專利名稱：克隆原核生物耐鹽相關基因方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程，尤其是一種可快捷克隆原核生物耐鹽相關基因的方法。
背景技術：
目前從某種原核生物中克隆一個已知基因的常規做法是通過生物信息查尋，得知其它生物該基因的序列后，再循兩條技術路線進行克隆基因1.合成該基因的寡聚核苷酸DNA探針，以放射性同位素或非放射性化學物質標記該分子探針，將該探針與事先構建的該生物基因組文庫進行Southern雜交，釣出含有目的基因的DNA片段，對該片段測序；構建含該片段的表達重組質粒，轉化受體細胞，檢測該DNA片段轉錄后轉化子獲得的新蛋白及其生物學功能(參見文獻1Sambrook J，Fritsch E F，Maniantis TMolecular CloningA Laboratory Mannual(2nd).Cold Spring HarborLaboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南(第二版).北京科學出版社，1996))。
2.根據已知基因的兩端序列設計并人工合成3′端和5′端寡聚短核苷酸引物，以該生物的總DNA為模板進行PCR擴增，回收擴增產物并構建重組質粒，測序，轉化受體細胞，檢測該DNA片段轉錄后轉化子獲得的新蛋白及其生物學功能(參見文獻2吳乃虎編著.基因工程原理.北京科學出版社，1998)。
方法1需要事先構建該生物的基因組文庫，然后化學合成放射性或非放射性DNA探針，再進行大量的Southern雜交，費錢、費時，實驗周期又長；方法2雖然比方法1簡單，但由于不同生物的基因序列并不完全相同，因此往往需合成多對的引物，然后在PCR反應中設置多套循環參數，尤其是“退火”的溫度。這樣，方法2一般都要進行多次的反復摸索才可能克隆出目的基因，甚至可能以實驗失敗而告終。
此外，上述兩種克隆基因的策略都只能克隆已知(即前人已克隆過)的基因，無法克隆序列未知的具有某種功能的基因。
發明內容
本發明的目的在于提供一種既快捷又經濟的克隆原核生物耐鹽相關基因的方法。
本發明的具體步驟如下1 將極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物，包括各種耐鹽細菌和藍藻接種在含NaCl0.1～0.9mol/L的培養基中，溫度為15～32℃，以100～150rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期；如果是耐鹽藍藻，應在光照下培養；2 常規堿變性法提取極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物的總DNA，經紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應≥1.8。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是否≥21kb，若OD260/OD280比值≥1.8，說明所得DNA較純，可以進入下一步驟；若OD260/OD280比值＜1.8，說明所得DNA純度不夠，應進一步純化，直至OD260/OD280比值≥1.8；3、在無菌條件下用限制性核酸內切酶(E.coRI)或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶對上述總DNA在37℃進行60～100分鐘的不完全酶切，酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為1～3kb的酶切片段區域，切出含上述該酶切片段的凝膠，回收其中的DNA片段；4、在無菌條件下以E.coRI在人工構建的表達載體，如pUC18的多克隆位點將其完全酶切成線性，去磷酸化處理，將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接10～24小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌；5、將轉化子溶液分別涂抹在高鹽和含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，培養48～60小時后，挑選既能在高鹽瓊脂培養基上生長又在含Amp-Xgal-IPTG培養基上菌落呈白色的轉化子；6、提取上述至少10個中選耐鹽轉化子中的重組質粒，用E.coRI切出其中的插入片段，測序；7、將已測知的各個插入片段序列與生物數據庫中的信息進行基因和蛋白質的同源性比較，初步判斷插入基因的性質；8、檢測轉化子中外源基因表達的產物以及轉化子獲得的新功能，判定該基因的性質；9、將各轉化子與對照分別接種在含NaCl為0.9～1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恒溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養，此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而各耐鹽轉化子則較快生長，取樣檢測其中的含菌數，分別繪出轉化子與對照的生長曲線，比較兩者生長狀態的差異，借此再次驗證該基因為耐鹽相關基因。
在上述步驟3中可采用凝膠回收試劑盒回收含酶切片段的凝膠中的DNA片段；酶切后的總DNA經含溴乙啶(其含量已有相約俗成的規定，即約1‰)的1％瓊脂糖凝膠電泳。
在步驟4中，所說的去磷酸化處理可按上述文獻1的方法進行。將回收的DNA片段與線性載體共育，一般載體的量至少1倍于DNA片段；轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌通常都用大腸桿菌。
在步驟5中，最好在無菌條件下各取100μL轉化子溶液分別用三角形無菌玻棒均勻涂抹在高鹽(所含NaCl≤1.1mol/L)和含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，培養48～60小時后，按常規挑選既能在高鹽瓊脂培養基上生長又在含Amp-Xgal-IPTG培養基上菌落呈白色的轉化子。
在步驟7中，所說的生物數據庫為GenBank或其他數據庫。
在步驟9中，所說的對照為未經遺傳學處理的大腸桿菌，分別接種在含NaCl為0.9～1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恒溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養48～72小時。每隔4～8小時取樣檢測其中的含菌數。
與已有的常規基因克隆方法比較，本發明的突出優點在于1.簡捷。由于不需要建立基因組文庫等煩瑣的實驗程序，因此本發明步驟較少，比較簡便；2.經濟。由于實驗方法比較簡便，且無需各種昂貴的藥品，因此本發明的費用較低；3.可以克隆未知基因。由于本發明不以克隆哪一個基因為目標，而是設計經篩選獲得耐鹽相關基因，因此將可能獲得未知的與該生物耐鹽有關的基因；4.可以同時克隆多個基因。由于本發明隨機構建了眾多包含各種基因的重組質粒，經高鹽條件篩選，將可以同時克隆得到多個與該生物耐鹽有關的基因；5.略加改進可用于克隆其它種類的基因。只要在基因篩選條件方面有針對性地加以改變，同時結合后續基因鑒定，將可克隆其它種類的基因。
具體實施例方式
以下實施例將結合克隆各種耐鹽原核生物，其中包括各種耐鹽細菌和藍藻的耐鹽相關基因對本發明作進一步說明。
實施例1從極端耐鹽的假單胞菌中克隆其耐鹽相關基因，其步驟為1.將假單胞菌接種在含NaCl 0.5mol/L的培養基中，恒溫25℃，以120rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期，約為22小時；2.常規堿變性法提取其總DNA。分別檢測總DNA溶液的OD260和OD280值以確認它的純度，兩者的比值為1.82。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是為21.5kb；3.用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對上述高純度的總DNA在37℃進行80分鐘的不完全酶切。酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為2kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段；4.以E.coRI在表達載體，如pUC18，的多克隆位點將其完全酶切成線性，去磷酸化處理以減少其自身連接的幾率。將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接20小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)；5.在無菌條件下，各取100μl轉化子分別涂抹在高鹽(含NaCl 1.1mol/L)和含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，培養48小時后，挑選既能在高鹽瓊脂培養基上生長又在含Amp-Xgal-IPTG培養基上菌落呈白色的轉化子；6.在含NaCl 0.5mol/L的LB培養基中，恒溫25℃，以120rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。分別提取10個耐鹽轉化子中的重組質粒，用原內切酶(E.coRI)切出其中的插入片段，測序；7.將已測知的各個插入片段序列與生物數據庫(GenBank或其他數據庫)中的信息進行基因和蛋白質的同源性比較，初步判斷插入基因的性質8.根據上述提示，進一步檢測轉化子中外源基因表達的產物以及轉化子獲得的新功能，判定該基因的性質。
9.將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 0.9mol/L)中，在恒溫37℃、120rpm的搖床中連續培養48小時。此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而各耐鹽轉化子則較快生長。每隔6小時取樣檢測其中的含菌數，分別繪出轉化子與對照的生長曲線，比較兩者生長狀態的差異，借此再次驗證該基因為耐鹽相關基因。
實施例2與實施例1類似，其區別在于將假單胞菌接種在含NaCl0.7mol/L的培養基中，恒溫20℃，以150rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期，約為20小時。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對上述高純度的總DNA在37℃進行70分鐘的不完全酶切。酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為3kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接18小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl0.7mol/L的LB培養基中，恒溫20℃，以150rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl0.95mol/L)中，在恒溫37℃、130rpm的搖床中連續培養48小時。
實施例3與實施例1類似，其區別在于將假單胞菌接種在含NaCl0.3mol/L的培養基中，恒溫28℃，以110rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期，約為18小時。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對上述高純度的總DNA在37℃進行90分鐘的不完全酶切。酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為1kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接15小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl0.3mol/L的LB培養基中，恒溫28℃，以110rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl1.0mol/L)中，在恒溫37℃、110rpm的搖床中連續培養48小時。
實施例4與實施例1類似，其區別在于將假單胞菌接種在含NaCl 0.1mol/L的培養基中，恒溫32℃，以100rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期，約為16小時。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對上述高純度的總DNA在37℃進行60分鐘的不完全酶切。酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為2kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接10小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl0.1mol/L的LB培養基中，恒溫32℃，以100rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 0.95mol/L)中，在恒溫37℃、100rpm的搖床中連續培養48小時。
實施例5與實施例1類似，其區別在于將假單胞菌接種在含NaCl 0.9mol/L的培養基中，恒溫15℃，以150rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期，約為24小時。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對上述高純度的總DNA在37℃進行100分鐘的不完全酶切。酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為3kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接24小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl 0.9mol/L的LB培養基中，恒溫15℃，以150rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl0.9mol/L)中，在恒溫37℃、150rpm的搖床中連續培養48小時。
實施例6采用在含NaCl0.1mol/L以上的環境生長的耐鹽細菌，其步驟與實施例1類似，培養至指數生長中后期的時間為12～24小時。
實施例7采用耐鹽藍藻接種在含NaCl0.1～0.9mol/L的培養基中，溫度為15～32℃，在2000～4000lux的光照下以100～150rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期，其余步驟與實施例1類似。
該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，登記入冊的保藏編號為CCTCC NOM204052，保藏的培養物名稱及注明的鑒別特征為假單胞桿菌Pseudomonas sp.cn 4902，保藏日為2004年7月13日。
權利要求
1.克隆原核生物耐鹽相關基因方法，其特征在于其步驟為1)將極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物，包括各種耐鹽細菌和藍藻接種在含NaCl0.1～0.9mol/L的培養基中，溫度為15～32℃，以100～150rpm的速度震蕩培養至指數生長中后期；如果是耐鹽藍藻，應在光照下培養；2)常規堿變性法提取極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物的總DNA，經紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應≥1.8。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是否≥21kb，若OD260/OD280比值≥1.8，說明所得DNA較純，可以進入下一步驟；若OD260/OD280比值＜1.8，說明所得DNA純度不夠，應進一步純化，直至OD260/OD280比值≥1.8；3)在無菌條件下用限制性核酸內切酶(E.co RI)或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶對上述總DNA在37℃進行60～100分鐘的不完全酶切，酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為1～3kb的酶切片段區域，切出含上述該酶切片段的凝膠，回收其中的DNA片段；4)在無菌條件下以E.co RI在人工構建的表達載體，如pUC18的多克隆位點將其完全酶切成線性，去磷酸化處理，將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接10～24小時，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌；5)將轉化子溶液分別涂抹在高鹽和含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，培養48～60小時后，挑選既能在高鹽瓊脂培養基上生長又在含Amp-Xgal-IPTG培養基上菌落呈白色的轉化子；6)提取上述至少10個中選耐鹽轉化子中的重組質粒，用E.co RI切出其中的插入片段，測序；7)將已測知的各個插入片段序列與生物數據庫中的信息進行基因和蛋白質的同源性比較，初步判斷插入基因的性質；8)檢測轉化子中外源基因表達的產物以及轉化子獲得的新功能，判定該基因的性質；9)將各轉化子與對照分別接種在含NaCl為0.9～1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恒溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養，此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而各耐鹽轉化子則較快生長，取樣檢測其中的含菌數，分別繪出轉化子與對照的生長曲線，比較兩者生長狀態的差異，借此再次驗證該基因為耐鹽相關基因。
2.如權利要求1所述的克隆原核生物耐鹽相關基因方法，其特征在于在步驟3)中采用凝膠回收試劑盒回收含酶切片段的凝膠中的DNA片段；酶切后的總DNA經含溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶的含量為1‰。
3.如權利要求1所述的克隆原核生物耐鹽相關基因方法，其特征在于在步驟4)中，將回收的DNA片段與線性載體共育，載體的量至少1倍于DNA片段；轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌通常都用大腸桿菌。
4.如權利要求1所述的克隆原核生物耐鹽相關基因方法，其特征在于在步驟5)中，在無菌條件下各取100μL轉化子溶液分別用三角形無菌玻棒均勻涂抹在高鹽和含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，培養48～60小時后，按常規挑選既能在高鹽瓊脂培養基上生長又在含Amp-Xgal-IPTG培養基上菌落呈白色的轉化子。
5.如權利要求1所述的克隆原核生物耐鹽相關基因方法，其特征在于在步驟7)中，所說的生物數據庫為GenBank或其他數據庫。
6.如權利要求1所述的克隆原核生物耐鹽相關基因方法，其特征在于在步驟9)中，所說的對照為未經遺傳學處理的大腸桿菌，分別接種在含NaCl為0.9～1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恒溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養48～72小時，每隔4～8小時取樣檢測其中的含菌數。
全文摘要
克隆原核生物耐鹽相關基因方法，涉及基因工程。提供一種克隆原核生物耐鹽相關基因的方法。將極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物，提取極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物的總DNA；對總DNA不完全酶切，酶切后的總DNA經凝膠電泳，找酶切片段區域，切出凝膠，回收DNA片段；完全酶切成線性，將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶形成重組質粒，轉化用CaCl
文檔編號C12P19/00GK1644706SQ20041008481
公開日2005年7月27日 申請日期2004年10月1日 優先權日2004年10月1日
發明者劉廣發, 謝金鎮, 陳啟偉 申請人:廈門大學