檢測系統的制作方法

專利名稱：檢測系統的制作方法
技術領域：
本發明提供了例如，通過定量監測擴增反應來檢測樣品中靶多核苷酸的方法，還提供了用于這些方法中的探針和試劑盒。本發明尤其適于檢測多態性或等位基因變異，因此可用于診斷方法。
公知的熒光聚合酶鏈式反應(PCR)監測技術包括鏈特異的和普通DNA嵌入劑技術，這些技術可以在一些二代PCR熱循環裝置上使用。這些反應以關閉的管形式在熱循環儀上均一地進行。使用熒光計監測反應。測定的確切形式不同但是通常依賴于系統中兩個熒光部分之間的熒光能量轉移或FET以便產生信號，該信號指示擴增產物的存在。
WO 99/28500描述了用于檢測樣品中靶核酸序列存在的一種非常成功的測定法。在該方法中，向樣品中加入一種DNA雙鏈體結合劑和對所述靶序列特異的探針。該探針含有反應性分子，該分子能夠從所述DNA雙鏈體結合劑吸收熒光或者將熒光能量送給所述DNA雙鏈體結合劑。然后將該混合物實施擴增反應，其中靶核酸被擴增，并且在擴增過程期間或之后誘導探針與靶序列雜交的條件。監測來自所述樣品的熒光。
由于探針與靶序列雜交，DNA雙鏈體結合劑如嵌入染料被捕獲在鏈之間。通常，這將增加與染料有關的波長處的熒光。然而，當反應性分子能夠從染料吸收熒光(即，它是受體分子)時，其通過FET，特別FRET從染料接受發射能量，因此其發射具有其特征波長的熒光。來自受體分子的熒光(其和染料的熒光具有不同波長)的增加將表明探針以雙鏈體形式結合。
類似地，當反應性分子能夠向染料供出熒光(即，它是供體分子)時，來自供體分子的發射作為FRET的結果而減小，并且可以檢測該減小。在這些情況下染料的熒光的增加比所預期的更大。
來自探針上反應性分子的信號是鏈特異信號，其指示樣品內靶標的存在。從而，優選監測來自反應性分子的熒光信號的改變，該改變表明與探針有關的雙鏈體的形成或去穩定。
可以用于該方法的DNA雙鏈體結合劑是自身與雙鏈體形式的DNA粘附或結合并且能夠作為能量供體或受體的任何實體。具體的實例是本領域中熟知的嵌入染料。
使用DNA雙鏈體結合劑如嵌入染料和單標記的探針是有利的，因為這些組分比需要雙標記的其他測定更經濟。通過使用僅一種探針，形成探針基礎必需的公知序列的長度可以相對較短并因此該方法甚至可用于困難的診斷情形中。
用于測定中的DNA雙鏈體結合劑通常為嵌入染料，例如SYBRGreen，如SYBRGreen I、SYBRGold、溴化乙錠和YOPRO-1，它們自身是發熒光的。
為了在反應性分子和染料之間發生FET，如FRET，供體(其可以是嵌入染料或者探針上的反應性分子)的熒光發射必須比受體(即另一種染料或反應性分子)具有更短波長。用作供體和/或受體的分子產生的熒光信號可以可見光譜內的峰表示。
通常，發射波長內至少有一些重疊。即使信號是尖峰，也有來自熒光分子信號的一定“泄漏”，從而通常需要分辨探針產生的鏈特異峰和DNA雙鏈體結合劑信號。這可以例如，通過由經驗確定供體和受體光譜之間的關系并使用該關系使來自供體和受體的信號正常化來解決。
申請人已經發現了操作這種類型的測定的改良方法。
本發明提供了檢測樣品中靶核酸序列存在的方法，所述方法包括a)向被懷疑含有所述靶核酸序列的樣品加入對所述靶序列特異的熒光標記的探針，和DNA雙鏈體結合劑，該結合劑可以吸收來自探針上熒光標記的熒光能量但是不發射可見光，b)將所形成的混合物進行擴增反應，在擴增反應中靶核酸被擴增，c)將所述樣品置于所述探針與靶序列雜交的條件下，和d)監測來自所述樣品的熒光。
此處所用的表達“可見光”指光譜的可見區內，即390nm到750nm范圍內波長的發射。
通過使用不發射可見光譜范圍內的光的DNA雙鏈體結合劑，使用該結合劑提供的信號可能與探針的信號重疊的問題就被避免了。從而，不用分辨來自探針的信號和來自DNA雙鏈體結合劑的信號，并且可以測量更寬帶寬上的有意義信號。這意味著可以簡化裝置，或者至少置于該裝置上的計算需求。
因此可以在更寬范圍的儀器上實施測定。
備選地，通過摻入額外的探針可以利用可見光譜內的自由帶寬的任何區域，這些額外探針包括在不同波長發出熒光的不同標記，從而可以同時監測一種以上的靶標。這對于多重PCR反應尤其有用。
如果DNA雙鏈體結合劑不發出光譜的可見部分內的發射，那么可以使用的DNA雙鏈體結合劑可以是結合DNA雙鏈體的任一種化合物。因此它可以是嵌入劑、小溝結合劑、結合DNA大溝的化合物，或者結合或堆疊到探針的末尾堿基的化合物，以及它們的組合。在特定實施方案中，DNA雙鏈體結合劑將包括嵌入劑或小溝結合劑。它可以發出波長在可見光譜范圍之外，例如紅外范圍內的輻射。然而，在本發明方法的背景中將檢測不到這些發射，因此DNA雙鏈體結合劑僅有效作為一種“暗淬滅劑”。
這些化合物通常比熒光嵌入染料更經濟，使得本發明的方法更劃算。
可以用于該方法中的適宜的DNA結合劑包括具有共軛芳香環系統的DNA結合劑。環可以是芳基環，如苯基、萘基或蒽基，或者芳香雜環，例如，含有高達20個原子，其中高達5個是雜原子，如氧、硫和氮。這些系統的實例包括蒽環(anthracyclin)或蒽醌。它們可被取代以提供適宜的DNA結合性質。
具體地，化合物含有結構(I)的任選取代的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、官能團，或任選被例如官能團取代的烴基，或者R1和R2或R3和R4任選連接在一起形成環，該環任選含有雜原子，和/或任選被官能團或烴基取代。
如此處所用的，術語“官能團”指反應性基團，其適宜地含有雜原子。官能團的實例包括鹵素、氰基、硝基、氧代、-OC(O)Ra、-ORa、-C(O)ORa、S(O)tRa、NRbRc、OC(O)NRbRc、C(O)NRbRc、OC(O)NRbRc、-NR7C(O)n’R6、-NRaCONRbRc、-C＝NORa、-N＝CRbRc、S(O)tNRbRc、C(S)nRa、C(S)ORa、C(S)NRbRc或-NRbS(O)tRa，其中Ra、Rb和Rc獨立地選自氫或任選被烴基取代，或者Rb和Rc一起形成任選取代的環，該環任選含有其他雜原子如S(O)s、氧和氮，n’是整數1或2，s為0、1、或2，t為0或1-3的整數。
烴基Ra、Rb和Rc的適宜的任選取代基也可以是官能團。
如此處所用的術語“烴基”指含有碳和氫原子的有機基團，如烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基或芳烷基。術語“烷基”指直鏈或支鏈烷基，其適宜地含有高達20，更適宜地高達10個和優選高達6個碳原子。術語“烯基”或“炔基”指具有2到10個碳原子的不飽和直鏈或支鏈。術語“環烷基”指具有至少3個碳原子并且結構為環狀的烷基基團。術語“芳基”指芳香環，如苯基和萘基。術語“芳烷基”指被芳基取代的烷基，如苯甲基。
R1、R2、R3和R4的取代基的特定實例為羥基以致產生酮基-烯醇互變異構。
優選地，該化合物含有一個或多個雜原子以產生電荷，該電荷有助于結合DNA。取代基側鏈中可以含有雜原子，如氧、氮或硫。在特定實施方案中，式(I)的化合物包括取代基R1、R2、R3和R4內的至少一個氮原子。
作為DNA結合官能度的結果，這些化合物的實例可以在藥學領域，尤其抗癌和抗生素應用中發現。例如，具有使得它們適宜作為本發明的測定法中的DNA結合劑的性質的化合物包括美國專利號4197249、美國專利號3183157、美國專利號4012284、和美國專利號3997662中描述的化合物。
其他特定化合物是式(IA)的化合物并且在美國專利號513327中描述。這些化合物具有上面描述的式(I)，但是在那一情況中，R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、X、NH-ANHR和NH-A-N(O)R’R”，其中X為羥基、鹵素、氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰氧基，A為C2-4亞烷基，NH與NHR或N(O)R’R”之間的鏈長為至少2個碳原子并且R、R’和R”每一個獨立地選自C1-4烷基和C2-4羥基烷基和C2-4二羥基烷基，條件是與氮原子連接的碳原子不攜帶羥基，以及沒有碳原子被兩個羥基取代；或者R，和R”一起為C2-6亞烷基，該亞烷基與R’和R”所連接的氮原子一起形成具有3到7個原子的雜環，條件是R1、R2、R3和R4中的至少一個是基團NH-A-N(O)R’R”。具體實例在美國專利號5132,327中描述，該專利的內容被并入作為參考。
使用常規方法，可以試驗適于用作本發明的DNA雙鏈體結合劑的化合物以觀察它們是否吸收例如，來自特定標記或者一系列標記的熒光能量。具體地，它們可以被包括在使用熒光劑的PCR反應中，該熒光劑可以是標記探針或甚至熒光嵌入劑，如Sybr Green或Sybr Gold，以便試驗淬滅性質，并且還確保它們不阻礙擴增反應自身的進行。實施該試驗的適宜方案在下文的實施例3中給出。
具體實例為米托蒽醌(1，4-二-羥基5，8-二[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其鹽，如鹽酸鹽或二鹽酸鹽，或諾加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脫氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氫-3，5，8，10，13-五羥基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-環氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)，或柔紅霉素(8S，-順式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
其他特定實例包括美國專利號5132327(相當于EP-A-0450021)中描述的化合物，具體地，可以從Biostatus以商標名“Draq5”得到的細胞滲透的DNA化合物，以及以商標名“Apoptrak”得到的該化合物的N-氧化物衍生物。
用于本發明的一組特定DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌、柔紅霉素、Draq5TM和ApoptrakTM。
在特定實施方案中，DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌。
備選地或者附加地，淬滅部分如4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)可以附著并優選共價結合到公知的DNA結合劑、嵌入劑或小溝或大溝結合劑。在該情況中，如果熒光被淬滅部分完全淬滅，那么該DNA結合劑可以有一定程度的熒光。這些化合物具有穩定雙鏈體的作用。這在兩方面是有利的。首先其提高了探針與靶標的結合，減少了擴增期間改變溫度所需的時間，并允許反應更快地進行。其次其允許為引物和探針使用更短的核酸序列。當例如實施解鏈點分析時，這通常是有用的，因為探針越短，錯配導致的解鏈溫度之間的差異將越顯著。其尤其可用于例如富含AT的靶標，其中由于探針和引物退火所需的低溫，長引物和探針可以降低反應的特異性。
單鏈形式時，探針在一定程度上可以感知DNA雙鏈體結合劑的淬滅效果。然而，對于雙鏈體DNA，淬滅效果可以更顯著和清晰。通常，系統中存在的任何游離標記將不會受到DNA雙鏈體結合劑的淬滅，因為它們之間不會形成結合。
加入反應混合物中的DNA雙鏈體結合劑的量適宜地足夠導致可以測量的來自熒光標記的信號的淬滅，但是不足以抑制擴增。實現該目的的濃度范圍根據所用的具體DNA雙鏈體結合劑而變，并且可以通過下文中闡明的常規方法確定。對于DNA雙鏈體結合劑如米托蒽醌或柔紅霉素，將使用1μM到100μM，適宜地約10μM-25μM的濃度。對于Draq5，約1μM到100μM，優選約50μM的濃度可有效淬滅單標記的熒光素探針。可能需要更高濃度，例如，1mM ApoptrakTM以令人滿意地淬滅熒光素標記的探針。
本發明的方法在其應用中非常靈活。該方法可用于產生關于樣品中靶核酸序列的定量和定性數據，如下文中更詳細討論的。具體地，本發明不僅提供了用于定量擴增，而且還可以用于額外或備選地得到特征性數據，如雙鏈體去穩定溫度或解鏈溫度。
在本發明方法中，在擴增反應之前、期間或之后，樣品可以被置于探針與樣品能夠雜交的條件下。因此該方法允許以同質的方式實現檢測，因為可以在最初加入所有試劑的單個容器中實施擴增和監測。不需要隨后的試劑加入步驟。也不需要在固體支持體(盡管這是一種選擇)存在下實現該方法。
探針可含有核酸分子，如DNA或RNA，當靶核酸序列是單鏈形式時，探針將與靶核酸序列雜交。在該情況中，步驟(c)將包括使用使得靶核酸單鏈化的條件。
探針可以是在溶液中游離的或者被固定到固體支持體上，例如，固定到用于分離產物的珠子，如磁珠的表面，或者檢測裝置，如表面胞質團共振檢測器表面的導波管的表面。該選擇將取決于所考慮的具體測定的性質和所用的具體檢測方法。
具體地，所用的擴增反應將包括將樣品置于一定條件下，在該條件下，樣品中存在的任何靶核酸序列都變成單鏈。這些擴增反應包括聚合酶鏈式反應(PCR)或連接酶鏈式反應(LCR)，但是優選PCR反應。
在擴增反應期間如果遇到適宜的雜交條件，探針可能雜交。
在優選實施方案中，可以設計探針使得在擴增反應的每一循環期間這些條件都被滿足。從而，在擴增反應的每個循環期間的某一點，探針將與靶序列雜交，并且由于探針與被捕獲在探針和靶序列之間的DNA雙鏈體結合劑的緊密接近，熒光信號將被淬滅。隨著擴增的進行，探針將與靶序列分開或者熔解，因此探針產生的信號將被恢復。因此，在擴增的每個循環中，探針退火時產生來自熒光標記的熒光峰。該峰的強度將隨著擴增的進行而減弱，因為更多的靶序列可以被用來結合該探針。
通過監測每個循環期間樣品中熒光標記的熒光，可以以各種方法監測擴增反應的進展。例如，通過例如，計算熔解峰下面的面積可以分析熔解峰提供的數據并將該數據對循環數作圖。
使用公知的熒光計適宜地監測熒光。由此而來的熒光信號(例如，以光電倍增管電流形式)被送到數據處理板并被轉化成與每個樣品管相關的波譜。可以同時評估多個管，例如，96個管。在反應期間可以以該方法經常地，例如每10ms一次收集數據。
該數據提供了定量樣品中存在的靶核酸的量的機會。
此外，探針雜交的動力學將允許絕對地確定靶序列濃度。來自樣品的熒光的變化可以允許計算探針與樣品的雜交速率。雜交速率的增加將與樣品中存在的靶序列的量有關。
由于隨著擴增反應的進行靶序列濃度增加，探針的雜交將發生地更快。從而，該參數也可用作定量的基礎。這種數據處理模式是有用的，因為其不依賴于信號強度來提供該信息。
適宜的熒光標記是羅丹明染料或者其他染料，如Cy5、Cy3、Cy5.5、熒光素或其衍生物。具體衍生物是商標名為FAM的羧基熒光素化合物，如5-羧基熒光素、6-羧基熒光素，或它們的琥珀酰亞胺酯。
熒光標記的選擇將通常與吸收劑的選擇有關。顯然，標記的熒光應該在可以被嵌入劑吸收的范圍內。
米托蒽醌、柔紅霉素、Draq5和Apoptrak是熒光素和其衍生物，尤其FAM化合物的尤其好的淬滅劑。
可以以常規方式將標記附著到探針。熒光素標記在探針中的位置是不重要的，盡管通常它們將位于探針的末端區域。
優選地，它們位于探針的3’末端，因為它們將作為空間或化學封閉劑，用以防止擴增期間探針被聚合酶延伸。這可避免采取其他措施，如磷酸化，以便在擴增反應期間封閉探針的3’末端。
可能設計探針和測定條件使得探針被用于擴增反應的DNA聚合酶水解，從而釋放熒光素標記。
在該情況中，將設計探針以在PCR反應的退火和延伸相期間結合，并且用于測定法中的聚合酶將具有5’-3’外切核酸酶活性。所釋放的熒光素標記產生增加的信號，因為該信號不再被DNA雙鏈體結合劑淬滅。因此，在該情況中，通過觀察游離熒光素標記的不斷增加的信號可以監測反應。必須在高于探針與靶標或產物相互作用溫度的溫度下監測信號。
然而，在該測定中探針不必以這種方式被消耗，因為實現信號產生可以不用解離探針。
為了實現完全可逆信號，該信號與反應的每個階段存在的擴增產物的量直接相關，和/或反應速度最重要時，例如，在快速PCR中，優選設計探針使得其從靶序列完整釋放。該釋放可以例如，在擴增反應的延伸相期間。然而，因為該信號不依賴于探針水解，可以設計探針在擴增循環的任一階段雜交和熔解。例如，在不同于循環的延伸相的一個階段雜交最強烈的探針將確保對擴增反應的干擾最小。
當使用在延伸溫度或低于延伸溫度時強烈結合的探針時，使用缺少5’-3外切核酸酶的酶，如Taq或Pwo的Stoffle片段作為擴增反應的聚合酶可以實現探針從靶序列的完整釋放。
然后探針可以再次參與反應，并因此代表探針的經濟應用。
可以以各種方法解釋用可逆地雜交靶標并不被水解的探針產生的數據。在最簡單的形式中，擴增反應期間或結束時探針退火溫度時熒光標記的熒光的減少表明所存在的靶序列量增加了，表明擴增反應已經進行了并且因此樣品中實際上存在靶序列。
然而，如上面所概述的，通過監測整個擴增反應也可能定量。
最后，可能得到特征數據，尤其解鏈溫度分析(作為終點測量或全部過程的測量)，以便得到關于序列的信息，下面將進一步討論。
從而，本發明的優選實施方案包括檢測核酸擴增的方法，該方法包括在(a)核酸聚合酶(b)能夠雜交靶多核苷酸的至少一種引物，(c)能夠結合所述靶多核苷酸序列并且含有熒光標記的寡核苷酸探針和(d)能夠從所述熒光標記吸收熒光能量，并且不發射可見光譜范圍內的光的DNA雙鏈體結合劑存在下對靶多核苷酸實施核酸擴增，并監測擴增反應期間熒光的變化。
適宜地使用一對引物實施擴增，這些引物被設計使得僅DNA鏈內的靶核苷酸序列被擴增，這是本領域中熟知的。核酸聚合酶適宜地為熱穩定的聚合物，如Taq聚合酶。
可以實施擴增反應的適宜條件是本領域中熟知的。在每種情況下最佳條件是可變的，其取決于有關的具體擴增子、所用的引物的性質和所用的酶。技術人員在每種情況中可以確定最優條件。典型的變性溫度為95℃，典型的退火溫度為55℃，延伸溫度為72℃。
適宜地，在整個擴增過程，并優選在每個擴增循環期間的至少相同點監測熒光。具體地，需要在探針與靶標退火時的溫度時監測熒光。例如，可以是在約60℃溫度時。
隨著更多靶標形成，更多探針與靶標退火，并且由于探針與DNA雙鏈體結合劑的緊密接近而被淬滅。熒光的減小表明擴增的進行。
聚合酶，諸如樣品中存在的TAQTM聚合酶將具有從靶標除去探針的效果。在聚合酶的亞最佳溫度，如探針退火溫度時低水平發生該效果。因此在該溫度，這兩種反應(探針在其退火溫度的結合和聚合酶從靶標除去探針的效果)將競爭。通常，前一反應將對于許多反應循環占優勢，從而使得可以監測擴增反應。然而，最后，可以觀察到熒光的升高，此時平衡偏移并且聚合酶的效果占優勢。因此，這些結果可以揭示一種“鉤子”效應，該效應由擴增反應結束時熒光的上升導致。
可以對用本發明方法得到的數據進行處理以監測擴增反應的進行，并可以因此用于定量樣品中存在的靶標的量。
為了解釋所得數據，有必要做出一些調節。例如，在常規PCR監測反應(如WO 99/28500中描述的)中，PCR反應將導致熒光的指數上升，因此需要從所得最低值得到背景熒光的基線調節。
相反，在本申請的方法中，PCR反應的進行將導致熒光的指數下降，因為越來越多標記的探針被DNA雙鏈體結合劑淬滅。因此，需要基于所達到的熒光的最高水平調節基線。
這可適宜地通過從樣品反應采集數據并將下面的方程式應用于每個數據點來進行y＝1/xz＝y-MIN其中x是來自PCR儀器，如LightCyler的數據點，Z為基線調節的數據點，MIN為整個數據集中y的最小值。Z對循環數的作圖將允許對適宜的基線調節進行計算。
該方法可用于雜交測定法中以確定特定序列的特征。
從而在另一方面，本發明提供了確定序列的特征的方法，所述方法包括a)向懷疑含有所述序列的樣品加入對所述靶序列特異的熒光標記的探針和DNA雙鏈體結合劑，該DNA雙鏈體結合劑能夠吸收來自探針上熒光標記的熒光但是不發射可見光譜范圍內的輻射，b)將所述樣品置于所述探針與靶序列雜交的條件下，c)監測所述樣品的熒光并確定所述序列的特征性反應條件，在該條件下熒光的變化是探針與樣品的雜交或者探針和靶核酸序列之間形成的雙鏈體去穩定化。
適宜的反應條件包括溫度、電化學或對特定酶或化學品存在的反應。通過監測這些性質的改變導致熒光的變化，可以確定序列的精確性質的特征性信息。例如，對于溫度，可以確定探針分離或者從靶序列“熔解”的溫度。這可非常適用于例如，檢測和如果希望，定量序列中的多態性，包括基因診斷中等位基因變異。“多態性”包括在序列中，尤其自然情況下可以發生的轉換、顛換、插入、缺失或倒位。
如果靶序列僅一個堿基對不同，那么探針熔解的滯后現象將不同。從而，當樣品僅含有一種等位基因變體時，探針的熔解溫度將是一個具體值，其將與僅含有另一等位基因變體的樣品中發現的值不同。含有兩種等位基因變體的樣品呈現相應于每種等位基因變體的兩個熔解溫度。
類似的考慮應用于電化學性質，或者某些酶或化學品的存在。探針可以固定在固體表面，在該固體表面可以應用電化學電位。在特定電位值靶序列將結合探針或者被探針排斥，這取決于該序列的精確性質。
該實施方案可以與擴增反應，如上面提到的PCR反應聯合實現，或者其可以單獨使用。
本發明的其他方面包括用于本發明方法中的試劑盒。這些試劑盒將含有DNA雙鏈體結合劑，其能夠吸收在探針上發現的熒光標記的熒光能量，但是不能發射可見光譜范圍內的光。試劑盒的其他可能的組分包括用于擴增反應的試劑，如DNA聚合酶(包括用于“熱啟動”反應的化學修飾的TAQ)、引物、緩沖液和公知改善PCR過程的輔助劑，如“熱啟動”試劑，如抗Taq抗體，或者焦磷酸鹽和焦磷酸酶，如待決國際專利申請PCT/GB02/01861中描述的。試劑盒可額外或備選地包括靶序列的被熒光標記的探針。
試劑盒可以包括所有試劑在單個容器中，或者一些試劑可以在分離的容器中，它們在現場混合。
另一方面，本發明提供了可以吸收熒光能量但是不發射可見光的DNA雙鏈體結合劑在檢測樣品中靶核酸序列的存在的方法中的用途。
適宜的方法如上面定義。DNA雙鏈體結合劑的具體實例也如上面描述。
本發明現在將通過實施例參考附圖具體描述本發明，這些附圖中

圖1用圖解法顯示了使用本發明方法發生的相互作用；圖2闡明了按照本發明的擴增反應期間的階段；圖3顯示了按照本發明的擴增反應的結果，用退火步驟末產生的熒光的倒數對循環數作圖，并闡明了1∶100的0.0193M米托蒽醌對人胎盤DNA的3次10倍稀釋液的影響；圖4顯示了純(neat)(0.0193M)米托蒽醌的10倍稀釋系列對CTW19探針的淬滅效果；圖5顯示了純(5nM)柔紅霉素的10倍稀釋系列對CTW19探針的淬滅效果；圖6闡明了在FAM標記的探針存在下實施PCR反應時各種濃度的暗淬滅劑對熒光的影響。
本發明方法的一個要素是探針(1)，它優選在3’末端攜帶熒光標記(2)。該探針可以特異結合靶序列，將該探針與DNA雙鏈體結合劑(3)一起加到被懷疑含有靶序列的樣品。
當探針(1)在溶液中是游離的時候，熒光標記(2)將發熒光。一些DNA雙鏈體結合劑可以與探針結合，這可以輕微淬滅信號，但是淬滅的水平是低的(圖1A)。然而，當探針(1)與單鏈靶序列(4)雜交而形成如圖1B中所示雙鏈體時，DNA雙鏈體結合劑(3)與雙鏈體結合并因此與熒光標記緊密接近。來自標記的熒光能量傳遞給DNA雙鏈體結合劑(3)，并因此來自樣品的熒光被減小或淬滅。從而標記的熒光的減小表明探針與靶序列的雜交。
從而通過測量標記的熒光的減小(例如，隨著溫度降低)，可以檢測發生雜交的點。類似地，隨著溫度增加，在探針(1)從靶序列(4)熔解時，將發生標記熒光增加，因為該標記不再受DNA雙鏈體結合劑的影響。
熔解溫度將根據探針和靶序列的雜交特征而變。例如，與靶序列完全互補的探針將在與靶序列雜交但是含有一個或多個錯配的探針不同的溫度下熔解。
圖2闡明了本發明的方法怎樣可用于擴增反應如PCR反應中。探針(1)將聯合DNA雙鏈體結合劑(3)與單鏈DNA雜交并從而標記信號將被淬滅(圖2A)。在所闡明的實施方案中，這在循環的退火相期間發生，在該期間引物(5)退火。隨著擴增導致的靶序列的量增加，更多雙鏈體形成，這些雙鏈體摻入探針以及DNA雙鏈體結合劑，導致退火相期間標記產生的信號減小。
延伸相期間，因為DNA聚合酶代替探針，探針被從靶序列除去。在該點，因為探針離開DNA雙鏈體結合劑，標記信號增強(圖2B)。
通過監測來自標記的熒光，可以跟蹤擴增反應的進行并確定原始樣品中存在的靶序列的量。
實施例1 PCR擴增反應使用人β珠蛋白基因的Carl Wittwer測定法檢驗本發明的方法。在每種情況中，下面的實驗方案如下
首先，制備含有下面組分的2×Master混合制劑2×Master混合制劑2000μl 500mM Tris pH8.8，2000μl 2mM dUTP核苷酸250μl 20mg/ml B.S.A1600μl甘油200μl 1單位/μl尿嘧啶-N-糖基化醇160μl 5單位/μl Taq聚合酶3190μl HPLC級水600μl 0.1M氯化鎂溶液然后制備適于實施Carl Wittwer測定法的PCR混合制劑，其含有下面的組分PCR混合制劑50μl 3mM Mg2+的2×Master混合液10μl 10μM正向引物(PCO3)10μl 10μM反向引物(PCO4)10μl 2μM探針(CTW19)5μl HPLC級水5μl 10μM米托蒽醌引物序列(PCO3)ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC引物序列(PCO4)CAA CTT CAT CCA CGT TCA CCCTW19CAA ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAT(3’熒光素)該PCR混合制劑共90μl。然后將混合物充分渦旋并分成2×45μl。向其中之一加入5μl HPLC水作為無模板對照(NTC’s)，向另一份加入5μl人胎盤DNA(各種濃度)作為陽性反應物。然后將這些2×50μl進一步分成4×20μl并移液到Lightcycler毛細管中以產生雙份NTC’s和雙份+’s。
應該為每個實驗中試驗的變量的每個值制備上面的混合物。
然后將毛細管旋下(spin down)并以下面的循環程序在RocheLightcycler上運行遺留防止(carry over prevention)×150℃60秒95℃15秒循環×5095℃5秒60℃5秒。在該步驟收集F1通道(530nm)的熒光74℃5秒熔解分析×150℃15秒以0.1℃/秒緩慢升高到95℃。在該步驟中收集F1通道(530nm)的熒光典型結果在圖3中顯示。
圖3圖解了對于10倍稀釋系列，高于背景信號的可區別信號。最適PCR(其中將發生指數擴增)中靶模板的10倍稀釋將導致每個循環擴增子的數目增加2。用于檢測擴增子濃度(并推論出靶標的最初量)的探針系統將產生信號，這些信號將高于任意循環值處的背景，這些循環值對于PCR功能范圍內的每個10倍稀釋相隔～3.31個循環。這在圖3有明確顯示。
實施例2 確定DNA雙鏈體結合劑的最佳濃度用各種濃度的DNA雙鏈體結合劑米托蒽醌和柔紅霉素重復實施例1中描述的PCR反應。結果分別在圖4和5中顯示。從這些圖可清楚地看出出現代表擴增反應的清晰信號，其中起始米托蒽醌物質(0.0193M)被以1∶100有效稀釋后加入反應混合物而被1∶20稀釋，導致終濃度為約10μM。
類似地，將5mM柔紅霉素起始物以1∶10稀釋后進一步稀釋(1∶20)到PCR反應混合物中。該情況下終濃度為25μM。
實施例3 其他淬滅性DNA結合劑的鑒定步驟1 吸收劑的鑒定使用下面的方法鑒定了可用于吸收熒光能量的許多其他DNA雙鏈結合劑。
制備潛在淬滅劑的10倍稀釋系列并將5μl每種稀釋液加到下面的PCR反應混合物中。
PCR混合制劑50μl 3mM Mg2+的如實施例1中定義的2×Master
混合液10μl 10μM正向引物(PCO3)10μl 10μM反向引物(PCO4)5μl Sybr Gold10μl HPLC級水5μl各種濃度的暗淬滅劑然后將它進行如實施例1中描述的擴增反應。該實驗的目的是為兩方面，首先確定混合物中包括潛在淬滅劑是否將抑制PCR并且如果抑制在怎樣的濃度下抑制。其次，我們可以看到混合物中包括潛在淬滅劑是否減小(淬滅)了Sybr Gold的熒光(通過比較用不含有淬滅劑的對照運行得到的基線和最大熒光)。它們之間這兩個結果使得可以確定潛在分子可尤其用作DNA雙鏈體結合劑的濃度范圍，這些DNA雙鏈體結合劑可以作為暗淬滅劑。
然而，Sybr Gold信號的減弱可以是由于潛在淬滅劑與Sybr Gold競爭(out-competing)小溝中的結合位點。盡管難以說出這和淬滅(或者兩者一起)之間的差異，但是其仍然是有益的觀察，其將表示潛在淬滅劑實際上可以嵌入。
然后將以這種方法鑒定的潛在淬滅劑進行下面的實驗以闡明這一問題。
步驟2 用FAM標記的探針試驗完全暗淬滅劑形式的潛在分子使用實驗1中建立的潛在淬滅劑的更窄的濃度范圍，將所有選擇的潛在淬滅劑加入下面的混合物PCR混合制劑50μl 3mM Mg2+的2×Master混合液10μl 10μM正向引物(PC03)10μl 10μM反向引物(PC04)10μl 2μM探針(CTW19)5μl HPLC級水5μl通過實驗1縮小的各種濃度的暗淬滅劑然后將它進行如實施例1中描述的擴增，并監測熒光。產生圖6中圖解類型結果的那些淬滅劑，選擇指數線性的有效部分用于進一步評估。
如果沒有觀察到效果，則保留潛在淬滅劑用于使用備選染料如Cys(其在565nm發熒光)和Cy5.5(其在694nm發熒光)的試驗中。
PCR儀器的基線調節功能將使曲線偏移(如圖6中)，因為這些儀器從反應的錯誤末端扣除。這可以通過輸出原始數據并應用基線調節公式進行校正，該基線調節公式已經被調節用于處理如上面概述的熒光的減弱而不是增強。
步驟3 定量效果在試驗2中成功的潛在淬滅劑被包括在一個試驗中，該試驗使用靶DNA的10倍稀釋系列。隨后稀釋液之間CT值的3.3個循環的差異表明該效果直接與靶DNA的量有關并且因此也與PCR方法有關。
PCR混合制劑50μl 3mM Mg2+的2×Master混合液10μl 10μM正向引物(PCO3)10μl 10μM反向引物(PCO4)10μl 12μM探針(CTW19)5μl HPLC級水5μl通過實驗1)和2)定義的濃度的暗淬滅劑然后如實施例1中描述的擴增該混合物，被改變的變量是靶DNA的濃度(我們的10-倍系列)。僅運行一組非靶標對照(NTCs)。
使用該方案，米托蒽醌、柔紅霉素、Draq5TM和ApoptrakTM被鑒定為有用的暗淬滅劑。
權利要求
1.檢測樣品中靶核酸序列存在的方法，所述方法包括a)向被懷疑含有所述靶核酸序列的樣品加入對所述靶序列特異的熒光標記的探針，和DNA雙鏈體結合劑，該結合劑可以吸收來自探針上熒光標記的熒光能量但是不發射可見光，b)將所形成的混合物進行擴增反應，在擴增反應中靶核酸被擴增，c)將所述樣品置于所述探針與靶序列雜交的條件下，和d)監測來自所述樣品的熒光。
2.根據權利要求1的方法，其中DNA雙鏈體結合劑具有稠合的共軛環系統。
3.根據權利要求1或2的方法，其中DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌(1，4-二羥基5，8-二[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其鹽，如鹽酸鹽或二鹽酸鹽，或諾加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脫氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氫-3，5，8，10，13-五羥基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-環氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)，或柔紅霉素(8S，-順式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
4.根據權利要求3的方法，其中DNA結合劑是米托蒽醌。
5.根據權利要求1或2的方法，其中DNA結合劑是式(I)化合物 其中R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、X、NH-ANHR和NH-A-N(O)R’R”，其中X為羥基、鹵素、氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰氧基，A為C2-4亞烷基，NH與NHR或N(O)R’R”之間的鏈長為至少2個碳原子并且R、R’和R”每一個獨立地選自C1-4烷基和C2-4羥基烷基和C2-4二羥基烷基，條件是與氮原子連接的碳原子不攜帶羥基，以及沒有碳原子被兩個羥基取代；或者R’和R”一起為C2-6亞烷基，該亞烷基與R’和R”所連接的氮原子一起形成具有3到7個原子的雜環，條件是R1、R2、R3和R4中的至少一個是基團NH-A-N(O)R’R”。
6.根據前面權利要求任一項的方法，其中靶核酸在步驟(c)與探針雜交前被單鏈化。
7.根據前面權利要求任一項的方法，其中擴增反應是聚合酶鏈式反應(PCR)。
8.根據前面權利要求任一項的方法，其中在擴增反應的每個循環期間探針與靶核酸雜交。
9.根據權利要求8的方法，其中在擴增反應整個過程中監測來自樣品的熒光。
10.根據權利要求9的方法，其中產生的熒光數據被用于確定探針雜交的速率。
11.根據權利要求8到10任一項的方法，其中熒光數據被用于測定樣品中存在的靶核酸的量。
12.根據前面權利要求任一項的方法，其中熒光標記是羅丹明染料、Cy5、熒光素或熒光素衍生物。
13.根據前面權利要求任一項的方法，其中熒光標記附著到探針的末端區域。
14.根據權利要求13的方法，其中熒光標記被附著到探針的3’末端并防止聚合酶對探針的延伸。
15.根據前面權利要求任一項的方法，其中設計探針使得在非延伸相的擴增過程的相期間探針從靶序列完整釋放。
16.根據前面權利要求1到14任一項的方法，其中在擴增過程的延伸相期間通過聚合酶的作用使探針從靶序列完整釋放，并且使用缺少5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶實現擴增反應。
17.根據權利要求1的方法，其包括在(a)核酸聚合酶(b)能夠雜交所述靶多核苷酸的至少一種引物，(c)能夠結合所述靶多核苷酸序列并且含有熒光標記的寡核苷酸探針和(d)能夠從所述熒光標記吸收熒光能量并且不發射可見光譜范圍內的光的DNA雙鏈體結合劑的存在下對靶多核苷酸實施核酸擴增，并監測擴增反應期間熒光的變化。
18.根據權利要求17的方法，其中使用一對擴增引物適宜地實施擴增。
19.根據權利要求17或權利要求18的方法，其中核酸聚合酶是熱穩定聚合酶。
20.根據前面權利要求任一項的方法，其中在另一步驟中，實施雜交分析并檢測序列的特征性雜交條件。
21.根據權利要求20的方法，其中條件是溫度、電化學電位，或者與酶或化學品的反應。
22.根據權利要求21的方法，其中條件是溫度。
23.根據權利要求22的方法，該方法用于檢測靶序列中等位基因變異或多態性。
24.確定序列特征的方法，所述方法包括a)向懷疑含有所述序列的樣品加入對所述靶序列特異的熒光標記的探針和DNA雙鏈體結合劑，該DNA雙鏈體結合劑能夠吸收來自探針上熒光標記的熒光但是不發射可見光譜范圍內的輻射，b)將所述樣品置于所述探針與靶序列雜交的條件下，c)監測所述樣品的熒光并確定所述序列的特征性反應條件，在該條件下熒光變化是探針與樣品雜交或者探針和靶核酸序列之間形成的雙鏈體去穩定化的結果。
25.根據權利要求24的方法，其中所述序列的特征性反應條件是溫度、電化學電位，或者與酶或化學品反應。
26.根據權利要求25的方法，其中條件是溫度。
27.根據權利要求24到26任一項的方法，其中比較從兩個序列得到的結果以確定它們之間多態性或變異的存在。
28.根據權利要求24到27任一項的方法，其中DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌(1，4-二羥基5，8-二[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其鹽，如鹽酸鹽或二鹽酸鹽，或諾加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脫氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氫-3，5，8，10，13-五羥基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-環氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)或柔紅霉素(8S，-順式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
29.根據權利要求24到27任一項的方法，其中DNA雙鏈體結合劑是如權利要求5所限定的式(IA)的化合物。
30.用于根據前面權利要求任一項的方法中的試劑盒，該試劑盒含有(1)DNA雙鏈體結合劑，其能夠吸收熒光能量，但是不發射可見光譜范圍內的輻射，和(ii)對靶核苷酸序列特異的熒光標記的探針，或(iii)實施擴增反應所需的一種或多種試劑。
31.根據權利要求30的試劑盒，其含有(iii)并且其中試劑選自引物、DNA聚合酶、緩沖液，或者公知改善PCR的輔助劑。
32.根據權利要求30或權利要求31的試劑盒，其中DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌(1，4-二羥基5，8-二[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其鹽，如鹽酸鹽或二鹽酸鹽，或諾加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脫氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氫-3，5，8，10，13-五羥基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-環氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)或柔紅霉素(8S，-順式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
33.根據權利要求30或權利要求31的試劑盒，其中DNA雙鏈體結合劑是如權利要求5所限定的式(IA)的化合物。
34.根據權利要求28到33任一項的試劑盒，其含有(i)和(ii)。
35.可以吸收熒光能量但是不發射可見光的DNA雙鏈體結合劑在檢測樣品中靶核酸序列的存在的方法中的用途。
36.根據權利要求35的用途，其中DNA雙鏈體結合劑含有共軛芳香環系統。
37.根據權利要求36的用途，其中DNA雙鏈體結合劑包括蒽環或蒽醌。
38.根據權利要求35到37任一項的用途，其中DNA雙鏈體結合劑是結構(I)的任選取代的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、官能團，或任選被例如官能團取代的烴基，或者R1和R2或R3和R4任選連接在一起形成環，該環任選含有雜原子，和/或任選被官能團或烴基取代。
39.根據權利要求35到38任一項的用途，其中DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌(1，4-二羥基5，8-二[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其鹽，如鹽酸鹽或二鹽酸鹽，或諾加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脫氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氫-3，5，8，10，13-五羥基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-環氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)或柔紅霉素(8S，-順式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
40.根據權利要求35到38任一項的用途，其中DNA雙鏈體結合劑是如權利要求5所定義的式(IA)的化合物。
41.根據權利要求39的用途，其中DNA雙鏈體結合劑是米托蒽醌。
全文摘要
檢測樣品中靶核酸序列存在的方法，所述方法包括(a)向被懷疑含有所述靶核酸序列的樣品加入對所述靶序列特異的熒光標記的探針，和DNA雙鏈體結合劑，該結合劑可以吸收來自探針上熒光標記的熒光能量但是不發射可見光，(b)將所形成的混合物進行擴增反應，在擴增反應中靶核酸被擴增，(c)將所述樣品置于所述探針與靶序列雜交的條件下，和(d)監測來自所述樣品的熒光。該方法可用于例如監測擴增反應，如PCR反應，從而可以確定樣品中存在的靶序列的量。額外或備選地，該方法可用于產生雙鏈體去穩定數據，如熔解滯后信息，它們用于擴增監測或檢測和定量多態性或等位基因變異，并因此可用于基因診斷。
文檔編號C12Q1/68GK1723288SQ200380105600
公開日2006年1月18日 申請日期2003年10月10日 優先權日2002年10月10日
發明者M·A·李, M·巴斯徹, T·布郎 申請人:英國國防部