專利名稱：氯離子含量測定方法及氯離子診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種氯離子含量測定方法，同時本發明還涉及用以實現該方法的氯離子診斷試劑盒，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
體液中的氯以離子形式存在，全部幾乎與鈉離子平衡增減。測定氯離子含量對于醫學鑒定具有重要意義，目前已知測定方法有多種化學測定法—硝酸汞滴定法、硫氰酸汞比色法電量分析法離子選擇電極法酶法銷酸汞滴定法判斷滴定終點比較困難，不同樣本蛋白質含量不等，其終點的深淺和強度是變化不定的，且受膽紅素、血紅蛋白和血脂的干擾，因此本法精密度明顯不佳，而且工作效率低。硫氰酸汞比色法在測定時，血清中其他因素如F.Br和I也可以起反應，其量少于1mmol/L，故可忽略不計。某些藥物及膽紅素均對其有影響。這種比色法消除主觀因素的影響，并可在自動生化分析儀進行批量測定，屬臨床常用的一種方法。滴定法需要熟練的操作，終點要準確，盡可能排除主觀因素的干擾，否則誤差很大。血清中過多的膽紅素。血脂及血紅蛋白(溶血)對結果干擾很大。滴定法有淘汰的趨勢。
電量分析法屬于物理學方法。在恒定的電流下，以銀電極置于標本中，從電極釋放的Ag+與Cl-反應開始生成不解離的AgCl沉淀開始計時，當Cl-全部與Ag+作用完畢，游離的Ag+出現，其溶液電導明顯增加，使儀器傳感器和計時器立即切斷電流并計算滴定所需的時間作為完成測定過程。標本中Br-和I-對其有一定干擾，其量很少，可忽略不計。該法簡便，快速，測定時需要控制好電流。
離子選擇電極法是目前測定氯離子的最好方法，因為測定氯離子的電極均與K+、Na+電極配套，僅需100μl全血即可測出標本中K+、Na+和Cl-的含量而快速、準確，操作簡便，是目前廣為臨床使用的方法。但是氯離子電極壽命較短，一般有效期僅4-6個月。而且不同型號的儀器測定結果有一定誤差。
近年來，研究出用酶法測定氯離子的新方法，本法穩定性好，結果準確可靠，適合大型生化分析儀使用。在臨床化學分析中必定取代其他方法成為常規分析項目。然而，目前這方面的研究還不夠深入，尤其是國內，檢索包括專利文獻在內的現有技術資料，尚未發現適合國情的實用技術方案。
檢索中國專利，僅發現申請號為94112025.2、申請日為1994.01.21之類測定工業氯的專利，而未發現醫學領域氯離子的測定專利，這從一個側面說明，我國此方面的研究還比較欠缺。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種可以克服以上現有技術缺點的氯離子含量測定方法，同時本發明還給出相應的氯離子診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行氯離子含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明測定氯離子含量的步驟如下1)、將樣品與主要由α-淀粉酶(失活)、3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(3-CNP-β-G7)、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶組成的試劑混合，使之發生如下原理的反應α-淀粉酶(失活)Clα-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶2氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水β-葡萄糖苷酶氯-硝基酚+葡萄糖2)、檢測最終反應物在主波長405nm吸光度上升的速度，測算出氯離子含量的大小。
通常步驟2)將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長405nm吸光度上升的速度，測算出氯離子含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規的20℃到50℃范圍，反應時間控制在常規的2-30分鐘。
本發明應用氯激活淀粉酶偶聯葡萄糖苷酶反應比色法，應用氯離子激活已失去活性的淀粉酶使之重獲活性后，偶聯葡萄糖苷酶反應水解3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖產生氯-硝基酚，氯-硝基酚在405nm處有吸收峰，從而在405nm處發生吸光度升高，反應所產生的吸光度變化和樣品中氯離子的含量成正比。在405nm處，在固定時間間隔內測定吸光度上升速度，即可將氯離子的含量算出。酶法測定無機氯離子試劑盒有操作簡便、特異性高、靈敏度好等特點。
用于實現本發明方法的氯離子診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液 40--200mmol/lα-淀粉酶(失活)500--50000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.2--3mmol/Lα-葡萄糖苷酶 500--20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 500--20000U/L穩定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑試劑I緩沖液 40--200mmol/lα-淀粉酶(失活)500--50000U/Lα-葡萄糖苷酶 500--20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 500--20000U/L穩定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.2--3mmol/L穩定劑 10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖可以放在試劑II，試劑II其中的成分，α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶等也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，更有利于試劑的穩定試劑I緩沖液 40--200mmol/lα-淀粉酶(失活)500--50000U/L
穩定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/lα-葡萄糖苷酶500--20000U/Lβ-葡萄糖苷酶500--20000U/L穩定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.2--3mmol/L穩定劑 10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，α-淀粉酶(失活)可以放在試劑II中。試劑II其中的成分，α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的βH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是磷酸鹽(Phosphate)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關系的本發明氯離子診斷試劑盒較為理想
緩沖液 80--120mmol/lα-淀粉酶(失活)10000--40000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.5--2mmol/Lα-葡萄糖苷酶 5000--13000U/Lβ-葡萄糖苷酶 5000--13000U/L穩定劑 20--50％(總體積)由于本發明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內、外源其他物質的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的氯離子診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/lα-淀粉酶(失活) 10000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.5mmol/Lα-葡萄糖苷酶 5000U/Lβ-葡萄糖苷酶 5000U/L穩定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長405nm，測試副波長460nm以上，被測氯離子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發生以下反應
α-淀粉酶(失活)Clα-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶2氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水β-葡萄糖苷酶氯-硝基酚+葡萄糖將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長405nm吸光度上升的幅度，從而測算出氯離子的含量。
本實施例應用氯激活淀粉酶偶聯葡萄糖苷酶反應比色法，應用氯離子激活已失去活性的淀粉酶使之重獲活性后，偶聯葡萄糖苷酶反應水解3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖產生氯-硝基酚，氯-硝基酚在405nm處有吸收峰，從而在405nm處發生吸光度升高，反應所產生的吸光度變化和樣品中氯離子的含量成正比。在405nm處，在固定時間間隔內測定吸光度上升速度，即可將氯離子的含量算出。
實施例二(雙劑)本實施例的氯離子診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/lα-淀粉酶(失活) 25000U/Lα-葡萄糖苷酶 9000U/Lβ-葡萄糖苷酶 9000U/L穩定劑 50％(總體積)試劑II
緩沖液 100mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖1mmol/L穩定劑 20mmol/L測定氯離子含量時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長405nm，測試副波長460nm以上，被測氯離子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
具體測定步驟為α-淀粉酶(失活) Cl α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水 α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶 2 氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水 β-葡萄糖苷酶 氯-硝基酚+葡萄糖將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長405nm吸光度上升的幅度，從而測算出氯離子的含量。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的氯離子診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/lα-淀粉酶(失活) 40000U/L穩定劑50％(總體積)試劑II
緩沖液 120mmol/lα-葡萄糖苷酶 13000U/Lβ-葡萄糖苷酶 13000U/L穩定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 2mmol/L穩定劑 20mmol/L在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長405nm，測試副波長460nm以上，被測氯離子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
具體測定步驟為α-淀粉酶(失活) Cl α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水 α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶 2 氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水 β-葡萄糖苷酶 氯-硝基酚+葡萄糖將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長405nm吸光度上升的幅度，從而測算出氯離子的含量。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的氯離子診斷試劑有
試劑I緩沖液 100mmol/lα-淀粉酶(失活)20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 10000U/L穩定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/lα-葡萄糖苷酶 10000U/L穩定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 100mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 2mmol/L穩定劑 50％(總體積)在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長405nm，測試副波長460nm以上，被測氯離子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發生以下反應α-淀粉酶(失活) Cl α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水 α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶 2 氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水 β-葡萄糖苷酶 氯-硝基酚+葡萄糖將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長405nm吸光度上升的幅度，從而測算出氯離子的含量。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的污染。
權利要求
1.一種氯離子含量測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由α-淀粉酶(失活)、3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶組成的試劑混合，使之發生如下反應α-淀粉酶(失活)Clα-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖+3水α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖+葡萄四糖+葡萄五糖3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶2氯-硝基酚-β-葡萄糖氯-硝基酚-β-葡萄糖+水β-葡萄糖苷酶氯-硝基酚+葡萄糖2)、檢測最終反應物在主波長405nm吸光度上升的速度，測算出氯離子含量的大小。
2.根據權利要求1所述氯離子含量測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長405nm吸光度上升的速(程)度，測算出氯離子的含量。
3.根據權利要求1或2所述氯離子含量測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據權利要求1或2所述氯離子含量測定方法，其特征在于被測氯離子樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種氯離子診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40——200mmol/lα-淀粉酶(失活)500——50000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖0.2——3mmol/Lα-葡萄糖苷酶 500——20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 500——20000U/L穩定劑 10——80％(總體積)
6.根據權利要求5所述氯離子診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據權利要求5或6所述氯離子診斷試劑盒，其特征在于所述穩定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據權利要求5或6所述氯離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是磷酸鹽緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種測定氯離子含量的方法，同時本發明還涉及氯離子診斷試劑盒，屬于醫學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩沖液、α－淀粉酶(失活)、3－氯4－硝基酚－β－葡萄庚糖、α－葡萄糖苷酶、β－葡萄糖苷酶、穩定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶偶聯反應，再將最終反應物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出氯離子的含量。采用本發明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/40GK1763220SQ200410065049
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月20日 優先權日2004年10月20日
發明者王爾中 申請人:王爾中