專利名稱：一種天然產物紅景天苷的酶促合成方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，涉及紅景天苷的制備方法，具體涉及紅景天苷酶法合成及純化工藝。
紅景天苷，或稱為紅景天甙，是紅景天植物中被研究得最多的主要有效成分，具有抗缺氧、抗疲勞、抗微波輻射、興奮中樞神經等藥理作用，因此作為營養保健品和藥品，紅景天苷有很好的應用前景(環境適應藥物)。目前，主要是通過提取的方法從紅景天屬植物根莖中分離得到紅景天苷，一般過程為根莖浸泡、醇回流提取、有機溶劑萃取、吸附樹脂和硅膠柱層析。步驟復雜，一般提取產率在0.4％～0.8％。化學合成紅景天苷的過程主要有用過量的酪醇經過成甙、脫乙酰基合成了紅景天苷；以對羥基苯乙酸乙酯為原料經芐基化、還原、甙化和脫芐基等步驟合成了紅景天苷；以對溴苯酚為原料經烯丙基化、環氧化、甙化和脫烯丙基等步驟合成了紅景天苷；以對羥基苯乙酸為原料，經過芐基化、酯化、還原、甙化等步驟合成紅景天苷。總之，化學合成步驟較多，必須經過羥基保護與脫保護步驟。近年來人們開始利用微生物或酶進行天然產物的生物催化合成或修飾。由于生物催化反應過程簡單、條件溫和、操作方便，環境污染小，能得到單一立體構型的化合物而成為許多科技人員關注的課題。目前，與紅景天苷酶促合成直接相關的公開報道很少，只有一篇文獻涉及了這方面的技術Tetrahedron Asymmetry 1999，102429-2439公開了一種采用杏仁β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase from almond，Sigma G-0395)催化轉葡萄糖苷化反應合成了一系列天然β-葡萄糖苷包括紅景天苷的方法。但該方法采用價格昂貴的活性葡萄糖苷(如對硝基苯基葡萄糖苷)作為葡萄糖基供體，且大部分的活性葡萄糖苷發生水解反應，不能回收，合成成本很高，不適合工業化應用。
綜上所述，現有的酶促合成紅景天苷的技術，采用價格昂貴的商品酶和糖基供體，成本很高，因此限制了這種方法在工業上的推廣應用。
本發明需要解決的技術問題是公開一種天然產物紅景天苷的有效酶促合成方法，以克服現有技術的上述缺陷。
本發明的構思是這樣的發明人發現，蘋果籽粉作為一種葡萄糖苷酶，在催化性能上與杏仁β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase from almond，Sigma G-0395)相當，而且制備容易、價格低廉，穩定性高(因蘋果籽本身實際上充當了固定化材料)。因此以自制蘋果籽粉作為酶促糖苷化反應的催化劑可以使生產成本大幅降低。
由于酶的活性受到體系中緩沖溶液種類與pH的影響，因此發明人在反應體系中選擇合適的緩沖溶液及pH能提高反應的速度；由于酶反應的底物(酪醇)為固體，在水中溶解性有限，因此有必要在反應體系中加入一種助溶劑改善底物的分散狀況，提高其在反應體系中的溶解度，以加快酶反應的速度；由于葡萄糖與酪醇縮合成糖苷的反應(又稱糖苷逆水解反應)受到熱力學平衡的控制，因此發明人通過調節體系中的水含量，使反應在低水含量中進行，并適當提高底物酪醇的濃度，能顯著提高紅景天苷的平衡產率。
根據以上構思，發明人提出了如下所述的實現本發明的技術方案(1)本發明的方法包括如下步驟將蘋果籽粉、底物葡萄糖和酪醇(對羥基苯乙醇)在含有緩沖溶液的有機溶劑中反應，反應的工藝條件是這樣的所說的蘋果籽粉為采用一般的蘋果籽去皮、磨碎后的產物，蘋果籽粉的加入量為1～100g/L；所說的有機助溶劑，經過優選可采用二氧六環、叔丁醇、乙腈、丙酮、二甲基亞砜或二甲基甲酰胺中的一種；
反應溫度為20～70℃，最佳溫度為50～60℃；反應時間為1～5天，具體可根據反應的實際進程而定；緩沖溶液的pH為4～8，最佳pH為5.5～6.5；葡萄糖濃度0.01～0.50M，最佳濃度為0.2～0.3M；葡萄糖與酪醇的摩爾比為葡萄糖∶酪醇＝1∶(1～15)，最佳比例1∶(5-10)；體系中有機溶劑的體積含量為0～100％(v/v)，最佳含量為80～99％(v/v)。
(2)采用常規的分離方法，如萃取和柱層析等，能從反應液中收集本發明所提到的產品--紅景天苷和未反應的酪醇。
采用本發明所公開的酶促工藝，不僅能簡單方便地獲得高純度的紅景天苷，而且生產成本比現有的技術低得多，是一種具有廣泛應用前景的生產方法，可以滿足迅速發展的醫藥工業的需要，以下將通過實施例對本發明的技術內容作進一步的描述。
具體實施例方式
實施例1蘋果籽粉的制備將蘋果籽去皮、磨碎，先用乙酸乙酯洗3次，再用丙酮洗2次除脂除水，置于真空干燥箱干燥。從28kg蘋果總計能得到8g蘋果籽粉，可置4℃冰箱冷藏待用。
實施例2在50ml磨口三角瓶中依次加入250mg蘋果籽粉，0.272g(1.37mmol)葡萄糖，0.5ml磷酸緩沖液(0.07M Na2HPO4-KH2PO4，pH 6.0)，2.28g酪醇(16.5mmol)，5.0ml二氧六環，塞緊磨口瓶塞，并用生料帶封口，在50℃、160r/min的旋轉式搖床上振蕩反應120h。
反應結束后加入甲醇10ml過濾除去酶，濾出的酶再用甲醇洗滌(20ml×3)，在濾液中加入無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發除去溶劑，快速柱層析(乙酸乙酯/甲醇＝13/1)，得紅景天苷固體66mg，產率15.8％。
實施例3250ml磨口三角瓶中加入2.16g(10mmol)葡萄糖、4ml緩沖液(0.07MNa2HPO4-KH2PO4，pH 6.0)和16.7g(0.11mol)對羥基苯乙醇，再加2g蘋果籽粉和40ml二氧六環，塞緊磨口瓶塞，并用生料帶封口，置50℃、160r/min旋轉式搖床上反應5天。反應過程中用HPLC法測定產物紅景天苷的濃度取反應樣品液0.04ml，加入0.10ml對硝基苯酚(0.5mM)的甲醇溶液與0.86ml甲醇混合均勻，然后用反相HPLC柱，分析產物紅景天的濃度。色譜柱用YWS C-18(Merck，200×5.0mm，10μ)；流動相為甲醇/水(40/60，v/v，0.8ml/min)；紫外檢測器波長275nm。糖苷、內標和底物的出峰時間分別為4.0、5.7和17.6min。
反應結束后加入甲醇20ml過濾除去酶，濾出的酶再用甲醇洗滌三遍(20ml×3)，濾液旋轉蒸發除去溶劑。剩下的固體加入200ml乙酸乙酯與100ml去離子水溶解，倒入分液漏斗振蕩，靜置分層，乙酸乙酯相再用100ml去離子水反萃一遍。合并水相，并用100ml乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯相，旋轉蒸發除去溶劑即得到未反應的大部分底物酪醇。將水相旋轉蒸發除去水，干燥后進行快速柱層析(乙酸乙酯/甲醇＝12/1)，得紅景天苷固體0.51g，產率15.5％。
實施例4采用實施例2相同的方法，并采用5.0ml叔丁醇為有機溶劑，結果得紅景天苷固體58mg，產率13.9％。
實施例5采用實施例2相同的方法，但是不加有機溶劑，結果得到紅景天苷18mg，產率4.3％。
權利要求
1.紅景天苷的酶促合成方法，其特征在于，包括如下步驟將蘋果籽粉、底物葡萄糖和酪醇在含有緩沖溶液的有機溶劑中反應，然后采用常規的分離方法從反應液中收集產品-紅景天苷，所說的有機溶劑采用二氧六環、叔丁醇、乙腈、丙酮、二甲基亞砜或二甲基甲酰胺中的一種。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，蘋果籽粉的加入量為1～100g/L。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，緩沖溶液的pH為4～8。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，體系中有機溶劑的體積含量為0～100％(v/v)。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，體系中有機溶劑的體積含量為80～99％(v/v)。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，反應溫度為20～70℃。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，反應溫度為50～60℃。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，反應時間為1～5天。
9.根據權利要求1～8任一項所述的方法，其特征在于，葡萄糖濃度為0.01～0.5M，葡萄糖與酪醇的摩爾比為葡萄糖∶酪醇＝1∶(1～15)。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，葡萄糖濃度為0.2～0.3M，葡萄糖與酪醇的摩爾比為葡萄糖∶酪醇＝1∶(5～10)。
全文摘要
本發明公開了一種天然產物紅景天苷的酶促合成方法，該工藝以自制的蘋果籽粉為廉價催化劑，以葡萄糖或/和對羥基苯乙醇為底物，在單相有機溶劑－水體系中一步反應，合成了紅景天苷，產率為15.8％。產物的分離提取過程比較簡單，而且未反應的酪醇能得到完全回收并重復利用，生產成本相對較低，是一種制備天然藥物紅景天苷純品的新方法，具有很好的工業應用開發前景。
文檔編號C12P19/44GK1560268SQ20041001665
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月1日 優先權日2004年3月1日
發明者許建和, 童愛敏, 林國強 申請人:華東理工大學