌中表達的具有N末端殘基的重組IL-21(IL-21met)，在細胞破碎之后以不溶性包含體的形式被分離出來。這種物質沒有正確地折疊因此不具有所需的生物活性。大多數情況下包含體需要在具變性作用的離液序列高的溶劑中溶解，并稀釋離液序列高的溶劑使蛋白質重折疊，然后進行純化。蛋白質重折疊所需的最佳環境差異很大。影響正確折疊的且有生物活性物質回收的因素包括起始蛋白質濃度、氧化狀態、pH、賦形劑、鹽、去污劑、溫度、重折疊緩沖液加入的方式等等。與IL-21結構和序列相似的蛋白質IL-2，已經在大腸桿菌系統中表達并且成功地重折疊(Weir et al.，J.Biochem.24585，1987.)。一種人IL-2的重組突變蛋白ALDESLEUKIN已經在大腸桿菌系統中作為包含體表達并且在體外重折疊。
對人IL-21cDNA使用的密碼子進行考查顯示其含有過量的大腸桿菌中極少使用的密碼子。含有大量稀有密碼子的基因往往在大腸桿菌中表達的水平較低(Kane，Curr Opin Biotechno l.6(5)494-500，1995)。另一個與人IL-21在大腸桿菌中表達有關的問題是在IL-21序列中有四個潛在的OmpT切割位點。OpmT是一種內肽酶，它特異地在兩個連續堿性氨基酸中間切割，該酶在變性條件下(例如8M尿素和6M鹽酸胍)具有活性(White et al.，J Biol Chem.270(22)12990-4，1995；Dekker et al.，Biochemistry，40(6)1694-701，2001)。這引起了對于大腸桿菌細胞提取物中IL-21穩定性的擔心，原因就是OmpT的蛋白酶活性。
一些實驗室已經證明如果在宿主體內增加某些稀有tRNA的水平，則含有稀有密碼子的基因的表達水平會有顯著提高。(Zdanovsky etal.，Appl Environ Microbiol.66(8)3166-73，2000；Calderoneet al.，J Mol Biol.262(4)407-12；Kleber-Janke et al.，Protein Expr Purif.19(3)419-24，2000；You et al，.Biotechniques.27(5)950-4，1999.)。pRARE質粒編碼大腸桿菌內稀有的tRNA基因(argU，argW，leuW，proL，ileX和glyT)及其天然的啟動子(Novy et al.，InNovations，122-3，2001)。在大腸桿菌內與pRARE共同表達使IL-21met的產量提高了5-10倍。在大腸桿菌內與pRARE共同表達還降低了大腸桿菌細胞裂解物中截斷的IL-21met的水平，這提示使用更為適當的密碼子重新合成IL-21met基因是有益的。
本發明還提供了一個表達載體，該載體包含為在大腸桿菌中進行翻譯而進行了密碼子優化的IL-21的編碼序列。編碼IL-21met的合成基因是通過重疊PCR得到的。最后的PCR產物引入一個表達載體，用于在Tac啟動子的控制下的表達。但是表達水平低。對IL-21met cDNA的二級結構進行檢查發現極其穩定的發夾結構。懷疑該發夾環就是阻止已經完全優化的序列有效進行表達的結構元件。當使用SEQ ID NO1中的序列代替優化序列中的前80個堿基之后，發夾結構被除去。SEQ IDNO27顯示了雜合的IL-21，該所得基因在大腸桿菌中有高水平的表達。使用新表達構建體的表達水平增加到細胞總蛋白的大約20％或者100毫克/升。
適合于在原核細胞中生產所需蛋白質的表達載體通常包含(1)編碼細菌復制起點的原核DNA元件，用于維持細菌宿主中的表達載體；(2)控制轉錄起始的DNA元件，例如啟動子；(3)控制轉錄產物加工的DNA元件，例如轉錄終止子；以及(4)編碼選擇標記例如抗生素抗性的基因。原核宿主細胞在引入表達載體以及適當的誘導劑之后產生IL-21。因此，本發明著重考慮的是包含啟動子、優化的IL-21核苷酸序列以及終止子的表達載體。SEQ ID NO27給出了優化的IL-21核苷酸序列的示例。在另一個實施方案中，表達載體還包含選擇性標記。在一個實施方案中，選擇標記是卡那霉素抗性。
表達載體還包含編碼肽標簽的核苷酸序列以幫助純化目的蛋白質。在分離重組多肽中有用的肽標簽包括，例如，多聚組氨酸標簽(與鎳螯合的樹脂有親和性)、c-myc標簽、鈣調蛋白結合蛋白(通過用鈣調蛋白親和層析分離)、P物質、RYIRS標簽(與抗RYIRS抗體結合)、谷氨酸-谷氨酸標簽以及FLAG標簽(與抗FLAG抗體結合)。參見例如Luo et al.，Arch.Biochem.Biophys.329215(1996)，Morgantiet al.，Biotechnol.Appl.Biochem.2367(1996)，和Zheng et al.，Gene 18655(1997)。可以從例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，MO)得到編碼這些肽標簽的核酸分子。
本領域內具有普通技術的人員熟悉多種用于制備表達載體的分子技術。例如IL-21多聚核苷酸可以通過使用相互引發的長的寡聚核苷酸以及這里描述的核苷酸序列(參見例如Ausubel(1995)8-8到8-9頁)合成核酸分子來制備。使用聚合酶鏈式反應已經建立的技術使得能夠合成至少2kb長的DNA分子(Adang et al.，Plant Molec.Biol.211131(1993)，Bambot et al.，PCR Methods and Applications2266(1993)，Dillon et al.，″Use of the Polymerase ChainReaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，″inMethods in Molecular Biology，Vol.15PCR Protocol sCurrentMethods and Applications，White(ed.)，263-268頁，(HumanaPress，Inc.1993)，以及Holowachuk et al.，PCR Methods Annal.4299(1995))。
另外一種構建表達系統的方法使用的是利用酵母系統的同源重組。參見美國專利6,207,442號--通過同源重組構建質粒，在這里引用作為參考。該系統提供了一個通用的受體質粒，該質粒可以用于克隆編碼任何目標多肽(包括融合多肽)的DNA。該系統提供了制備雙鏈環形DNA的方法，此DNA包含了編碼目標蛋白的DNA區域。一個或者更多編碼目標蛋白質如IL-21的供體DNA片段在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞內與受體質粒、第一DNA連接物以及第二DNA連接物結合，由此供體DNA片段與受體質粒通過供體DNA、受體質粒以及連接物之間的同源重組連接進入受體質粒形成閉合的環形質粒。
還可以使用例如氨基磷酸酯方法的實驗方案，利用“基因機器”來合成本發明的核酸分子。如果一項應用，例如合成基因或者基因片段需要化學合成的雙鏈DNA，則每條互補DNA鏈分別合成。短基因(60-80bp)的制備在技術上可以直接進行，并可由合成互補的鏈之后使其退火而實現。但是對于長基因(＞300bp)的制備則需要特殊的策略，因為在DNA化學合成中每一個循環的偶聯效率很少能達到100％。為了解決這個問題，從長度為20-100個核苷酸的單鏈片段以模塊形式裝配成合成基因(雙鏈)。對于多聚核苷酸合成的綜述參見例如Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles andApplications of Recombinant DNA(ASM Press 1994)，Itakura etal.，Annu.Rev.Biochem.53323(1984)，以及Climieetal.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 87633(1990)。
其他可以用于制備IL-21基因和表達載體的技術包括，例如限制性內切酶消化和連接以及聚合酶鏈式反應，它們都是本領域內眾所周知的。
多種類型的選擇性標記基因可以利用(見例如Kaufman，Meth.Enzymol.185487(1990)；Kaufman，Meth，Enzymol.185537(1990))表達載體中通常包含選擇性標記，例如四環素抗性、氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、新霉素抗性或者氯霉素抗性。選擇標記使被表達載體轉化的細胞從沒有被轉化的細胞中被選擇和/或檢測出來。一個表達載體可以攜帶一個以上的這種抗生素抗性基因。一個沒有使用抗生素抗性的選擇標記的實例使用來自R1質粒的hok/sok系統。hok基因編碼52個氨基酸長的有毒的HoK蛋白質，且sok基因編碼一個反義RNA，它與hok mRNA的引導序列互補。本領域內的技術人員知道該選擇標記，并其在Gerdes，K.et al.，Genetic Engineering，1949-61，1997中有更詳細的描述。
本發明包括了多種不同的適宜重組宿主細胞，它們包括，但是不限于，革蘭氏陰性原核宿主生物體。適宜的大腸桿菌菌株包括W3110，K12-衍生的菌株MM294，TG-1，JM-107，BL21，和UT5600。其他適宜的菌株包括BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE，DH1，DH4I，DH5，DH5I，DH5IF′，DH5IMCR，DH10B，DH10B/p3，DH11S，C600，HB101，JM101，JM105，JM109，JM110，K38，RR1，Y1088，Y1089，CSH18，ER1451，ER1647，E.coli K12，E.coli K12 RV308，E.coli K12 C600，E.coli HB101，E.coli K12 C600R.sub.k-M.sub.k-，E.coliK12 RR1(參見例如Brown(ed.)，Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991))。其他革蘭氏陰性原核宿主可以包括粘質沙雷菌(Serratia)、假單孢菌(Pseudomonas)、柄桿菌(Caulobacter)。原核宿主可以包括革蘭氏陽性生物體，例如芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌以色列變種，還有鏈霉菌，例如鉛青鏈霉菌(S.lividans)，生二素鏈霉菌(S.ambofaciens)，弗氏鏈霉菌(S.fradiae)，和灰褐鏈霉菌(S.griseofuscus)。適宜的枯草芽孢桿菌菌株包括BR151，YB886，MI119，MI120，以及B170(參見例如Hardy，″Bacillus Cloning Methods，″in DNACloningA Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press 1985))。在原核宿主中擴增載體的標準技術對于本領域內的技術人員是眾所周知的(參見例如Ausubel et al.(eds.)，Short Protocols inMolecular Biology 3rd Edition(John Wiley & Sons 1995)；Wu etal.，Methods in Gene Biotechnology(CRC Press，Inc.1997))。對于原核生物中蛋白酶缺陷菌株的綜述，參見Meerman et al.，Biotechnology 121107-1110，1994。本發明使用W3110菌株作為示例，該菌株被保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，編號為ATCC#27235。
操作克隆的DNA分子以及向多種不同宿主細胞中引入外源DNA的技術在Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989，以及Ausubel et al.，eds.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987.中予以公開。用常規的步驟培養轉化的或者轉染的宿主細胞，使用的培養基中含有營養物和被選宿主細胞生長所需的其他組分。本領域內已知有多種不同的適宜培養基，包括成分明確的培養基和復合培養基，且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素以及礦物質。培養基中還可以根據需要含有例如生長因子或者血清等組分。生長培養基一般通過例如藥物選擇或者必需營養物的缺失來選擇含有外源DNA的細胞，藥物選擇或者一種必需營養物的缺失通過表達載體上攜帶的或者共轉染入宿主細胞內的選擇標記得到彌補。用常規的方法，例如振蕩小型搖瓶或者向發酵罐內通氣，為液體培養基提供充足的通氣。可以對轉化的細胞進行選擇和擴增以提供表達目標基因的重組宿主細胞。可以使用MBP(麥芽糖結合蛋白)融合系統(New England Biolabs(NEB；Beverly，MA))在大腸桿菌中表達IL-21。在該系統中，IL-21的cDNA連在malE基因的3′端，形成MBP-IL-21融合蛋白。tac啟動子驅動融合蛋白的表達，但是在加入1mmol IPTG誘導啟動子之前表達是“關閉”的。可以按照pMAL-c2載體(NEB)的多克隆位點(MCS)以及生產商的說明將構建體與MBP形成符合讀碼框的融合。
發酵在本發明的一個實施方案中可以使用批量發酵，特別是當需要使用本發明的表達系統進行IL-21的大規模生產時。一般地，批量發酵包含第一階段的種子搖瓶培養，將表達IL-21的大腸桿菌菌株置于適宜的培養基中搖瓶振蕩培養使細菌生長到600nm光密度(OD)達到5-20。適宜的培養基含有的氮來源于例如硫酸銨、磷酸銨、氯化銨、酵母提取物、水解動物蛋白、水解植物蛋白或者水解酪蛋白。由磷酸鉀、磷酸銨、磷酸或者磷酸鈉提供磷。其他的組分有氯化鎂或者硫酸鎂，硫酸鐵或者氯化鐵以及其他微量元素。生長培養基中可以補充糖，例如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖以及甘油以提高生長。在某些實施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是1-20克每升培養基。在某些實施方案中，甘油或者葡萄糖是5-10克/升。從含有抗生素(例如10-50微克/毫升的卡那霉素)的瓊脂培養基上或者冷凍的儲存培養物中取大腸桿菌接種到含有優選的生長培養基的搖瓶(500-2000毫升帶擋板的搖瓶)中開始培養。在搖瓶中的培養溫度是28到40攝氏度。在某些實施方案中，搖瓶在30到37攝氏度培養。搖瓶在培養中的振蕩速度設置為200到300rpm。
使用適宜的生長培養基準備發酵容器，并將容器滅菌。培養基的pH調節為6.5到7.5。在某些實施方案中，pH是6.8，6.9，7.0，7.1或7.2。為容器設置適當的通氣和振蕩水平，從生長10到20小時的600nmOD值達到5-20的第一階段種子搖瓶培養物中取出一定量的培養物進行接種。接種的水平是1到12％(v/v)。在某些實施方案中，接種的水平是3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％v/v。通過提高振蕩速度、提高通氣率、向培養基中通氧或不同方式的組合，使溶解氧的水平保持在20％飽和以上。培養物生長直至600nm的OD值達到2-20的OD單位，然后向培養物中加入IPTG至濃度為0.1-2.0mM。IPTG誘導tac啟動子表達IL-21。或者可以在24小時時以10克/升加入30％的乳糖溶液誘導。讓培養物繼續生長2至8小時。在某些實施方案中，培養物繼續生長3至4小時。
在另一個實施方案中，使用補料批量培養來得到高產量的IL-21蛋白。生產IL-21的大腸桿菌菌株生長在適宜的培養基中，在搖瓶中培養至600nmOD值達到5-20。適宜的培養基含有的氮來源于例如硫酸銨、磷酸銨、氯化銨、酵母提取物、水解動物蛋白、水解植物蛋白或者水解酪蛋白。由磷酸鉀、磷酸銨、磷酸或者磷酸鈉提供磷。其他的組分有氯化鎂或硫酸鎂，硫酸鐵或者氯化鐵以及其他微量元素。生長培養基中可以補充糖，例如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖以及甘油以提高生長。在某些實施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是1-20克/升培養基。在某些實施方案中，甘油或者葡萄糖是5-10克/升。從含有抗生素(例如10-50微克/毫升的卡那霉素)的瓊脂培養基上或者冷凍的儲存培養物中取大腸桿菌接種到含有優選生長培養基的搖瓶(500-2000毫升帶擋板的搖瓶)中開始培養。在搖瓶中的培養溫度是28到40攝氏度。在某些實施方案中，搖瓶在30到37攝氏度培養。搖瓶在培養中的振蕩速度設置為200到300rpm。
使用適宜的生長培養基準備第二階段的發酵容器，并將容器滅菌。適宜的培養基可以是例如Super Broth II(Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)，APS-Super Broth，Luria Broth，或者ZSM(參見表1-4)以及卡那霉素。生長培養基中可以補充糖以促進生長。在某些實施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是1-40克/升培養基。在一個實施方案中，甘油或者葡萄糖是5-10克/升。培養基的pH調節為6.5到7.5。在某些實施方案中，pH是6.8，6.9，7.0，7.1或7.2。為容器設置適當的通氣和振蕩水平，從生長了10-20小時的600nmOD值達到5-20的第一階段種子搖瓶培養物進行接種。接種的水平是1-12％(v/v)。在某些實施方案中，接種的水平是3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％v/v。通過提高振蕩速度、提高通氣速率、向培養基中通氧或上述方法的不同組合，使溶解氧的水平保持在20％飽和以上。
使用適宜的生長培養基準備發酵容器(如上所述)，并將容器滅菌。培養基的pH調節為6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1或7.2。在一個實施方案中，調節培養基pH為6.8。生長培養基中可以補充糖以促進生長。在某些實施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是5-40克/升培養基。在某些實施方案中，甘油或者葡萄糖是15-20克/升。為容器設置適當的通氣和振蕩水平，并從培養了10-20小時的600nmOD值達到5-20的第一階段種子搖瓶培養物進行接種。接種的水平是1-12％(v/v)。在某些實施方案中，接種的比例是5％，6％，7％，8％，9％或10％v/v。通過提高振蕩速度、提高通氣速率、向培養基中通氧或以上方式的不同組合，使溶解氧的水平保持在20％飽和以上。
以發酵運行開始時預先確定的速率向發酵罐內補充糖溶液，但一般是在6小時流逝發酵時間(EFT)以后，且不超過12小時EFT。補料一直持續到發酵結束。補料溶液可以是40-70％v/v的甘油或者40-70％w/v的葡萄糖。在某些實施方案中甘油或者葡萄糖分別是70％v/v甘油和60％w/v葡萄糖。補料速率可以為5-15克葡萄糖或甘油每升每小時。在一個實施方案中補料速率是8、9或10克每升培養基每小時。在20到30小時EFT時，例如在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5-2mM。或者，可以在24小時時以10克/升加入30％的乳糖溶液進行誘導。在48-56小時EFT時，收獲發酵物。或者再向發酵液補充0.5到2mmol/L的IPTG。然后在52-56小時EFT收獲發酵物。
在發酵進行的末尾，將溫度向下調節至4到20攝氏度，維持pH或者將其調整為5.0-9.0。在某些實施方案中，這個范圍是6.0-8.0pH單位。通過給發酵容器增壓，收獲發酵液，通過取樣端口收集培養物。或者可以通過一個取樣端口將培養物泵出。發酵液可以含有10-30％w/v的固體。
IL-21的回收發酵之后離心收獲細胞，重懸于勻漿緩沖液中，使用例如APV-Gaulin勻漿器(Invensys APV，Tonawanda，New York)或者其他類型的細胞破碎裝置，如珠磨機或者超聲波破碎儀進行勻漿。或者從發酵罐中直接取出細胞，在APV-Gaulin勻漿器中勻漿。或者，在勻漿前用水或緩沖液稀釋發酵液。
在一個實施方案中，細胞直接在發酵液中勻漿。例如在4-15攝氏度冷卻APV-Gaulin 1000或APV-Gaulin 2000勻漿器至少30分鐘。將發酵液通過勻漿器，收集細胞懸液。為了獲得最大的細胞破碎，勻漿器的壓力應該設置在6000到14,000磅/平方英寸。在一個實施方案中，勻漿器的壓力設置在10000磅/平方英寸。懸液通過勻漿器1到5次，例如通過3次。在另一個實施方案中，在勻漿前用等體積的水稀釋培養物。在勻漿過程中或者勻漿之后可以通過加入PEI、精胺或者benzonase降低DNA的含量。
離心勻漿產物，傾出上清得到含有包含體的沉淀。用水或者含或不含不同水平的下列化合物的Tris緩沖液洗滌包含體沉淀氯化鈉、尿素、Triton X-100、氯化鋅、月桂基硫酸鈉、蔗糖。
在另一個實施方案中，將發酵液轉移至離心瓶中，2-8℃離心20-60分鐘，收獲細胞。例如，可以使用帶KompSpin KAJ7.100轉頭的Beckman J6MI離心機(Beckman Coulter，Fullerton，CA)，用7500×G離心收獲細胞。可以使用帶Beckman JLA-8.1固定角度轉頭的Avanti JHC離心機8000到15800×G離心或者用Aries JS 5.0旋轉斗轉頭以2.25升的瓶子在7500×G離心。還可以使用如CarrSeparations，Inc.(Franklin，MA)或Westfalia Separator，Inc.(Northvale，NJ)提供的連續離心機。
從離心瓶中取出培養物或者上清。細胞沉淀以每10-30％w/v固體重懸于勻漿緩沖液(100mM Tris，5mM氯化鋅，pH7.5)。發酵液通過APVGaulin勻漿器，并收集細胞懸液。勻漿器的壓力應設置為6000-14000磅/平方英寸，以獲得最大的細胞破碎。在一個實施方案中，壓力是10000磅/平方英寸。懸液反復通過勻漿器1-5次，例如3次。
此外，回收IL-21的方法可以進一步包含IL-21的沉淀、漂洗以及重溶。漂洗后的包含體在6M鹽酸胍或者8M尿素中溶解，在水或者緩沖液中稀釋6-10倍，孵育30分鐘，并離心或者過濾。或者，可以使用超濾或大量過濾漂洗勻漿后的包含體。得到的沉淀用2-6M的尿素漂洗，并含IL-21蛋白。在重溶之前用水再洗沉淀。可以加入Al3+或者Fe3+或者陰離子和陽離子聚合物或者如精胺、PEI和benzonase之類的試劑，以沉淀細胞殘渣、可溶性蛋白、DNA、RNA和糖。
包含體的溶解漂洗過的包含體制備的可以使用含有還原劑，例如β巰基乙醇(10-100mM)或二硫蘇糖醇(5-50mM)的鹽酸胍(5-8M)、硫氰酸胍(5-6M)或者尿素(7-8M)中溶解。溶液可以使用Tris、磷酸、HEPES或者其他適當的緩沖液制備。包含體還可以使用含有月桂基硫酸鈉(0.1-2％)的尿素(2-4M)溶解。可以使用50-200毫升上述的溶液溶解來自1升發酵液的包含體。一種方法是用150毫升在100mM Tris，pH8.0、40mM DTT的溶液中制備的6M鹽酸胍溶解來自1升發酵液的包含體沉淀。在另一個實施方案中，用50-100毫升的8M鹽酸胍溶解包含體漿。用刮鏟混和包含體漿使其重懸然后使用Omni EZ勻漿器(OmniInternational，warrenton，VA)，或者用機械裝置使其重懸。懸液在3-37度混和30-120分鐘。在一個實施方案中，懸液在15-25攝氏度混和以完成溶解過程。然后使用適當的離心機以7,500-16,000×G的轉速在4度離心樣品10-30分鐘。上清中含有溶解的IL-21，將其傾出并保留。
由反相HPLC確定溶解的級分中IL-21的濃度。使用乙腈/三氟乙酸作為Jupiter C5柱(Phenomenex，Torrance，CA)的流動相。在含有胍/DTT/Tris的緩沖液中稀釋IL-21標準物，向層析柱中注入不同量的標準物。IL-21峰下面的面積用于構建標準曲線。在注射到HPLC層析柱之前，用微量離心機離心溶解的IL-21樣品以除去小顆粒。確定IL-21峰下面的面積，則可以根據標準曲線對IL-21進行定量。
此外，可以在這個階段使用切向流過濾、固定化金屬親和層析的反相HPLC來純化溶解的IL-21。
重折疊在本發明的一個方面，從以折射包含體的形式表達IL-21的轉化的大腸桿菌宿主菌株中回收純化IL-21的過程是，破碎細胞并通過離心回收包含體。
然后使用含有還原劑的6M鹽酸胍對包含體進行溶解和變性。然后使用控制的復性步驟氧化被還原的IL-21。該步驟涉及在含有精氨酸鹽酸鹽、鹽以及一種氧化穿梭系統的重折疊緩沖液中進行稀釋。氧化穿梭系統用來起始IL-21分子中二硫鍵的形成，該系統是基于氧化的和還原的分子的混合物，例如半胱氨酸和胱氨酸、DTT和胱氨酸、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以及DTT和氧化型谷胱甘肽。還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比例可以從1∶1到6∶1，濃度的范圍從0.5到8mM。在一個實施方案中，最佳的濃度是4mM還原型谷胱甘肽比2mM氧化型谷胱甘肽。半胱氨酸和胱氨酸的比例可以從2∶1到1∶1，每一種試劑的濃度范圍可以從4mM到1mM。在一個實施方案中，最佳的濃度是4mM半胱氨酸和2mM胱氨酸。還可以使用形成4mM半胱氨酸和2mM胱氨酸的4mM胱氨酸和2mM DTT，獲得最佳的重折疊。還可以在亞硫酸鈉和四硫代硫酸鈉等試劑存在的條件下通過亞硫酸鹽解進行重折疊。使用陽離子交換層析從稀釋的重折疊緩沖液中捕獲復性的IL-21，使用疏水相互作用層析和高效陽離子交換層析純化復性的IL-21。
在攪拌下，將含有IL-21的溶液迅速(1-5分鐘)或者緩慢(0.5-5小時)地加入到重折疊緩沖液中。重折疊緩沖液含有精氨酸(0.5到1.25M)、PEG和鹽。還可以含有甘油、鹽酸胍、尿素、EDTA、蛋白酶抑制劑和分子伴侶、乙醇、去污劑、甘油和硫酸銅。IL-21可以一次加入、多次加入或者連續不斷地補充。IL-21加入到重折疊混合物中的終濃度為0.05到1.2毫克/毫升。溫度的范圍是4-30度。pH是7.3到8,5。將含有重折疊混合物的容器暴露在空氣中，或者在復性過程中通入空氣或者氮氣。重折疊的時間要1到26小時。
還可以在EDTA存在的條件下進行重折疊，以降低甲硫氨酸的氧化，或者使用分子大小排組柱、或者使用切向流過濾或電泳。
重折疊IL-21的澄清和濃縮將重折疊IL-21的pH調節為5.5，然后通過1.2微米的濾膜進行澄清并除去不溶解的蛋白。使用板框式系統上的切向流過濾或者中空纖維濾器對過濾后的溶液濃縮10-30倍。然后使用緩沖液或者水將濃縮產物稀釋3-10倍，使未折疊的和聚集的蛋白沉淀。然后通過一個濾膜使溶液澄清并取出不溶解的蛋白。
或者在水或25mM乙酸鈉pH5.5中將重折疊的IL-21稀釋2倍到10倍。沉淀或者凝絮物形成并且在大約30分鐘到5小時之后過濾除去。可以先后使用1.2微米的標稱濾膜和然后0.45微米的濾膜或者使用具有正zeta電勢的深濾膜除去凝絮物。還可以使用其他濾膜如分級密度濾膜。還可以離心或者微過濾除去凝絮物。
IL-21的捕獲在本發明的另一個方面，在IL-21蛋白重折疊和濃縮之后，本發明的方法包含使用陽離子交換柱從稀釋緩沖液中捕獲IL-21蛋白，以及使用疏水相互作用層析和高效陽離子交換層析純化IL-21蛋白。
捕獲步驟的目的是捕獲稀釋、折疊的IL-21并且開始初步的純化。為了使IL-21結合到層析柱上，首先進行稀釋。澄清、稀釋的IL-21在pH5.5的陽離子交換柱上被捕獲。通常使用SP Sepharose XL(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)或者TOYOPEARL SP 550C(Tosoh Biosep，Montgomery，PA)。平衡緩沖液是25mM乙酸鈉、0.2-0.45M氯化鈉，pH5.5，且使用增加的鹽梯度洗脫結合的IL-21。使用SP Sepharose XL層析柱在大約0.6M氯化鈉處洗脫IL-21，使用TOYOPEARL SP 550C層析柱在大約0.8M氯化鈉處洗脫IL-21。
也可以使用膨脹床層析在重折疊之后捕獲IL-21。這種情況中在將IL-21上樣到柱上的同時在線進行稀釋。使用25mM乙酸鈉、0.2M氯化鈉pH5.5平衡Streamline SP XL(Amersham Biosciences)。將IL-21以向上流動的模式上樣于平衡好的Streamline SP XL樹脂中，樹脂維持在兩倍固定柱床高度處，同時用水進行1∶3在線稀釋。以向上流動和向下流動兩種方式洗柱之后，以向下流動的方式用0.6M氯化鈉或者氯化鈉梯度洗脫IL-21。
本發明的方法提供了多種不同的陽離子交換樹脂在該步驟中的用途，包括弱陽離子交換劑例如羧甲基、不同類型的固相支持物，例如瓊脂糖或纖維素以及不同的顆粒大小。本發明的方法還提供了在5.0到7.0范圍中的不同pH值下以及使用不同的緩沖液和鹽進行層析。或者可以使用其他的層析方法，例如疏水相互作用、陰離子交換及金屬螯合等捕獲重折疊的IL-21。
純化在本發明的一方面中，有IL-21蛋白的中間純化步驟。該步驟的目的是使用疏水相互作用層析對IL-21進行進一步的純化。通常該步驟使用的樹脂是Butyl Sepharose FF(Amersham Biosciences)或者是TOYOPEARL丁基650M(Tosoh Biosep)。使用25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，1.5M硫酸銨，pH5.5的溶液平衡樹脂。陽離子交換層析后純化出的IL-21調節硫酸銨的濃度至1.5M，然后通過0.45微米的標稱濾膜。將經過這些處理的IL-21上樣于平衡好的樹脂上，使用平衡緩沖液洗滌樹脂除去未結合的物質。使用至25mM乙酸鈉、50mM氯化鈉的梯度進行洗脫，在大約0.75M硫酸銨到0.3M硫酸銨時IL-21被洗脫出來。
可以用于該步驟的其他疏水相互作用層析樹脂包括，例如，那些被苯基或者己基取代的介質、不同類型的固體支持物，例如瓊脂糖或纖維素，以及不同的顆粒大小。本發明還提供了在5.0到9.0范圍中的不同pH值下以及使用不同的緩沖液和鹽進行層析。本發明還提供了在IL-21不結合的情況下進行層析的方法。
進一步通過高效陽離子交換層析純化IL-21。通常將IL-21稀釋至電導率為30ms/cm，用0.5M磷酸一氫鹽調節pH至6.0，上樣至Sepharose SP HP(Amersham Biosciences)柱上。使用25mM磷酸鈉，0.3M氯化鈉pH6.0的溶液平衡層析柱。先用平衡緩沖液洗柱，然后用氯化鈉梯度洗脫IL-21。本發明還提供了使用其他高效陽離子交換樹脂。柱可以在5.0到7.5范圍內的不同pH值、在不同緩沖體系，例如磷酸緩沖體系中進行層析。上樣的物質可以使用水或者緩沖液稀釋至電導率范圍在5-35ms/cm之間。
純化IL-21的方法可以包含濃縮以及蛋白質的緩沖液交換。該步驟的目的是濃縮高效陽離子交換柱的洗脫產物，并且將其轉換為制劑緩沖液。使用5kD截留分子量的切向流過濾板框式膜將最后匯集的層析柱洗脫物濃縮大約10倍，對磷酸鹽緩沖液pH6.0或者對10mM組氨酸，4.72％(w/v)甘露醇pH5.0、5.1、5.2或者5.3進行滲濾(diafiltered)，然后第二次濃縮進一步提高IL-21的濃度。
可以使用其他的濾膜，例如3kD或8kD截留分子量的板框式濾膜或者10kD截留分子量的中空纖維系統，來完成這個超濾/滲濾的步驟。根據SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，在高效陽離子交換層析之后IL-21的純度至少是95％，通常大于98％。在陽離子交換層析捕獲、疏水相互作用層析純化以及緩沖液交換之后IL-21的內毒素水平一般小于10內毒素單位每毫克IL-21蛋白，通常小于2內毒素單位每毫克IL-21蛋白。在高效陽離子交換層析之后的內毒素水平一般小于1內毒素單位每毫克IL-21對使用Streamline SP XL以及丁基Sepharose IF(在陽離子交換層析之前沒有進行20倍濃縮)產生的物質進行分析顯示通過大小排阻HPLC測得的聚集物小于0.2％，通過陽離子交換HPLC測得得電荷異質性大約是10％，通過反相HPLC測得的純度大約是90％。對使用Toyopearl SP 550C、Toyopearl丁基650M以及Separose SP HP產生的物質進行分析顯示通過大小排阻HPLC測得的聚集物小于2％，通過反相HPLC測得的純度大約是90％，通過陽離子交換HPLC測得的電荷異質性大約是4％。
可能需要對IL-21進行進一步純化以去除剩余的雜質和污染物。例如可以使用陰離子交換層析柱來降低內毒素水平。將IL-21稀釋至電導率水平小于10mS/cm，調節pH至8.0。上樣至Q Sepharose FF柱(Amersham Biosciences)上，該柱事先平衡至20mMTris pH8.0。與上樣物相比，通過層析柱后的IL-21其內毒素水平降低了大約80％。也可以使用Mustang Q或者Mustang E(Pall，Port Washington，NY)膜在pH5.0到9.0之間降低內毒素水平。
其他有可能用來進一步純化IL-21的純化步驟包括金屬螯合層析、陰離子交換層析或者苯基柱上的疏水相互作用層析。還可以在IL-21重折疊之前進行純化，使用例如反相HPLC、離子交換層析或者金屬螯合層析。因此本發明進一步提供了包含額外純化步驟的方法，這些純化步驟在這里予以公開。
純化IL-21的特性鑒定BaF 3是一種來自于小鼠骨髓的依賴于白細胞介素3(IL-3)的前類淋巴細胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41727-734，1985；Ma theyPrevot et al.，Mol.Cell.Biol.64133-4135，1986)。已經構建了表達全長IL-21受體的BaF3細胞，并且其在美國專利6,307,024號中有全面的描述。該細胞系必須要依賴于與IL-21受體相連的途徑才能存活，所以在沒有其他生長因子的條件下培養該細胞系可以用來檢測出具有生物活性的IL-21。可以使用多種不同稀釋度的純化的IL-21蛋白加入到細胞中，比較接受處理的細胞與沒有IL-21蛋白的細胞的生長，來評價BaF3/IL-21R細胞的增殖。
測量細胞增殖或者分化的試驗是本領域內眾所周知的。例如，測量增殖的試驗方法包括對中性紅染料的化學敏感性的(Cavanaugh etal.，Investigational New Drugs 8347-354，1990，這里引用作為參考)，對放射性標記核苷酸摻入的試驗(Cook et al.，AnalyticalBiochem.1791-7，1989，這里引用作為參考)，或者對增殖細胞DNA中5-溴-2′-脫氧尿嘧啶(BrdU)摻入的試驗(Pors tmann et al.，J.Immunol.Methods 82169-179，1985，這里引用作為參考)，以及使用四唑鹽的試驗(Mosmann，J.Immunol Methods 6555-63，1983；Alley et al.，Cancer Re s.48589-601，1988；Marshall et al.，Growth Reg.569-84，1995；以及Scudiero et al.，Caneer Res.484827-4833，1988；所有的在這里引用作為參考)。測量分化的試驗方法包括例如測量與組織、酶活性、功能活性或者形態變化的階段特異表達相關的細胞表面標記(Watt，FASEB，5281-284，1991；Francis，Differentiation 5763-75，1994；Raes，Adv.Anim.CellBiol Technol.Bioprocesses，161-171，1989；所有的在這里引用作為參考)。通過這里描述的方法制備的IL-21能夠促進BaF3/IL-21R細胞的增殖。
純化的IL-21可以通過多種物理方法進行鑒定。最理想的，氨基酸分析顯示所有殘基的氨基酸組成在預期值正負10％范圍之內。N末端序列給出了一個以甲硫氨酸開始的單一序列，且與根據IL-21表達載體預測的序列相對應。使用質譜進行全分子量分析給出了在IL-21預測分子量(15593.84Da)正負0.01％范圍內的數值。使用內切蛋白酶LysC消化后進行液相層析-質譜可以用來產生一個肽圖，在肽圖中所有的峰全部對應于預測的IL-21中由胰蛋白酶作用產生的肽，并且在肽圖中鑒定出了所有預測的IL-21的胰蛋白酶肽。肽圖作圖還顯示二硫鍵成鍵與對一個屬于IL-2家族的蛋白質進行的二硫鍵成鍵預測是一致的，還顯示沒有出現甲硫氨酸的氧化。
制劑選擇pH以使以下層析中觀察到的降解最小化大小排阻HPLC(形成可溶性二聚體、含量減少)、陽離子交換HPLC(虛脫酰胺化作用)、反相HPLC(通過尚不知道的途徑發生的氧化和降解)。在某些實施方案中，根據緩沖液的緩沖容量、穩定性以及是否適用于注射給藥等方面使用組氨酸緩沖液使pH范圍為5.0到5.6。或者可以使用檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液。在一個實施方案中，依據其穩定性和對冷凍干燥的適合性，選擇甘露醇作為滲透壓調節劑(等滲溶液)。在其他實施方案中可以使用山梨醇或者甘氨酸。可以使用氯化鈉，但是較不穩定。可以使用海藻糖或蔗糖，但是它們可能在這些弱酸性條件下水解。但是制劑可以包含1毫克/毫升到100毫克/毫升的IL-21。在一個實施方案中，IL-21蛋白配制為在10mM組氨酸，4.7％w/v甘露醇，pH5.3溶液中濃度為10毫克/毫升。產物在-20攝氏度凍存。確定一個溶液產物是否是有活力的取決于認為可以接受的規格范圍，本領域內的技術人員會明確這些范圍使產物回收最大化、聚集最小化、電荷不均勻性最小化、雜質最少化以及維持可接受的生物活性。當設置了二聚體＜3％(高分子量)，陽離子交換HPLC和反相HPLC的純度范圍為90％，內容物的標簽含量大于90％等規格，則冷凍的溶液產物是穩定的，并且認為是合理的替代。用于靜脈內快速注射給藥，0.1到3毫克每千克體重的IL-21劑量一般不超過30毫升。
也可以制備凍干產物，這也在本發明的范疇內。在本發明的組合物內還可以包含其他賦形劑。例如，可以接受的賦形劑包括二糖，例如使用0.5％到10％的海藻糖和蔗糖作為穩定劑；0.001％到0.1％的聚乙二醇作為穩定劑或者潤濕劑；0.001％到0.1％的表面活性劑，如Tween 20，Tween 80或TritonX-100作為穩定劑或者潤濕劑；或者其他的填充劑，如0.5％到5％范圍內的甘氨酸、羥乙基淀粉。
可以在加速條件下如在提高的溫度(25到45攝氏度)下儲存或者振蕩的條件下，進行穩定性研究。例如，對IL-21制劑進行多次凍融循環，顯示濃度為20毫克/毫升的制劑是穩定的。在一個實施方案中，使用pH5.25降低降解速率。但是凍干產品的最佳pH范圍是4.75到7.5，而非凍干產品的pH范圍為5到5.6。
本發明的組合物中還可以包含一種或者多種防腐劑，特別是在那些包裝用于多種用途的組合物中。可以在本發明中使用的防腐劑包括那些通常在藥物制劑中使用的防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯，苯甲醇，間甲苯酚，硫代水楊乙汞，苯酚，柳硫汞等等。
藥用目的的IL-21組合物應該是無菌和無熱源的，應該根據公認的制藥步驟進行生產和包裝。組合物可以以單劑量包裝或者多劑量包裝。組合物通常包裝于密封的玻璃瓶中，具有聚四氟乙烯襯里的塞子和適當的標簽。凍干的組合物可以成套包裝，其中包含適當量的適宜的稀釋劑，例如注射用水(WFI)或者含有5％右旋葡萄糖的注射用水。
使用以下非限制性的實施例進一步具體闡述本發明。
實施例實施例1實施例1表達載體pTAP237的構建通過同源重組在pTAP186的SmaI位點處插入一個由PCR產生的連接物，由此得到質粒pTAP237。質粒pTAP186來源于質粒pRS316(一個啤酒酵母的穿梭載體)以及質粒pMAL-c2(一個來源于pKK223-2的大腸桿菌表達質粒且包含tac啟動子和rrnb終止子)。質粒pTAP186包含一個卡那霉素抗性基因，該基因中的SmaI位點被破壞，而具有由位點NotI和SfiI包圍的酵母ARS-CEN6和URA3序列，使得這兩個序列可以被NotI酶切下來。PCR產生的連接物用合成的RBSII序列代替了pTAP186中的表達偶聯序列。該序列的制備使用了100pmol的各種寡核苷酸zc29，740和zc29，741(分別如SEQ ID NO3和4所示)以及大約5pmol的各種寡核苷酸(分別如SEQ ID NO5和6所示)。將這些寡核苷酸由下面10個循環的PCR混和在一起94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，然后4℃浸泡。得到的PCR產物使用兩倍體積的100％乙醇沉淀進行濃縮。沉淀重懸于10微升的水，用于重組進入由SmaI酶切的受體載體pTAP186中，產生包含合成RBSII序列的構建體。將大約1微克經PCR產生的連接物和100納克經SmaI酶切的pTAP186載體混和，并轉化酵母感受態細胞(啤酒酵母)。然后將酵母涂布于URA D平板上，室溫培養約72小時。挑取一個平板上的Ura+轉化子，重懸于1毫升水中，微離心以沉淀酵母細胞。細胞沉淀重懸于0.5毫升的裂解緩沖液中。提取DNA并轉化大腸桿菌MC1061。根據以上公開的方法，使用20pmol的各種寡核苷酸zc29，740和zc29，741(如SEQ IDNO3和4分別所示)進行菌落PCR以篩選克隆。對在瓊脂糖凝膠上顯示正確大小條帶的克隆進行序列分析。正確的質粒被命名為pTAP237。
實施例2pTAP252的構建通過PCR擴增產生人IL-21的編碼序列(如SEQ ID NO1所示)，使用CD3+cDNA文庫作為模板，以及寡核苷酸引物zc29，084和zc22，127(分別由SEQ ID NO7和8所示)。為了優化大腸桿菌中的翻譯過程，使用引物zc29，084(SEQ ID NO7所示)在IL-21編碼序列的5′端加上一個ATG起始密碼子。得到的基因序列編碼在N末端具有一個額外甲硫氨酸的成熟L-21(IL-21met)。最終的PCR產物通過酵母同源重組插入表達載體pTAP237(在實施例1中已描述)中(Raymond et al.，Biotechniques.26(1)134-8，140-1，1999；美國專利6,027,442號，這里引用作為參考)。從酵母中提取表達構建體pTAP252并轉化感受態大腸桿菌MC1061。通過菌落PCR鑒定卡那霉素抗性克隆。陽性克隆通過測序和轉化生產宿主菌株E104或者UT5600進行證實。
實施例3密碼子優化在大腸桿菌菌株E104中引入pTAP252表達人IL-21met，產生大約2-5％的總細胞蛋白。對IL-21編碼序列中使用的密碼子進行檢查，顯示密碼子中含有過量的大腸桿菌中很少使用的密碼子，CAI值為0.181。CAI是同義密碼子偏好的一個統計量度，可以用于預測蛋白質表達的水平(Sharp et al.，Nucleic Acids Res.15(3)1281-95，1987)。編碼高水平表達蛋白的基因常常具有高的CAI值(＞0.6)，而具有低CAI值(＜0.2)的基因編碼的蛋白質一般表達效率較低。這提示了IL-21在大腸桿菌中產量低的一個原因。此外，稀有密碼子成簇聚集在信息鏈的后半部分，使翻譯停頓、翻譯提前終止以及氨基酸錯誤摻入的可能性很高(Kane JF.Curr.Opin.Biotechnol.6(5)494-500，1995)。
已經證明如果在宿主內提高某些稀有tRNA的水平，則含有稀有密碼子的基因的蛋白質表達水平會有顯著的提高(Zdanovsky et al.，同上，2000；Calderone et al.，同上，1996；Kleber-Janke et al.，同上，2000；You et al，.同上，1999)。pRARE質粒攜帶編碼大腸桿菌中很少使用的密碼子tRNA的基因(argU，argW，leuW，proL，ileX和glyT)。這些基因在它們自身的啟動子(Novy，同上)的控制下。與pRARE共表達使大腸桿菌中IL-21met的表達提高了5-10倍。與pRARE共表達還降低了大腸桿菌裂解物中截斷的IL-21met的含量。這些數據提示使用更為適當的密碼子重新合成編碼IL21-met的基因，提供了表達大量IL-21的優化載體。
從16個重疊的寡核苷酸構建密碼子優化的IL-21met編碼序列zc22，913(SEQ ID NO9)，zc22，914(SEQ ID NO10)，zc22，915(SEQID NO11)，zc22，916SEQ ID NO12)，zc22，961(SEQ ID NO13)，zc22962(SEQ ID NO14)，zc22，963(SEQ ID NO15)，zc22，964(SEQID NO16)，zc22，965(SEQ ID NO17)，zc22，966(SEQ ID NO18)，zc22，968(SEQ ID NO20)，zc22，969(SEQ ID NO21)，zc22，967(SEQID NO19)，zc22，970(SEQ ID NO22)，zc22，971(SEQ ID NO23)，以及zc22，972(SEQ ID NO24)。對這些重疊的寡核苷酸進行引物延伸，然后進行PCR擴增，產生全長的IL-21me t基因，其密碼子已經被優化，用于在大腸桿菌中的表達。通過酵母同源重組將最終的PCR產物插入表達載體pTAP168中。從酵母中提取表達構建體，轉化感受態大腸桿菌MC1061。通過菌落PCR鑒定抗卡那霉素的克隆。陽性克隆通過測序和轉化生產宿主菌株E104或者UT5600進行證實。具有優化IL-21met序列的表達載體被命名為pTAP196。將最終的PCR產物插入載體pTAP168中，用于在Tac啟動子控制下的表達。但是表達非常低，產物只能使用IL-21的單克隆抗體通過蛋白質印跡分析檢測到。
對IL-21met信使序列的二級結構進行檢查發現了在36號到64號堿基之間(SEQ ID NO1)有一個極其穩定的發夾結構。懷疑該結構元件阻止了IL-21met序列的有效翻譯。因此通過重疊PCR產生一個雜合IL-21met編碼序列。使用pTAP252作為模板和寡核苷酸引物zc29，740(SEQ ID NO3)和zc40，133(SEQ ID NO25)進行PCR擴增，產生的片段含有未優化的IL21-met序列的前80個堿基。使用pTAP196作為模板和寡核苷酸引物zc22，971(SEQ ID NO23)和zc40，107(SEQ ID NO26)進行PCR擴增，產生的片段含有優化的IL21-met區域的81到450號堿基(SEQ ID NO27)。混和這兩個PCR產物，使用寡核苷酸引物zc22，971(SEQ ID NO23)和zc29，740(SEQ IDNO3)，通過重疊PCR產生全長的IL-21met。最終的PCR產物通過酵母同源重組插入表達載體pTAP237中。從酵母中提取表達構建體，轉化感受態大腸桿菌MC1061。通過菌落PCR鑒定抗卡那霉素的克隆。陽性克隆通過測序和轉化生產宿主菌株E104或者UT5600進行證實。具有雜合IL-21met編碼序列的表達載體被命名為pTAP337。
當使用未優化的IL-21met序列(SEQ ID NO1所示)的前80個核苷酸代替了優化序列的前80個核苷酸，除去了發夾結構，得到的基因在大腸桿菌中表達得很好。使用新構建體的表達水平提高到總細胞蛋白的大約20％。
實施例4IL-21met的表達將大腸桿菌接種到100毫升含有0.01％Antifoam289(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和30微克每毫升卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)培養基中，在37℃培養過夜。取10毫升接種物加入到500毫升的同樣培養基中，在2升的培養搖瓶中，37℃275rpm振蕩培養至培養物的OD600達到4。然后加入IPTG至終濃度為1mM，繼續振蕩2.5小時。在4℃4000×g離心10分鐘，得到細胞。在-80℃凍存細胞沉淀，備用。
更大規模的IL-21met的表達在25毫升的培養基中于37℃培養。IPTG誘導之后2小時取1毫升的培養物。將大腸桿菌細胞重懸于等體積的BugBuster蛋白質提取試劑(Novagen，Madison，WI)中，于4℃孵育20分鐘。4℃16000×g離心10分鐘分離可溶性和不溶的級分。
重組的IL-21met聚集為不溶性的包含體。IL21-met從大多數大腸桿菌菌株中的回收較低。在4℃裂解細胞和孵育后20分鐘內包含體內80-90％的IL-21met都丟失了。用8M尿素裂解細菌沒有提高回收。但是在細胞裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，例如5mM氯化鋅和0.5mM苯甲脒，抑制了來自E104株(W3110 arabinose-)的IL21-met丟失。這表明在變性條件下能夠切割IL21-met的細菌蛋白酶與包含體被共同純化出來。觀察到IL-21met在UT5600的細胞裂解物中是穩定的，但是在E104的細胞裂解物中不穩定。這提示在E104中存在蛋白酶而在UT5600中沒有。比較兩個菌株的基因型發現在E104中存在在雙堿性殘基之間切割的OmpT，而在UT5600中沒有。OmpT是熱穩定的，即使在變性條件下也具有活性(White et al.，同上1995)。對IL-21的氨基酸序列進行檢查顯示其含有至少4個可能的OmpT切割位點。IL-21met還在另一個OmpT缺陷的大腸桿菌菌株BL21中顯示了高度的穩定性。這些數據提示OmpT蛋白酶的活性對于IL-21的回收和穩定性是至關重要的。用大腸桿菌UT5600作為生產宿主顯著地提高了IL-21met的回收。將改進構建體和宿主菌株結合起來，使整體產量由2毫克/升提高到50-100毫克/升。
實施例5IL-21的鑒定對于蛋白質印跡分析，在還原條件下用4-20％MES SDS NuPAGE凝膠(Invitrogen)分離蛋白質樣品并轉移至硝酸纖維素膜(Invitrogen)上，30伏轉移1小時。使用含有5％脫脂牛奶的TTBS緩沖液(20mMTris pH7.4，160mM氯化鈉，0.1％Tween 20)封閉膜。將人IL-21特異的多克隆抗體加入到含有5％脫脂牛奶的TTBS緩沖液中孵育1小時。使用TTBS洗膜后，使用偶聯HRP的山羊抗兔IgG(Bio-Rad)探測膜1小時。然后使用TTBS漂洗印跡3次，之后使用Pierce的ECL試劑進行化學發光檢測。
實施例6質粒穩定性分析將大腸桿菌接種到25毫升含有0.01％Antifoam 289(Sigma)和30微克每毫升卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)培養基中，在37℃培養過夜。取25微升接種物加入到25毫升不含卡那霉素的同樣培養基中，在25毫升細胞培養搖瓶中37℃275rpm振蕩培養至OD600分別達到2、4、6和8。稀釋樣品并涂布于沒有任何添加物質的LB瓊脂培養平板上。37℃培養過夜后，將100個大腸桿菌菌落復制到一個LB瓊脂平板和一個含有30微克每毫升卡那霉素的瓊脂平板上。37度培養過夜后，計數每個平板上形成的菌落并進行比較。在含有卡那霉素的LB平板上長出的菌落數目與在不含抗生素的平板上長出的菌落數目之比，反映了仍然帶有表達載體的細胞的百分比。
當攜帶pTAP337表達載體的W3110克隆在不含卡那霉素的培養基中培養12小時后，90％以上的克隆仍然帶有質粒。帶有不含IL-21基因的表達載體的克隆顯示了相似的質粒保留。這些數據證明攜帶IL-21的pTAP337表達載體在W3110中是穩定的。
由于IL-21的低產率和嚴重的質粒不穩定性，大腸桿菌菌株TG1和MM294沒有被選作生產宿主。最鼓舞人心的結果來自對使用大腸桿菌菌株W3110(ATCC編號27325)生產IL-21的研究。W3110的產率與UT5600的產率相當。質粒的穩定性研究證明表達載體pTAP337在W3110中也得到保持。UT5600是一個營養缺陷型菌株，大規模培養更為困難。這些考慮的結果就是選擇了W3110作為優選的宿主菌株用于生產IL-21。
實施例7批量發酵使用添加5克/升甘油和25微克每毫升卡那霉素的Difco APSSuper Broth(Difco Laboratories，Detroit，MI)準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從長了24小時的瓊脂平板(Luria瓊脂(Difco Laboratories)，含有25微克每毫升的卡那霉素)上用接種環挑取一滿環含有表達載體pTAP337(EE410)的大腸桿菌W3110，接種于搖瓶中開始培養。搖瓶中的生長在30℃下進行。搖瓶振蕩的速度設置在250rpm。
使用3.0升Difco APS Super Broth加入到6升的發酵容器內并滅菌。在培養基中添加10克/升的甘油和25微克每毫升的卡那霉素。調節培養基的pH至7.2。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。
使培養物生長至OD600達到2.5(大約2.5小時)。向培養物中加入IPTG至濃度為1.0mM。繼續培養3小時。
實施例8A.補料批量發酵使用添加5克/升甘油和25微克每毫升卡那霉素的Difco APSSuper Broth(Difco Laboratories，Detroit，MI)準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從長了24小時的瓊脂平板(Luria瓊脂(Difco Laboratories)，含有25微克每毫升的卡那霉素)上用接種環挑取一滿環含有表達載體pTAP337(以上描述的)的大腸桿菌W3110，接種于搖瓶中開始培養。搖瓶中的培養在30℃下進行。搖瓶振蕩的速度設置在250rpm。
將3.0升ZymoM生長培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。在培養基中添加20克/升的甘油和25微克每毫升的卡那霉素。調節培養基的pH至6.4。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為32℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。
在10小時EFT時向發酵罐中補充糖溶液。持續補充直至發酵結束。補料溶液是70％v/v的甘油溶液。根據最開始的體積，補料速率是每升每小時6克甘油。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為2mM。在48小時EFT時收獲發酵物。
在另一種補料批量發酵過程中，使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從凍存于20％甘油中的含有表達載體pTAP 337的大腸桿菌W3110中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在30℃下進行。搖瓶振蕩的速度為250rpm。
將3.0升ZymoM生長培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。在培養基中添加20克/升的葡萄糖和25微克每毫升的卡那霉素。調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。
在10小時EFT時向發酵罐中補充糖溶液。持續補充直至發酵結束。補料溶液是60％v/v的葡萄糖。根據最開始的體積，補料速率是每升每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為2mM。48小時EFT時向培養物中加入2mmol/L的IPTG使IPTG的濃度達到4mM。在56小時EFT時收獲發酵物。
表1ZSM培養基(搖瓶和種子發酵罐)
表2用于補料發酵的60％葡萄糖溶液
表3ZymoM(補料批量發酵培養基)
表4微量“D”溶液(用于ZvmoM和ZSM培養基)
B.使用PCOL22培養基進行補料批量發酵使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度設置為250rpm。
將2.7升PCOL22生長培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過加入5N的NH4OH控制pH。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
C.使用不含卡那霉素的PCOL22培養基進行補料批量發酵使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度設置為250rpm。
將2.7升PCOL22培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂和氯化鈣，不加入卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過加入5N的氨水控制pH在6.8。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入I PTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
D.使用PCOL22-L培養基進行補料批量發酵使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度為250rpm。
將2.7升PCOL22-L培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。該培養基含有檸檬酸并且鹽的含量減少了三分之一以防止沉淀。冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過加入5N的NH4OH控制pH在6.8。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充不含有硫酸鎂的葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
E.使用PCOL22-L培養基的補料批量發酵使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培養基準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度為250rpm。
將2.7升PCOL22-L培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。該培養基的鹽含量減少了四分之一以防止沉淀。冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過加入5N的NH4OH控制pH在6.8。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充不含有硫酸鎂的葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始的體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
F.使用PCOL22-R培養基補料批量發酵使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培養基準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度為250rpm。
將2.7升PCOL22-R培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。該培養基中酵母提取物和葡萄糖的含量提高，目的是在開始葡萄糖補料之前提高宿主菌株的生長。冷卻后在培養基中添加40克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
G.20L容器內的補料批量發酵在另外一種補料批量發酵過程中，使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的3.0升ZSM培養基準備第一階段種子容器(6升)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出3.0毫升接種于搖瓶中，開始培養。通氣設置在1vvm，振蕩的速度為350rpm，溫度設置在32℃。
使用10.8升PCOL22培養基準備20升的發酵容器內并滅菌。該冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物接種發酵罐，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過添加5N NH4OH控制培養物的pH在6.8。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
H.使用第二階段種子進行補料批量發酵使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培養基準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株EE410(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度為250rpm。
使用3.0升ZSM培養基加入到6升的第二階段種子容器內，在培養基中添加20克/升的葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素。接種100毫升來自第一階段種子搖瓶含有生產菌株EE410的物質(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110)開始生長。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為32℃。
使用10.8升PCOL22培養基準備20升的發酵容器內并滅菌。冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm且溫度設置為37度。取生長12小時、600nm光吸收達到16的第二階段種子容器培養物接種發酵罐。接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過加入5N的NH4OH控制培養物的pH在6.8。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
I.使用ZGOLD1進行補料批量發酵表達載體zGOLD1的構建在實施例19中予以描述。使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培養基準備第一階段種子搖瓶(帶有擋板的500毫升搖瓶中加入100毫升培養基)。從融化的冷凍保藏的含有生產菌株(含有表達載體pTAP337的大腸桿菌W3110ompT-(ZGOLD1))的小管中取出300微升接種于搖瓶中，開始培養。搖瓶中的培養在32℃下進行。搖瓶振蕩的速度為250rpm。
將2.7升PCOL22培養基加入到6升的發酵容器內并滅菌。冷卻后在培養基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣和25微克每毫升卡那霉素。用5N的NH4OH調節培養基的pH至6.8。向容器內的通氣設置為1vvm，振蕩速率設置為350rpm。溫度設置為37℃。取生長16小時、600nm光吸收達到16的EE410第一階段種子搖瓶培養物進行接種，接種比例為5％v/v。通過提高振蕩速度保持溶解氧在20％飽和以上。通過加入5N的NH4OH控制培養物的pH在6.8。
在8小時EFT時開始向發酵罐中補充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整個發酵過程中維持恒定的補料速率，每升起始體積每小時9.5克葡萄糖。在24小時EFT時，向培養物中加入IPTG至濃度為0.5mM。48小時EFT時收獲發酵物。
PCOL22生產培養基表5
PCOL22-L培養基表6
使用PCOL22-L和PCOL 12 L培養基的補料批量發酵的60％葡萄糖表7
PCOL12-R培養基表8
PCOL12L培養基表9
實施例9IL-21的回收A.破碎收獲的細胞收獲的大腸桿菌細胞沉淀由補料批量發酵產生，其含有大約5-6克每升的以包含體的形式存在的IL-21met。發酵液(1升)在8000×g離心30分鐘得到沉淀。沉淀重懸于850毫升破碎緩沖液(100mM Tris，pH7.2，5mM氯化鋅)中，在冰上冷卻。在10000磅每平方英寸的壓力下，使培養物三次通過APV勻漿器。然后培養物在8000×g離心30分鐘。棄上清，小心保留沉淀。沉淀通過在800毫升去離子水中重懸并在8000×g離心40分鐘兩次進行洗滌。棄上清，并小心保留蓬松的沉淀。包含體沉淀在-80℃保藏或者不冷凍直接重折疊。
B收獲培養物的直接破碎收獲的大腸桿菌培養物由補料批量發酵產生，其含有大約6-7克每升的以包含體的形式存在的IL-21met。發酵液(0.5升)用去離子水稀釋至1升，在10000磅每平方英寸的壓力下，使培養物三次通過APV勻漿器。然后培養物在15000×g離心30分鐘。棄上清，并小心保留蓬松的沉淀。沉淀重懸于500毫升去離子水，在15000g離心30分鐘。棄上清，并小心保留蓬松的沉淀。重復洗滌的步驟，包含體沉淀在-80℃保藏或者不冷凍直接重折疊。
C.溶解和沉淀1.將洗滌好的包含體沉淀懸浮于200毫升的100mM Tris，6M鹽酸胍，5mM氯化鋅，pH7.2溶液中，室溫作用1小時，達到溶解的目的。懸液在12000×g離心30分鐘。上清在4℃保藏。用100mM Tris，5mM氯化鋅，pH7.2的溶液將上清稀釋8倍(v/v)。懸液在12000×g離心10分鐘。棄上清。沉淀用200毫升的100mM Tris，8M尿素，pH7.2的溶液重懸。懸液在12000×g離心30分鐘。棄上清。再重復兩次洗滌步驟。將洗滌的沉淀懸于200毫升的100mM Tris，6M鹽酸胍，10mM DTT，pH7.2中達到重溶解的目的。懸液在12000g離心30分鐘。上清中的蛋白質濃度經HPLC蛋白質檢測為10毫克/毫升。然后將IL-21樣品存放于4℃。
2.將洗滌的包含體沉淀懸于在100mMTris pH8.0中制備的6M鹽酸胍，40mM的DTT(GDT40)中達到溶解的目的。每升原始的發酵液要使用約150毫升的GDT40。溶解在室溫下進行1小時。然后離心懸液。來自溶解的包含體上清通過在含有0.75M精氨酸和DTT/胱氨酸氧化還原對的重折疊緩沖溶液中稀釋20至30倍進行重折疊5-16小時，此后調節混合物的pH至5.5，在純化前進行過濾。
D.直接破碎收獲自ZGOLD1的培養物收獲的大腸桿菌ZGOLD1培養物由PCOL22培養基(如上描述)中的補料批量發酵產生，其含有大約9-10克每升的IL-21met，以包含體的形式存在。發酵液(0.5升)用去離子水稀釋至1升，并在10000磅每平方英寸的壓力下，使培養物三次通過APV勻漿器。然后培養物在15000×g離心30分鐘。棄上清，并小心保留蓬松的沉淀。沉淀重懸于500毫升去離子水，在15000×g離心30分鐘。棄上清，并小心保留蓬松的沉淀。重復洗滌的步驟--沉淀重懸于500毫升去離子水，在15000×g離心30分鐘。棄上清，并小心保留蓬松的沉淀。包含體沉淀在-80℃保藏或者不冷凍直接重折疊。
實施例10A.溶解洗滌后的包含體將洗滌好的包含體沉淀懸浮于150毫升的100mM Tris，6M鹽酸胍，20mM DTT，pH7.5，室溫作用1小時，達到溶解的目的。懸液在12000×g離心30分鐘。上清中的蛋白質濃度經HPLC蛋白質檢測為21毫克/毫升。然后將IL-21樣品存放于4℃。
B.溶解來自ZGOLD1的洗滌后的包含體將洗滌好的包含體沉淀(來自1升發酵液)懸浮于150毫升的100mM Tris，6M鹽酸胍，40mM DTT，pH8.0的溶液中，室溫作用1小時，達到溶解的目的。懸液在15000×g離心30分鐘。上清中的蛋白質濃度經HPLC蛋白質檢測為29毫克/毫升。然后將IL-21樣品存放于4℃。
C.溶解后包含體的澄清用固定化金屬親和層析(IMAC)樹脂來澄清溶解后的IL-21包含體沉淀。在一個實施例中，洗滌后的包含體沉淀在6M鹽酸胍，10mM咪唑，pH7.5的條件下室溫溶解1小時。用0.5毫升的0.1M硫酸鎳負載1.0毫升的His-Trap柱(Amersham Biosciences)。負載后用水洗柱，再使用5.0毫升含有6M鹽酸胍、20mM咪唑、0.5M氯化鈉和20mM磷酸的結合緩沖液平衡層析柱。
溶解的樣品(1.0毫升)上層析柱，之后用5.0毫升結合緩沖液洗柱。向層析柱中加入2.5毫升的洗脫緩沖液(6M鹽酸胍、0.5M咪唑、0.5M氯化鈉和20mM磷酸鹽)。重復洗脫過程，并用SDS-PAGE凝膠分析樣品的純度和澄清度。
實施例11重折疊A.用GSH和GSSG的復性在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為21毫克/毫升。確定重折疊緩沖液的體積是根據溶液的量以及溶液中IL-21的濃度。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG3350，1.1ML-精氨酸，2mM GSH，1mM GSSG，pH7.5)冷卻至室溫(21度)。臨用前溶解GSH和GSSG。
含有IL-21的溶液(175毫升)在混和下緩慢(1.5小時)加入到重折疊緩沖液(11升)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.30毫克/毫升。溫度范圍是20-22度。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行16小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.165毫克/毫升，這代表了55％的復性產量。
B.使用DTT和GSSG進行復性在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為15.02毫克/毫升。確定重折疊緩沖液的體積是根據溶液的量以及溶液中IL-21的濃度。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG3350，1.1ML-精氨酸，2mM DTT，4mM GSSG，pH7.5)冷卻至室溫(21度)。臨用前溶解DTT和GSSG。
含有IL-21的溶液(88毫升)在混和下緩慢(1.0小時)加入到重折疊緩沖液(1L)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.50毫克/毫升。溫度范圍是20-22度。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行16小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.27毫克/毫升，這代表了59.5％的復性產量。
C.使用半胱氨酸和胱氨酸二鹽酸鹽進行復性在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為18.6毫克/毫升。確定重折疊緩沖液的體積是根據溶液的量以及溶液中IL-21的濃度。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG3350，1.0ML-精氨酸，4mM半胱氨酸，2mM胱氨酸鹽酸鹽，pH7.5)冷卻至室溫(21度)。臨用前溶解半胱氨酸和胱氨酸二鹽酸鹽。
含有IL-21的溶液(20.5毫升)在混和下緩慢(0.5小時)加入到重折疊緩沖液(0.78升)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.49毫克/毫升。溫度范圍是20-22度。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行21小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.29毫克/毫升，這代表了58％的復性產量。
D.使用DTT和胱氨酸二鹽酸鹽進行復性在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為18.6毫克/毫升。確定重折疊緩沖液的體積是根據溶液的量以及溶液中IL-21的濃度。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG 3350，1.1ML-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸二氯化物，pH7.5)冷卻至室溫(21度)。臨用前溶解DTT和胱氨酸二鹽酸鹽。
含有IL-21的溶液(20.5毫升)在混和下緩慢(0.5小時)加入到重折疊緩沖液(0.78升)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.49毫克/毫升。溫度范圍是20-22度。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行16小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.28毫克/毫升，這代表了58％的復性產量。
E.時間脈沖重折疊時間脈沖重折疊提供了一種方法，將人IL-21met重折疊至終濃度為0.3-0.9毫克/毫升。在批量重折疊中，重折疊緩沖液中IL-21蛋白的終濃度優化為0.2-0.3毫克/毫升。需要高濃度的精氨酸(1M)，且重折疊步驟的產量為40％到50％。盡管根據一般的蛋白質折疊標準，這已經令人滿意了，但是將IL-21met重折疊至更高的濃度仍然是非常理想的。
根據實施例4中的描述準備溶解的包含體，只是最終蛋白濃度為15毫克/毫升。使用描述的重折疊緩沖液將溶液稀釋50倍。溶液在室溫下攪拌3小時。在3小時結束時取樣并離心。上清用HPLC分析。然后重復該過程4次。
在前三次重復中正確重折疊的IL-21met的百分比產率保持恒定，但是在第四次重復后下降。沒有產量損失的最高蛋白質終濃度達到0.9毫克/毫升。在重折疊早期(＜3小時)期間高的蛋白質濃度(＞0.3毫克/毫升)由于聚集導致低產量。一旦重折疊完成(＞3小時)，可以開始加入重折疊儲液，而沒有產量的損失。最終的重折疊緩沖液中鹽酸胍的最大濃度是0.3-0.6M。
F.在降低的精氨酸濃度中使用DTT和胱氨酸進行重折疊在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為14.53毫克/毫升。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG3350，0.75ML-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸，pH8.0)冷卻至21℃。將胱氨酸溶解于0.25M的氫氧化鈉溶液終至濃度為80mM，并在臨用前加入DTT。
含有IL-21的溶液(96毫升)在混和下緩慢(1.0小時)加入到重折疊緩沖液(1.0升)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.61毫克/毫升。溫度范圍是14-16度。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行16小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.40毫克/毫升，這代表了66％的復性產量。
G.使用DTT和胱氨酸進行的容量重折疊容量重折疊根據的是IL-21溶液的體積而不是溶液中IL-21的濃度。在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為26.1毫克/毫升。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG3350，0.75ML-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸，pH8.0)冷卻至15℃。將胱氨酸溶解于0.25M的氫氧化鈉溶液至終濃度為80mM，并在臨用前加入DTT。
含有IL-21的溶液(935毫升)在混和下緩慢(2.0小時)加入到重折疊緩沖液(28.0升)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.83毫克/毫升。溫度范圍是14-16℃。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行16小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.51毫克/毫升，這代表了61％的復性產量。
H.來自ZGOLD1的洗滌過的包含體的容量重折疊在溶解的級分中IL-21的濃度由反相HPLC確定為29.9毫克/毫升。重折疊緩沖液(50mM Tris，10mM氯化鈉，0.5mM氯化鉀，2mM氯化鎂，2mM氯化鈣，0.05％(w/v)PEG3350，0.75ML-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸，pH8.0)冷卻至15度。將胱氨酸溶解于0.25M的氫氧化鈉溶液中至濃度為80mM，并在臨用前加入DTT。
含有IL-21的溶液(935毫升)在混和下緩慢(2.0小時)加入到重折疊緩沖液(27.3升)中。在重折疊混合物中加入的IL-21至終濃度為0.96毫克/毫升。溫度范圍是14-16度。含有重折疊混合物的容器敞口與空氣接觸。令重折疊進行16小時。重折疊的IL-21濃度確定為0.60毫克/毫升，這代表了62.3％的復性產量。
實施例12A.重折疊IL-21的澄清此步驟的目的是終止重折疊反應并且從重折疊的IL-21溶液終除去顆粒物質。通常調節重折疊IL-21至pH5.5然后通過一個1.2微米的標稱濾膜。在一些情況下在過濾之前不調節pH，另一些情況下可以使用不同大小(0.45-2.0微米)的或者其他類型的濾膜。可以通過離心，使用Carr powerfuge連續離心機(Carr Separations，Inc.，Franklin，MA)或者在瓶中離心，除去顆粒物質。
重折疊后，需要降低緩沖液的電導率，才能上樣至SP550C捕獲樹脂上。還需要過濾混濁的溶液以除去未折疊的IL-21和沉淀的大腸桿菌蛋白。在一個實施例中，含有重折疊的IL-21的29.5升重折疊緩沖液用1.4倍(42.0升)25mM乙酸鹽緩沖液pH5.5稀釋。令溶液在室溫沉淀4小時。然后使溶液通過一個1.2-0.8微米的Cuno Zeta Plus深濾器進行過濾。
B.重折疊IL-21的稀釋和澄清這一步驟終止重折疊反應、稀釋重折疊的物質使其能結合于陽離子交換層析柱，并且從重折疊的IL-21溶液中去除顆粒物質。調節重折疊IL-21的pH至5.5，然后用25mM乙酸鹽緩沖液pH5.5稀釋1.4倍。該溶液在室溫下沉降4小時，目的是增加稀釋的重折疊溶液中可溶與不溶性蛋白的物理分離。沉降并稀釋的重折疊溶液通常已經沒有顆粒物質，然后通常通過一個1.2-0.8微米的深濾器(Cuno Zeta PlusA30M03)。
實施例13澄清的、重折疊的IL-21的濃縮通過切向流過濾將澄清的、重折疊的IL-21濃縮10倍到30倍。切向流過濾裝置和膜系統(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa分子量截留板(Millipore，Bedford，MA)和框架系統或者AmershamBiosciences 10 kDa分子量截留中空纖維系統)用0.5M氫氧化鈉清潔，然后用水潤洗。對于來自1升發酵液的重折疊IL-21，使用0.2到0.3平方米的膜面積，交叉流速率大約為48升每小時，跨膜的壓力是20磅每平方英寸到30磅每平方英寸。
實施例14重折疊IL-21的捕獲A.使用TOYOPEARL SP 550 C樹脂進行陽離子交換濃縮后用陽離子交換層析柱捕獲IL-21。在一個實施例中，濃縮的IL-21用水或者25mM乙酸鈉pH5.5稀釋3倍。室溫孵育30分鐘后過濾除去形成的沉淀。使用Millipore 1.2um Polysep II濾膜(Millipore)或者1.2-0.8微米Cuno Zeta Plus A30MO3膜(Cuno，Meriden，CN)。過濾后的IL-21上樣于用平衡緩沖液(25mM乙酸鈉，0.2M氯化鈉，pH5.5)平衡的TOYOPEARL SP550C樹脂(Tosoh Biosep)柱上。層析柱的上樣量是每升樹脂上6-10克IL-21，柱床高度是15厘米，監測280nm和215nm的紫外吸收。流速是150厘米每小時。上樣后層析柱用平衡緩沖液洗至紫外吸收返回基線。然后使用4倍柱體積的50％平衡緩沖液和50％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，1.0M氯化鈉，pH5.5)的混合液洗柱。使用25％平衡緩沖液和75％洗脫緩沖液從柱上洗脫IL-21。或者在IL-21上樣至層析柱上、用平衡緩沖液洗柱以后，用10倍柱體積的100％平衡緩沖液到100％洗脫緩沖液的線性梯度洗脫IL-21。
或者在調節pH、稀釋、終止、用深度濾膜過濾之后，用陽離子交換層析捕獲IL-21。將過濾后的溶液上樣于平衡至平衡緩沖液(25mM乙酸鈉，pH5.5，0.4M氯化鈉)的TOYOPEARL SP 550 C樹脂(TosohBiosep)柱上。層析柱的上樣量是每升樹脂6到15克IL-21。監測280nm和215nm的紫外吸收。使用的流速是150厘米每小時。上樣后層析柱用平衡緩沖液平衡至紫外吸收返回基線。用至100％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，pH5.5，0.75M氯化鈉)的分級梯度從層析柱上洗脫IL-21。
B.使用SP Sepharose XL樹脂進行陽離子交換層析濃縮的IL-21用25mM乙酸鈉pH5.5稀釋10倍。室溫孵育30分鐘后過濾除去形成的沉淀。使用Millipore 1.2um Polypro XI濾膜(Millipore)和然后的0.45微米Whatman Polycap 75 AS濾膜(Maidstone，Kent，UK)過濾。過濾后的IL-21上樣于用平衡緩沖液(25mM乙酸鈉，0.2M氯化鈉，pH5.5)平衡的SP Sepharose XL樹脂(Amersham Biosciences)柱上。層析柱的上樣量是每升樹脂上3-6克IL-21，柱床高度是15厘米，監測280nm和215nm的紫外吸收。流速是150厘米每小時。上樣后層析柱用平衡緩沖液平衡至紫外吸收返回基線。然后使用4倍柱體積的25％平衡緩沖液和75％洗脫緩沖液(25mM乙酸，1.0M氯化鈉，pH5.5)的混合液洗柱。使用50％平衡緩沖液和50％洗脫緩沖液的混合液洗脫IL-21。
C.使用Streamline SP XL樹脂進行陽離子交換層析在另一個實施例中，在用陽離子交換層析捕獲IL-21之前不使用切向流濃縮。重折疊之后，調節pH至5.5，然后使用1.2微米標稱的截留濾膜過濾。將Amersham Biosciences Streamline SP XL樹脂填充Amersham Biosciences Streamline柱用平衡緩沖液(25mM乙酸鈉，0.2M氯化鈉，pH5.5)平衡。平衡后，經過過濾和調節pH的重折疊IL-21上樣至層析柱上，使用在線稀釋，即使用層析系統上樣30％經過濾的、調節pH的重折疊IL-21和70％的水以獲得正確的比例。IL-21的上樣采取向上流動的方式，使用的流速使柱內樹脂與固定的柱床高度相比擴張2倍。經過濾、調節pH的重折疊IL-21上樣完成后，換成平衡緩沖液。然后連續向柱內泵入30％平衡緩沖液和70％的水，直至層析柱入口處記錄的電導率小于10mS/cm。然后用平衡緩沖液洗柱，采取向上流動的方式，具有2倍的沉降柱床高度，平衡至280nm紫外吸收返回基線。然后停止流動，令樹脂沉降。將Streamline柱的柱塞降低至沉降床高度，用2倍體積的平衡緩沖液洗柱，方向是向下流動，流速是150厘米/小時。然后用向下流動的方式，用50％平衡緩沖液和50％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，1.0M氯化鈉，pH5.5)洗脫IL-21，流速為150厘米/小時。
實施例15通過疏水相互作用層析進行IL-21的中間純化A.使用丁基Sepharose樹脂進行疏水相互作用層析(HIC)每升IL-21溶液中加入198克固體硫酸銨，使硫酸銨的濃度達到1.5M。攪拌溶液直至硫酸銨溶解，然后通過0.45微米標稱的截留濾膜過濾除去固體物質。在一個實施例中，用平衡緩沖液(25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，1.5M硫酸銨，pH5.5)平衡一個15厘米高的AmershamBiosciences丁基Sepharose 4 FF柱。將調節的并過濾的IL-21溶液上樣至層析柱上，上樣量是每升樹脂1.0-2.5克IL-21，監測280mm和215nm的紫外吸收。監測280nm和215nm的紫外吸收。流速是150厘米每小時。上樣后層析柱用平衡緩沖液平衡至紫外吸收返回基線。使用50％平衡緩沖液和50％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5)洗脫IL-21。或者在IL-21上樣至層析柱上、用平衡緩沖液洗柱以后，用10倍柱體積的從100％平衡緩沖液到100％洗脫緩沖液的線性梯度洗脫IL-21。
B.使用TOYOPEARL 650M樹脂進行HIC在另一個實施例中使用一種不同的樹脂Tosoh Biosep TOYOPEARL丁基650M純化IL-21。除了以下的不同以外，該方法與使用丁基Sepharose FF樹脂的方法是一樣的用3.5M硫酸銨儲液調節陽離子交換的洗脫液至硫酸銨濃度為1.5M；將調節過硫酸銨濃度并過濾的IL-21溶液上樣至層析柱上，上樣量是每升樹脂10-12克IL-21；上樣后層析柱用平衡緩沖液平衡至紫外吸收返回基線；使用100％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，pH5.5，0.05M氯化鈉，0.15M硫酸銨)洗脫IL-21。
實施例16A.濃縮IL-21并使用磷酸鹽緩沖液進行緩沖液交換IL-21在純化之后進行超濾和滲濾，使其濃縮，將其緩沖液系統交換為一種適于儲存的系統。使用0.5M氫氧化鈉清潔切向流過濾裝置和膜系統(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa分子量截留板和框式系統)，并用水潤洗。對于來自1升發酵液的純化IL-21，使用0.1平方米或者更小面積的膜，交叉流速率為大約20-25升/小時，跨膜壓力是10-15磅每平方英寸。將IL-21濃縮至大約15-20毫克/毫升，然后向滲濾體積(diavolume)為5-10的磷酸鹽緩沖液pH6.0進行滲濾。經過濃縮和緩沖液交換的IL-21儲存于-80℃。
B.濃縮IL-21并使用組氨酸/甘露醇緩沖液進行緩沖液交換IL-21在用SP HP Sepharose純化之后進行超濾和滲濾，使其濃縮，將其緩沖液系統交換為一種適于儲存的系統。使用0.5M氫氧化鈉清潔切向流過濾裝置和膜系統(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa分子量截留板和框式系統)，并用水潤洗。對于來自1升發酵液的純化的IL-21，使用0.1平方米或者更小面積的膜，交叉流速率為大約30升/小時，跨膜壓力是25磅每平方英寸。將IL-21濃縮至大約10-15毫克/毫升，然后向滲濾體積為5-10的10mM組氨酸，4.72％(w/v)甘露醇pH5.0-5.3的溶液進行滲濾。得到的溶液進行過濾除菌。
實施例17IL-21的進一步純化A.使用用于精制的SP HP Sepharose樹脂進行陽離子交換層析使用SP HP Sepharose進行進一步純化，進一步提高整體純度。TOYOPEARL butyl 650M的洗脫液用水稀釋至電導率為30mS/cm，然后使用磷酸氫二鈉儲液調節pH至6.0。將調節pH的溶液使用0.22微米的濾膜過濾。過濾后的物質上樣到用50mM磷酸鹽，pH6.0，0.3M氯化鈉平衡的層析柱上，上樣量是10-15克IL-21每升樹脂。使用紫外280nm和紫外215nm監測層析。上樣后層析柱用平衡緩沖液洗至紫外吸收返回基線。使用20倍柱體積的至100％洗脫緩沖液(50mM磷酸鹽，0.7M氯化鈉，pH6.0)的梯度洗脫IL-21。
B.陰離子交換層析將IL-21通過陰離子層析柱去除內毒素。Amersham Biosciences QSepharose FF層析柱用平衡緩沖液(20mM Tris，pH8.0)平衡。用平衡緩沖液調節IL-21溶液的電導率小于10mS/cm。經過調節的IL-21溶液上樣于層析柱上，流速為150厘米/小時。IL-21并不結合到層析柱上，所以從流出物中收集。在其他實施例中，可以使用AmershamBiosciences DEAE Sepharose FF樹脂或者Pall Mustang Q膜代替QSepharose FF純化IL-21。在另外的實施例中，證明5.0至9.0的pH值范圍可以使IL-21通過陰離子交換介質。
C.疏水相互作用層析在其他實施例中，使用與上述應用丁基樹脂不同的條件進行疏水相互作用純化IL-21。Amersham Biosciences苯基Sepharose FF highsub，Amersham Biosciences苯基Sepharose HP以及AmershamBiosciencesSGH AD Sepharose 4 FF可以在結合及流過方式中作為樹脂。用50mM氯化鈉，25mM乙酸鈉，1.5M硫酸銨，pH5.5的溶液平衡柱以結合IL-21。在攪拌下加入固體硫酸銨直至溶解，調節IL-21溶液的硫酸銨濃度至1.5M。調節好的IL-21溶液上樣于平衡好的層析柱上，流速為150厘米/小時。監測280nm和215nm的紫外吸收。在洗柱之后，使用10倍柱體積的從100％平衡緩沖液到100％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5)的線性梯度洗脫IL-21。在流過模式中，含IL-21的溶液調節至1.0M或更低硫酸銨，并上樣于用25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，1.0M硫酸銨，pH5.5的溶液平衡的柱上。收集流出液。
在其他實施例中，使用硫酸鈉而不是硫酸銨作為鹽，通過疏水相互作用純化IL-21。Amersham Biosciences苯基Sepharose FF high sub，Amersham Biosciences苯基Sepharose HP以及AmershamBiosciences丁基Sepharose 4 FF可以用作為樹脂。用25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，1.5M硫酸銨，pH5.5的溶液平衡層析柱。在攪拌下加入固體硫酸銨直至溶解，調節IL-21溶液的硫酸銨濃度至1.5M。調節好的IL-21溶液上樣于平衡好的層析柱上，流速為150厘米/小時。監測280nm和215nm的紫外吸收。在洗柱之后，使用10倍柱體積的從100％平衡緩沖液到100％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5)的線性梯度洗脫IL-21。
在另一個實施例中，在裝配丁基Sepharose 4 FF層析柱(Amersham Biosciences)的BIOCAD 700E FPLC系統(PerseptiveBiosystems，Framingham，MA)上進行HIC FPLC流出方式。使用25mM乙酸鈉，600mM氯化鈉，1M硫酸銨，pH5.5平衡柱。在陽離子交換洗脫液中加入固體硫酸銨至終濃度為1M。將溶液上樣于層析柱上，在流出物中收集IL-21。
D.使用金屬螯合Sepharose進行固定化金屬親和層析使用Amersham Biosciences Chelating Sepharose(Amersham)進一步純化IL-21。將含有IL-21的陽離子交換洗脫液上樣于一個負載了銅、鋅或鎳離子的已用25mM乙酸鈉，0.8M氯化鈉，pH5.5平衡的層析柱上。使用280nm和215nm的紫外吸收監測層析。使用平衡緩沖液洗柱至基線，用10倍柱體積的至100％洗脫緩沖液(25mM乙酸鈉，0.8M氯化鈉，0.5M咪唑，pH5.5)的梯度洗脫IL-21。
實施例18A.在乙腈緩沖液中對溶解的IL-21進行反相HPLC分析這里描述的方法用于對溶解后的包含體樣品和純化樣品中的IL-21進行定量。在Agilent Technologies 1100系列HPLC系統上使用4.6×50毫米Jupiter C5層析柱(300，5微米，Phenomenex)，HPLC系統上配有恒溫自動進樣器和恒溫層析柱溫箱。在柱前放置一個0.2微米的柱前濾膜。流動相A是溶于HPLC級水的0.1％三氟乙酸，且流動相B是溶于乙腈的0.1％三氟乙酸。純化樣品的洗脫梯度/時間表如下表10
溶解包含體樣品的洗脫梯度/時間表如下表11
將層析柱平衡至洗脫梯度/時間表中的初始條件，直至得到穩定的基線。
方法的參數如下1.流速1毫升/分鐘.
2.總的運行時間20分鐘3.層析柱溫度40度4.自動進樣器溫度8度5.最大層析柱壓力240巴6.注射器吸液速度100微升/分鐘7.注射器噴液速度100微升/分鐘8.二極管陣列檢測器數據收集波長信號A280nm，帶寬25nm9.二極管陣列檢測器數據監測波長信號B215nm，帶寬10nm10.二極管陣列檢測器數據參考波長信號A350nm，帶寬25nm；信號B350nm，帶寬25nm11.二極管陣列檢測器自動平衡運行前/運行后方式12.峰寬響應時間＞0.1分鐘。
13.狹縫寬度4nm14.針洗功能設定程序以降低鹽酸胍在針和針座上的堆積。
對于未折疊的IL-21的定量，使用50mMTris，pH7.5，6M鹽酸胍，10mM DTT稀釋IL-21參比標準至0.5毫克/毫升，并在40度加熱20分鐘。將稀釋的參比標準注射入層析柱內，在10微克和50微克之間至少設5個水平(例如注射10，20，30，40和50微克)。溶解的IL-21樣品在微量離心機中離心，并用50mMTris，pH7.5，6M鹽酸胍稀釋，然后向層析柱內注射25微升。
對于折疊的IL-21的定量，使用磷酸鹽緩沖液pH6.0稀釋IL-21參比標準至1.0毫克/毫升。折疊的IL-21樣品不用經過任何處理直接上HPLC。層析后對IL-21峰下的面積進行積分。構建標準曲線，從標準曲線讀取樣品中IL-21的濃度。
B.使用基于甲醇的反相HPLC定量IL-21也可以使用一種15分鐘的基于甲醇的RP-HPLC方法對從溶解的包含體到最終產品范圍的IL-21制品進行評估。
基于甲醇的RP-HPLC分析定量IL-21的方法參數如下層析柱Zorbax 300SB-CN(4.6×50毫米)，3.5微米流動相A0.154％三氟乙酸，HPLC級水流動相B0.154％三氟乙酸，甲醇洗脫梯度/時間表表12
全程運行時間15分鐘層析柱溫度40度自動進樣器溫度5度注射器吸液速度90微升/分鐘注射器噴液速度90微升/分鐘二極管陣列監測器波長信號A280nm，8nm帶寬信號B215nm，8nm帶寬信號C280nm，6nm帶寬(參考波長關閉)二極管陣列數據收集波長信號A280nm，8nm帶寬二極管陣列參考波長信號A和B，360nm，16nm帶寬二極管陣列自動平衡運行前/運行后方式峰寬響應時間大于0.1分鐘狹縫寬度4nm負吸收限度100mAu標準曲線上樣量的范圍1-20微克最小注射體積5微升最大注射體積100微升壓力限制350巴標準運行壓力130-220巴實施例19用于表達IL-21的OmpT缺陷型菌株A.構建新型宿主菌株用于生產IL-21目前生產IL-21的方法包括在大腸桿菌宿主W3110[F-mcrA mcrBIN(rrnD-rrnE)1 λ-]中的表達。盡管W3110是生產IL-21的強壯宿主，但是對于下游加工它并不是理想的宿主。細菌裂解后，IL-21在74號亮氨酸(如SEQ ID NO28所示)位置被外膜中存在的OmpT蛋白酶切割。已知該蛋白酶還切割其他異源的重組蛋白質，包括FGF-18。IL-21的蛋白酶解在沒有OmpT的菌株如BL21[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm lon]中并不出現。盡管在細胞裂解過程中可以加入硫酸鋅或硫酸銅以使OmpT的活性降低到最小，仍然需要對純化方案進行設計以除去最終產物中截斷的IL-21。為了使IL-21的生產過程更為簡單有效，將從W3110中除去OmpT蛋白酶產生一個新的生產菌株。以下描述該新型大腸桿菌宿主菌株的構建。
B.構建質粒pCHAN1用于表達Red重組酶操縱子使用以同源重組為基礎的策略，從W3110中去除OmpT3110蛋白酶。為了有效地從大腸桿菌染色體中通過同源重組刪除基因，細胞內必須具有某些具有重組酶活性的酶。為了達到這個目的，構建一個質粒，它包含來自lambda細菌噬菌體的Red重組酶操縱子。使用重組特異的引物zc43，586(SEQ ID NO29)和zc43，587(SEQ ID NO30)，通過PCR從lambda細菌噬菌體DNA(New England Biolab)中合成出一個含有Red重組酶基因的片段。反應中包含100pmol的兩個引物zc43，586和zc43，587，10微升的10×PCR緩沖液(Boehringer Mannheim)，1微升的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)，10微升的0.25mM三磷酸核苷酸混合物(Perkin Elmer)，且加水至終體積為100微升。PCR反應由以下步驟組成94℃5分鐘；接下來是30個循環的94℃1分鐘，50℃1分鐘，和72℃1分鐘；之后是72℃5分鐘延伸，最后在4℃過夜。產生的1964bp的片段含有Red重組酶操縱子(SEQ ID NO31)。SEQ ID NO31中的核苷酸序列編碼3個基因，41-514號核苷酸編碼Gam(γ)，463-1245號核苷酸編碼Bet(β)，且1245-1922號核苷酸編碼Exo。
在酵母中通過同源重組將Red重組酶操縱子整合進一個質粒中。將感受態酵母細胞(100微升啤酒糖酵母SF838-9Da)與100納克SmaI酶切的pTAP399(保藏于美國典型培養物保藏中心，在提交申請時未命名)、受體載體和1微克上面得到的PCR片段混和。酵母和DNA混合物被轉移到0.2厘米的電穿孔小杯中，在0.75千伏(5千伏/厘米)，電阻無窮大，25微法電容時脈沖。然后在轉化混合物中加入1毫升1.2M山梨醇，于30℃孵育1小時。500微升份的細胞涂布于兩個URA DS平板(2％右旋葡萄糖，2％山梨醇)上，于30℃孵育兩天。48小時后，將平板上的Ura+酵母轉化子懸于2毫升水中，離心取沉淀。沉淀重懸于1毫升Qiagen P1裂解緩沖液(Qiagen)，轉移至一個含有1毫升0.5毫米氧化鋯/二氧化硅研磨珠(Biospec Products Inc.)的干凈小管中。裂解細胞，沉降樣品，取250微升的裂解物轉移至新的小管中，使用Qiagen Spin Miniprep試劑盒，根據生產商的使用說明提取質粒DNA。
用1微升酵母質粒DNA提取物轉化電感受態的大腸桿菌DH10B細胞(Invitrogen)。在0.1厘米的小杯中以2.0千伏、25微法、100歐姆條件下脈沖細胞。電穿孔后，向每一個樣品中加入250微升SOC(2％細菌胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母提取物(Difco)，10mM氯化鈉，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，10mM硫酸鎂，20mM葡萄糖)。細胞在37℃復蘇2小時。將整個的250微升一份的樣品涂布于一塊含有25毫克/升卡那霉素(Sigma)的LB平板(LB培養基(Lennox)，1.8％細菌瓊脂(Difco))上。在37℃培養平板過夜。通過限制性酶切，鑒定出攜帶Red重組酶操縱子的單個克隆，從而證明插入片段的存在。對陽性克隆的插入片段進行測序。含有正確插入片段的質粒被命名為pCHAN1。
從pCHAN1的載體骨架上去除酵母的序列。3.0微升的質粒DNA與24.3微升水和2.7微升緩沖液H(Roche)和2.0微升NotI(New EnglandBiolabs)一起在37℃孵育過夜。5微升的過夜酶切產物與1微升6×DNA上樣染料(25％Ficoll Type 400(Sigma)，0.25％溴酚藍(EMScience)，0.25％二甲苯藍(Kodak Biomedicals Inc.))混和，取4微升混合液在1％瓊脂糖凝膠(EM Science)上電泳，證明酶切完全。14微升的過夜NotI酶切產物與4微升5×連接緩沖液(Invitrogen)和2微升連接酶(Invitrogen)混和，使質粒重新環化。連接體系在25℃孵育過夜。
重新連接的pCHAN1轉化W3110。1微升pCHAN1DNA轉化電感受態的W3110細胞(50微升)，使用以上描述的大腸桿菌電轉化方法。復蘇后，將整個250微升一份的轉化混合物涂布于一塊含有25毫克每升卡那霉素的LB平板上。平板在37℃孵育過夜，挑取10個產生的克隆進行進一步分析。它們培養在2.0毫升含有25微克每毫升卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)中在37℃生長過夜。第二天取1.0毫升的過夜酶切物來確證pCHAN1的存在。根據生產商的使用說明用Qiagen Spin Miniprep試劑盒提取質粒DNA。使用EcoRI(Gibco BRL)和NotI(New England Biolabs)酶切對質粒進行鑒定。選擇第三號分離物用于進行接下來的實驗，將其命名為EE670。
產生一個四環素片段用于在W3110中進行基因替代選擇四環素基因作為適宜同源重組進入OmpT基因座中的標記，使該基因失活。使用重組特異的引物ZG45，112(SEQ ID NO32)和ZG45，171(SEQ ID NO33)通過PCR從pBR322DNA(New England Biolabs)中擴增出四環素啟動子∷四環素(tetp∷tet)片段。反應混合物中包含100pmol的兩個引物ZG45，112和ZG45，171，10微升的10×PCR緩沖液(Boehringer Mannheim)，1微升的Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)，10微升的0.25mM三磷酸核苷酸混合物(Perkin Elmer)，加水至終體積為100微升。PCR反應的條件如下94℃2分鐘；接下來是30個循環的94℃30秒，50℃1分鐘，72℃2分鐘；之后是72℃7分鐘延伸，最后在4℃過夜。得到的1590bp片段帶有tetp∷tet(SEQID NO34)。
將PCR反應物上樣到1％的瓊脂糖制備膠上，以純化tetp∷tet片段。從膠上切下tetp∷tet片段，置于一個0.5毫升的微量離心管中，在管的底部有一個小洞，下面有玻璃(aquarium)濾棉(FinnyProducts，Inc.，Cincinnati，OH)。將小管插到一個1.5毫升的微量離心管中，在臺式離心機中于25℃14000rpm離心10分鐘。將1.5毫升管底部的液體與10％(v/v)3M乙酸鈉和2倍體積的100％乙醇混和。樣品在-20℃放置10分鐘，并在臺式離心機中于4℃離心10分鐘沉淀PCR片段。吸走上清，沉淀重懸于50微升水中。tetp∷tet片段的工作濃度是50納克/升。
將PCR片段連接進入pCR4.0-BLUNT TOPO載體(Invitrogen)中，作為基因替代實驗的陽性對照。根據生產商的使用說明進行連接反應。用2微升的tetp∷tetDNA片段轉化大腸桿菌DH10B細胞(Invitrogen)，使用上面描述的電穿孔轉化方法。復蘇后，將整個250微升轉化混合物涂布于一塊含有100毫克/升氨芐青霉素(Sigma)的LB平板上，平板在37度孵育過夜。
挑取10個克隆進一步分析。它們培養在2.0毫升的含有100微克/毫升氨芐青霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)中在37℃生長過夜。第二天取1.0毫升的過夜培養物來確證pCHAN1的存在。根據生產商的使用說明用Qiagen Spin Miniprep試劑盒提取質粒DNA。使用SalI(New England Biolabs)和PstI(New England Biolabs)酶切對質粒和插入片段的方向進行鑒定。選擇第1號分離物用于進行接下來的實驗，將該質粒命名為pSDH185，將該克隆命名為EE686。
W3110中的基因替代刪除OmpT基因在500毫升的SOB培養基[20克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取物，0.5克/升氯化鈉，每升培養基加10毫升250mM氯化鉀，5毫升2M氯化鎂，pH7.0]中，37℃培養W3110/pCHAN1至OD600達到0.6。培養物分成4瓶125毫升的培養物。將一瓶留作未誘導的對照，其他三瓶用1mM IPTG分別誘導15分鐘、30分鐘或60分鐘。在三個誘導孵育時間結束時，按照下面的方法對所有四瓶培養物制備感受態細胞。5000rpm離心10分鐘沉淀細胞。傾倒干凈上清，每份沉淀用62.5毫升冰冷的水重懸。再次離心培養物，傾倒干凈上清，且各沉淀用31.5毫升冰冷的10％甘油重懸。8000rpm再次離心5分鐘，傾倒干凈上清，用殘留的10％甘油重懸細胞沉淀。
所有的四個培養物都分成6個50微升的小份。按照以下方式轉化1)沒有DNA的陰性對照，2)轉化1微升(1微克/微升)pBR322(NewEngland Biolabs)陽性對照，3)轉化1微升(1微克/微升)pTAP279陽性對照，4)1微升pSDH185陽性對照，5)2微升(50納克/微升)tetp∷tet片段，以及6)4微升(50納克/微升)tetp∷tet片段。按照上面描述的大腸桿菌轉化方法電轉化細胞。將所有的轉化混合物涂布于含有10毫克/升四環素(Sigma)的LB平板上，而pTAP279對照涂布于含有35毫克/升氯霉素(Sigma)的LB平板上。平板在37℃培養過夜。此外，四個培養物都用水稀釋至10-6和10-7，涂布于LB平板上，通過確定細胞數目估計重組過程的整體效率。
第二天，從培養箱內去除對照平板進行分析。在檢測以前，轉化tetp∷tet片段的樣品繼續孵育24小時。鑒定出26個最大的克隆用于進一步的分析。
ompT缺失克隆的性質鑒定26個選擇的克隆全部在含有5微克每毫升四環素的1毫升LB培養基中培養過夜。第二天，根據生產商的使用說明，用Genomic Prep DNA提取試劑盒(Amersham Pharmacia)提取26個克隆的基因組DNA。
所有克隆的基因組DNA用水稀釋100倍，作為PCR分析的模板。用三組不同的PCR引物對所有的稀釋樣品進行檢測(每個克隆作三個PCR反應)。反應混合物中包含100pmol的1號引物組中的兩個引物ZG45，357(SEQ ID NO35)和ZG45，350(SEQ ID NO36)；或者2號引物組中的兩個引物ZG45，353(SEQ ID NO37)和ZG45，355(SEQID NO38)；或者3號引物組中的兩個引物ZG45，354(SEQ ID NO39)和ZG45，359(SEQ ID NO40)。100μl終體積的剩余體積由10微升的10×PCR緩沖液(Boehringer Mannheim)，1微升的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)，10微升的0.25mM三磷酸核苷酸混合物(Perkin Elmer)和水組成。PCR反應的條件如下94℃5分鐘；接下來是30個循環的94℃30秒，50℃1分鐘和72℃2分鐘；之后是72℃7分鐘延伸，最后在4℃過夜。如果W3110中的OmpT基因被四環素基因成功替代，1號引物組應該擴增出一條1584bp的條帶(SEQ ID NO41)；2號引物組應該擴增出一條1190bp的條帶(SEQ ID NO42)。結果顯示篩選的26個克隆中有25個都是ompt-。選擇W3110ompT-克隆1號和3號進行接下來的分析。
為了確證蛋白酶解活性的喪失，將IL-21與新得到的ompT-菌株的細胞裂解物以及W3110親本的細胞裂解物一同孵育。來自ompT-菌株BL21的裂解物被用作陽性對照。將細胞接種于Superbroth II中37℃生長過夜。每一種過夜培養物取四個1毫升的小份，室溫離心，根據生產商的使用說明用BugBuster(Novagen)裂解細胞。細胞裂解物在25℃與1)0.332毫克/毫升的IL-21，或者2)含有5mM氯化鋅的0.332毫克/毫升的IL-21分別孵育4小時。每一個樣品與等體積的含β巰基乙醇(Sigma)2％的NuPAGE 4×樣品緩沖液(Invitrogen)混和。將還原后的樣品在100度加熱5分鐘，取10微升上10％NuPAGE聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)。在變性條件下，130伏進行電泳(SDS-PAGE)，使用1×MES電泳緩沖液(Invitrogen)。根據生產商的使用說明用Simply Blue Safestain(Invitrogen)對膠進行染色。
結果表明基因替代使OmpT蛋白酶失活。在與BL21、W3110 ompT-1號菌株和W3110 ompT-3號菌株的裂解物共同孵育4小時以后，IL-21完全沒有損失；而與W3110親本的裂解物孵育后，IL-21完全降解。OmpT蛋白酶的活性被鋅抑制。在與含有5mM氯化鋅的裂解物共同孵育時，IL-21沒有受到損失，這證明了OmpT是導致降解的原因。新構建的W3110 ompT-菌株被命名為ZGOLD1(W3110 ompT-1號菌株；(保藏于美國典型培養物保藏中心(提交申請時未命名)))以及ZGOLD3(W3110 ompT-3號菌株)。
ZGOLD1和ZGOLD3的性質鑒定ZGOLD1和ZGOLD3與W3110親本一同生長，以評價其生長。所有三個菌株的培養物在LB培養基中37℃生長至OD600達到1.0。每小時測定細胞密度以評價生長。每個培養物用水進行稀釋(10-6，10-7和10-8)，涂布于LB卡那霉素平板上(參見上面)以確定細胞數目。結果顯示ZGOLD菌株的生長與W3110親本株的生長是相當的。
為了評價轉化效率，收獲細胞根據以上描述制備感受態用于轉化。每個菌株取一份感受態細胞，轉化1)1微升pTAP337(IL-21表達質粒；ATCC No.PA-4853)，或者2)沒有DNA(陰性對照)。根據以上描述進行電穿孔轉化。復蘇之后，每一個轉化混合物涂布于含有25毫克/升卡那霉素的LB平板上，37℃培養過夜。數據顯示W3110的轉化效率未受到去除opmT基因的影響。
對每個ZGOLD菌株選擇轉化有IL-21表達載體的10個克隆，評價其蛋白生產。克隆在Superbroth II(含有25微克/毫升卡那霉素)培養基中在37℃生長過夜。用過夜的培養物接種含有25微克/毫升卡那霉素Superbroth II的滾瓶。37℃使細胞生長。培養其中一個克隆的第二個培養物作為未誘導的對照。當每一個培養物的OD600達到1.5-2.0時，用1mM IPTG(ICN Biomedicals Inc.)誘導。繼續培養這些培養物5小時。從每一個培養物中取樣，用4-12％梯度NuPAGE凝膠(Invitrogen)，使用上面描述的還原條件進行SDS-PAGE分析。結果表明ZGOLD1和ZGOLD3的IL-21生產與W3110親本株的IL-21生產是相同的。選擇ZGOLD1/pTAP337的1號分離物(保藏于美國典型培養物保藏中心(提交申請時未命名))對用于IL-21生產的過程進行進一步開發。
從以上詳述，可以理解盡管為了舉例說明在這里已經描述了本發明的特異實施方案，但在不偏離本發明精神和范疇的前提下，可以進行多種不同的改動。因此除了附帶的權利要求的限制以外，本發明是沒有限制的。
序列表<110>ZymoGenetics，Inc.
<120>在原核宿主中生產IL-21<130>02-12PC<160>42<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>642<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(47)...(535)<400>1gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55Met Arg Ser1agt cct ggc aac atg gag agg att gtc atc tgt ctg atg gtc atc ttc103Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe5 10 15ttg ggg aca ctg gtc cac aaa tca agc tcc caa ggt caa gat cgc cac 151Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His20 25 30 35atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat199Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn40 45 50
tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta247Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val55 60 65gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgt ttt cag aag gcc caa295Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln70 75 80cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata atc aat gta tca343Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser85 90 95att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat gca ggg aga aga391Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg100 105 110 115cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct tat gag aaa aaa439Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys120 125 130cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt ctc caa aag atg487Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met135 140 145att cat cag cat ctg tcc tct aga aca cac gga agt gaa gat tcc tga535Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser *150 155 160ggatctaact tgcagttgga cactatgtta catactctaa tatagtagtg aaagtcattt 595ctttgtattc caagtggagg agccctatta aattatataa agaaata642<210>2<211>162<212>PRT<213>人<400>2Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met1 5 10 15Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln20 25 30Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro50 55 60Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln65 70 75 80Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile85 90 95Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala100 105 110Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr115 120 125Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu130 135 140Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160Asp Ser<210>3<211>50<212>DNA<213>寡核苷酸ZC29740人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC29740<400>3ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 50<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC29741<400>4tctgatttaa tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cg 42<210>5<211>62<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC29736<400>5gtggaattgt gagcggataa caatttcaca cagaattcat taaagaggag aaattaactc 60cc 62<210>6<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC29738<400>6gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca cccgggagtt aatttctcct ctttaatgaa 60ttc 63<210>7<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC29084<400>7atcaacacca acatcagcac cataaggagg agtagcatat gcaaggtcaa gatcgccaca 60tg 62<210>8<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22127<400>8tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcaggaatct tcacttccgt 60
gtgttcta68<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22913<400>9ggaaccaggt cgttcacata gtttttcagc tgatcaacaa 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22914<400>10ttgttgatca gctgaaaaac tatgtgaacg acctggttcc 40<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22915<400>11tgtttctgac gacgacctgc gttggtggac ggcggtttac 40<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22916
<400>12gtaaaccgcc gtccaccaac gcaggtcgtc gtcagaaaca 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22961<400>13gttttcacga gcacttcacc aacaaggacc atagattatg 40<210>14<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22962<400>14aacaaggacc atagattatg caggatcgcc acatgattcg tatgcgtcag 50<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22963<400>15gtttttcagc tgatcaacaa tatcgatcag ctgacgcata cgaatcatgt 50<210>16<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22964
<400>16tatgtgaacg acctggttcc ggaattcctg ccggctccgg aagatgttga gaccaactgt 60<210>17<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22965<400>17tcagctgggc tttctggaaa caggagaaag cggaccactc acagttggtc tcaacatctt 60<210>18<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22966<400>18tttccagaaa gcccagctga aatccgcaaa caccggtaac aacgaacgta tcatcaacgt 60<210>19<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22967<400>19gttggtggac ggcggtttac gtttcagttt tttaatggaa acgttgatga tacgttcgtt 60<210>20<211>60
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22968<400>20gcaggtcgtc gtcagaaaca ccgtctgacc tgcccgtcct gtgattctta tgagaaaaaa 60<210>21<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22969<400>21gcagcaggga tttgaaacgt tccaggaatt ctttcggcgg ttttttctca taagaatcac 60<210>22<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22970<400>22acgtttcaaa tccctgctgc agaaaatgat tcaccagcac ctgtcctctc gtacccacgg 60<210>23<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22971<400>23
aatcttatct catccgccaa aacatcagga atcttcggaa ccgtgggtac gagaggacag 60<210>24<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC22972<400>24ttaatctgta tcaggctgaa aatcttatct catccgccaa 40<210>25<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC40133<400>25caacatct tccggagccg gcaggaattc cggaaccagg tcattcacat aattt cag60ccttgg63<210>26<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC40107<400>26ttatagatat tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cctggttccg gaattcctgc 60cggc 64<210>27<211>405<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>優化的IL-21<221>CDS<222>(1)...(405)<400>27atg caa ggt caa gat cgc cac atg att aga atg cgt caa ctt ata gat 48Met Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp1 5 10 15att gtt gat cag ctg aaa aat tat gtg aat gac ctg gtt ccg gaa ttc 96Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe20 25 30ctg ccg gct ccg gaa gat gtt gag acc aac tgt gag tgg tcc gct ttc 144Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe35 40 45tcc tgt ttc cag aaa gcc cag ctg aaa tcc gca aac acc ggt aac aac 192Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn50 55 60gaa cgt atc atc aac gtt tcc att aaa aaa ctg aaa cgt aaa ccg ccg 240Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro65 70 75 80tcc acc aac gca ggt cgt cgt cag aaa cac cgt ctg acc tgc ccg tcc 288Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser85 90 95tgt gat tct tat gag aaa aaa ccg ccg aaa gaa ttc ctg gaa cgt ttc 336Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe100 105 110aaa tcc ctg ctg cag aaa atg att cac cag cac ctg tcc tct cgt acc 384Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr115 120 125cac ggt tcc gaa gat tcc tga 405His Gly Ser Glu Asp Ser *130
<210>28<211>134<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優化的IL-21<400>28Met Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp1 5 10 15Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe20 25 30Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe35 40 45Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn50 55 60Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro65 70 75 80Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser85 90 95Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe100 105 110Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr115 120 125His Gly Ser Glu Asp Ser130<210>29<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC43,586<400>29acaatttcac acagaattca ttaaagagga gaaattaact atggatatta atactgaaac 60tgag64<210>30
<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC43,587<400>30tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcatcgccat tgctccccaa 60atac 64<210>31<211>1965<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用ZC43，586和ZC43，587擴增的Red Recombinase操縱子的DNA序列<400>31acaatttcac acagaattca ttaaagagga gaaattaact atggatatta atactgaaac 60tgagatcaag caaaagcatt cactaacccc ctttcctgtt ttcctaatca gcccggcatt 120tcgcgggcga tattttcaca gctatttcag gagttcagcc atgaacgctt attacattca 180ggatcgtctt gaggctcaga gctgggcgcg tcactaccag cagctcgccc gtgaagagaa 240agaggcagaa ctggcagacg acatggaaaa aggcctgccc cagcacctgt ttgaatcgct 300atgcatcgat catttgcaac gccacggggc cagcaaaaaa tccattaccc gtgcgtttga 360tgacgatgtt gagtttcagg agcgcatggc agaacacatc cggtacatgg ttgaaaccat 420tgctcaccac caggttgata ttgattcaga ggtataaaac gaatgagtac tgcactcgca 480acgctggctg ggaagctggc tgaacgtgtc ggcatggatt ctgtcgaccc acaggaactg 540atcaccactc ttcgccagac ggcatttaaa ggtgatgcca gcgatgcgca gttcatcgca 600ttactgatcg ttgccaacca gtacggcctt aatccgtgga cgaaagaaat ttacgccttt 660cctgataagc agaatggcat cgttccggtg gtgggcgttg atggctggtc ccgcatcatc 720aatgaaaacc agcagtttga tggcatggac tttgagcagg acaat9aatc ctgtacatgc 780cggatttacc gcaaggaccg taatcatccg atctgcgtta ccgaatggat ggatgaatgc 840cgccgcgaac cattcaaaac tcgcgaaggc agagaaatca cggggccgtg gcagtcgcat 900cccaaacgga tgttacgtca taaagccatg attcagtgtg cccgtctggc cttcggattt 960gctggtatct atgacaagga tgaagccgag cgcattgtcg aaaatactgc atacactgca 1020gaacgtcagc cggaacgcga catcactccg gttaacgatg aaaccatgca ggagattaac 1080actctgctga tcgccctgga taaaacatgg gatgacgact tattgccgct ctgttcccag 1140atatttcgcc gcgacattcg tgcatcgtca gaactgacac aggccgaagc agtaaaagct 1200cttggattcc tgaaacagaa agccgcagag cagaaggtgg cagcatgaca ccggacatta 1260tcctgcagcg taccgggatc gatgtgagag ctgtcgaaca gggggatgat gcgtggcaca 1320
aattacggct cggcgtcatc accgcttcag aagttcacaa cgtgatagca aaaccccgct 1380ccggaaagaa gtggcctgac atgaaaatgt cctacttcca caccctgctt gctgaggttt 1440gcaccggtgt ggctccggaa gttaacgcta aagcactggc ctggggaaaa cagtacgaga 1500acgacgccag aaccctgttt gaattcactt ccggcgtgaa tgttactgaa tccccgatca 1560tctatcgcga cgaaagtatg cgtaccgcct gctctcccga tggtttatgc agtgacggca 1620acggccttga actgaaatgc ccgtttacct cccgggattt catgaagttc cggctcggtg 1680gtttcgaggc cataaagtca gcttacatgg cccaggtgca gtacagcatg tgggtgacgc 1740gaaaaaatgc ctggtacttt gccaactatg acccgcgtat gaagcgtgaa ggcctgcatt 1800atgtcgtgat tgagcgggat gaaaagtaca tggcgagttt tgacgagatc gtgccggagt 1860tcatcgaaaa aatggacgag gcactggctg aaattggttt tgtatttggg gagcaatggc 1920gatgatgttt tggcggatga gataagattt tcagcctgat acaga 1965<210>32<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,112<400>32attgttacat tgaaatggct agttattccc cggggcgatt ttcacctcgg ggaaatttta 60gttggcgttc tcaggtcgag gtggcccggc tc 92<210>33<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸 ZC45,171<400>33taattgactc attaagttag atataaaaaa tacatattca atcattaaaa cgattgaatg 60gagaactttt attattgaag catttatcag ggttattgt99<210>34<211>1591<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用ZC45，112和ZC45，171擴增的四環素啟動子∷四環素基因(tetp∷tet)片段<400>34taattgactc attaagttag atataaaaaa tacatattca atcattaaaa cgattgaatg 60gagaactttt attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 120gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 180cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 240aggccttctc atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag 300ttaaattgct aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc 360ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc 420ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg 480ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt 540ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg 600gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 660gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 720cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 780gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 840ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 900ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 960atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca 1020gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg 1080tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc 1140accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc 1200tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc 1260gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac 1320gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact 1380ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca 1440tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg 1500agccgggcca cctcgacctg agaacgccaa ctaaaatttc cccgaggtga aaatcgcccc 1560ggggaataac tagccatttc aatgtaacaa t1591<210>35<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,357<400>35tcattaagtt agatataaaa aatacatatt ca 32
<210>36<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,350<400>36taattgttac attg aaatgg ctagttatt 29<210>37<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,353<400>37atgaaatcta acaatgcgct catcgtc 27<210>38<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,355<400>38tcaggtcg aggtggcccggc tc 22<210>39<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,354<400>39tctaccgaga ctttatcgtt tactcct 27
<210>40<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ZC45,359<400>40ttaaaatgtg tacttaagac cagcagta28<210>41<211>1585<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用引物組#1(ZC45，357和ZC45，350)擴增的1584bp的PCR片段的序列<400>41tcattaagtt agatataaaa aatacatatt caatcattaa aacgattgaa tggagaactt 60ttattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 120ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 180ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccttc 240tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg 300ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac 360cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg 420ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc 480gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg 540cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac 600acccgtcctg tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg 660tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt 720cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact 780gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 840cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc 900cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 960cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 1020ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 1080ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 1140tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 1200gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg 1260
cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 1320gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct 1380gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt 1440aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc 1500cacctcgacc tgagaacgcc aactaaaatt tccccgaggt gaaaatcgcc ccggggaata 1560actagccatt tcaatgtaac aatta 1585<210>42<211>1191<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用引物組#2(ZC45,353和ZC45,355)擴增的1190bp的PCR片段的序列<400>42atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 119權利要求
1.用于生產IL-21蛋白的表達載體，其包含以下操作性連接的元件(a)原核復制起點；(b)轉錄起始DNA元件；(c)如SEQ ID NO27所示的多聚核苷酸序列；以及(d)轉錄終止子。
2.權利要求1的表達載體，該載體還包含選擇性標記。
3.包含pTAP337載體的表達載體，其保藏于弗吉尼亞州Manassas的美國典型培養物保藏中心，專利保藏號為PTA-4853。
4.用根據權利要求1、2或3的表達載體轉化的原核宿主細胞。
5.權利要求4的宿主細胞，其中該宿主細胞是大腸桿菌菌株W3110。
6.生產IL-21蛋白的方法，包含(a)在生長培養基中，在IL-21被表達的條件下培養根據權利要求5的宿主細胞；(b)從生長培養基中回收宿主細胞；以及(c)從宿主細胞中分離IL-21蛋白。
7.生產IL-21蛋白的方法，包含(a)在生長培養基中由補料批量發酵培養根據權利要求5的宿主細胞；(b)從生長培養基中回收宿主細胞；以及(c)從宿主細胞中分離IL-21蛋白。
8.生產IL-21蛋白的方法，包含(a)用搖瓶在生長培養基中培養根據權利要求4或者權利要求5的宿主細胞，直至OD600達到5-20；(b)用1-12％v/v的含有宿主細胞的搖瓶培養基接種發酵容器；(c)在pH6.2到7.2的生長培養基中培養宿主細胞，其中在15小時流逝發酵時間(EFT)以前將補料溶液補充到發酵容器內；(d)在20-30小時EFT時向發酵容器中加入誘導劑；以及(e)在48-56小時EFT時收獲宿主細胞。
9.權利要求8的方法，其中所述誘導劑是濃度為0.5-2mM的異丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。
10.權利要求8的方法，其中的補料溶液包含選自甘油和葡萄糖的糖，其濃度為生長培養基的濃度，補料的速率為每小時5-15克糖。
11.權利要求10的方法，其中甘油是40-70％v/v或者其中葡萄糖是40-70％w/v。
12.權利要求10的方法，其中甘油是大約70％v/v或者其中葡萄糖是大約60％w/v。
13.生產IL-21蛋白的方法，包含(a)向搖瓶中接種接種物，其包含表達由SEQ ID NO28所示的IL-21多肽的大腸桿菌W3110宿主細胞，或者是其中表達IL-21多肽的包含pTAP337載體的大腸桿菌W3110宿主細胞，并且使用的生長培養基包含大約5克/升的甘油；(b)在約30攝氏度下在生長培養基中培養接種物16-20小時；(c)將生長培養基中培養的接種物轉移至批量發酵罐內，接種物濃度為0.5-5％v/v；(d)在溫度大約37攝氏度和pH大約6.8以及大約2％的甘油存在下進行批量發酵；(e)在大約8小時流逝發酵時間(EFT)時引入葡萄糖補料，速率是大約9.5克葡萄糖每升每小時，且持續補充至一輪發酵運行結束；(f)在大約24小時EFT時加入IPTG至終濃度為0.5-2mM；(g)加入IPTG后發酵大約28小時；(h)從發酵罐中收獲發酵液；(i)向發酵液中加入等體積的水；以及(j)勻漿并離心發酵液以收集包含IL-21蛋白物質的細胞沉淀或者細胞漿。
14.分離包含如SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，包含以下步驟(a)從細胞沉淀或者細胞漿中分離出不溶于水的IL-21蛋白物質；(b)將不溶性的IL-21蛋白物質溶于離液序列高的溶劑中；(c)稀釋離液序列高的溶劑并使IL-21蛋白重折疊；以及(d)分離IL-21蛋白，其中分離的IL-21蛋白能夠具有生物活性。
15.權利要求14的方法，其中分離的IL-21蛋白其純度至少為90％。
16.權利要求14的方法，其中分離的IL-21蛋白其純度至少為90％，且內毒素水平為每毫克IL-21蛋白小于10個內毒素單位。
17.分離包含如SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，包含以下步驟(a)從發酵液中分離出包含不溶于水的IL-21蛋白物質的細胞沉淀或者細胞漿；(b)勻漿細胞沉淀或者細胞漿以收集包含體；(c)將不溶性的IL-21蛋白物質溶解于包含胍鹽的離液序列高的溶劑中；(d)通過加入包含精氨酸鹽和氧化還原組分混合物的重折疊緩沖液而稀釋離液序列高的溶劑；(e)通過過濾去除未折疊的和聚集的蛋白而分離出IL-21蛋白；以及(f)在陽離子交換柱上純化重折疊的IL-21蛋白；其中分離出的和純化的IL-21蛋白能夠具有生物活性。
18.分離包含如SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，包含以下步驟(a)從發酵液中分離出包含不溶于水的IL-21蛋白物質的細胞沉淀或者細胞漿；(b)勻漿細胞沉淀或者細胞漿以收集包含體；(c)將不溶性的IL-21蛋白物質溶解于包含胍鹽的離液序列高的溶劑中；以及(d)通過加入包含精氨酸鹽和氧化還原組分混合物的重折疊緩沖液而稀釋離液序列高的溶劑；(e)通過過濾去除未折疊的和聚集的蛋白而分離出IL-21蛋白；(f)在陽離子交換柱上純化重折疊的IL-21蛋白；以及(g)在疏水相互作用柱上純化步驟(f)產生的IL-21洗脫液，其中分離出的和純化的IL-21蛋白能夠具有生物活性。
19.分離包含如SEQ ID NO28所示氨基酸殘基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，包含以下步驟(a)從發酵液中分離出包含不溶于水的IL-21蛋白物質的細胞沉淀或者細胞漿；(b)勻漿細胞沉淀或者細胞漿以收集包含體；(c)將不溶性的IL-21蛋白溶于包含約6M鹽酸胍，40mM二硫蘇糖醇(DTT)的離液序列高的溶劑中，在室溫下作用約1小時；(d)將含包含體的離液序列高的溶劑向包含大約0.75M精氨酸，2mM DTT/4mM胱氨酸氧化還原對的重折疊緩沖液中稀釋至少20倍而使溶解的包含體在溶液中重折疊；(e)用約20％的乙酸調節pH至大約5.5并使溶液反應至少5小時；(f)用約1倍到1.4倍體積的pH5.5的25mM乙酸鹽稀釋溶液；(g)將溶液過濾；(h)將溶液上樣于事先用乙酸鈉緩沖液平衡至pH5.5的樹脂柱上；(i)用約0.4M的氯化鈉洗樹脂柱；(j)用約0.75M的氯化鈉洗樹脂柱以洗脫結合的IL-21蛋白；(k)向洗脫液中加入硫酸銨至濃度約為1.5M并過濾洗脫液；(l)將洗脫液上樣于事先用含有1.5M硫酸銨、0.05M氯化鈉的乙酸鈉緩沖液平衡的Tosohaas丁基650-M柱上；(m)用含有約0.15M硫酸銨、0.05M氯化鈉的乙酸鈉緩沖液洗柱；(n)用水將洗脫液稀釋至電導率為大約30mS/cm；(o)將洗脫液上樣于用乙酸鈉緩沖液平衡的SP SepharoseHP柱上；(p)用20倍柱體積的0.3到0.7M氯化鈉溶液的線性梯度洗柱；(q)濃縮IL-21蛋白；以及(r)使用切向流超濾將緩沖液更換為制劑緩沖液。
20.根據權利要求13，14，15或者16的方法，其中的生物活性是用IL-21受體結合細胞測定法測量的。
21.包含IL-21蛋白的組合物，該IL-21蛋白包含如SEQ ID NO28所示的氨基酸殘基1-163，組合物中IL-21蛋白在約10mM組氨酸，4.7％甘露醇，pH5.3的溶液中濃度為約10毫克/毫升。
22.來自zGOLD1菌株的宿主細胞，其保藏于弗吉尼亞州Manassas的美國典型培養物保藏中心(ATCC)中，該宿主細胞被包含pTAP337載體的表達載體轉化，pTAP337載體保藏于ATCC，專利保藏號為PTA-4853。
全文摘要
本發明描述了用大腸桿菌表達系統大規模生產IL－21的表達載體和方法。載體使用了IL－21編碼序列，其中的核苷酸有特異的改變，目的是為在大腸桿菌中翻譯而優化密碼子和mRNA二級結構。使用表達載體，在補料批量發酵中大腸桿菌表達IL－21的基因(應該是蛋白)，表達水平大于1克每升。本發明還包括轉化了IL－21表達載體的0mpT缺陷大腸桿菌菌株。
文檔編號C12N15/00GK1726281SQ200380105873
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月12日 優先權日2002年12月13日
發明者C·常, B·L·贊莫斯特, D·C·卡福特, H·Y·劉, K·S·德瓊夫, J·D·米爾, S·D·霍爾德曼 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司