一種雙t－dna載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用的制作方法

專利名稱：：一種雙t－dna載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種無抗性選擇標記轉基因作物的培育方法，屬于生物和現代農業
技術領域：
的應用技術。更具體地說，本發明涉及一種具有兩個獨立T-DNA結構域的雙元載體，分別含有抗性選擇標記基因和目的基因；涉及利用該雙T-DNA雙元載體系統產生同時含有選擇標記基因與目的基因的共轉化轉基因植株后，在其后代群體中選育只含目的基因而無抗性選擇標記基因的個體，從而消除因為選擇標記的存在而對轉基因作物商業化生產等可能帶來的負面影響。
背景技術：
：自1994年首例轉基因植物進入商品化生產以來，全球轉基因作物的種植面積迅速擴大，2001年已達到5260萬公頃，是1996年種植面積的近20倍。但隨著轉基因作物商品化生產的加快，也呈現出越來越多潛在的問題。其中，抗性選擇標記基因(Resistantselectablemakergene)潛在的生態環境和食用安全性是考慮得較多的、也是爭論最大的焦點問題之一。抗性選擇標記目前廣泛應于植物的遺傳轉化，在輔助篩選轉目標基因植物的過程中起到了很大的作用。但當成功獲得轉基因植株后，選擇標記基因的存在便又是多余的，而且有可能會影響目的基因的穩定性、加重受體植物細胞代謝的負擔；更為重要的是，抗性選擇標記一般都是一些抗生素抗性標記，含此類選擇標記的轉基因植物在進入商品化生產應用后，是否會對人畜產生潛在的危害，是否會被病原菌所攝取而造成更為嚴重的潛在后果等等？這些潛在的問題對轉基因作物的進一步應用造成了一定的影響。因此，培育無抗生素選擇標記的、更為安全的轉基因作物已成為當前全球植物基因工程育種的重要目標之一。解決轉基因植物中抗性選擇標記安全性問題的途徑有兩條一是采用可剔除抗性選擇標記或無標記轉化技術，培育不含任何選擇標記的轉基因植株；二是發展非抗性的安全性標記基因。其中第一條途徑中因培育的轉基因植物中只含有目標基因而不含任何非目的基因，所以受到了廣泛的重視；特別是最近幾年來國外在這方面的研究與技術進步非常迅速。目前，已發展了多種培育無抗性選擇標記轉基因植物的技術，主要可分為兩類，一類稱為標記基因的剔除技術，另一類為無標記直接轉化技術。其中又以標記基因的剔除技術最為成功，也是目前研究和應用最多的一項技術。從轉基因植物中剔除選擇標記的技術可歸納為三種。(1)共轉化(Co-transformation)和遺傳分離系統。該系統是用得最多的、也是最為普遍的一種用于培育無標記轉基因植物的技術。將目的基因和選擇標記基因分別構建進不同的載體或同一載體的不同功能區段，共同轉化入同一受體細胞中獲得轉基因共整合植株作為選育對象，在下一個自交分離世代中標記基因和目的基因可經遺傳重組而被分離，即可篩選獲得僅含目的基因而不含選擇標記的理想轉基因植株。該系統比較簡單，適用于多種轉化體系，但必須保證標記基因和目的基因共整合在受體基因組的不同位點。早前主要是運用基因槍介導的雙載體共轉化法獲得共轉化植株。隨著農桿菌轉化植物技術的成熟和普及，基于農桿菌的共轉化技術已成為該系統的主流，發展的技術有雙菌株雙載體法、單菌株雙載體法以及單載體雙T-DNA(或雙T-DNA邊界)法等。其中以單載體雙T-DNA法的效果最好，共整合頻率在50％以上，獲得無標記轉基因植株的機率也很高，目前已相繼在水稻、煙草、玉米和大豆等中獲得應用。共轉化系統中標記基因和目的基因的遺傳分離必需經過有性世代才能實現，這不僅會增加育種時間，而且無法應用于無性繁殖的物種。(2)位點特異性重組(Site-specificrecombination)或轉座子(Transposon)介導切除系統。該技術是將選擇標記基因構建在DNA專一性位點間或轉座子內，篩選獲得的轉基因植株與含重組酶或轉座酶基因的轉基因植株雜交，經重組或轉座從目的基因整合位點處切除選擇標記基因。目前已應用的重組酶系統主要有兩種，即噬菌體P1的Cre/loxP系統和質粒pSR1的R/Rs重組系統。該技術需要在受體細胞中額外表達重組酶或轉座酶，但在轉基因植株中發生重組或轉座的機率往往不高；另外，在剔除標記基因后還必須經有性世代的遺傳分離去除重組或轉座酶基因，操作程序繁瑣，應用受到很大限制。最近新發展的兩類標記切除系統可明顯地改進這些缺陷，一是結合了重組酶基因R與正選擇標記基因ipt(Iropentennyltransferase，異戊烯基轉移酶)的農桿菌MAT(Muti-autotransformation)載體系統，二是基于人雌激素受體和Cre/loxP重組系統的化學誘導標記基因剔除系統。前者最終可實現一步法獲得無標記轉基因植株，但必須依賴于ipt表型篩選；后者不僅可精確控制切除時間、提高標記基因切除頻率，而且有利于高頻再生無標記的單拷貝轉基因植株。(3)染色體內同源重組(Introchromosomalhomologousrecombination，ICR)誘導缺失系統。自然條件下植物細胞內的ICR頻率極低。借助于噬菌體附著序列attP構建的農桿菌attP-ICR載體系統使轉基因煙草中的ICR頻率顯著提高，并成功誘導了標記基因的切除。該系統為培育無標記轉基因植株提供了又一條捷徑，但其作用機制仍有待闡明，而且具體操作實效也有待提高。上述各項技術雖然都已在無抗性選擇標記轉基因植物的培育中得到了一定的研究應用，但多數技術離實際的商業化應用，尤其對于大眾化的育種應用仍有一定的距離。綜合分析評價各項技術的實際要求，并結合轉基因作物，尤其是重要的禾谷類作物的研究結果，可以看出真正能適用于培育無抗性選擇標記轉基因作物(重點是禾谷類作物)、并富有成效的主要還是共轉化技術。因為(1)以基于重組酶、轉座子或染色體內重組等的標記基因剔除系統為例，這些系統雖然已在煙草和擬南芥等模式植物中獲得了證明，但到目前為止極少見應用于水稻、玉米等重要糧食作物的報道；其次，在水稻等作物中發生同源重組或轉座的機率往往不高，再加上這些系統仍需要與含重組酶或轉座酶基因的轉基因植株雜交以及隨后世代的遺傳分離，所以真正能篩選獲得的無標記轉基因植株的效果仍十分有限，而且選育周期也較長。(2)多數改良的標記基因剔除系統都要結合ipt基因等正選擇標記作為輔助標記(如Endo等2002)，這些技術雖然已在個別植物品種中獲得了應用，但對于受體材料的要求卻極為嚴格，特別是對多數較難轉化的玉米和水稻(尤其是秈稻類型)來講，都不適宜于使用ipt基因作為正選擇標記。因此，要在重要的禾谷類作物，特別是水稻和玉米等中普及此類技術仍有很大的難度。(3)與上述兩點形成鮮明對比的是，基于共轉化技術的標記基因剔除系統卻已包括水稻、玉米和大豆等重要作物在內的大多數作物中獲得了非常普遍的應用，而且效果良好。尤其是經農桿菌介導的雙T-DNA載體系統，不僅共轉化率高(50％以上)，而且通過遺傳分離后獲得無選擇標記轉基因植株的幾率也很高(超過60％)。該技術不僅在水稻中獲得了很好的效果，而且已被證明在玉米、煙草和大豆等中也同樣有效。但這些雙T-DNA載體的分子量往往較大，而且不具通用性。因此，發展一種適用性廣的、極易進行體外遺傳操作的T-DNA載體系統是非常有必要的。
發明內容本發明的目的是提供一種可用于高效培育無抗性選擇標記轉基因植物的簡便雙T-DNA雙元載體系統。該系統借助于根瘤農桿菌介導的共轉化原理，在一個雙元載體上含有兩個獨立的T-DNA結構區段，其中的第一個T-DNA區含有抗生素抗性選擇標記基因，而第二個T-DNA區含有一個通用的多克隆位點，可任意插入目的基因。該雙T-DNA載體分子量小，易于克隆操作；利用該載體系統轉化植物，尤其是單子葉作物如水稻等的共轉化效率高，而且適用性廣。本發明的另一個目的是提供一種無選擇標記轉基因水稻的高效培育方法。該方法是借助于所構建的簡便雙T-DNA雙元載體系統，在其中一個T-DNA區克隆入目的基因及其必要的調控系列后，實現對水稻的共轉化；經自花授粉，在其自交后代中選育含有目的基因、而已剔除了選擇標記基因的轉基因個體。本發明的再一個目的是提供由上述載體系統和方法培育的轉基因水稻植株及其后代，以及由這些材料為親本經有性雜交轉育而成的所有含有目的基因的轉基因水稻。本發明的技術方案包括(1)制備含有兩個T-DNA結構域的農桿菌雙元載體，稱為雙T-DNA雙元載體，其中所述第一個T-DNA區上含有可用于篩選轉化植物細胞的抗生素抗性選擇標記基因，第二個T-DNA區上含有一個通用的多克隆位點，可方便地克隆入目的基因。(2)在第二個T-DNA區克隆入用于改良作物的目的基因，再用該載體系統借助于根瘤農桿菌介導的共轉化方法轉化受體水稻。可期望借助于一個農桿菌將兩個獨立的T-DNA區導入同一個細胞中，并整合到不同染色體或同一染色體的不同位置上，從而可在分離后代中獲得只含目的基因、無抗性選擇標記基因的轉基因植株。其中所述的雙T-DNA雙元載體相對于常規的農桿菌雙元載體，只多了一個T-DNA功能區，其它所含核酸序列及其功能同常規雙元載體。該載體系統在轉化植物的技術方法上與其它雙元載體系統無明顯差別，但卻可方便地用于培育無抗性選擇標記的轉基因作物。所述第一個T-DNA區上的抗生素抗性選擇標記基因為潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycinphosphotransferase，HPT)基因，第二個T-DNA區上的多克隆位點源自質粒pUC18的通用多克隆位點。所述目的基因可以包括任何在生產上的有應用價值的基因，包括抗生物脅迫(抗蟲、抗病)基因、抗非生物脅迫(抗除草劑、耐鹽等)基因、品質改良基因、以及與其它轉基因應用有關的目的基因及其上述不同基因的融合或多價基因。所述受體水稻指所有栽培稻種，包括秈稻、粳稻、爪哇稻，常規稻，雜交稻的不育系、保持系或恢復系。圖1(A)所示為含有雙T-DNA結構區的植物通用雙元載體pSB130；圖1(B)所示為含有雙T-DNA結構區的植物通用雙元載體pSB131；圖2所示為含有LRP基因的雙T-DNA植物表達載體pSB130-LRP；圖3所示為T0代轉pSB130-LRP水稻植株總DNA的Southern雜交分析；圖4所示為轉雙T-DNA載體pSB130-LRP水稻T1代植株總DNA的Southern雜交分析；圖5所示為含有Bt毒蛋白基因和GUS基因的雙T-DNA植物表達載體pSB131-BT；圖6所示為Bt基因與HPT基因共轉化的水稻植株T0代總DNA的PCR分析；圖7所示為Bt基因與HPH基因共轉化的水稻植株T1代總DNA的PCR分析；附圖1本發明構建開發的通用雙T-DNA雙元載體pSB130和pSB131。雙元載體pSB130上的第一個T-DNA結構區(RB1-LB1)上含有一個源自質粒pUC18的通用多克隆位點，而第二個T-DNA結構區(RB2-LB2)含有潮霉素磷酸轉移酶基因作為抗性選擇抗性標；pSB131為攜帶有GUS報告基因的雙T-DNA通用雙元載體，其中第一個T-DNA區(RB1-LB1)上除含有一個源自質粒pUC18的通用多克隆位點外，還含有一個GUS報告基因，第二個T-DNA區(RB2-LB2)含有潮霉素磷酸轉移酶基因作為抗性選擇抗性標。附圖2攜帶有高賴氨酸含量LRP目的基因的雙T-DNA雙元載體pSB130-LRP。其中一個T-DNA區含有潮霉素磷酸轉移酶基因作為抗性選擇抗性標，另一個T-DNA區上含有來自四棱豆的高賴氨酸含量蛋白LRP基因。附圖3T0代轉pSB130-LRP水稻植株總DNA的Southern雜交分析。總DNA分別抽提自轉基因水稻植株L(經含雙T-DNA載體pSB130-LRP的農桿菌介導轉化而來)或未轉化植株(標記為W)的葉片。總DNA在電泳前都經HindIII(h)或PstI(p)酶切消化，雜交所用的探針分別為地高辛標記的反義HPT基因編碼區序列(圖3-A)或LRPcDNA(圖3-B)，P表示pSB130-LRP質粒DNA，圖左側所示(M)為地高辛標記的分子量標準(GIBCOBRL公司)。附圖4轉pSB130-LRP水稻T1代不同植株總DNA的Southern雜交分析。總DNA分別抽提自轉基因水稻L(經含雙T-DNA載體pSB130-LRP的農桿菌介導轉化而來)T1代植株或未轉化植株(標記為W)的葉片。總DNA在電泳前都經EcoRI酶切消化，雜交所用的探針分別為地高辛標記的反義潮霉素抗性基因編碼區序列(圖4-A)或LRPcDNA(圖4-B)，圖左側所示(M)為地高辛標記的分子量標準(GIBCOBRL公司)。附圖5攜帶有Bt毒蛋白目的基因的雙T-DNA雙元載體pSB131-BT。其中一個T-DNA區含有潮霉素磷酸轉移酶基因作為抗性選擇抗性標，另一個T-DNA區上含有來自蘇云菌芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因和GUS報告基因。附圖6Bt基因與HPT基因共轉化的水稻植株T0代總DNA的PCR分析。A.Bt基因的PCR分析結果；B.HPT基因的PCR分析結果。泳道M為DNA分子量標記，泳道P指質粒DNA；泳道W為未轉化植株總DNA；泳道1-5分別為5個T0代轉基因植株總DNA。附圖7Bt基因與HPT基因共轉化的水稻植株T1代總DNA的PCR分析。A.Bt基因的PCR分析結果；B.HPT基因的PCR分析結果。泳道M為DNA分子量標記，泳道P指質粒DNA；泳道W為未轉化植株總DNA；泳道1-9分別為來源于同一T0代共轉化植株的T1代9個轉基因單株的總DNA。圖中8號植株即可無抗性選擇標記的轉基因植株。具體實施例方式以下結合四個最佳實施例進一步闡明本發明的具體實施方式。實施例所述內容不構成對本發明權利要求范圍的限制。實施例1植物雙T-DNA通用雙元載體pSB130和pSB131的構建1.1根據雙元載體pCAMBIA1300(CAMBIA，Australia)的核苷酸序列，設計了兩個引物LBP1(5’-CAAGCGGCCGCGAGATCATCCGTGTTT-3’)和LBP2(5’-GTAGAATTCGACCGGATCTGTCGATCGA-3’)，以便從該雙元載體中擴增其T-DNA區的左邊界序列。在這兩個引物的5’端分別加接上了NotI和EcoRI(下劃線)酶切位點，其中LBP2位于左加界序列靠近T-DNA一側。PCR反應的條件為95℃、5min；95℃、50sec，55℃、50sec，72℃、30sec，30個循環；72℃、7min。495bp長的PCR產物經NotI和EcoRI酶切后克隆進中間載體pBluescriptSK-中，經鑒定的陽性克隆稱為pBSK/LB。1.2用HindIII和EcoRI雙酶切雙元載體pCAMBIA1300，再用Klenow大片段補平并讓其自連，以去除該雙元載體中的多克隆位點，形成無多克隆位點的雙元載體pC130。1.3用SacII和NotI雙酶切雙元載體pC130，回收并純化3.8kb的含T-DNA區的一個片段，將其克隆進第一步的載體pBSK/LB中，構建成載體pBSK/LB/T-DNA。1.4用SphI和NotI雙酶切載體pBSK/LB/T-DNA，再用Klenow大片段補平并讓其自連，以去除該質粒中位于SphI和NotI之間的DNA序列，形成載體pBSK/LB/T-DNA(M)。1.5用SacII和EcoRI雙酶切載體pBSK/LB/T-DNA(M)，回收并純化3.4kb長的含一個T-DNA區和一個左加界序列的片段，用這一片段取代原雙元載體pCAMBIA1300或pCAMBIA1301中SacII和EcoRI之間的序列(含T-DNA區左邊界和潮霉素抗性基因)，即構建成含兩個T-DNA區的雙元載體pSB130(附圖1-A)和pSB131(附圖1-B)。構建的兩個雙T-DNA載體中，其中一個含有由CaMV35S啟動子控制的潮霉素磷酸轉移酶基因，在導入植物細胞后可使其產生對潮霉素的抗性，用作抗性選擇標記。在pSB130的另一個T-DNA結構區中，含有一個來源于質粒pUC18的多克隆位點，可方便地用于克隆入目的基因；在pSB131的另一個T-DNA結構區中，除也含有pUC18的多克隆位點外，還攜帶有一個來源于細菌的GUS(beta-glucuronidase，beta-葡萄糖甘酸酶)報告基因，可通過組織化學染色來篩選含有目的基因的轉基因后代個體。實施例2利用雙T-DNA載體培育無選擇標記的高賴氨酸含量轉基因優質水稻2.1攜帶有高賴氨酸含量蛋白LRP基因的雙T-DNA雙元載體的構建稻米中缺乏賴氨酸，被認為是水稻的第一限制必需氨基酸，利用轉基因技術在水稻中表達異源的富含賴氨酸的蛋白質，可提供稻米中總的賴氨酸含量。克隆自四棱豆的高賴氨酸含量蛋白(Lysine-richprotein，LRP)基因，其編碼的蛋白質中含有10.7％的賴氨酸(Sun等，USApatent，1998)，是一個理想的用于改良稻米營養品質的基因。為使其在轉基因水稻種子胚乳中特異性高表達，將編碼LRP的cDNA連接于水稻本身的谷蛋白基因Gt1啟動子之后，再克隆入雙T-DNA雙元載體pSB130(圖1-A)的多克隆位點中，構建了含1.8kb長Gt1啟動子、LRPcDNA和NOS終止子序列的植物表達載體pSB130-LRP(圖2)。將此植物表達載體經凍融法轉化入農桿菌菌株EHA105中，并用于水稻的轉化。2.2轉基因水稻植株的獲得按申請人已建立的農桿菌介導轉化水稻的程序(劉巧泉等，植物生理學報，1998)將所構建的植物表達載體中所含的基因導入水稻中。取開花后12～15天的水稻未成熟種子經70％乙醇表面消毒2min后，于2％(活性氯含量)的NaClO溶液中消毒90min以上，并不時搖動，用無菌水沖洗4～5次，然后用解剖刀和鑷子剝出幼胚并培養于愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織，經4-7天預培養后誘導出的初生愈傷組織用于農桿菌介導的轉化實驗。將在超低溫保存的根癌農桿菌菌種于含50mg/l卡那霉素(Kanamycin，Km)的YEB半固體培養基上活化后，挑取單菌落接種到3ml含50mg/lKm的YEB液體培養基中，于28℃振搖培養過夜；第2天按1％接種量轉接入40ml含50mg/lKm的AB液體培養基中，于28℃、250rpm繼續培養6～8hr(培養至生長對數期)。將新鮮的培養液于6000rpm、4℃離心5min，收集菌體并重懸于10～15ml的AAM(含100～400μmol/l乙酰丁香酮)液體培養基中，立即用于與水稻受體材料的共培養轉化。將各種適宜的水稻受體材料浸沒在新鮮的AAM農桿菌菌液中15～30min，間或搖動幾次。然后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到N6D2C共培養培養基上，于26-28℃黑暗條件下共培養3天。3天后，切去胚芽并轉入選擇培養基上進行選擇培養。10～14天后長出的新鮮愈傷組織再轉移到新的選擇培養基上繼續篩選2代(10～14天/代)，然后選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到分化培養基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小苗經生根壯苗后移入網室或人工氣候室盆栽。共獲得了41個獨立的轉化子，分別稱為L1、L2和L41等；每個轉化子含有2-6個轉基因水稻植株。大多數轉基因水稻植株移栽入大田后，絕大多數能正常生長、開花并結實。2.3T0代轉基因水稻植株的分子鑒定取一定的水稻嫩綠葉片，按Murray和Thompson(1980)所述的CTAB法提取總DNA，總DNA溶解于含20mg/lRNAaseA的ddH2O中，37℃溫浴1h，直接1μl總DNA用于PCR分析。在25μl反應液中混合1μl總DNA、1×反應緩沖液、1.5mmol/lMgCl2、0.2mmol/ldNTPs、1μmol/l引物、1單位TaqDNA聚合酶(Promega)及適量ddH2O，進行PCR擴增。PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離并在凝膠成像儀上觀察。Southern雜交時，取6-8μg總DNA，用適量的限制性內切酶消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，并按Sambrook等(1989)預處理凝膠，并將DNA轉移到帶正電荷的尼龍膜(Roche)上。按Roche推薦的條件，尼龍膜先在不含DNA探針的丘奇(Church)緩沖液(7％SDS，50％formaldehyde，5×SSC，2％blockingreagent，50mmol/lsodiumphosphate，pH7.0，0.1％N-lauroylsarcosine)中于42℃預雜交2-4h，然后加入2.2.10.2中已經地高辛標記的反義DNA探針至終濃度為10ng/ml)雜交過夜。第二天分別用2×SSC、0.1％SDS(室溫)和0.5×SSC、0.1％SDS(68℃)各洗2次，每次20min；然后按DIGLuminescentDetectionKit(Roche)推薦的程序進行檢測。用已雜交的尼龍膜進行第二次雜交時，先將膜用ddH2O清洗5min，再用0.2mol/lNaOH、0.1％SDS在37℃洗2次，每次20min，以去除與DNA結合的探針。然后將膜浸泡在2×SSC中5min，便可按上述程序用第二個DNA探針進行預雜交、雜交。在由雙T-DNA雙元載體來源的所有轉基因水稻植株中，首先用PCR篩選同時整合有兩個T-DNA的共轉化子。對由雙T-DNA雙元載體pSB130-LRP來源的41個的獨立轉化子中，從28個轉基因株系中擴增出了與LRP和HPT基因特異的PCR產物，共轉化頻率達到68.3％。進一步以LRP或HPT基因特異的探針作Southernblot分析，在所分析的轉基因水稻植株中都整合有HPT基因(圖3-A)，但只在一部分轉基因植株中檢測到LRP嵌合基因的整合(圖3-B)。PCR和Southern雜交分析的結果，都說明位于同一雙元載體上的兩個獨立T-DNA區上的HPT基因與LRP嵌合基因可一起整合入轉基因水稻植株的基因組中。另外，從部分轉基因水稻植株只整合有HPT基因這一點分析，該超雙元載體中含潮霉素抗性基因的T-DNA可單獨整合入水稻基因組中。2.4無抗性選擇標記轉LRP目的基因植株的獲得對27個同時含有HPT和LRP基因的共轉化植株，分別收取T1代成熟種子。隨機選取部分種子去殼滅菌，接種在含50mg/l潮霉素的1/2MSH培養基上，統計潮霉素抗性分離情況；或直接將種子播種入人工氣候室，待苗長大后，按劉巧泉等(2001)的方法檢測各植株中的潮霉素抗性；同時選取部分T1代植株按單株提取葉片總DNA，用于PCR或Southern雜交分析。結果顯示，HPT和LRP基因在部分獨立轉化株的后代中發生遺傳分析，其后代的部分植株只含有LRP目的基因，而不含有HPT基因，如L15、L16、L22和L26等(表1)，這些后代個體中HPT和LRP基因的整合情況進一步經Southern雜交獲得了證實(圖4)。也有部分后代中HPT和LRP基因未發生分離的，即兩個基因仍緊密聯鎖在一起，如L1和13等(表1)。在所分析的總共27個獨立轉化系中，發現有12個可產生無抗性選擇標記的轉目的基因水稻后代個體，獲得無選擇標記轉基因植株的頻率為44％。表1轉雙T-DNA載體pSB130-LRP共轉化植株后代個體間HPT和LRP的分離比分析T0代植株整合拷貝數T1植株數T0代共轉化植株HPTLRPHPT4/LRP+HPT4/LRP-HPT4/LRP+HPT4/LRP-L11124007L131116002L151127452L161114231L172235005L221217030L262312330L281114005實施例3利用雙T-DNA載體培育無抗性選擇標記的抗蟲轉Bt基因水稻3.1攜帶有Bt毒蛋白基因的雙T-DNA雙元載體的構建來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因是目前應用最為廣泛的抗蟲基因，轉Bt毒蛋白基因棉花、玉米等已獲成功運用；該基因導入水稻后對稻螟蟲具有很好的抗性。本實例采用根據植物偏愛密碼子重新合成Bt毒蛋白基因，可使該基因在轉基因植物中更高效并穩定地表達；另外在Bt毒蛋白的N-端加接上來自于植物的轉運肽信號序列，可使表達產物定位于內質網中，使目的蛋白的表達更具高效性(彭日荷等，生物化學與生物物理學報，2001，33219-224)。分別用SacI和EcoRI以及HindIII和BamHI雙酶切將來自于農桿菌的胭脂堿合成酶基因的終止子(NOS)和來自于玉米的泛素Ubiquitin基因啟動子克隆入雙T-DNA載體pSB131(圖1-B)的相應多克隆位點中，然后再用BamHI和SacI將化學合成并經修飾的Bt毒蛋白基因插入pSB131中Ubiquitin啟動子和NOS終止子之間，即構建了含有Bt毒蛋白基因的雙T-DNA植物表達載體pSB131-BT(圖5)。此植物表達載體經凍融法轉化入農桿菌菌株EHA105中，并用于水稻的轉化。3.2轉基因水稻植株的獲得轉基因水稻的培育方法同實施例2。經該雙T-DNA植物表達載體系統轉化，一共在一個粳稻品種武香粳9中獲得了77個獨立的轉基因水稻株系，在另一個秈稻品種協青早中獲得了3個獨立的轉基因株系。3.3T0代轉基因水稻植株的鑒定對由雙T-DNA雙元載體來源的所有轉Bt毒蛋白基因水稻植株，首先用PCR分析HPT基因的整合情況，結果表明所有轉基因水稻植株都已整合有潮霉素抗性基因(圖8)。因在該雙元載體的其中一個T-DNA還含有GUS報告基因，我們可用GUS組織化學染色法進行檢測目的基因的整合情況。經對所有轉基因株系進行GUS染色，發現在總共81個株系中僅3個顯示有GUS陽性。同時對所有轉基因水稻植株又進行了針對目的基因(Bt基因)的PCR分析，結果顯示在共81個轉基因株系中有23個含有Bt基因(圖6)，證明兩個T-DNA區的共整合率為30％左右，對GUS基因的PCR分析進一步證實了這一結果。比較GUS組織化學染色及PCR分析的結果也可看出，大部分共轉基因植株中雖然整合有GUS基因，但沒有檢測到其表達。3.4無抗性選擇標記轉Bt基因植株的篩選對部分同時含有HPT和Bt基因的共轉化植株，分別收取T1代成熟種子。隨機選取部分種子去殼滅菌，接種在含50mg/l潮霉素的1/2MSH培養基上，統計潮霉素抗性分離情況；或直接將種子播種入人工氣候室，待苗長大后，按劉巧泉等(2001)的方法檢測各植株中的潮霉素抗性；同時選取部分T1代植株按單株提取葉片總DNA，用于PCR分析。結果顯示，HPT和Bt基因在部分獨立轉化株的后代中發生遺傳分析，其后代的部分植株只含有Bt基因，而不含有HPT基因，如圖7所示的一個T1代株系中第8號植株。這些后代個體中HPT和Bt基因的整合情況進一步經Southern雜交獲得了證實。同時也發現有部分后代中HPT和Bt基因未發生分離的，即兩個基因仍緊密聯鎖在一起。權利要求1.一種雙T-DNA載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用，其特征在于(1)制備含有兩個T-DNA結構域的農桿菌雙元載體，稱為雙T-DNA雙元載體，其中第一個T-DNA區上含有可用于篩選轉化植物細胞的抗生素抗性選擇標記基因，第二個T-DNA區上含有一個通用的多克隆位點，可方便地克隆入目的基因。(2)在第二個T-DNA區克隆入用于改良作物的目的基因，再用該載體系統借助于根瘤農桿菌介導的共轉化方法轉化受體水稻，可期望借助于一個農桿菌將兩個獨立的T-DNA區導入同一個水稻細胞中，并整合到不同染色體或同一染色體的不同位置上，從而可在分離后代中獲得只含目的基因、無抗性選擇標記基因的轉基因水稻植株。2.根據權利要求1所述的一種雙T-DNA載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用，其特征在于所述的雙T-DNA雙元載體相對于常規的農桿菌雙元載體，多了一個T-DNA功能區，所含核酸序列及其功能同常規雙元載體，該載體系統在轉化植物的技術方法上與其它雙元載體系統無明顯差別，但卻可方便地用于培育無抗性選擇標記的轉基因作物。3.根據權利要求1所述的一種雙T-DNA載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用，其特征在于其中一個T-DNA區上的抗生素抗性選擇標記基因為潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycinphosphotransferase，HPT)基因，另一個T-DNA區上的多克隆位點源自質粒pUC18的通用多克隆位點。4.根據權利要求1所述的一種雙T-DNA載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用，其特征在于所述目的基因可以包括任何在生產上的有應用價值的基因抗生物脅迫(抗蟲、抗病)基因、抗非生物脅迫(抗除草劑、耐鹽等)基因、品質改良基因、以及與其它轉基因應用有關的目的基因及其上述不同基因的融合或多價基因。5.根據權利要求1所述的一種雙T-DNA載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用，其特征在于所述受體水稻指所有栽培稻種，包括秈稻、粳稻或爪哇稻；可以是常規稻，也可以是雜交稻的不育系、保持系或恢復系。6.根據權利要求1所述的一種雙T-DNA載體及其在無選擇標記轉基因水稻培育中的應用，其特征在于所述的無抗性選擇標記轉基因水稻，包括所有通過上述載體系統和方法直接培育的無選擇標記轉基因水稻植株及其后代，以及由這些材料為親本經有性雜交轉育而成的所有含有目的基因的無選擇標記轉基因水稻。全文摘要本發明提供一種含有雙T－DNA結構區的簡便農桿菌雙元載體，以及利用此載體系統培育無抗性選擇標記轉基因水稻的方法。該系統借助于根瘤農桿菌介導的共轉化原理，在一個雙元載體上含有兩個獨立的T－DNA結構區段，其中的第一個T－DNA區含有抗生素抗性選擇標記基因，而第二個T－DNA區含有一個通用的多克隆位點，可任意插入目的基因。該雙T－DNA載體分子量小，易于克隆操作，在其含多克隆位點的T－DNA區上克隆入目的基因及其必要的調控系列后，實現對水稻的共轉化；經自花授粉，在其自交后代中選育含有目的基因、而已剔除了選擇標記基因的轉基因個體，從而消除因為選擇標記的存在而對轉基因植物商業化生產等可能帶來的負面影響。文檔編號C12N15/84GK1597969SQ20041006469公開日2005年3月23日申請日期2004年9月20日優先權日2004年9月20日發明者劉巧泉,辛世文,于恒秀,顧銘洪申請人:揚州大學