專利名稱：蛋白質修飾的制作方法
技術領域：
本發明涉及糖基化化合物的修飾，更具體地涉及重組產生的糖基化化合物的修飾以增加其在血液中的循環壽命。
背景技術：
糖蛋白是綴合形式的含有一或多個共價結合的碳水化合物的蛋白質。根據聚糖和蛋白質之間連鍵的性質，蛋白質連接的碳水化合物可以分成兩組，即附著于天冬酰胺殘基的游離氨基上的N-連接碳水化合物，和連接于蘇氨酸和絲氨酸殘基的羥基的O-連接碳水化合物。
本領域熟知糖蛋白的半衰期，即50％化合物被清除出血液循環所需時間，高度依賴于其N-連接碳水化合物的組成和結構。例如，從糖蛋白的碳水化合物中除去唾液酸將導致這些糖蛋白快速從循環中清除(Morell et al.(1971)J.Biol.Chem.246.1461)，因為去唾液酸化的糖蛋白被機體中的各種碳水化合物受體識別。參與清除的這類碳水化合物受體的例子包括肝細胞上的去唾液酸糖蛋白受體和甘露糖受體。在重組產生的人蛋白質中觀察到相同的現象，這些蛋白質例如在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或轉基因動物中產生的人蛋白質，它們通常含有比其未轉基因的對應物少的唾液酸基團。
迄今為止，廣泛認可的是N-連接碳水化合物決定了糖蛋白的藥動學性質。因此，優選的改善糖蛋白半衰期的策略是通過唾液酸化或除去末端半乳糖殘基而修飾其N-連接碳水化合物。
詳細描述本發明涉及通過修飾O-連接碳水化合物而改變糖基化化合物的半衰期的方法。當本文中指稱糖基化化合物時，優選是指糖基化蛋白或包含糖基化蛋白的化合物。本文中，半衰期定義為50％化合物被清除出血液循環所需時間。本文中，“碳水化合物”是指單糖和寡糖。迄今為止，據信半衰期高度依賴于并主要由N-連接碳水化合物的組成和結構決定。本發明人證實O-連接碳水化合物也可決定糖基化化合物的半衰期。
這對于腸胃外給藥的糖基化化合物的治療應用直接相關，因為根據本發明方法半衰期可顯著延長。
本發明方法可以用于縮短或增加糖基化化合物的半衰期，在本文中稱為“改變半衰期”。在本發明的一個實施方案中，在O-連接碳水化合物的修飾用于延長糖基化化合物的半衰期。通過這一修飾，修飾的糖基化化合物的半衰期與未修飾的化合物相比增加了至少10％、優選地至少30％、50％或70％。最優選的是修飾的糖基化化合物的半衰期值增加到未修飾化合物半衰期值的至少2倍、3倍或4倍。
O-連接碳水化合物的修飾優選地用酶制劑經酶學反應進行。酶制劑可包含一種酶或者是酶的混合物。這些酶可有不同程度的純度。它們可以是純化的或者基本上純的，但這不是必需的。
體內和體外修飾方案均可用于修飾O-連接碳水化合物。體內修飾的例子包括但不限于例如通過一種或多種合適的酶的共表達而發生在細胞培養系統、轉基因動物或轉基因細菌或植物中的修飾。
O-連接碳水化合物的修飾集中于加帽(capping)或除去末端半乳糖殘基，由此干擾與清除所涉及的受體的結合，從而導致延長的血液中的循環半衰期。合適的酶包括但不限于用于末端半乳糖加帽的唾液酸轉移酶，如ST3GalIII或ST3GalI或現有技術中已知的其它唾液酸轉移酶。用于除去末端半乳糖的酶的例子為半乳糖苷酶和內乙酰半乳糖胺酶(endo-acetylgalactosaminidase)(O-糖苷酶)。半乳糖苷酶能夠從N-或O-連接碳水化合物除去末端半乳糖，而內乙酰半乳糖胺酶水解非唾液酸化Galβ1，3GalNAc結構的多肽和半乳糖胺(O-連接于絲氨酸或蘇氨酸)之間的共價鍵。在兩種情況下，暴露的半乳糖殘基均降低，并因此增加糖蛋白的循環壽命。
修飾O-連接碳水化合物基團的一個優選方式為唾液酸化(sialylation)。一般地，唾液酸化涉及通過唾液酸轉移酶的作用將唾液酸從一個唾液酸供體轉移至糖基化化合物的碳水化合物基團。這可以在體內發生(例如通過在糖蛋白表達系統中共表達唾液酸轉移酶)或在體外發生。目前，胞嘧啶核苷-5’-一磷酸-N-乙酰神經氨酸(CMP-唾液酸)被通常用作唾液酸供體。唾液酸轉移酶可以重組產生或者分離自一種唾液酸轉移酶源。生產重組唾液酸轉移酶的方法已經在例如US 5,541,083中公開。用于本發明方法中的唾液酸轉移酶的一個優選例子是ST3Gal I(EC 2.4.99.4)，優選為人ST3Gal I，但是來自非人哺乳動物或細菌來源的唾液酸轉移酶也可以使用，優選與ST3Gal III(EC 2.4.99.6)聯合應用。ST3Gal I特異性轉移唾液酸至Galβ1，3GalNAc表位的末端半乳糖上，其是粘蛋白型O-連接碳水化合物的核心結構，而ST3Gal III特異于在復合和雜合型N-連接碳水化合物中經常存在的乳糖胺單位(Galβ1，4GlcNAc)。本文描述的方法可以用于改善任何糖基化化合物、特別是攜帶粘蛋白型O-連接碳水化合物的那些糖基化化合物的藥動學性質。唾液酸化可以用已知方法例如WO98/31826中描述的方法進行。
或者，糖基化化合物的循環半衰期可以經除去部分或全部O-連接碳水化合物鏈而修飾其O-連接碳水化合物基團來延長。優選地，部分或完全除去一或多個非唾液酸化O-連接碳水化合物鏈。例如，可以從一或多個碳水化合物鏈中除去一或多個非唾液酸化O-連接半乳糖。如上所述，除去一或多個O-連接碳水化合物或碳水化合物鏈可以在體內或體外進行。在體內除去的一個實施方案中，編碼一或多個合適酶如半乳糖苷酶和/或內乙酰半乳糖胺酶的核苷酸序列在相同細胞中與糖蛋白共表達。編碼合適酶的核苷酸序列可以來自任何來源，如人、小鼠、大鼠、細菌等，或者可以化學合成。在體外除去的一個實施方案中，一種或多種合適酶被體外加至重組糖蛋白中。
半衰期欲改變的任何糖基化化合物均可以用于本發明方法中。以這種方式可以獲得與未修飾的化合物的半衰期相比有縮短或延長的血漿半衰期的化合物。優選地，半衰期被縮短或延長至少10％、至少30％、至少50％或至少70％。最優選地，半衰期值至少降低至未修飾的化合物的半衰期值的2/3、1/2、1/3或1/4，或至少增加至未修飾的化合物半衰期值的1.5倍、2倍、3倍或4倍。所述化合物例如可在O-連接碳水化合物的唾液酸化之后或者在除去一或多個非唾液酸化O-連接碳水化合物之后獲得。典型地，非唾液酸化O-連接碳水化合物是半乳糖或Gal(β1-3)GalNAc。這些修飾優選地經例如使用包含一或多種酶的酶制劑經酶學反應進行。合適的酶制劑包括一或多種唾液酸轉移酶，一種或多種半乳糖苷酶和一種或多種內乙酰半乳糖胺酶。這三種類型的酶可以替換使用。在一個實施方案中，包含內-α-N-乙酰半乳糖胺酶的酶制劑用于獲得修飾的化合物。本領域技術人員理解兩或三種類型酶也可聯合應用。本發明的化合物可用于制備藥物組合物以用于治療使用未修飾的對應化合物的應用中的個體。藥物組合物典型地也包括藥物學可接受的載體和任選地藥物學可接受的佐劑。
優選地，所述方法用于重組產生的糖蛋白。所述方法特別適用于改進打算經腸胃外給藥的重組產生的糖蛋白的半衰期。
文中“重組產生的糖蛋白”或“重組糖蛋白”是指通過復制異源核酸或表達由異源核酸編碼的肽或蛋白質的細胞產生的糖蛋白。異源核酸典型地含有一個或多個在天然形式細胞中未發現的或者可能在此類細胞中發現但已被修飾或操作的基因。異源核酸可整合進轉化細胞的基因組中。應理解的是重組糖蛋白無需包含全長糖蛋白，而是可包含其功能片段。天然存在的糖蛋白的功能變體也是合適的，如具有保守氨基酸取代的蛋白質。本文所用術語“功能”是指全長糖蛋白或天然存在的糖蛋白的至少80％、或至少85％或90％、優選至少95％的化學生物學活性得以保留。用于產生重組分子的分子克隆技術是本領域已知的并已由各種文獻描述，例如Sambrook and Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold SpringHarbour Laboratory Press，NY。用于表達的合適細胞包括真核細胞并包括哺乳動物、真菌和昆蟲細胞。
在本申請中，重組產生的糖蛋白優選地在哺乳動物細胞培養系統或轉基因動物如山羊、綿羊和牛中產生。產生這些系統的方法在本領域中已有描述并為本領域技術人員已知，例如參見WO97/05771。糖蛋白可以以已知的分離和/或純化重組產生的蛋白質的方式得自這些生產系統，參見Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，New York，1982)。體外修飾可以在分離或純化過程中或在之后進行。如果在純化過程中進行，其優點為修飾添加劑可在下游加工中除去。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種修飾的重組糖蛋白。本文所用術語“修飾的重組糖蛋白”是指一種包含一個或多個修飾的O-連接碳水化合物的重組糖蛋白，其中該重組糖蛋白的血液循環半衰期被改變，優選地被增加至未修飾的重組糖蛋白的半衰期值的至少1.5、2、3或4倍。應注意的是重組糖蛋白可以與非重組(天然)糖蛋白在幾個方面不同。特別是重組糖蛋白的糖基化模式可以不同于非重組糖蛋白的糖基化模式。例如，盡管非重組糖蛋白的N-連接聚糖的結構可以是很復雜的，但是其重組對應物可含有高甘露糖類型的結構。因此重組糖蛋白可以通過HPAEC-PAD分析(高效陰離子交換色譜脈沖電流檢測法)、特別是如實施例所述與非重組糖蛋白區分。
在一個實施方案中，純化自轉基因兔的乳中的重組人C1抑制劑(rhC1INH)通過使用重組產生的唾液酸轉移酶在體外唾液酸化。修飾的rhC1INH可用于治療個體和制備藥物組合物，例如如WO01/57079所述。
本領域技術人員了解糖基化化合物的半衰期可通過增加末端半乳糖殘基數而降低，這可以例如通過用唾液酸酶如唾液酸酶EC3.2.1.18處理而實現。糖基化化合物的半衰期與未修飾的化合物相比可降低至少10％、優選至少30％、50％或70％。更優選地，半衰期可降低至未修飾化合物的至少2/3、1/2、1/3或1/4。優選地，這一過程涉及存在于O-連接碳水化合物鏈上的半乳糖殘基。
很清楚下述實施例不以任何方式限制本發明。除非實施例中另有說明，所有分子學技術均根據如下文獻的標準方案進行Sambrookand Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，ThirdEdition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY，Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1卷和第2卷，Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition，Academic Press(UK)的第I卷和第II卷。
實驗部分唾液酸測定兔產生的rhC1INH樣品上的唾液酸以如下方式進行定量將來自Arthrobacter ureafaciens的唾液酸酶加至rhC1INH，樣品在37℃保溫1小時。在加入3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulosonic acid(KDN，Toronto research Chemicals)作為內標后，在HPAEC-PAD上定量測定釋放的唾液酸的量。
SDS-PAGE和抑制活性用Novex系統根據廠商推薦進行非還原和還原SDS-PAGE。銀染色觀察蛋白質。用靶蛋白酶C1根據標準程序在合成生色底物存在下測定在體外唾液酸化之前和之后的rhC1INH的抑制活性。在經ELISA分析測定rhC1INH抗原濃度后，計算比活性，以mU/mg蛋白質表示。
N-連接糖基化分布分析
N-連接糖基化分布分析根據內部方法進行。簡而言之，rhC1INH在含有5mg/ml N-辛基葡糖苷的25mM磷酸鈉、62mM EDTA，pH7.2中稀釋并煮沸2分鐘。隨后，加入N-糖苷酶F并將樣品在37℃保溫45小時。在14000rpm下旋轉樣品5分鐘，在配有Carbopac PA-100防護罩的Carbopac PA-1柱上分析上清，該柱預先在150mM NaOH中預平衡。碳水化合物在30分鐘內以1ml/min流速的于150mM NaOH中的0-175mM乙酸鈉梯度洗脫。
O-連接糖基化分布分析在N-連接碳水化合物從rhC1INH制備物中被除去之后，經β-消除反應從rhC1INH中除去O-連接碳水化合物。由此，200微克rhC1INH如上所述用N-糖苷酶F處理，例外是樣品被消化17小時而非48小時。去糖基化之后，樣品與3體積的96％(v/v)乙醇混合并在冰上保溫10分鐘，之后在4℃以15000rpm旋轉5分鐘。將蛋白質沉淀兩次溶于水中，并用乙醇再沉淀。第2次洗滌后，沉淀在SpeedVac中于室溫干燥，并在45℃保溫17小時。通過在冰上添加HAc(0.8M終濃度)終止β-消除反應。樣品在SpeedVac中干燥并用在甲醇中的1％HAc洗3次。第3次洗滌后，沉淀溶于100微升水中，樣品上樣于在水中預平衡的BioradAG50WX12柱(每個樣品1ml填充珠)。柱用3柱體積的水洗脫。級分在SpeedVac中干燥并重懸于100微升水中。樣品上樣于配有Carbopac PA-100防護罩的Carbopac PA-1柱上，該柱預先在150mM NaOH中預平衡。碳水化合物在30分鐘內以1ml/min流速的于150mM NaOH中的0-250mM乙酸鈉梯度洗脫。
實施例1 體外唾液酸化方案A體外唾液酸化由Neose Technologies，Inc(La Jolla，CA)在50mMTris，0.15M NaCl，0.05％NaN3，pH7.2中的產自轉基因兔的乳中的批號為04i00011的重組人C1抑制劑上進行，這通過添加與CMP-唾液酸組合的唾液酸轉移酶ST3GalIII而實現。在32℃保溫16小時后，樣品在液氮中冷凍托運。在用于本申請所述的分析之前，將樣品解凍，在截斷值為Mr 25000的Spectrapor膜中對10mM磷酸鈉、0.15MNaCl，pH7.4(PBS)進行透析。
對rhC1INH上唾液酸量的測定揭示其已從7mol唾液酸/molrhC1INH增加至9mol/mol。體外唾液酸化對這一蛋白質的蛋白酶抑制活性沒有影響，并且未導致任何降解或凝聚。
rhC1INH的N-連接糖基化分布分析表明體外唾液酸化導致雙唾液酸化結構的量明顯增加，即增加約7倍。不是所有單唾液酸化結構均可被轉化成雙唾液酸化結構，由此提示留下的結構不含唾液酸轉移酶的受體位點。
rhC1INH的O-連接糖基化分布分析表明唾液酸化Gal-GalNAc的量僅微量增加，說明僅很小一部分唾液酸摻入O-連接碳水化合物中。
實施例2 體外唾液酸化方案B如實施例1所述在50mM Tris，0.15M NaCl，0.05％NaN3，pH7.2中進行批號為04i00011的重組人C1抑制劑的體外唾液酸化，但是使用唾液酸轉移酶ST3Gal III和ST3Gal I的混合物。
對rhC1INH上唾液酸量的測定揭示其已從7mol唾液酸/molrhC1INH增加至28mol/mol。
rhC1INH的N-連接糖基化分布分析表明體外唾液酸化導致雙唾液酸化結構的量明顯增加，即增加約7倍。同樣，不是所有單唾液酸化結構均可被轉化成雙唾液酸化結構。
rhC1INH的O-連接糖基化分布分析表明大部分唾液酸摻入O-連接碳水化合物中，即單唾液酸化Galβ1，3GalNAc的量增加了約10倍。
結果示于表1(N-連接糖基化分布分析)和表2(O-連接糖基化分布分析)，其清楚表明兩個樣品的N-連接分布圖沒有差異，而O-連接分布圖有顯著差異。因此，樣品rhC1INH-A和rhC1INH-B之間的最重要的差異是O-連接碳水化合物的唾液酸化程度。
表1體外唾液酸化的重組人rhC1INH的N-連接聚糖HPAEC-PAD圖的相對峰面積
表2體外唾液酸化的重組人rhC1INH的O-連接聚糖HPAEC-PAD圖的相對峰面積
實施例3 修飾的rhC1INH的藥動學通過皮下注射hyponorm/midazolam麻醉大鼠，打開腹腔。經尾靜脈或腔靜脈或vena penis注射測試物即rhC1INH樣品。在規定的時間，從下腔靜脈取約0.2ml血樣，轉移至含有10微升0.5M EDTA于PBS中的eppendorf管。樣品在3500xg離心5分鐘，將每一樣品的100微升血漿儲存在-20℃直至分析。血漿樣品用ELISA進行分析以檢測rhC1INH。重組人C1INH的血漿循環半衰期為16±3.7min，而rhC1INH-A和rhC1INH-B的半衰期分別為25±3和75±14min。rhC1INH-B的半衰期與我們先前測試的分離自人血漿的人C1抑制劑的半衰期類似，即75±14min。
這些結果清楚地表明通過O-連接碳水化合物的修飾獲得了半衰期的改善。這一改善可以在未修飾的蛋白質上獲得(接近5倍于原始值)，也可以在(N-連接)修飾的蛋白質上獲得(3倍于N-連接的值)。這一程度的改善是新觀察到的，之前對于O-連接碳水化合物從未報道有這一改善。
表3不同C1 INH樣品的半衰期
實施例4 用內-α-N-乙酰半乳糖胺酶體外修飾rhC1INH O-連接碳水化合物從rhC1INH除去非唾液酸化O-聚糖通過用市售重組內-α-N-乙酰半乳糖胺酶(O-糖苷酶，Prozyme，其特異性水解Galβ1，3GalNAcα-Ser/Thr結構)完成。為此，將從0.125到3.25mU范圍內的不同量的O-糖苷酶加入到于40微升pH5.0的20mM磷酸鹽緩沖液中的200微克rhC1INH中。混合物在37℃保溫過夜，之后沉淀蛋白質并用70％乙醇洗3次以除去釋放的Galβ1，3GalNAc。隨后，樣品如實驗部分所述用HPAEC-PAD進行O-聚糖分布分析。未修飾的和修飾的rhC1INH的色譜圖表明O-糖苷酶處理顯著降低了rhC1INH上的Galβ1，3GaINAc的量。Galβ1，3GalNAc的峰降低至未修飾的rhC1INH的峰的約25％。另外，O-糖苷酶處理沒有影響rhC1INH的蛋白酶抑制活性，也沒有導致降解的聚集。rhC1INH中非唾液酸化O-聚糖數的降低預期導致修飾產物的藥動學改善。
本文描述的方法可用于改善任何攜帶粘蛋白型O-連接聚糖的糖基化化合物的藥動學性質。
權利要求
1.C1抑制劑，其特征在于其血漿循環半衰期已通過O-連接碳水化合物的修飾而改變。
2.權利要求1的C1抑制劑，其特征在于其血漿循環半衰期與未修飾的C1抑制劑的半衰期相比被延長。
3.權利要求1的C1抑制劑，其特征在于其血漿循環半衰期與未修飾的C1抑制劑的半衰期相比被縮短。
4.權利要求1-3任一項的C1抑制劑，其特征在于修飾的抑制劑的血漿循環半衰期減少至未修飾的抑制劑的半衰期值的2/3、1/2、1/3或1/4，或者增加至未修飾的抑制劑的半衰期值的1.5、2、3或4倍。
5.權利要求1-4任一項的C1抑制劑，其特征在于修飾包括O-連接碳水化合物的唾液酸化或者除去一個或多個非唾液酸化的O-連接碳水化合物。
6.權利要求5的C1抑制劑，其特征在于非唾液酸化的O-連接碳水化合物是半乳糖或Gal(β1-3)GalNAc。
7.權利要求1-6任一項的C1抑制劑，其特征在于O-連接的碳水化合物通過與一種包含一或多種酶的酶制劑保溫而被修飾。
8.權利要求7的C1抑制劑，其特征在于所述酶制劑包含一或多種唾液酸轉移酶、半乳糖苷酶或內乙酰半乳糖胺酶。
9.權利要求8的C1抑制劑，其特征在于所述酶制劑包含唾液酸轉移酶ST3Gal III和ST3Gal I或內-α-N-乙酰半乳糖胺酶。
10.權利要求1-9任一項的C1抑制劑，其特征在于所述修飾是體外修飾。
11.權利要求1-10任一項的C1抑制劑，其特征在于C1抑制劑是人C1抑制劑。
12.權利要求1-11任一項的C1抑制劑，其特征在于C1抑制劑是重組產生的。
13.一種藥物組合物，其包含權利要求1-12任一項的C1抑制劑。
14.權利要求1-12任一項的C1抑制劑在制備用于給予血液循環系統的藥物中的應用。
15.權利要求14的應用，其中血液循環系統是人或動物的血液循環系統。
16.抑制延長糖蛋白或含糖蛋白化合物的血液循環半衰期的方法，其中所述方法包括從糖蛋白除去一或多個非唾液酸化O-連接碳水化合物。
17.權利要求16的方法，其中所述非唾液酸化碳水化合物是半乳糖或Gal(β1-3)GalNAc。
18.權利要求16或17的方法，其中除去碳水化合物是通過與包含一或多種酶的酶制劑體外保溫而進行。
19.權利要求18的方法，其中酶制劑包含半乳糖苷酶或內乙酰半乳糖胺酶。
20.權利要求18或19的方法，其中酶制劑包含一或多種重組產生的酶。
21.權利要求16或17的方法，其中除去碳水化合物是通過表達編碼半乳糖苷酶或內乙酰半乳糖胺酶的核酸而在體內進行的。
22.權利要求16-21任一項的方法，其中糖蛋白是C1抑制劑。
全文摘要
本發明涉及一種通過修飾糖基化化合物的O－連接碳水化合物而改變該糖基化化合物的半衰期的方法。這一修飾優選地經酶學反應進行并且目的在于延長化合物的半衰期。體內和體外修飾方法均可以使用。
文檔編號C12N9/10GK1726284SQ200380106575
公開日2006年1月25日 申請日期2003年10月17日 優先權日2002年10月17日
發明者帕特里克·范貝克爾, 莫里斯·曼內瑟, 弗蘭克·皮珀 申請人:法明知識產權股份有限公司