流感免疫原和疫苗的制作方法

專利名稱：流感免疫原和疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學和蛋白質工程領域的交叉部分，并且特別涉及用于預防甲型流感病毒導致的流感感染的免疫原和疫苗。
背景技術：
嗜肝DNA病毒科是具有包膜的、含有DNA的動物病毒，它能導致人的乙型肝炎(HBV)。嗜肝DNA病毒科包括其他動物的乙型肝炎病毒，例如土撥鼠(WHV)和地松鼠(GSHV)和存在于鴨(DHV)和灰蒼鷺(HeHV)中的禽類病毒。本文所說的乙型肝炎病毒(HBV)表示與感染禽類宿主的病毒相比，感染哺乳動物的嗜肝DNA病毒科的成員，除非有關討論涉及非哺乳動物病毒的特定的例子。
根據病毒的亞型，哺乳動物乙型肝炎病毒(HBV或嗜肝DNA病毒)的核殼或核心含有具有183或185個氨基酸殘基的序列，而鴨病毒衣殼含有262個氨基酸殘基。若干種嗜肝DNA病毒科的乙型肝炎核心蛋白單體，能在受感染的細胞中自我組裝成被稱為乙型肝炎核心蛋白顆粒(HBc顆粒)的穩定聚集體。業已報導了C末端截短的HBc顆粒的兩種三維結構。第一種結構包括具有作為二聚體的90個拷貝的HBc亞基蛋白或180個獨立的單體蛋白的次要群體，而第二種結構包括具有作為二聚體的120個拷貝的HBc亞基蛋白或240個獨立的單體蛋白的主要群體。以上顆粒分別被稱為T＝4或T＝3顆粒，其中，“T”是三角形的數量。所述感染人的病毒(人病毒)的HBc顆粒的直徑分別為大約10或34納米。Pumpens et al.(1995)Intervirology，3863-74；和Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79587-590。
Conway et al.，(1997)Nature，38691-94披露了在9埃分辯率時由冷凍電子顯微鏡照片確定的人HBc顆粒的結構。Bottcher et al.(1997)，Nature，38688-91披露了人HBc單體的多肽折疊，并且提供了對形成α螺旋區及其連接環區的氨基酸殘基進行大致計數的方法。Zheng et al.(1992)，J.Biol.Chem.，267(13)9422-9429根據他們進行的缺乏一個或多個半胱氨酸的突變型蛋白的研究和其他人用C-末端截短的蛋白進行的研究[Birnbaum et al.，(1990)J.Virol.64，3319-3330]，報導了核心顆粒形成不取決于富含精氨酸的C-末端結構域、核酸的結合或二硫鍵的形成。Wynne at al.，(1999)Mol.Cell，3(6)70-80報道的T＝4顆粒的3.3分辨率晶體結構證實了Conway et al.，(1997)和Bottcher et al.，(1997)報道的HBc顆粒的低分辨率結構。
業已披露了乙型肝炎核殼或病毒核心蛋白(HBc)是一種免疫原性載體部分，它能刺激免疫的宿主動物的T細胞應答。例如，參見美國專利No.4,818,527，4,882,145和No.5,143,726。這種載體的一種特別有用的用途是它在從該蛋白的氨基末端(N-末端)開始計算的大約70-90號殘基位置上的免疫優勢環呈遞外源或異源B細胞表位的能力，更常見的是大約75-85號位置。Clarke et al.(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.313-318。
在病毒復制期間，HBV核殼與病毒RNA前基因組、病毒逆轉錄酶(Pol)、和末端蛋白(源于Pol)締合，形成能復制的核心。核殼和病毒RNA前基因組的締合是由羧基末端(C-末端)的富含精氨酸的結構域介導的。當在缺乏病毒RNA前基因組的大腸桿菌等異源表達系統中表達時，魚精蛋白樣C-末端，即150-183號位置上的殘基能夠與大腸桿菌RNA結合。Zhang et al.(1992)JBC，267(13)9422-29。
HBcAg是源于被提議作為異源表位的載體的乙型肝炎病毒的顆粒蛋白。將HBsAg(HBs)的相對免疫原性與HBcAg(HBc)進行比較，并且比較了它們各自在不同的遺傳背景中激發免疫應答的能力[Milich etal.，Science，(1986)234(4782)p.1398-1401]。這些數據強調了HBc相對于HBs更高的免疫原性，以及不考慮遺傳背景，對HBc的普遍反應性。
例如，在BALB/c小鼠中，HBc的免疫原性比HBs高300倍；并且，盡管B10.S和B10.M小鼠都對HBs無反應，測試的每株都對HBc有反應。這些結果再次強調了HBc作為疫苗載體的適用性，并且具體地，強調了其比HBs優越，因此，HBc的選擇替代了HBS來攜帶異源表位。HBc的這些方面被認為對于流感疫苗開發是重要的，因為它們解決了涉及異源限制和抗體滴度不足的問題。
HBc載體的另一個優點是它們的效能可能不需要復雜佐劑的事實。這是由于該顆粒固有的高免疫原性。HBc-貝氏瘧原蟲顆粒的免疫原性比較表明，批準用于人類的明礬，比IFA或CFA都更有效[Schodelet al.，J.Exp.Med.，(1994)180(3)p.1037-46]。最近在SKB的候選瘧疾疫苗的臨床試驗中注意到的與更新的、更復雜的佐劑相關的毒性問題強調了這一觀察結果的重要性[Stoute et al.，N.Engl.J.Med.， 336(2)p.86-91]。
在作為疫苗載體部分的用途中，HBV核殼優選不與源于宿主的核酸結合。Birnbaum et al.(1990)J.Virol.，643319-3330證實HBV核殼的魚精蛋白樣C-末端結構域可以缺失，而又不影響該蛋白組裝成病毒樣顆粒的能力。因此，有人報導將蛋白截短到大約144號位置，即含有從1至大約144號位置的HBc序列可以自我組裝，而缺失超過139號殘基會破壞衣殼組裝[F.Birnbaum & M.Nassal(1990)J.Virl.，643319-30]。
Zlotnick et al.，(1997)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，USA，949556-9561研究了全長和截短的HBc蛋白組裝成顆粒的情況。除了討論全長的分子之外，以上作者還報導了截短蛋白的制備，這種蛋白含有從1到149號位置的HBc序列，其中，48、61和107號位置上的半胱氨酸分別被丙氨酸取代，并且在C-末端(150號位置)添加了一個半胱氨酸殘基。C-末端的硫醇用于連接金原子團，以便在電子顯微術中進行標記。
最近，Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79587-590報導了人病毒序列的138號位置上的脯氨酸(Pro-138或P138)是顆粒形成所必需的。以上作者還報導了在羧基末端截短為142和140個殘基長度的顆粒的組裝能力受到了影響，當截短到長度為139和137個殘基時，組裝能力完全喪失。
若干個研究小組業已證實，與標準乙型肝炎核心顆粒相比，截短的顆粒具有較低的穩定性[Galena et al.(1989)J.Virol.，634645-4652；Inada，et al.(1989)Virus Res.，1427-48]，體現在顆粒大小的變化和顆粒片段在純化制劑中的存在[Maassen et al.，(1994)Arch.Virol.，135131-142]。因此，在上述Metzger等的報導之前，Pumpens等，1995，Intervirology，3863-74對有關文獻報導進行了綜述，指明自我組裝所必需的HBc序列的羧基末端邊界位于139和144號氨基酸殘基之間，并且前兩個或三個氨基末端殘基可以被其他序列所取代，但是消除4個或11個氨基末端殘基會導致嵌合蛋白在轉化的大腸桿菌細胞中的完全消失。
重組生產的雜合HBc顆粒具有內在插入片段(在本領域中被稱為HBc嵌合顆粒或HBc嵌合體)，它含有各種插入的多肽序列，這些序列是通過在多種生物中異源表達而制備的，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、牛痘，鼠傷寒沙門氏菌，啤酒糖酵母，例如，參見Pumpens et al.(1995)Intervirology，3863-74，以及它所引用的文獻，其中提到了若干個研究小組的工作。也已經在植物中產生了天然HBc顆粒(Tsudaet al.，1998)Vox Sang，74(3)148-155。
當通過電子顯微鏡分析時，與缺乏異源表位的顆粒相比，所述HBc嵌合體通常表現為具有較無序的結構[Schodel et al.，(1994)J.Exp.Med.，1801037-1046]。在某些情況下，將異源表位插入C末端截短的HBc顆粒，所述顆粒具有顯著的去穩定效果，使得雜合顆粒不能在異源表達后回收[Schodel et al.(1994)Infect.Immunol.，621669-1676]。這樣，很多嵌合HBc顆粒不穩定，使得它們在純化時分離到它們不能回收，或它們表現出非常差的穩定性特征的程度，使得它們不能用于開發疫苗。
上述Pumpens et al.(1995)Intervirology，3863-74的報導列舉了顆粒形成嵌合體，其中，所插入的多肽序列位于N-末端、C-末端以及位于兩個末端之間。在該文獻中所報導的插入片段的長度為在N-末端為24-50個殘基，在內部為7-43個殘基，在C-末端為11-741個殘基。
Kratz et al.，(1999)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，961915-1920最近披露了嵌合HBc顆粒的大腸桿菌表達，該顆粒包括內部融合在綠色熒光蛋白(GFP)的238號殘基上的截短的HBc序列。該嵌合體包括插入的GFP序列，其側翼是一對取代了HBc的79和80號氨基酸殘基的富含甘氨酸的柔性接頭臂。據說這種顆粒能在作為宿主動物的兔體內有效誘導抗天然GFP的抗體。
美國專利No.5,990,085披露了由抗原性牛抑制素肽融合在(i)78和79號殘基之間的免疫原性環和(ii)羧基末端截短的HBc的144號殘基后面所產生的兩種融合蛋白。據說所表達的融合蛋白在給宿主動物施用之后能誘導抗抑制素抗體的產生。據報導，在免疫接種30天之后在患者體內的滴度相對低，插入環中的融合蛋白的滴度為1∶3000-15000，而插在144號殘基后面的滴度為1∶100-125。
美國專利No.6,231,864教導了策略上修飾的與半抗原連接的乙型肝炎核心蛋白的制備和用途。修飾的核心蛋白含有長度為1-大約40個殘基的插入片段，其含有與半抗原垂直連接的化學反應性氨基酸殘基。
最近公開的WO 01/27281教導了對HBc的免疫應答可以分別通過存在或不存在天然分子的含有C-末端半胱氨酸的序列，從Th1應答改變為Th2應答。該公開內容也認為，通過C-末端半胱氨酸導致的二硫化物形成，能夠幫助穩定顆粒。認為緊鄰C-末端半胱氨酸的上游的天然HBc序列的一些殘基的存在是優選的，但不是必須的。認為可以用于替代截短的C-末端HBc序列的一種這樣的替代方案包括C-末端半胱氨酸和限定來自除HBc之外的其它抗原的表位的任選序列。
公開的PCT申請WO 01/98333教導了天然HBc的C-末端上存在的四個精氨酸重復的一個或多個的缺失，而保持C-末端半胱氨酸殘基。該申請也教導了可以用除HBc以外的蛋白的表位替代缺失的區域，從而如此形成的分子的HBc部分能夠作為添加的表位的載體。
相應于WO 02/13765A2和WO 02/14478A2的公開的PCT申請教導了可以通過在組裝成顆粒的嵌合蛋白中使用一個或多個添加的半胱氨酸殘基，實現C-末端截短的HBc顆粒的穩定化。根據教導，這些添加的半胱氨酸殘基位于或鄰近于嵌合蛋白的C-末端。
在用嗜肝DNA病毒核殼送遞系統開發疫苗時，能夠保留全長HBc顆粒的穩定性，同時又消除全長HBc顆粒的核酸結合能力的結構特征將是非常有利的。實際上，Ulrich等在他們的有關用HBc嵌合體作為外源表位載體的最新的綜述中[Adv.Virus Res.，vol.50(1998)AcademicPress pages 141-182]指出將這種嵌合體用于人類疫苗需要解決三個潛在問題。第一個潛在問題是將嵌合疫苗中的核酸意外轉移到接種的宿主中。第二個潛在的問題是現有免疫對HBc的干擾。第三個可能的問題涉及對完整嵌合體顆粒的可重復制備的需要，這種顆粒還能經受長期的保存。
上述4個公開的PCT申請似乎包含了可以用于克服Ulrich等人提出的潛在問題的教導。如下文的公開，本發明提供了另一種HBc嵌合體，該嵌合體提供了出乎意料高的抗流感抗體的滴度，并且在一方面，也提供了關于HBc嵌合體穩定性和構建體基本缺乏核酸結合能力的問題。此外，考慮的重組嵌合體表現出對預先存在的抗HBc抗體的抗原性降低。
上述顆粒不穩定性的發現與N-末端截短的HBc嵌合體分子相關，但Neirynck et al.，(1999年10月)Nature Med.，5(10)1157-1163報道了在HBc嵌合體的大腸桿菌表達時發生了顆粒形成，該嵌合體包含流感M2蛋白(M2e)的N-末端24個殘基組成的部分，包括起始的甲硫氨酸，該部分在第5號殘基與全長HBc融合。
Bachmann和合作者[Jegerlehner et al.，(2002)Vaccine，203104-3112]比較了與上文引用的Neirynck等的文獻中的構建體基本相同的融合構建體與相似于公開于U.S.No.6,231,864中的構建體的偶聯的構建體，該偶聯的構建體中甲型流感病毒的M2蛋白的外部23個殘基(在體內除去甲硫氨酸殘基后)通過接頭與賴氨酸殘基偶聯，所述賴氨酸殘基工程化到C-末端截短的HBc(1-149)中的環中，所述C-末端截短的HBc中48和107號位置的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。他們的結果表明，偶聯的構建體與N-末端融合蛋白相比，抗M2滴度增加，并且存活率增加(6/6vs.0/3)。
前面討論的將具有截短的C末端的雜合HBc蛋白用于疫苗，相對于它們的全長對應物，提供了一些優點，包括表達水平增強和缺乏結合的大腸桿菌RNA。但是，經過工程化以展示異源表位的C-末端截短的顆粒通常是不穩定的，得到在表達后不能締合為穩定的顆粒狀結構的顆粒，或在純化期間和/或純化后容易解離為非顆粒狀結構的顆粒。所述穩定性的缺乏由包含C-末端截短到HBc第149位并且也含有甲型流感病毒M2蛋白的上述2-24號殘基的嵌合HBc分子的顆粒所展現。
其他人報道了在野生型嗜肝DNA病毒核心抗原中，HBcAg起始密碼子上游的半胱氨酸殘基直接參與防止顆粒形成[Schodel et al.(Jan.15，1993)J.Biol.Chem.，268(2)1332-1337；Wasenauer et al.(Mar.1993)J.Virol.，67(3)1315-1322；and Nassal et al.(Jul.1993)J.Virol.，67(7)4307-4315]。所有三個組都報道了在野生型HBeAg中，當從-30位的起始甲硫氨酸上游開始翻譯核心基因時存在的前核心序列-7位的半胱氨酸殘基負責防止顆粒形成，并因此促進從顆粒狀HBcAg轉變為分泌的、非顆粒狀的HBeAg。
基于上述三篇公開文獻，可以預見到在HBc的起始甲硫氨酸之前的位置，即，在小于相對于SEQ ID NO1的序列的N-末端而言的位置的殘基位置引入一個或多個半胱氨酸殘基，實際上使C-末端截短的雜合顆粒不穩定，而不是使其穩定。如下文的討論可見，本發明提供了與這些解釋相反的結果。
發明概述本發明涉及用于誘導針對甲型流感病毒M2蛋白(M2e)的細胞外結構域的抗體的基于嗜肝DNA病毒的免疫原，以及包含分散在生理學耐受的稀釋劑中的免疫原的接種物和疫苗。下文中，名稱“M2”和“M2e”可互換使用。涉及的免疫原是包含重組乙型肝炎病毒核心(HBc)嵌合蛋白分子的自組裝顆粒。這些分子均具有大約150-大約375個氨基酸殘基的長度，包括SEQ ID NO9的6-大約24個殘基的序列，并且包括4個肽連接的氨基酸殘基序列結構域，從N-末端開始命名為結構域I、II、III和IV。
第一個結構域，即結構域I，包含大約75-大約160個氨基酸。該結構域的序列至少包括HBc的第4位到大約75位的殘基的序列。在嵌合體分子中相對于SEQ ID NO1的HBc的N-末端的大約1--55，優選1--30，更優選1--20的位置上也存在1-3個半胱氨酸殘基[N-半胱氨酸殘基]。N-半胱氨酸殘基存在于除HBc的前核心序列的序列之外的序列中。結構域I的半胱氨酸殘基也存在于SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-X22X23X24，如SEQ ID NO10的優選多肽X1X2X3X4X5X6X7X8-TPIRNE-X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24的大約6-大約24個殘基的2-4個序列中，所述多肽與HBc序列的N-末端的大約15個殘基通過肽鍵連接，或通過肽鍵連接在HBc序列的N-末端的大約15個殘基內，其帶有腳標的X殘基是下文所定義，以及HBc殘基1-4中的一個或多個。
第二個結構域，即結構域II，包含與結構域I的大約75號殘基通過肽鍵連接的大約0-大約60個氨基酸殘基，其中(i)HBc的76-85位的序列中的0-所有10個殘基通過肽鍵連接于(ii)構成上述SEQ IDNO9的甲型流感M2多肽的一個或多個重復序列的大約6-大約48個殘基組成的任選序列。
第三個結構域，即結構域III，是通過肽鍵連接于大約85號殘基的大約86位到大約135位的HBc序列。
第四個結構域，即結構域IV，包含(i)通過肽鍵連接于結構域III的大約135位殘基的大約136-140位殘基加上從141-149位的HBc氨基酸殘基序列的最多9個殘基，(ii)0-3個半胱氨酸殘基，(iii)少于4個精氨酸或賴氨酸殘基，或彼此鄰接的其混合物，和(iv)與HBc的164位到C-末端異源的序列，優選與HBc的156位到C-末端異源的序列中的最多約100個氨基酸殘基。
涉及的嵌合體分子(i)HBc序列中包含不超過10％的保守取代的氨基酸殘基，(ii)自組裝為基本不與宿主細胞上表達的核酸結合的顆粒，這些顆粒比由缺乏所述N-末端半胱氨酸殘基或嵌合體分子中存在的N-末端半胱氨酸被其它殘基替代的其它方面相同的HBc嵌合體形成的顆粒在形成時更穩定。
結構域I的HBc序列優選包括單獨的第4位-第75位的殘基，至少加上N-末端半胱氨酸殘基。更優選的是涉及的免疫原單獨在結構域IV內，或在與HBc的164位到C-末端的序列異源的氨基酸殘基序列中包含1個半胱氨酸殘基。特別優選的是該異源序列包含甲型流感的T細胞表位。
另一種實施方案包括接種物或疫苗，它包括溶解或分散在可以藥用的稀釋組合物中的上述HBc嵌合顆粒，該組合物通常還含有水。在以免疫原性有效量給諸如哺乳動物或禽類的動物施用時，接種物誘導與嵌合顆粒特異性免疫反應的抗體。由此誘導的抗體還能夠與M2蛋白的N-末端部分特異性免疫反應(與它結合)。
本發明具有若干益處和優點。
本發明的一個具體的益處是將其用作疫苗，提供了抗甲型流感的卓越的抗體滴度。
本發明的一個優點是在批準用于人類的佐劑的輔助下產生了非常高的抗體滴度。
本發明的另一個益處是采用公知的細胞培養技術生長轉化的宿主細胞，可以容易并且大量制備重組免疫原。
本發明的另一個優點是用公知的重組技術很容易制備免疫原。
本發明的另一個益處是優選的免疫原與其它HBc嵌合體相比，在更高的溫度下表現出更強的穩定性。
本發明的另一個優點是涉及的免疫原基本不含核酸。
通過以下說明，本領域技術人員可以了解其他益處和優點。


在構成本說明書一部分的附圖中圖1用圖1A和圖1B兩幅圖表示來自六種病毒的哺乳動物HBc蛋白的六種公開的序列的比對。第一種(SEQ ID NO1)人病毒序列是ayw亞型的，并且公開于Galibert et al.(1983)Nature，281646-650中；adw亞型的第二種人病毒序列(SEQ ID NO2)是由Ono et al.(1983)Nucleic Acids Res.，11(6)1747-1757公開的；第三種人病毒序列(SEQID NO3)是adw2亞型，并且由Valenzuela et al.，Animal VirusGenetics，Field et al.eds.，Academic Press，New Y或k(1980)57-70頁公開的；第四種人病毒序列(SEQ ID NO4)是adyw亞型的，它是由Pasek et al.(1979)Nature，282575-579公開的；第五種序列(SEQID NO5)是土撥鼠病毒序列，它是由Galibert et al.(1982)J.Virol.，4151-65公開的；而第六種哺乳動物序列(SEQ ID NO6)是地松鼠序列，它是由Seeger et al.(1984)J.Virol.，51367-375公開的。
圖2表示在制備在本發明中用于制備重組HBc嵌合體的質粒載體pKK223-3N時對商業化質粒載體pKK223-3進行的修飾。在可商購的載體(SEQ ID NO8)下面示出了修飾的序列(SEQ ID NO7)。所添加的NcoI位點的堿基用小寫字母表示，而所添加的堿基通過雙下劃線示出，而缺失的堿基用虛線表示。示出了出現在該序列片段上的兩個限制位點(NeoI和HindIII)。
圖3是ICC-1603顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜，其中在縱坐標上示出了280nm處的吸光度，以秒表示的時間示于橫坐標上。
如同對圖3的討論，圖4是ICC-1590顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜。
如同對圖3的討論，圖5是ICC-1560顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜。
如同對圖3的討論，圖6是ICC-1605顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜。
如同對圖3的討論，圖7是ICC-1604顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜。
如同對圖3的討論，圖8是ICC-1438顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜。
如同對圖3的討論，圖9是ICC-1492顆粒的分析大小排阻層析洗脫圖譜。
圖10是在顆粒制備之后在還原條件下進行的SDS-PAGE分析的照片，表明與ICC-1492構建體(泳道3)相比，ICC-1438單體構建體在老化后不穩定(泳道2)，其中HBc-149(泳道1)，ICC-1475(泳道4)和ICC-1473(泳道5)作為額外的分子量對照。
圖11有兩張圖片，顯示了如每個柱所示，在室溫(RT；圖11A)和37℃(圖11B)下在采用溶于顆粒儲存緩沖液20mM磷酸鈉，pH 7.2的0、1、2、5和10mM EDTA進行的穩定性研究后，含有三個順序連接的M2e多肽拷貝的CV-1818顆粒的SDS-PAGE分析的照片，并且說明添加EDTA(1-10mM)時不存在切割。對照(C)是就要開始使用前從冷凍儲存物中回收的相同顆粒。
圖12有兩張圖片，顯示了SDS-PAGE分析的照片，證明在室溫下(RT)儲存、在所示的溫度下熱處理圖11所示的對照1.5或3小時(圖12A)或儲存一周后(圖12B)，CV-1818顆粒的單體的蛋白水解減少。
圖13有兩張圖片，顯示了一系列疊加的SEC照片，顯示了在熱處理后不久(圖13A)和此后在室溫下維持一周后(圖13B)，經過熱處理(3小時)的顆粒的分析。
圖14是還原SDS-PAGE凝膠的照片，表示用描述的包括熱步驟(泳道1)和缺乏熱步驟(泳道2)的方法純化后的CV-1906顆粒單體。
圖15是顆粒的還原SDS-PAGE凝膠分析的照片，所述顆粒含有0(1123，泳道1)、1(1604，泳道2)、2(1817，泳道3和4)和3(1818，泳道5和6)個拷貝的表達的M2e，其以串聯方式融合于在149位后截短，并且在150位添加了半胱氨酸殘基的HBc顆粒的N-末端。
圖16是表示用一種或另一種圖15所示含有Me2的HBc嵌合體或圖中指出的對照免疫的小鼠在用甲型流感病毒進行致死攻擊后的存活率的圖片。
圖17是表示圖16和如圖中指出的用甲型流感病毒進行攻擊的小鼠的體溫的圖片。
圖18是表示上述用甲型流感病毒攻擊的小鼠的體重的圖片。
定義與HBc嵌合體一起使用的編號表示在SEQ ID NO1的HBc ayw氨基酸殘基序列中的位置，在該序列的所述位置上添加或缺失了一個或多個殘基，而無論是否存在所述氨基酸殘基序列的添加或缺失。因此，HBc149表明該嵌合體的末端是149號殘基，而HBc149+C150表示相同的嵌合體在相對于SEQ ID NO1的序列編號的HBc 150位包含一個半胱氨酸殘基。
術語“抗體”表示作為被稱為免疫球蛋白的糖基化蛋白家族成員的分子，它能特異性結合于抗原。
術語“抗原”曾經被用于表示由抗體或受體結合的實體，并且還被用于表示能誘導抗體產生的實體。更近一些的用法將抗原的含義局限于由抗體或受體結合的實體，而術語“免疫原”被用于表示能誘導抗體產生或與受體結合的實體。其中，本文所討論的實體同時具有免疫原性和抗原性，根據其預期的用途通常稱之為免疫原或抗原。
“抗原決定簇”表示抗原的實際結構部分，它能與抗體結合位點或T細胞受體發生免疫結合。該術語還可以與“表位”交換使用。
本文所使用的術語“綴合物(conjugate)”表示通過氨基酸殘基側鏈可操作地與載體蛋白連接的半抗原。
本文所使用的術語“保守取代”表示一種氨基酸殘基被另一種生物學上似的殘基所取代。保守取代的例子包括用諸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的疏水性殘基取代另一種疏水性殘基，或者用一種極性殘基取代另一種極性殘基，如精氨酸和賴氨酸之間的取代，谷氨酸和天冬氨酸之間或谷氨酰胺和天冬酰胺之間的取代等。
與肽序列一起使用的各種語法形式的術語“相當”表示在所描述的肽序列的氨基末端和羧基末端中的任一個末端或兩個末端上添加或減少最多達3個氨基酸殘基，并且僅含有保守取代，特別是沿著多肽序列的氨基酸殘基。
本文所使用的術語“結構域”表示重組HBc嵌合體分子的一部分，它是通過(i)相對Galibert et al.，(1979)Nature，281646-650(SEQID NO246)HBcAg亞型ayw的位置編號進行的殘基位置編號而確定的。所述多肽的至少嵌合體結構域I，II和III的部分被認為以類似于天然存在的HBcAg的相應序列的三級形式存在。
在本文中，術語“融合蛋白”表示包含至少兩個在正常情況下不是天然連接在一起的氨基酸殘基序列的多肽，這兩個序列是通過其相應的羧基末端和氨基末端氨基酸殘基之間的肽鍵末端-末端(頭-尾)地操作性連接在一起。本發明的融合蛋白是HBc嵌合體分子，它能誘導抗體的產生，這種抗體能與在氨基酸殘基序列中與所述融合蛋白的多肽部分相當的多肽發生免疫反應。
在本文中，術語“乙型肝炎”以其最廣義的含義表示哺乳動物嗜肝DNA病毒科的任何成員，正如上文所討論的。
術語“多肽”和“肽”在本說明書中可以交換使用，并且表示通過鄰接氨基酸的α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接的線性系列的氨基酸殘基。多肽可以是各種長度，以其中性(不帶電)形式或鹽形式存在。本領域公知，含有酸性和堿性基團的氨基酸殘基序列，和多肽所表現的特定離子化狀態，取決于周圍培養基的pH值(當肽處于溶液中)或獲得所述肽的培養基的pH值(如果肽是固體形式)。因此，“多肽”或其等同術語意欲包括提到的合適氨基酸殘基序列。本文中通常從左到右，并且以從氨基末端(N-末端)到羧基末端(C-末端)的方向表示肽。
術語“殘基”可以與術語氨基酸殘基交換使用。本文所說的所有氨基酸殘基具有天然的或L-構型。為了保持標準多肽命名，[J.Biol.Chem.，2433557-59，(1969)]，在下面的對應表中示出了氨基酸殘基的縮略語

發明詳述本發明涉及抗甲型流感病毒的免疫原和包含該免疫原的疫苗或接種物。涉及的免疫原是包含重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子的顆粒，這些分子均具有大約150-大約375個氨基酸殘基，優選大約150-大約235個氨基酸殘基的長度，包括4個通過肽鍵連接的氨基酸殘基序列結構域，從N-末端開始命名為結構域I、II、III和IV。在嵌合體的N-末端或N-末端附近，存在1-3個半胱氨酸殘基，并且，含有SEQ ID NO9的甲型流感M2細胞外結構域(或M2e)多肽的6-大約24個殘基的2-4個多肽，例如下文定義的SEQ ID NO10的多肽，通過肽鍵與嵌合體分子連接(融合)。
應該注意，人、禽類和豬甲型流感病毒的M2e序列非常相似。因此，人和禽類病毒的1-9號殘基是相同的，人和豬病毒的1-7和9-10號殘基也是相同的。所以三種病毒共有兩個半胱氨酸(17和19)位置，并且在22-24位具有相同的殘基。盡管其它位置可以在M2e的其它位置上含有不同的殘基，發現人類序列的殘基存在于不同的分離物中，使得人序列代表了所有三種病毒的共有序列。
在涉及的免疫原性嵌合顆粒中，(a)結構域I包含大約75-大約160個氨基酸殘基，其序列至少包含HBc的第4位到大約75位的殘基的序列。在嵌合體分子中相對于SEQ ID NO1的HBc的N-末端的大約1-大約-55，優選1-大約-30，更優選1-大約-20的位置上也存在1-3個半胱氨酸殘基[N-半胱氨酸殘基]。N-半胱氨酸殘基存在于除HBc的前核心序列的序列之外的序列中。
結構域I的半胱氨酸殘基也任選存在于，但優選存在于(i)上文指出的甲型流感M2多肽，如SEQ ID NO9的X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-X22X23X24或優選多肽，如SEQ ID NO10的X1X2X3X4X5X6X7X8-TPIRNE-X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24的大約6-大約24個殘基的2-4個序列中，所述多肽與HBc序列的N-末端的大約15個殘基通過肽鍵連接，或通過肽鍵連接在HBc序列的N-末端的大約15個殘基內(參見表4)和(ii)HBc殘基1-4中的一個或多個。在所述甲型流感M2多肽序列中，殘基X1-X8不存在或存在，并且當存在時，是M2e蛋白序列中天然存在的殘基，分別是甲硫氨酸，絲氨酸，亮氨酸，亮氨酸，蘇氨酸或脯氨酸，谷氨酸，纈氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，前提是當存在一個帶腳標的X殘基時，也存在任何其余的腳標數更大，最大到8的帶腳標的X，X10存在，并且是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸，X11存在，并且是異亮氨酸或蘇氨酸，X12存在，并且是精氨酸或賴氨酸，X13存在，并且是天冬酰胺或絲氨酸，X14存在，并且是谷氨酸或甘氨酸，殘基X15和X16存在或不存在，當存在時分別是色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，殘基X17和X19存在或不存在，當存在時各自獨立地是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸，殘基X18存在或不存在，當存在時是精氨酸或賴氨酸，并且殘基X20-X24存在或不存在，當存在時是M2蛋白序列中天然存在的殘基，分別是天冬酰胺、甘氨酸或絲氨酸，天冬氨酸或甘氨酸，絲氨酸，絲氨酸，天冬氨酸，前提是當存在一個帶腳標的X殘基時，也存在任何其余的腳標數更小，最小到15的帶腳標的X。
(b)結構域II包含通過肽鍵與大約75號殘基連接的大約0-大約60個氨基酸殘基。該序列包括(i)HBc的76-85位的序列中的0-所有10個殘基，其通過肽鍵連接于(ii)具有大約6-大約48個殘基的任選序列，其構成上述SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的一個或多個具有大約6-大約24個殘基的重復序列。
(c)結構域III是通過肽鍵連接于大約85號殘基的HBc序列的大約86位到大約135位。
d)結構域IV包含(i)通過肽鍵連接于結構域III的大約135位殘基的大約136-140位殘基加上HBc氨基酸殘基序列從141-156位的最多16個殘基，(ii)0-3個半胱氨酸殘基，(iii)少于4個精氨酸或賴氨酸殘基，或彼此鄰接的其混合物，和(iv)與HBc的156位到C-末端異源的序列中的最多約100個氨基酸殘基。
涉及的嵌合體分子(i)HBc序列中包含最多約10％的保守取代的氨基酸殘基，(ii)自組裝為基本不與宿主細胞上表達的核酸結合的顆粒，這些顆粒比由缺乏所述N-末端半胱氨酸殘基或嵌合體分子中存在的N-末端半胱氨酸被其它殘基替代的其它方面相同的HBc嵌合體形成的顆粒在形成時更穩定。
優選的嵌合體分子包含存在于相對于圖1和SEQ ID NO1所示的HBc的N-末端的大約-50-大約-1的位置。負數氨基酸位置的概念通常與前導序列相關，如HBc的前核心序列。此處相似地使用該概念，因為可以簡單將給定的嵌合體分子序列與SEQ ID NO1的序列進行比對，以確定相當于HBc的+1位的起始甲硫氨酸殘基的嵌合體中的位置。由于氨基酸殘基序列通常是從左到右，并且以從N-末端到C-末端的方向表示，在HBc起始甲硫氨酸占據的位置左邊的任何比對的嵌合體分子殘基具有負數位置。涉及的半胱氨酸殘基可以存在于比對的HBc起始甲硫氨酸殘基左邊大約20個殘基至相當于該起始甲硫氨酸的位置。
在檢驗涉及的HBc嵌合體的長度時，所述重組蛋白可以具有大約150-大約325個氨基酸殘基的長度。優選地，該長度是大約150-大約235個殘基。更優選地，該長度是大約170-大約215個殘基。這些長度差異是由于結構域I、II和IV的長度的改變，更具體是由于存在的M2多肽數目以及是否存在與HBc異源的C-末端序列。
業已報導了在結構域I中包括前3個氨基末端(N-末端)殘基的一個以上缺失的HBc嵌合體，會導致HBc嵌合蛋白在大腸桿菌細胞中的完全消失。Pumpens et al.，(1995)Intervirology，3863-74。另一方面，在一份最近的研究中，將來自流感病毒M2蛋白的免疫原性23聚體多肽與HBc N-末端序列融合，根據報導當天然HBc序列的1-4號殘基被取代時，所得到的融合蛋白能形成顆粒。Neirynck et al.(October1999)Nature Med.，5(10)1157-1163。因此，現有技術表明，當所添加的氨基酸序列可與HBc的1-5號殘基中的一個通過肽鍵連接時，可以形成顆粒，而如果不存在額外的序列并且缺失了HBc的N-末端的超過1-3號殘基，就不能形成顆粒。
通過肽鍵與HBc的前5個N-末端殘基之一連接的N-末端序列，可能包括一個與HBc異源的最多可達大約40個殘基的序列，即，前核心序列的一部分可以存在于涉及的嵌合體分子中。示例的序列包括諸如下文所公開的甲型流感B細胞或T細胞表位，上述Neirynck等所公開的源于流感病毒M2蛋白的23-聚體多肽，可以作為所使用的表達系統的結果而以融合蛋白形式存在的諸如β-半乳糖苷酶的另一種(異源)蛋白的序列。
結構域I優選具有HBc的2、3或4位-75位的殘基的序列。結構域I也包含1-3，優選1個添加的半胱氨酸殘基，并且也優選包含如下文所述在氨基末端通過肽鍵與甲型流感M2e蛋白連接的細胞外區序列的大約6-大約24個殘基的2-4個序列。因此，結構域I通常至少包含HBc的第1位的甲硫氨酸的缺失，并且可以包含HBc的2、3或4位的殘基的缺失。
在嵌合體分子中相對于SEQ ID NO1的HBc的N-末端的大約1-大約-55，優選1-大約-30，更優選1-大約-20的位置上存在1-3個半胱氨酸殘基[N-半胱氨酸殘基]。因此，采用SEQ ID NO1的序列作為參照點，N-末端半胱氨酸殘基位于嵌合體分子中相當于SEQ IDNO1的第1位的甲硫氨酸的位置(圖1)，或該位置上游最多約50個殘基的位置。最優選地，N-末端半胱氨酸殘基位于相對于SEQ ID NO1的第1位的大約1-大約-14的位置。
一個或多個N-末端半胱氨酸殘基存在于除HBc的前核心序列以外的序列中。如前面所指出的，HBeAg分子含有前核心序列，該序列包含半胱氨酸殘基。因此，盡管N-末端半胱氨酸殘基可以鄰接于前核心序列，但該殘基不存在于前核心序列或涉及的嵌合體分子中。
結構域I可以具有大約160個殘基的長度。優選地，結構域I具有大約95-大約145個氨基酸殘基的長度，并且包含2-4個，優選三個SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽表位序列，如SEQ ID NO10的序列，其優選包含SEQ ID NO9的M2多肽的C-末端的19個殘基。
最近的研究表明，從第一個谷氨酸殘基開始的上游N-末端殘基(在上述序列的殘基X5和X6之間)在制備和表達期間被迄今為止還未知的一種或多種蛋白酶切割，或者可以被切割，所述蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶[其活性可以被苯基甲磺酰氟(PMSF)抑制]或金屬蛋白酶[其活性可以被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制]。因此，一些優選實施方案利用了一種或多種19聚體或更短的M2序列，其N-末端殘基是SEQ ID NO9中X6處的谷氨酸。
更優選地，發現通過將嵌合體顆粒的緩沖液加熱到大約50°-大約70℃的溫度，加熱大約1.5-大約3小時，可以使蛋白酶的活性最低，或類似地，使活性消除。通過將顆粒維持在含有蛋白酶抑制量的EDTA(如，大約1-10mM)或相似的掩蔽劑的含水組合物中，也可以使蛋白酶的活性最低，或使活性消除。其它有用的金屬蛋白酶抑制性掩蔽劑(螯合劑)的示例基團包括2，2’-吡啶基、二巰基丙醇、乙二醇-二-(2-氨基乙基)-N，N，N’N”-四乙酸(EGTA)、次氮基四乙酸(NTA)、鄰-菲咯啉、水楊酸、四乙醇胺(TEA)、苯丁抑制素和phosphoramidon。可以使原本純化的顆粒通過大小排阻或相似的柱，然后透析或進行相似的處理，從而從組合物除去掩蔽劑和蛋白酶。也可以通過相似加熱含有掩蔽劑的嵌合體顆粒的含水組合物而處理蛋白酶。
當2或3個M2e序列通過肽鍵連接在一起并順序連接時，存在于天然M2序列17和19位的半胱氨酸殘基中的一個或兩個可以不存在，考慮的N-末端半胱氨酸殘基可以存在于添加的M2序列和HBc序列的N-末端之間。優選地，考慮的N-末端半胱氨酸殘基存在于天然序列17和19位的一個或兩個位置上。半胱氨酸可以存在于2或3個M2序列的每個序列中，存在于N-末端M2序列中(存在于大約-52--54位)，存在于3個序列的中間序列(存在于大約-30或-32)中，或存在于與HBc序列連接的序列(存在于大約-6或-8位)中。當存在2或3個M2序列時，優選的是，一個或兩個半胱氨酸，優選兩個半胱氨酸存在于通過肽鍵與HBc序列連接的M2序列中；即，與HBc序列直接鍵合的M2序列，或在分子的N-末端遠側的M2序列。
通過肽鍵與大約75號殘基連接的結構域II包含大約0-大約60個氨基酸殘基。該結構域包含大約76位-大約85位的HBc序列殘基中的0個(無)，優選至少4個殘基，更優選至少8個到所有10個。結構域II也任選包含構成前述SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的一個或多個重復的大約6-大約48個殘基的序列。當存在時，甲型流感M2多肽序列優選通過肽鍵連接于HBc78和79號殘基之間，并且HBc序列的76-85位全部存在。
下文表A中列舉了用于插入考慮的重組HBc嵌合體的結構域I或II，或插入這兩個結構域的優選的甲型流感M2多肽序列。以甲硫氨酸殘基(M)起始的序列被設計為是用于插入結構域I的N-末端的N-末端序列，而不含N-末端M殘基的序列被設計用于插入結構域II。
表A甲型流感M2蛋白B細胞表位序列 SEQ ID NOSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD 11SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 12SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD 13SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD 14SLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSD 15SLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSD 16SLLTEVETPIRNEWGCRANDSSD 17SLLTEVETPIRNEWGARCNDSSD 18MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 19MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD 20MGISLLTEVETPIRNEWGCRCND-SSDELLGWLWGI 21MSLLTEVETPIRNEWGARANDSSD 22MSLLTEVETPIRNEWGCRANDSSD 23MSLLTEVETPIRNEWGARCNDSSD 24MSLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSD 25MSLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSD 26SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSD 27SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGCRCNDSSD 28SLLTEVETPIRNEWGARANDSSDSLL-TEVETPIRNEWGCRCNDSSD 29SLLTEVETPIRNEWGARANDSSDSLL-TEVETPIRNEWGARANDSSDSLL-TEVETPIRNEWGCRCNDSSD 30EVETPIRNEWGSRCNDSSD 31
EVETPIRNEWGSRCNDSSDEVET-PIRNEWGSRCNDSSD 32EVETPIRNEWGSRCNDSSDEVET-PIRNEWGSRCNDSSDEVE-TPIRNEWGCRCNDSSD 33SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGCRCNDSSD 130SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-TEVETPIRNEWGCRCNDSSD 131X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-X18X19X20X21X22X23X2410X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16-X17X18X19X20X21X22X23X2434X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-X18X19X20X21X22X23X2435X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X249X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X2436X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X2437X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-X16X17X18X19X20X21X22X23X24132SLLTEVETPTRNEWGCRCNDSSD 134SLLTEVETPTRNGWGCRCNDSSD 135SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD 136SLLTEVETPTKNEWECRCNDSSD 137SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD 138SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD 139SLLTEVETLTRNGWECKCRDSSD 140乙型流感蛋白NNATFNYTNVNPISHIR38在SEQ ID NO9的多肽中，殘基X1-X8不存在或存在，并且當存在時，是M2e蛋白序列中天然存在的殘基，分別是甲硫氨酸，絲氨酸，亮氨酸，亮氨酸，蘇氨酸或脯氨酸，谷氨酸，纈氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，前提是當存在一個帶腳標的X殘基時，也存在任何其余的腳標數更大，最大到8的帶腳標的X，X10存在，并且是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸，X11存在，并且是異亮氨酸或蘇氨酸，
X12存在，并且是精氨酸或賴氨酸，X13存在，并且是天冬酰胺或絲氨酸，X14存在，并且是谷氨酸或甘氨酸，殘基X15和X16存在或不存在，當存在時分別是色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，殘基X17和X19存在或不存在，當存在時各自獨立地是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸，殘基X18存在或不存在，當存在時是精氨酸或賴氨酸，并且殘基X20-X24存在或不存在，當存在時是M2蛋白序列中天然存在的殘基，分別是天冬酰胺、甘氨酸或絲氨酸，天冬氨酸或甘氨酸，絲氨酸，絲氨酸，天冬氨酸，前提是當存在一個帶腳標的X殘基時，也存在任何其余的腳標數更小，最小到15的帶腳標的X。
在SEQ ID NO10的相似多肽中，X1-X8不存在或存在，并且當存在時，是報道的M2e蛋白序列中天然存在的殘基；即，分別是甲硫氨酸，絲氨酸，亮氨酸，亮氨酸，蘇氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，纈氨酸，谷氨酸，前提是當存在一個帶腳標的X殘基時，也存在任何其余的腳標數更大，最大到8的帶腳標的X。因此，當X1存在時，X2-X8也都存在。相似地，當X3存在時，X4-X8也都存在，依此類推。另一方面，X8可以存在，而其余腳標數更小的X殘基都不存在。殘基X15和X16存在或不存在，當存在時分別是色氨酸和甘氨酸或谷氨酸。殘基X17和X19存在或不存在，當存在時各自獨立地是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。優選的是X17和X19中的至少一個是半胱氨酸，特別是當M2多肽表位存在于嵌合體分子的N-末端時。更優選的是，當存在多個M2e序列時，存在兩個半胱氨酸，并且所述兩個半胱氨酸存在于距離HBc序列部分的N-末端殘基最近的M2序列中。殘基X18存在或不存在，當存在時是精氨酸或賴氨酸。殘基X20-X24存在或不存在，當存在時是報道的M2蛋白序列中天然存在的殘基；即，分別是天冬酰胺、甘氨酸或絲氨酸，天冬氨酸或甘氨酸，絲氨酸，絲氨酸，天冬氨酸，前提是當存在一個帶腳標的X殘基時，也存在任何其余的腳標數更小，最小到15的帶腳標的X。因此，例如，當存在X23時，X15-X22也都存在。
結構域III包含通過肽鍵在其N-末端連接于大約85號殘基的HBc大約86位到大約135位的序列。
第4個結構域，即結構域IV包含(i)通過肽鍵連接于結構域III的大約135位殘基的136-140位殘基加上HBc氨基酸殘基序列從141-156位的最多16個殘基，(ii)0-3個半胱氨酸殘基，優選一個半胱氨酸殘基，(iii)少于4個精氨酸或賴氨酸殘基，或彼此鄰接的其混合物，和(iv)與HBc的164位或優選156位到C-末端異源的序列中的最多約100個氨基酸殘基，優選最多50個氨基酸殘基，更優選最多約25個殘基。
優選的是，結構域IV包含通過肽鍵與135號殘基連接的136位-149位的HBc序列，即，從第136位的殘基開始，可以連續到149位的HBc序列的最多14個殘基。這樣，如果存在148位的殘基，也存在136位-147位的殘基的序列，或如果存在141位的殘基，也存在136位-140位的殘基的序列。
結構域IV也可以包含0-3個半胱氨酸殘基，并且所述cys殘基存在于嵌合體分子的羧基末端(C-末端)的大約30個殘基內。優選地，存在一個半胱氨酸(Cys)殘基，該Cys優選作為羧基末端(C-末端)殘基存在，除非流感T細胞表位作為結構域IV的一部分存在。當存在所述T細胞表位時，優選的Cys優選存在于HBc嵌合體的C-末端最后5個殘基內。
上文討論的N-末端半胱氨酸的存在，使嵌合體分子形成穩定免疫原性顆粒的能力出乎意料地增強(討論于下文)。因此，涉及的HBc嵌合體免疫原易于形成在收集和初始純化后保持在一起的顆粒，這是通過分析大小排阻層析測量的，其細節討論于下文。
涉及的顆粒在37℃下老化后比缺乏半胱氨酸殘基的相似嵌合體顆粒對分解更穩定。可以用15％的SDS-PAGE凝膠和分散在樣品緩沖液(還原)中的顆粒測量后一種類型的增強的穩定性。用考馬斯亮藍對凝膠染色，然后分析。認為這種類型的穩定性表現出抗水解，而通過大小排阻層析確定的穩定性是起始顆粒形成的穩定性。
額外含有一個或多個C-末端半胱氨酸殘基的顆粒表現出形成中的穩定性增強，并且對老化時的分解也是穩定的，一些既含有N-末端半胱氨酸，也含有C-末端半胱氨酸的顆粒通常在任何一種測量時都顯示比僅僅在N-末端或C-末端添加了半胱氨酸的顆粒更高的穩定性。
結構域IV含有少于4個精氨酸或賴氨酸殘基，或其彼此鄰接的混合物。精氨酸和賴氨酸存在于從天然分子的156位延伸到C-末端的HBc的C-末端區。該區有時稱作分子的“富含魚精蛋白”或“富含精氨酸”的區域，并且結合核酸。涉及的HBc嵌合體分子和顆粒基本不含結合的核酸。
通過比較在280和260nm測量的水溶液中的顆粒的吸光度，即280/260吸光度比值，可以容易確定基本無核酸結合。涉及的顆粒基本不與原始存在于生物細胞中、用于表達蛋白的作為寡聚和/或聚合的DNA和RNA物質的核酸結合。所述核酸在260nm表現出一個吸光度，以及在280nm的相對較低的吸光度，而例如所涉及的嵌合體的蛋白在260nm表現出相對較低的吸光度，在280nm具有較高的吸光度。
因此，含有位于150-183(或150-185)號殘基位置的富含精氨酸的序列的重組表達的HBc顆粒或嵌合體HBc顆粒在280nm的吸光度與260nm的吸光度的比值(280∶260吸光度比值)是大約0.8，而不含天然存在的HBc的富含精氨酸的核酸結合區的顆粒，如含有少于4個精氨酸或賴氨酸或其彼此鄰接的混合物的那些，或具有以HBc殘基140-149位為末端的天然或嵌合序列的那些，280∶260吸光度比值是大約1.2-大約1.6。
本發明的嵌合HBc顆粒基本不結合核酸，并且，280∶260吸光度比值是大約1.2-1.7，更典型是大約1.4-大約1.6。該范圍很大部分是由于存在于特定嵌合HBc顆粒的結構域II和IV中的芳族氨基酸殘基的數目。該范圍部分也是由于涉及的嵌合體的結構域IV中Cys的存在，其存在可以使觀察到的比值減少大約0.1，其原因目前還未知。
涉及的嵌合體HBc顆粒在37℃下水性緩沖液中在大約2周-大約1個月的時間段內比有含有相同的通過肽鍵連接的結構域II、III和IV序列以及除不存在1-3個半胱氨酸殘基[N-末端半胱氨酸殘基]或存在的單個N-末端殘基被諸如丙氨酸殘基的另一殘基取代的、其它方面相同的結構域I序列的HBc嵌合體形成的顆粒更穩定。
因此，例如，在結構域I中含有包含兩個半胱氨酸殘基的甲型流感M2e多肽的顆粒[如ICC-1590顆粒]比N-末端M2變體序列含有代替半胱氨酸的絲氨酸的嵌合體分子組裝成的其它方面相同的顆粒[ICC-1603顆粒]更穩定。類似地，在結構域I含有上述含絲氨酸的流感B細胞表位和在C-末端含有單個半胱氨酸的顆粒[ICC-1605顆粒]比不存在半胱氨酸的其它方面相同的顆粒更穩定，但比含有兩個N-末端半胱氨酸的顆粒、ICC-1590顆粒或含有N-末端和C-末端半胱氨酸的顆粒[ICC-1604顆粒]的穩定性差。
在此指出，由它們構成的顆粒和嵌合體分子也可以互換稱作前綴“ICC”或前綴“CV”后面加上四個數字，或者不帶前綴的四個數字。這樣，上述ICC-1590顆粒也可以稱作CV-1590顆粒，或僅僅稱作1590顆粒。每個名稱具有相同的含義。
涉及的含N-末端半胱氨酸殘基的顆粒通常也以比缺乏N-末端半胱氨酸的嵌合體分子組裝成的顆粒更高的產率制備。
盡管由HBc提供的T細胞輔助在接種后高度有效地增強抗體應答(即，B細胞介導的)以“攜帶”免疫原性序列，HBc不激活流感特異性T細胞，除非是在有限的個體中，對于所述個體，含有B細胞表位的序列也含有T細胞表位。為了幫助確保流感特異性T輔助細胞的激發，除B細胞外，優選將一種或多種流感特異性T輔助表位摻入涉及的免疫原，并且位于免疫原的結構域IV。
大量上述或另一種T細胞表位可以存在于結構域IV中，或可以存在另一種B細胞表位。在優選的實施中，結構域IV具有與HBc異源的序列中的最多大約50個殘基。更優選地，該序列最多大約25個殘基，并且包含T細胞表位。
由于M2由受感染的細胞足量表達，它具有作為流感特異性CTL活性的靶的潛能。細胞外結構域是抗體的可能的附著位點，其可能以類似于治療藥物金剛烷胺的方式，或通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的激活而起作用，使M2的功能固定。
實際上，已經顯示了M2的細胞外結構域含有至少2個獨特的人CTL表位，一個在7-15[Jameson et al.，(1998)J.Virol.，72(11)8682-8689]，另一個在3-11[Gianfrani er al.，(2000)Hum.Immunol.，61(5)438-352]。與CTL相比，通過ADCC和/或DCD進行的抗M2e介導的流感感染細胞的裂解，可能是靶細胞裂解的優選機制，因為與CTL不同，它們不受MHC限制。因此，激發足夠滴度的表現出需要的IgG亞類譜的抗M2抗體的能力和M2e特異性，應該激發跨多種群體的寬范圍的保護。
抗M2的細胞外結構域的抗體具有生物學效應的能力首先由Zebedee和Lamb描述，他們證明了單克隆抗M2抗體14C2使培養中的病毒生長減慢[Zebedee et al，(1988)J Virol，62(8)2762-2772]。在1990年，Treanor和同事證明了相同的單克隆抗體成功抑制小鼠中的甲型流感病毒復制[Treanor et al.，(1990)J.Virol.，64(3)1375-1377]。Palladino等確定了14C2不在體內中和病毒，但確實在體外結合感染的細胞，并且抑制病毒生長；但是，它不能治愈感染[Palladino et al.，(1995)J.Virol.，69(4)2075-2081]。后一篇文章的作者恰當指出了14C2是IgG1亞類抗體，IgG2a和IgG2b在固定補體方面最有效；它們在與NK細胞上的FcγRIII受體結合方面也比IgG1優越。實際上，如下文所示，小鼠中Th1免疫應答的典型的高滴度IgG2a抗體似乎與保護相關。因此，可以提供通過ADCC和/或CDC進行的抗M2e介導的流感感染細胞的裂解的免疫應答是優選的應答。
在對曾經用HBc-M2顆粒免疫過的小鼠進行攻擊后，重復觀察到了記憶性抗M2應答，這表明M2e-HBc顆粒激發M2特異性T細胞。為了對此進行研究，進行了初步研究，以調查M2e肽是否能在體外引起來自免疫小鼠的淋巴細胞的回憶。在用來源于M2的肽HBc p85-100和重組HbcAg引起回憶后，觀察到干擾素γ分泌細胞的數目顯著增加，但來自HBc的p100-120則不能引起該回憶。HbcAg引起的回憶最顯著，這是可以預期的，因為對于BALB/c小鼠，這是含有很多功能性T細胞表位的強效T細胞免疫原[Saito et al.，(2001)Vaccine，20(1-2)125-133]。
與用ICC-1569顆粒免疫相比，所有抗原引起的回憶對于分離自用ICC-1604顆粒免疫的小鼠的淋巴細胞表現得更強。該結果表明，與ICC-1569顆粒相比，ICC-1604可能是更優越的T細胞免疫原。但是，重要的是，注意這些研究的M2回憶抗原是M2e(2-24)，其在第17和19位含有半胱氨酸殘基，并因此僅僅對于ICC-1604顆粒是同源的，對ICC-1569顆粒則不是，因為后者含有代替了兩個半胱氨酸殘基的絲氨酸。
如果第17和/或19位的半胱氨酸殘基是一種或多種T細胞表位的成分，則可以解釋用M2e再刺激的水平對于ICC-1569顆粒免疫的小鼠的比ICC-1604顆粒免疫的小鼠低。但是，含有半胱氨酸殘基的T細胞表位的存在不能解釋用來源于HBc的抗原再刺激的水平降低。
在對M2e-HBc免疫的小鼠進行病毒攻擊后，在抗M2e滴度方面的記憶性應答的觀察結果似乎表明M2e結構域中存在至少一種T輔助細胞表位(2-24位)。
在人體內具有廣泛反應性(HLA-DR1，HLA-DR2，HLA-DRw13)[Brett et al.，(1991)J.Immunol.，147(3)984-991]并且也在BALB/c小鼠中有功能的來源于流感核蛋白(NP 206-229)的表位被考慮用作此處的T細胞表位。已經表達并純化了具有與HBc顆粒的C-末端融合的該表位的顆粒。也考慮其它的流感Th表位，如NP 341-362、NP 297-318和NP 182-205[Brett et al.，(1991)J.Immunol.，147(3)984-991]；這些序列可最終在表達M2e的顆粒的C-末端順序連接。下面提供了這些示例的序列。

一種所涉及的重組HBc嵌合體分子通常以自組裝的顆粒形式存在并且被用于免疫原或疫苗。所述顆粒包含180-240個嵌合體分子，這些分子在存在諸如2-巰基乙醇的二硫化物還原劑和諸如SDS的變性劑的條件下分離到蛋白分子中。各個分子通過蛋白-蛋白相互作用結合在一起成為顆粒，這些相互作用通過二硫鍵的存在而穩定。這些顆粒與在HBV感染的患者中觀察到的顆粒相似，但是這些顆粒是非傳染性的。在多種原核和真核宿主中表達后，各個重組HBc嵌合體分子在宿主中組裝成可以容易從宿主細胞收獲的顆粒。
除了上述N-和C-截短和插入流感M2多肽表位，所涉及的嵌合體分子還可以包括構成HBc結構域I，II，II和IV的氨基酸殘基的保守取代。保守取代如上文所定義。
較少見的是還涉及“非保守”改變，例如用色氨酸取代甘氨酸。類似的次要改變還可以包括氨基酸缺失或插入或包括這兩者。使用本領域眾所周知的計算機程序，例如LASERGENE軟件(DNASTARInc.，Madison，Wis.)可以發現確定那些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而又不會破壞生物學活性的指導。
當存在時，本發明的嵌合體分子的HBc部分[具有除了添加的表位以外的HBc序列或作為限制酶人為構造物的異源殘基的部分]最優選具有圖1所示的亞型ayw的2-149位的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO1)。其次優選的是亞型adw、adw2和adyw的相應的氨基酸殘基序列，這些序列同樣在圖1中示出(SEQ ID NO2、3和4)。其次優選的是在比對的2-149位的土撥鼠和地松鼠的序列，它們是圖1中的最后兩個序列(SEQ ID NO5和6)。正如在其他部分所指出的，可以將來自不同哺乳動物HBc蛋白的不同序列的部分同時用在單個嵌合體上。
當存在時，當本發明的嵌合體分子的HBc部分具有除第2-156位或2-149位的哺乳動物HBc分子以外的序列時，由于進行了一個或多個保守取代，優選的是，與SEQ ID NO1從第2-149位或2-156位相比，不超過10％，更優選不超過5％，最優選不超過3％的氨基酸殘基被取代。因此，涉及的149個HBc殘基的嵌合體最多可以含有大約15或16個，優選大約7或8個與SEQ ID NO1從第2-149位不同的殘基。最優選地，最多大約5個殘基與ayw序列(SEQ ID NO1)的2-149位的殘基不同。當HBc序列在一個或兩個末端被進一步截短時，取代的殘基數目成比例地不同。為了計算的目的，在分子中其它位置的缺失也考慮是保守取代，這樣，例如，如果結構域I具有在133位而不是135位的C-末端，為了計算的目的，假定存在兩個殘基(134和135)。
嵌合體制備一種涉及的嵌合免疫原是使用重組DNA技術中的眾所周知的技術制備的。因此，在編碼HBV的前體序列上添加或缺失編碼特定多肽序列的核酸序列。
涉及的嵌合免疫原通常采用存在于M2序列中的半胱氨酸殘基作為N-末端半胱氨酸。下文討論了用于通過編碼HBc分子的多核苷酸的體外誘變制備所述嵌合體分子的引物。當含有半胱氨酸的M2多肽表位不存在于N-末端時，可以通過采用僅僅編碼M2多肽的含半胱氨酸部分的引物或簡單的N-末端起始序列，如Met-Cys-或Met-Gly-Cys-的體外誘變提供N-末端半胱氨酸。
如前面所指出的，HBc免疫優勢環通常位于完整蛋白從氨基末端(N-末端)開始的大約75-85位。含有甲型流感M2B細胞表位的序列可以位于結構域II的該免疫優勢環序列中。該定位基本消除了HBc免疫原性和HBc環序列的抗原性，而將甲型流感M2B細胞表位呈遞于組裝顆粒中非常具有免疫原性的位置。
兩種公知策略之一對將甲型流感M2B細胞序列置于環序列中需要的位置，如殘基78和79之間特別有用。首先，成功率較低的策略稱作替代，其中編碼環的一部分的DNA被切除，并且用編碼甲型流感M2B細胞序列的DNA替代。第二個策略稱作插入，其中將甲型流感M2B細胞序列插入環中鄰接的殘基之間。
將使用聚合酶鏈反應(PCR)的定點誘變用于一種典型的替代方法中，以便提供一種嵌合HBc DNA序列，該序列編碼一對不同的限制位點，例如EcoRI和SacI，靠近免疫優勢環編碼DNA的每個末端。典型的殘基取代是在76-81號位置上進行的。將所述環編碼部分切除，將每個側翼具有合適的HBc序列殘基的甲型流感M2B細胞表位編碼序列連接到限制位點上，并且將所得到的DNA用于表達HBc嵌合體。例如，有關相似技術的典型應用可以參見Pumpens et al.，(1995)Intervirology，3863-74中的表2。
另外，可以將單個限制位點或兩個限制位點編碼到所述區域，用限制酶切割DNA以便提供“粘”端，將合適的粘端或平端異源DNA片段連接到所述切割區域。被替代到HBc中的這種類型序列的例子可以從以下文獻中找到Schodel et al.，(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.319-325；Schodel et al.，Behring Inst.Mitt.，1997(98)p.114-119和Schodel et al.，J.Exp.Med.，(1994)180(3)p.1037-4，后兩份文獻分別討論了抗約氏瘧原蟲和貝氏瘧原蟲的疫苗的制備。此處通常不使用導致從免疫優勢環凈去除殘基的替代策略。
插入是優選的。在插入方法的一種說明性例子中，利用定點誘變產生兩個彼此鄰接的限制位點，并且位于編碼鄰接的氨基酸殘基，如78和79位殘基的密碼子之間。該技術添加了12個堿基對，這些堿基對編碼位于HBc環中以前鄰接的殘基之間的4個氨基酸殘基(每個限制位點兩個殘基)。
當用限制酶進行切割，連接編碼示例的甲型流感M2序列的DNA，并且表達該DNA，以便形成HBc嵌合體時，發現HBc環氨基酸序列在其N-末端側被由5’限制位點編碼的兩個殘基間斷，在朝向C-末端方向上，隨后是甲型流感M2B細胞表位序列，隨后是另外兩個由3’非限制位點編碼的異源、非環殘基，然后是該環序列的其余部分。可以優選用相同策略將T細胞表位或不是T細胞表位一部分的一個或多個半胱氨酸殘基插入結構域IV。在以下文獻中公開了在82和83號殘基之間使用插入的類似方法Schodel et al.，(1990)F.Brown et al.eds.，Vaccines 90，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.193-198。
例如，將編碼C-末端截短的HBc序列的DNA序列(HBc149)進行工程化，以包含位于78和79號殘基之間的鄰接的EcoRI和SacI位點。用這兩種酶切割該DNA，提供了一種3’末端為EcoRI粘端的編碼HBc 1-78位的片段，而另一種片段具有5’末端SacI粘端，并且編碼79-149位殘基。連接一種具有5′AATT突出端、以及隨后的編碼需要的甲型流感M2B細胞表位和AGCT 3′突出端的合成核酸，從而提供了一種HBc嵌合序列，該序列編碼位于78和79號殘基之間的每一側的側翼各有兩個異源殘基(分別為GI和EL)的B細胞表位，同時，破壞了EcoRI位點，而保留了SacI位點。
可以將相似的策略用于插入含有C-末端半胱氨酸的序列。因此，將EcoRI和HindIII限制位點工程化到HBc DNA序列中的氨基酸殘基149號位置之后。在用EcoRI和HindIII消化之后，將一種具有上述AATT 5′突出端、隨后的T細胞表位編碼序列、終止密碼子和3′AGCT突出端的合成DNA連接到消化過的序列上，以便形成一種編碼HBc1-149號殘基、隨后的兩個異源殘基(GI)、終止密碼子和HindIII位點的序列。
用一種具有SacI限制位點、隨后是一個始于79號殘基位置的編碼HBc的序列的正向引物進行PCR擴增，然后用SacI和HindIII消化，提供了一種編碼HBc79-149號位置的序列，加上兩個添加的殘基和C-末端的T細胞表位。用SacI消化該構建體并且連接，提供了編碼需要的重組HBc嵌合免疫原的完整基因，從N-末端開始，所述免疫原具有HBc 1-78號位置的序列、兩個添加的殘基、含有B細胞表位的甲型流感M2序列、兩個添加的殘基、HBc79-149號位置，兩個添加的殘基、和T細胞表位。
業已發現，優選將兩個異源殘基用于含有B細胞或T細胞表位的異源免疫原性序列的任意一側(側翼)是一件方便的事情。結果，人們還可以在插入的序列的一側或兩側使用0-3個或更多個不是HBc序列一部分的添加的殘基。可以用一種合適的核酸酶(例如S1核酸酶)“消化”插入序列和HBc核酸的一端或兩端，以便提供平端，這些平端可以連接在一起。既不是插入的B細胞或T細胞表位的一部分也不是HBc序列的一部分的添加的異源殘基不被統計在出現在提到的結構域中的殘基數量內。
還發現可以使用眾所周知的合成方法合成需要的重組HBc嵌合核酸的全部或一部分，例如，在U.S.5,656,472中公開了177個堿基對DNA的合成，該DNA編碼煙草的具有59個殘基的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶信號肽。例如，人們可以合成具有平端或“粘端”的結構域I和II，其可以連接到結構域III和IV上，以便提供一種能表達涉及的HBc嵌合體的嵌合體，該嵌合體包括添加在B細胞表位N-末端側的0個殘基，和添加在C-末端側或添加在結構域II/III連接處或添加在某些其他需要位置上的0-3個殘基。
本發明還涉及編碼上述HBc嵌合體分子或該編碼序列的互補序列的核酸序列(片段)。在某些優選實施方案中，所述核酸片段是以分離的和純化的形式存在。
在活的生物中，蛋白或多肽的氨基酸殘基序列通過遺傳密碼直接與編碼該蛋白的基因的脫氧核糖核酸(DNA)序列相關。因此，通過眾所周知的遺傳密碼的簡并性，可以根據需要制備額外的DNAs和相應的RNA序列(核酸)，該序列編碼相同的嵌合體氨基酸殘基序列，但是與以前討論的基因序列有足夠的差異，以至這兩種序列在高嚴格條件下不能雜交，而在中等嚴格條件下能夠雜交。
高嚴格條件可以被定義為包括在大約50-55℃的溫度下在6XSSC中雜交，并且最終的洗滌是在68℃在1-3XSSC中進行。中等嚴格條件包括在大約50℃-大約65℃的溫度下在0.2-0.3M NaCl中雜交，然后在大約50℃-大約55℃在0.2X SSC，0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)中洗滌。
這樣一種核酸序列(DNA序列或RNA序列)，它(1)本身編碼，或其互補序列編碼一種嵌合體分子，它的HBc部分是1-136位殘基(如果存在)是SEQ ID NOS1、2、3、4、5或6的HBc部分和(2)至少能在中等嚴格條件(如上文所述)下與SEQ ID NO43、44、45、46、47或48的DNA序列雜交；和(3)它的與SEQ ID NO43、44、45、46、47或48的DNA序列具有至少80％，更優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少100％同一性的HBc序列被定義為DNA變體序列。正如眾所周知的，諸如所涉及的核酸序列的核酸序列是在操作性連接在合適的啟動子上時在合適的表達系統中表達的，正如在本文的其他部分所討論的。
編碼所涉及嵌合體分子的類似物或類似的核酸(DNA或RNA)也是本發明的一部分。嵌合體類似物核酸序列或其互補的核酸序列編碼一種HBc氨基酸殘基序列，該序列與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6所示1-136號殘基位置的HBc序列部分的同一性至少為80％，更優選至少90％，最優選至少95％。該DNA或RNA在本文中被稱為SEQ IDNO43、44、45、46、47或48的核酸序列“的類似物”或“與其類似”，并且能在中等嚴格雜交條件下與本發明的SEQ ID NO43、44、45、46、47或48的核酸序列或其互補序列雜交。編碼類似序列的核酸在進行適當轉染和表達時也能產生所涉及的嵌合體。
不同的宿主通常優先使用特定的密碼子編碼特定的氨基酸殘基。這種密碼子優先性是眾所周知的，并且可以通過諸如體外誘變的方法改變編碼所需嵌合體序列的DNA序列，以便宿主優先使用的密碼子被用于要表達的酶的特定宿主。另外，還可以使用遺傳密碼的簡并性來編碼SEQ ID NO1、2、3、4、5或6的序列的HBc部分，由此避免了與SEQ ID NosSEQ ID NO43、44、45、46、47或48或其互補序列的明顯的同一性。因此，有用的類似DNA序列，在中等嚴格條件下不一定能與SEQ ID NO43、44、45、46、47或48或互補序列的核苷酸序列雜交，但仍然能提供相關的嵌合體分子。
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還涉及一種重組DNA分子，它包括一種載體，該載體包括用于驅動一種嵌合體在宿主生物細胞中表達的啟動子，該啟動子操作性連接在一種DNA片段上，該DNA片段是一種類似物核酸序列，它所編碼的HBc嵌合體部分的氨基酸殘基序列與SEQ ID NO1、2、3、4、5或6的序列的HBc部分的同一性至少為80％，更優選90％，最優選95％。所述重組DNA分子在宿主細胞中進行適當的轉染和表達時，能提供一種所涉及的嵌合體分子。
業已發現，由于地松鼠HBc的N-末端的30個氨基酸殘基的序列與任何其他HBc序列都不相同，所述序列及其編碼核酸序列及其互補序列不包括在上述同一性范圍內，編碼所述30個殘基序列的核酸部分或其用于雜交測定的互補序列也不包括在內。類似地，在HBc N-和C-末端的一端或兩端截短的序列在同一性計算時不包括在內，為了插入異源表位而除去了免疫優勢環中的殘基的序列也不包括在內。因此，僅包括存在于嵌合體分子中的編碼HBc的堿基或HBc序列殘基，并且與同一性百分比計算中比對的核酸或氨基酸殘基序列進行比較。
本文所公開的基因的編碼序列如SEQ ID NOs43、44、45、46、47和48所示，分離的核酸片段，優選DNA序列、其變體及類似物可以通過體外誘變制備，這種技術是眾所周知的，并且公開于CurrentProtocols In Molecular Biology，Ausabel et al.eds.，John Wiley & Sons(New York1987)p.8.1.1-8.1.6，該編碼序列始于基因的起始ATG密碼子，并且止于或正好位于每一個基因的終止密碼子下游。因此，可以在起始密碼子部位或上游，以及在終止密碼子部位或下游產生工程化需要的限制位點，以便能夠制備、切除并分離其他基因。
正如本領域所公知，只要存在需要的核酸、所列舉的DNA序列(包括起始信號和終止信號)，其他的堿基對通常存在于該片段的任意末端，并且該片段仍然可用于表達該蛋白。當然，其前提是在片段中缺乏操作性連接的抑制表達、表達能消耗表達所需要的酶的另一種產物、表達能消耗需要的由所述需要的酶產生的反應產物的產物、或者以其他方式干擾該DNA片段基因的表達的DNA序列。
因此，只要該DNA片段不含有所述干擾性DNA序列，本發明的DNA片段的長度就可以為大約500-大約15000堿基對。重組DNA分子，特別是表達載體的最大大小在很多程度上是根據方便性決定的，并且載體的大小能夠被宿主細胞所容納，只要在需要時存在復制和表達所需要的所有最小DNA序列。最小載體大小是眾所周知的。長的DNA片段不是優選的，但是可以使用。
編碼上述嵌合體的DNA片段可以通過化學技術合成，例如Matteucci et al.(1981)J.Am.Chem.Soc.，1033185的磷酸三酯方法。當然，通過化學合成所述編碼序列，通過簡單地用合適的堿基取代編碼天然氨基酸殘基序列的堿基可以產生任何需要的修飾。不過，優選包括上述序列的DNA片段。
可以在多種轉化過的宿主系統，通常是宿主細胞中生產(表達)涉及的HBc嵌合體，不過表達也可以在無細胞的體外系統中進行。所述宿主細胞系統包括，但不限于微生物，如用重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達載體轉化過的細菌；用酵母表達載體轉化過的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染過的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒；煙草花葉病毒)或用細菌表達載體(例如Ti質粒)轉化過的植物細胞系統；或適當轉化過的動物細胞系統，如CHO或COS細胞。本發明受所采用的宿主細胞的限制。
含有編碼HBc嵌合體的基因的DNA片段優選是從含有該基因的重組DNA分子(質粒載體)獲得的。能夠指導嵌合基因表達成HBc嵌合體蛋白的載體在本發明中被稱為“表達載體”。
表達載體含有包括啟動子在內的表達控制元件。嵌合體編碼基因操作性連接在表達載體上，以便所述啟動子序列能指導RNA聚合酶的結合，并表達嵌合體編碼基因。可用于表達多肽編碼基因的有Poszkowski et al.(1989)EMBO J.，32719和Odell et al.(1985)Nature，313810所公開的誘導型、病毒的、合成的、組成型的啟動子，以及Chua et al.(1989)Science，244174-181所公開的時間調控的、空間調控的和空間時間調控的啟動子。
一種在諸如大腸桿菌的原核細胞中使用的優選的啟動子是Rec7啟動子，它可以通過外源提供的萘啶酮酸誘導。一種更優選的啟動子存在于質粒載體JHEX25(可以從Promega獲得)中，它可以通過外源提供的異丙基β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)誘導。一種更優選的啟動子tac啟動子存在于質粒載體pKK223-3中，并且也可以通過外源提供的IPTG誘導。用大約25-大約100微摩爾的IPTG進行誘導，能夠使pKK223-3質粒在諸如XL-1、TB1、BL21和BLR的多種大腸桿菌菌株中成功地表達。令人吃驚的是，業已發現大約25-大約50微摩爾IPTG的濃度能夠在2升搖瓶和發酵罐中產生最佳結果。
涉及的嵌合體分子在其它微生物，如，諸如傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌-大腸桿菌雜交體的沙門氏菌，酵母，如啤酒糖酵母或巴斯德畢赤氏酵母中，在哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，通常在單子葉和雙子葉植物細胞，特別是在雙子葉植物儲存器官，如根、種子或果實(其中需要口服疫苗或接種物)，以及通過采用Autographa californica核多角體病毒(AcNPV)或桿狀病毒在昆蟲細胞，如S.Frugiperda細胞或Trichoplusia的細胞中的表達業已在前面提到的專利申請和公開的WO 02/14478 A2中討論。因此，盡管涉及到這些表達方式，但在此處不再進一步討論。
業已開發了多種方法以便通過互補粘端或平端將DNA操作性連接到載體上。例如，可以將互補的均聚物片段添加到將要插入載體DNA中的DNA片段上。然后通過所述互補均聚物的尾之間的氫鍵結合連接所述載體和DNA片段，以便形成重組DNA分子。
另外，正如上文所公開的，可以用含有一個或多個限制性內切核酸酶位點的合成接頭將所述DNA片段連接到所述表達載體上。通過在存在能夠催化平端DNA分子連接的酶，諸如噬菌體T4 DNA連接酶的條件下溫育所述平端DNA片段和大量過量的合成接頭分子，將所述合成接頭連接在平端DNA片段上。
因此，所述反應的產物是在其末端具有合成接頭序列的DNA片段。然后用合適的限制性核酸內切酶切割所述DNA片段，并且連接到業已用一種能產生與所述合成接頭相容的末端的酶切割過的表達載體中。含有多種限制性內切核酸酶位點的合成接頭可以從多種來源購買，包括New England BioLabs，Beverly，MA。還可以通過PCR技術獲得需要的DNA片段，其中，正向和反向引物含有可以在擴增之后切割的理想的限制位點，以便可以將該基因插入所述載體。或者，可以將PCR產物直接克隆到包括T-突出端的載體上(Promega Corp.，A3600，Madison，WI)，正如本領域所熟知的。
所表達的嵌合蛋白在宿主細胞內自組裝成顆粒，所述宿主細胞是單細胞或多細胞宿主的細胞。用標準方法收獲含有顆粒的細胞，用弗氏壓碎器、溶菌酶、超聲儀、珠破碎器或微流化器(MicrofluidicsInternational Corp.，Newton MA)裂解細胞。在澄清裂解物之后，用45％的硫酸銨使顆粒沉淀，重新懸浮在20mM磷酸鈉，pH6.8中，并且用相同的緩沖液透析。通過短時間離心將透析過的材料澄清，并且用SepharoseCL-4B對上清液進行凝膠過濾層析。鑒定含有顆粒的級份，進行羥基磷灰石層析，并且再次用硫酸銨沉淀然后再次懸浮，透析，無菌過濾，并且在-70℃下保存。
接種物和疫苗將優選為顆粒形式的前述重組HBc嵌合體免疫原以免疫原性有效量溶解或分散于藥學可接受的媒介物組合物中形成接種物或疫苗，該組合物優選是含水的。在給需要免疫或需要誘導抗體的諸如哺乳動物(例如，小鼠、犬、山羊、綿羊、馬、牛、猴、猿或人)或禽類(例如，雞、火雞、鴨或鵝)的宿主動物施用時，接種物能誘導與免疫原中存在的甲型流感M2 B細胞表位進行免疫反應的抗體。在疫苗中，也確信那些誘導的抗體在體內與病毒或病毒感染的細胞進行免疫反應(結合)，并且保護宿主免受致病流感病毒的感染。在一種動物中作為疫苗的組合物可以是另一宿主的接種物，在沒有被甲型流感感染的第二宿主中誘導抗體。
用于每一次免疫的重組HBc嵌合體免疫原的量被稱為免疫原性有效量，并且可以有很大的不同，特別是根據所述重組HBc嵌合免疫原、免疫的動物宿主和佐劑在所述疫苗中的存在而有所不同，正如下文所討論的。如上文所述，免疫有效量的疫苗和接種物分別能提供保護或抗體活性。
疫苗或接種物通常含有每次接種大約1微克-大約1毫克濃度的重組HBc嵌合體免疫原(單位劑量)，優選大約10微克-大約50微克/單位劑量。在小鼠中的免疫通常含有10或20μg嵌合體顆粒。
與本發明的疫苗或接種物相關的術語“單位劑量”表示適合作為動物的單元劑量的物理學上分離的單位，每個單位含有計算出來的預定數量的活性物質，用于與需要的稀釋劑，即載體或媒介物一起單獨或共同產生需要的免疫效果。
與本發明的疫苗或接種物相關的術語“單位劑量”表示適合作為動物的單元劑量的物理學上分離的單位，每個單位含有計算出來的預定數量的活性物質，用于單獨或與需要的稀釋劑，即載體或媒介物一起共同產生需要的免疫原性作用。可以使用單個單位劑量或多個單位劑量以提供免疫原性有效量的重組HBc嵌合體免疫原顆粒。
疫苗或接種物通常是用回收的重組HBc嵌合體免疫原顆粒制備的，包括將所述顆粒分散在諸如水、鹽水、磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)、乙酸緩沖的鹽溶液(ABS)、或Ringer′s溶液等的生理學可耐受的(可接受的)稀釋媒介物中，以便形成含水組合物。所述稀釋媒介物還可以包括含油物質，如下文所討論的花生油、角鯊烷或角鯊烯。
免疫活性成分通常與藥學可接受的并且與所述活性成分相容的賦形劑混合。例如，合適的賦形劑包括水、鹽水、葡萄糖、甘油、或乙醇等及其組合。另外，如果需要，接種物或疫苗可以含有能增強該組合物的免疫效果的微量輔助物質，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑。
涉及的疫苗或接種物有利地還包括佐劑。適用于本發明的疫苗和接種物的佐劑包括能增強針對所述嵌合體的B細胞表位的抗體應答的佐劑，以及能增強細胞介導的針對所述嵌合體中所含的T細胞表位的應答的佐劑。佐劑是本領域公知的(例如，參見Vaccine Design-TheSubunit and Adjuvant Approach，1995，PharmaceuticalBiotechnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，和Newman，M.J.，PlenumPress，New York和London，ISBN 0-306-44867-X)。
示例的佐劑包括不能用于人的完全弗氏佐劑(CFA)，不完全弗氏佐劑(IFA)、角鯊烯、角鯊烷、明礬[例如，AlhydrogelTM(Superfos，Denmark)]，這些材料是本領域所公知，并且從若干來源購買。
可以與本發明的免疫原一起使用的優選佐劑包括鋁鹽或鈣鹽(例如，氫氧化物或磷酸鹽)。用于本發明特別優選的佐劑是諸如AlhydrogelTM的氫氧化鋁凝膠。對于氫氧化鋁凝膠(明礬)來說，將嵌合蛋白與該佐劑混合，以便每劑中存在大約50-大約800微克的鋁，優選存在大約400-大約600微克的鋁。磷酸鈣納米顆粒(CAP)是正在由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)開發的佐劑。感興趣的免疫原可以包被于顆粒外，或包囊在內部[He et al.(Nov.2000)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6)899-903]。
用于本發明免疫原的另一種特別優選的佐劑是乳液。所涉及的乳液可以是水包油乳液或油包水乳液。除了所述免疫原性嵌合蛋白之外，所述乳液包括眾所周知的諸如角鯊烯、角鯊烷、或花生油之類的油相，以及分散劑。優選非離子型分散劑，并且，所述材料包括山梨聚糖和二縮甘露醇的單和二-C12-C24脂肪酸酯，如山梨聚糖單硬脂酸酯，山梨聚糖單油酸酯和二縮甘露醇單油酸酯。含有免疫原的乳液以乳液形式施用。
所述乳液優選是油包水乳液，該乳液包括在水相中與所述嵌合蛋白顆粒乳化的角鯊烯、甘油和表面活性劑，如二縮甘露醇單油酸酯(ArlacelTMA)，并任選含有角鯊烷。油相優選包含大約0.1％-大約10％的疫苗，更優選大約0.2％-大約1％。油相的替代成分包括α-生育酚、混合鏈甘油二酯和甘油三酯，以及山梨聚糖酯。所述乳液公知的例子包括MontanideTMISA-720，和MontanideTMISA 703(Seppic，Castres，France)，這兩種乳液都被認為含有角鯊烯和角鯊烷，在每一種乳液中都以角鯊烯為主，但在MontanideTMISA-703中所占比重較小。最優選的是使用MontanideTMISA 720，并且使用7∶3(w/w)的油與水的比例。其他優選的水包油型乳液佐劑包括公開于WO 95/17210和EP 0 399 843中的佐劑。
本發明還可以使用小分子佐劑。可用于本發明的一種類型的小分子佐劑是公開于美國專利NO.4,539,205，No.4,643,992，No.5,011,828和No.5,093,3187中的7-取代的8-氧-或8-硫-鳥苷衍生物，以上專利內容被收作本文的參考。在上述材料中，7-烯丙基-8-氧鳥苷(loxoribine)是特別優選的。業已證實所述分子在誘導抗原-(免疫原)特異性反應方面特別有效。
優選使用的佐劑包括單磷脂酰脂質A(MPL)，3-脫酰基單磷脂酰脂質A(3D-MPL)，這是由西雅圖的Corixa公司(以前是RibiImmunochem，Hamilton，Montana)生產的公知的佐劑。該佐劑包含三種從細菌提取的成分單磷脂酰脂質A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)，其溶于2％角鯊烯/Tween80乳液中。可以通過GB 2122204B中教導的方法制備該乳液。一種優選形式的3-脫氧-酰化單磷酰脂質A是乳液形式的，具有直徑小于0.2微米的小粒度(EP 0 689 454 B1)。
最優選的是一種結構上與MPL佐劑相關的化合物，稱作氨基烷基葡糖酰胺磷酸酯(AGPs)，如可以從Corixa公司買到的名稱為RC-529TM佐劑{2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基氨基]-乙基-2-脫氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧四-癸酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基-氨基]-p-D-吡喃葡糖苷四乙銨鹽}的那些。RC-529佐劑存在于商品名為RC-529SE的角鯊烯乳液中和商品名為RC-529AF的含水制劑中，可以從Corixa公司購買(參見美國專利No.6,355,257和No.6,303,347；US6113918；和美國公開No.03-0092643)。
進一步涉及的佐劑包括含有一次或多次出現的CpG核苷酸基序(加上側翼序列)的合成寡核苷酸佐劑，可以從Coley PharmaceuticalGroup購買。可以從Aquila Biopharmaceuticals，Inc.購買的稱作QS21的佐劑是源于南美樹種Quillaja Saponaria Molina的樹皮的具有佐劑活性的免疫學活性皂苷級份(例如QuilTMA)，在U.S.5,057,540中公開了其制備方法。也公開了QuilTMA的衍生物，如QS21(QuilTMA的一種HPLC純化的級份衍生物，也稱作QA21)，以及其它級份，如QA17。Quillaja Saponaria Molina皂苷的半合成和合成衍生物也是有用的，如描述于美國專利No.5,977,081和No.6,080,725中的那些。可以從Chiron公司購買的稱作MF59的佐劑描述于美國專利No.5,709,879和No.6,086,901。
也涉及胞壁酰二肽佐劑，包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，被稱為正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(CGP)1983A，被稱為MTP-PE)。所謂的胞壁酰二肽類似物描述于美國專利No.4,767,842。
優選的佐劑混合物包括3D-MPL和QS21的組合(EP 0 671 948B1)、含有3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95/17210、PCT/EP98/05714)、與其他載體一起制劑化的3D-MPL(EP 0 689 454B1)、在含有膽甾醇的脂質體中制劑化的QS21(WO 96/33739)、或免疫刺激性寡核苷酸(WO 96/02555)。也可以使用獲自SKB(現在是Glaxo-SmithKline)的佐劑SBAS2(現在是ASO2)，其中含有水包油乳液中的QS21和MPL。其他佐劑包括公開于WO 99/52549中的佐劑，和聚氧乙烯醚的非顆粒懸浮液(英國專利申請號9807805.8)。
特別優選的是使用含有一種或多種toll樣受體-4(TLR-4)激動劑的佐劑，如MPL佐劑或結構上相關的化合物，如RC-529TM佐劑或脂質A模擬物，所述佐劑可以單獨使用，或與TLR-9激動劑一起使用，所述TLR-9激動劑如含有CpG基序的未甲基化的寡脫氧核苷酸。這些佐劑與涉及的含有免疫原性HBc的顆粒混合或與所述免疫原化學連接時，增強產生γ的CD 8+、CD 4+T細胞和細胞毒性淋巴細胞的生成。所述佐劑混合物中也可以存在明礬。初始的結果表明，明礬增強了有利于IgG1型抗體生成的Th2免疫應答，而RC-529型佐劑有利于Th1免疫應答，該免疫應答有利于產生IgG2a和IgG2b抗體，當T細胞免疫原存在時，RC-529型佐劑有利于T細胞應答，如同HBc顆粒包含免疫原的情況。
最優選的佐劑混合物包含穩定的油包水乳液，其中進一步含有氨基烷基葡糖胺磷酸酯，如美國專利No.6,113,918中描述的那些。在氨基烷基葡糖胺磷酸酯中，稱作RC-529{(2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基氨基]-乙基-2-脫氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧-四癸酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基氧四-癸酰基氨基]-p-D-吡喃葡糖苷四乙銨鹽)}的分子是最優選的。優選的油包水乳液描述于WO 9956776。
以佐劑量使用佐劑，佐劑量可以根據所述佐劑、宿主動物和重組HBc嵌合體免疫原而改變。典型的用量可以在每次接種大約1微克-大約1毫克之間變化。本領域技術人員了解的是，可以方便地確定合適的濃度或用量。
接種物和疫苗通常是通過注射以腸胃外方式施用的，例如皮下注射或肌內注射。適合其他施用模式的其他制劑包括栓劑，以及在某些場合下為口服制劑或鼻噴霧。對于栓劑來說，可以包括傳統粘合劑和載體，例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；所述栓劑可以用含有0.5％-10％，優選1-2％的活性成分的混合物制成。口服制劑包括常用的賦形劑，例如藥物級甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂等。
接種物或疫苗組合物采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放制劑或粉末形式并且含有免疫原性有效量的HBc嵌合體，優選顆粒形式，作為活性成分。在一種典型組合物中，免疫有效量的優選HBc嵌合體顆粒為每劑大約1微克-大約1毫克活性成分，更優選每劑大約5微克-大約50微克，正如上文所公開的。
疫苗或接種物通常制劑化以用于腸胃外施用。典型的接種是通過皮下(SC)、肌內(IM)、靜脈內(IV)、腹膜內(IP)或皮內(ID)注射進行的。
HBc嵌合體顆粒和HBc嵌合體顆粒綴合物可以制劑化為中性或鹽形式的疫苗。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白或半抗原的游離氨基一起形成)，并且是與無機酸，如鹽酸或磷酸，或諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有機酸一起形成的。與游離羧基形成的鹽還可以由諸如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵的無機堿衍生，以及由諸如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸和普魯卡因等的有機堿衍生。
所述接種物或疫苗是以與劑量制劑相容的形式，以及治療和免疫有效(抗體誘導量或保護量等)的量施用的。要施用的量取決于接受治療的對象，所述對象免疫系統合成抗體的能力，以及需要保護的程度。需要施用的活性成分的確切量取決于執業醫生的判斷，并且對每一個個體來說有所不同。不過，合適的劑量范圍是每個個體幾百微克的數量級的活性成分。最初施用和加強接種的合適方案也是可以變化的，不過通常在首次施用之后間隔一定時間(數周或數月)再進行隨后的注射或以其他方式施用。
一旦進行了免疫，就將宿主動物維持一段足以由所述重組HBc嵌合體免疫原誘導產生足夠滴度的與M2蛋白結合的抗體的時間。用于產生抗M2抗體的維持時間通常持續大約3周-大約12周時間，并且可以包括第2次加強免疫施用所述疫苗。如果必要，還可以在首次免疫之后數周-5年內進行第3次接種。特別考慮的是，一旦達到了保護性抗體滴度水平，就可以以大約1-大約5年的間隔定期加強免疫，以便優選維持在該抗體滴度水平上或接近該抗體滴度水平上。
業已發現，可以用眾所周知的技術從宿主的血液中分離所誘導的抗體，然后重配成用于被動免疫的第二種疫苗，這種技術同樣是眾所周知的。類似技術可用于人類的γ-球蛋白免疫。例如，可以在硫酸銨水溶液中(通常為40-50％的飽和度)沉淀來自一個或多個免疫宿主的抗血清，并且通過層析方法純化沉淀的抗體，例如通過親和層析純化，其中，將M2多肽用作固定在層析柱上的抗原。
接種物是與疫苗基本相同的制備物，但是用于需要誘導針對流感的抗體，但不需要預防流感的宿主動物中。
盡管沒有進一步的闡述，但認為本領域技術人員采用前面的說明書和下文的詳細實施例，可以在最完全的程度利用本發明。因此，下面的優選特定實施方案應該解釋為僅僅是說性的，不以任何方式限定公開的其它內容。
實施例1制備含有B細胞表位的嵌合體A.制備質粒載體pKK223-3N，即pKK223-3的一種修飾形式通過建立一個獨特的NcoI限制位點修飾質粒載體pKK223-3(Pharmacia)，以便能夠以NcoI-HindIII限制片段形式插入HBc基因，然后在大腸桿菌宿主細胞中表達。為了修飾pKK223-3質粒載體，使用PCR引物pKK223-3/433-452-F和pKK223-NcoI-mod-R，并且用pKK223-3作模板制備一種新的SphI-HindIII片段。
用限制酶SphI和HindIII切割該PCR片段，以便得到467bp的片段，然后將該片段連接到pKK223-3載體的4106bp片段上，以便有效取代原有的480bp SphI-HindIII片段。因此，所得到的質粒(pKK223-3N；4573bp)比親本質粒短了13bp，并且含有位于所導入的NcoI位點上游的修飾過的核苷酸序列(參見圖2，其中，虛線表示缺少的堿基)。在圖2中示出了質粒pKK223-3N中的限制位點，對pKK223-3親本質粒進行的核苷酸改變通過下劃線表示，如下文所示。
pKK223-3/433-452-F GGTGCATGCAAGGAGATG SEQ ID NO49pKK223-NcoI-mod-RGCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTCSEQ ID NO50B.V2、V16和V8克隆載體的制備通過PCR構建能夠接受定向插入免疫優勢環區的合成dsDNA片段的修飾過的HBc149(V2和V16)基因或HBc183(V8)基因。(接受D78和P79之間的插入片段并且截短到V149的的質粒命名為V2，在V149后有一個額外的半胱氨酸的相同質粒命名為V16，接受D78和P79之間的插入片段并且在C183終止的質粒稱作V8)。用兩個PCR引物對分兩半擴增HBc149和HBc183基因，其中的一個引物對擴增氨基末端，而另一個引物對擴增羧基末端。對于V2，PCR反應產物是249bp(N-末端)和243bp(C-末端)片段；對于V16，產物是249bp(N-末端)和246bp(C-末端)片段；對于V8，產物是249bp(N-末端)和349bp(C-末端)片段。
用NcoI和EcoRI消化所制備的N-末端片段，并且用EcoRI和HindIII消化C-末端片段。然后通過共同的EcoRI突出端將V2、V16和V8片段對連接在一起。然后將所得到的NcoI-HindIII片段連接到pKK223-3N載體中，該載體業已通過用NcoI和HindIII消化進行過制備。
為了將B細胞表位插入V2、V16和V8質粒，用EcoRI和SacI限制酶消化合適的質粒。然后插入含有5′EcoRI和3′SacI突出端的合成的dsDNA片段。在所有情況下，即，V2、V16和V8中，在所插入的B細胞表位側翼是甘氨酸-異亮氨酸(EcoRI)和谷氨酸-亮氨酸(SacI)氨基酸對。在下面的引物中在插入的限制位點下面加下劃線。
V2HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO51HBc-D78/EcoRI-R5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCACSEQ ID NO52HBc-P79/EcoRI-SacI-F5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAGSEQ ID NO53HBc149/HindIII-R5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO54V16HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO51HBc-D78/EcoRI-R5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCACSEQ ID NO52HBc-P79/EcoRI-SacI-F5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAGSEQ ID NO53
HBc149+C/HindIII-R5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO55V8HBc149/NcoI-F5′-GGGCCATGGACATCGACCCTTASEQ ID NO51HBc-D78/EcoRI-R5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC SEQ ID NO52HBc-P79/EcoRI-SacI-F5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAGSEQ ID NO53HBc183/HindIII-R5’-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG SEQ ID NO56C.V34和V55克隆載體的制備通過PCR構建能夠接受定向插入N-末端區，前核心序列LGWLWG5’的合成dsDNA片段的修飾過的HBc149基因。(編碼終止于V149的HBc序列的質粒命名為V34，而編碼具有V149 C-末端的額外半胱氨酸的HBc序列的質粒命名為V55)。用兩個PCR引物對分兩半擴增HBc149基因，其中的一個引物對擴增氨基末端，而另一個引物對擴增羧基末端。對于V34，PCR反應產物是293bp(N-末端)和484bp(C-末端)片段；對于V55，采用了相同的N-末端片段，制備了490bp C-末端片段。
用NcoI和SacI消化通過PCR制備的N-末端片段，并且用SacI和HindIII消化C-末端片段。然后通過共同的SacI突出端將V34和V55片段對連接在一起。然后將所得到的NcoI-HindIII片段連接到pKK223-3N載體中，該載體業已通過用NcoI和HindIII消化進行過制備。
通過前面對V2、V16和V8克隆載體描述的相同程序完成含B細胞表位的插入。在下面的寡核苷酸引物中在限制位點下面加下劃線。
V34/V55pKK-BamHI-F5’-GCGGGATCCGGAGCTTATCGA SEQ ID NO57HBc-NcoI/EcoRI/SacI-R5’-GCGGAGCTCTTTTTGAATTCCCATGGTTTTTTCCTCCTTATSEQ ID NO58PreC-SacI-HBc-F5’-GCGGAGCTCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATTGACATCGACCCTTATAAAGSEQ ID NO59V34HBc149/HindIII-R5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO54V55HBc149+C/HindIII-R5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO55D.V47、V48和V54克隆載體的制備通過PCR構建能夠接受定向插入氨基酸殘基I3和D4之間的N-末端區的合成dsDNA片段的修飾過的HBc149和HBc183基因。(編碼終止于V149的HBc嵌合體的質粒命名為V47，編碼具有位于V149 C-末端的額外半胱氨酸的HBc嵌合體的質粒命名為V54，編碼終止于C183的HBc嵌合體的質粒命名為V48)。對于V47、V48和V54，用PCR引物對從模板HBc149擴增氨基末端片段，包括HBc基因前的序列。得到的PCR片段具有190bp。對于V47的C-末端片段，用PCR引物對擴增HBc基因，得到一個469bp片段；對于V54，C-末端片段是475bp。對于V48的C-末端，用PCR引物對擴增HBc183基因，得到一個574bp片段。
用于此處的克隆程序與前面對克隆載體V43和V55的描述相同。
為了將異源序列插入V47、V48和V54質粒，首先用NcoI和SacI限制酶消化質粒。然后插入含有5′AflIII和3′SacI突出端的合成dsDNA片段(注意，限制酶AflIII和NcoI留下了相容突出端)。在所有情況下，即V47、V48和V54中，HBc殘基D2和I3都缺失，以便異源免疫原性序列直接位于殘基M1后；由SacI限制位點編碼的谷氨酸-亮氨酸(EL)氨基酸對位于插入的表位后。在下面的寡核苷酸引物中在限制位點下面加下劃線。
V47/V48/V54pKK(167-150)-F5’-GCATAATTCGTGTCGCTC SEQ ID NO60HBc-I3/EcoRI-R5’-GCGGAATTCCGATGTCCATGGTTTTTTCCT SEQ ID NO61HBc-EcoRI/SacI/D4-F5’-GCGGAATTCAAAAAGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGGASEQ ID NO62V47HBc149/HindIII-R5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
SEQ IDNO54V54HBc149+C/HindIII-R5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO55V48HBc183/HindIII-R5’-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGSEQ ID NO56E.V7克隆載體的制備為了能夠將T細胞表位融合在HBc嵌合體的C-末端，構建了一種新的載體V7。將獨特的EcoRI和SacI限制位點插入149號纈氨酸和HindIII位點之間，以便將合成的dsDNAs定向插入EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位點。使用下面的PCR引物對擴增在氨基末端具有NcoI限制位點，并且在羧基末端具有EcoRI、SacI和HindIII位點的HBc149基因。用NcoI/HindIII消化PCR反應的產物(479bp)，并且克隆到pKK223-3N中，以便形成V7。
為了插入T細胞表位，用EcoRI/HindIII(或EcoRI-SacI)消化質粒(V7)，將具有EcoRI/HindIII(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段連接到V7中。對于所有V7構建體來說，天然HBc的最后一個氨基酸(149號纈氨酸)和插入的T細胞表位的第一個氨基酸由形成EcoRI限制位點的核苷酸編碼的甘氨酸-異亮氨酸二肽序列隔開。對于插入EcoRI/SacI位點的表位來說，由于有SacI位點，在T細胞表位之后，在終止密碼子之前還存在額外的谷氨酸-亮氨酸殘基。同樣在所示出的限制位點下面加下劃線。
HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO51
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R5′-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCGSEQ ID NO63F.合成用于表達部分截短的顆粒的表達載體為了制備用于截短的HBc顆粒的表達質粒，將單個氨基酸末端寡核苷酸PCR引物(HBc149/NcoI-F)與獨特的C-末端引物一起使用。例如，為了制備HBc156(E.cR)表達質粒，使用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156(E.cR)-H3-R。為了制備HBc156(E.cR)+C表達質粒，使用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156C(E.cR)-H3-R。除了截短顆粒，并且在某些情況下摻入C-末端半胱氨酸殘基，也使用了對于在大腸桿菌中表達來說最優的密碼子。為了順序替代天然HBc中存在的罕見精氨酸密碼子，首先合成HBc156基因，然后用作HBc163構建體的模板；然后將HBc163構建體用作HBc171構建體的模板。下文示出了所有引物的序列。用限制酶NcoI和HindIII切割所有PCR產物，克隆到表達載體pKK223-3N中，該載體已經用相同的酶進行過切割。
HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO51HBc156(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGGSEQ ID NO64HBc156C(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG SEQ ID NO65HBc163(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGC
GGCCTCG SEQ ID NO66HBc163C(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCGSEQ ID NO67HBc171(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT SEQ ID NO68HBc171C(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGTSEQ ID NO69

實施例2制備含有甲型流感M2多肽序列的嵌合體A.將甲型流感M2N-末端結構域插入V2、V7、V8、V16、V34、V47、V48、V54和V55克隆載體對于V2、V7、V8、V16、V34和V55構建體，將編碼M2e-序列(甲型流感M2蛋白的2-24號殘基；；SEQ ID NO9)的合成dsDNA片段插入EcoRI/SacI限制位點，而對于V47、V48和V54構建體，將相同M2蛋白的1-24號殘基插入NcoI/SacI限制位點。在等摩爾濃度下混合互補的單鏈DNA寡核苷酸，加熱到95℃5分鐘，然后以-1℃/分鐘的速度冷卻到室溫，從而制備合成dsDNA片段。在TE緩沖液中進行退火反應。下文示出了雙鏈DNAs，上面是編碼的表位序列。
V2/V7/V8/V16/V34/V55M2(2-24)I S L L T E V E T P I R N E W G C RAATTAGCCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATCCGTAACGAATGGGGCTGCCGTCGGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAGGCATTGCTTACCCCGACGGCC N D S S D E L SEQ ID NO70CTGTAATGATTCTTCCGACGAGCT SEQ ID NO71GACATTACTAAGAAGGCTGC SEQ ID NO72V47/V48/V54M2(1-24)M S L L T E V E T P I R N E W G C RCATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGAAGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCTC N D S S D E L SEQ ID NO73TGTAACGATTCAAGTGATGAGCT SEQ ID NO74ACATTGCTAAGTTCACTAC SEQ ID NO75B.將各個半胱氨酸突變的甲型流感M2N-末端結構域[M2(1-24/C17S)、M2(1-24/C19S)]插入V47表達載體下文示出了編碼M2蛋白的1-24號殘基的退火的DNA片段，所述殘基中第17或19位的半胱氨酸突變為絲氨酸。按照上文A部分所述，將它們插入V47的NcoI/SacI限制位點。
V47M2(1-24/C17S)M S L L T E V E T P I R N E W G S RCATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGAAGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCAGATCTC N D S S D E L SEQ ID NO76TGTAACGATTCAAGTGATGAGCT SEQ ID NO77ACATTGCTAAGTTCACTAC SEQ ID NO78M2(1-24/C19S)M S L L T E V E T P I R N E W G C RCATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGAAGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCTS N D S S D E L SEQ ID NO79TCGAACGATTCAAGTGATGAGCT SEQ ID NO80AGCTTGCTAAGTTCACTAC SEQ ID NO81C.將半胱氨酸突變的甲型流感M2 N-末端結構域[M2(2-24/C17S，C19S)]插入表達載體V8、V16、V47、V48和V54對于V8和V16構建體，將具有兩個半胱氨酸到絲氨酸的突變，并且編碼M2e免疫原性序列(甲型流感M2蛋白的1-24號殘基)的合成dsDNA片段插入EcoRI/SacI限制位點，而對于V47、V48和V54構建體，將相同序列的1-24號殘基插入NcoI/SacI位點。按照上文A部分的描述制備合成dsDNA。
V8，V16M2(2-24/C17S，C19S)I S L L T E V E T P I R N E W G S RAATTTCTCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGCAGAGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAAGCATTGCTTACCCCATCGGCGS N D S S D E LSEQ ID NO82TCTAATGATAGCTCTGACGAGCTSEQ ID NO83AGATTACTATCGAGACTGCSEQ ID NO84M2(1-24/C17S，C19S)M S L L T E V E T P I R N E W G S RCATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGAAGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCAGATCTS N D S S D E L SEQ ID NO85TCGAACGATTCAAGTGATGAGCT SEQ ID NO86AGCTTGCTAAGTTCACTAC SEQ ID NO87D.將額外拷貝的甲型流感M2結構域插入表達載體V54.M2(1-24)的N-末端的N-末端將一個額外拷貝的天然M2序列[M2(1-24)]或突變M2序列[M2(1-24/C17S，C19S)克隆到存在的M2(1-24)序列的N-末端。在構建這些克隆時，除去了原始的甲硫氨酸，使得添加的拷貝僅僅提供一個起始甲硫氨酸。用PCR制備兩個片段的構建體。為了制備含有兩個天然M2拷貝[M2(1-24)/V54.M2(2-24)]的克隆，用模板V54.M2(1-24)擴增第一個N-末端片段，該片段將XhoI位點(因此，氨基酸亮氨酸，后面是谷氨酸)插入到M2序列的D24后(得到的片段是353bp)，然后是C-末端片段，它將XhoI位點插入M2序列的S2的N-末端，從而除去甲硫氨酸(得到的片段是538bp)。為了制備含有位于天然拷貝的M2[M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)])之前的突變的克隆，用模板V54.M2(1-24/C17S，C19S)制備N-末端片段，而C-末端片段與上文所述相同(得到的片段大小也是相同的)。
用BamHI和XhoI消化制備的N-末端片段，用XhoI和HindIII消化C-末端片段。然后在共有的XhoI突出端將片段對連接在一起。然后將得到的BamHI-HindIII片段連接到pKK223-3N載體中，該載體是通過用BamHI和HindIII消化而制備的。
將兩個額外拷貝的突變M2序列克隆到存在的M2(2-24)序列的N-末端。仍然僅僅在基因的第1號位置保留了一個起始甲硫氨酸，以產生構建體M2(1-24/C17S，C19S/M2(2-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)。同樣，產生了兩個PCR片段的克隆。用模板V54.M2(1-24/C17S，C19S)產生N-末端片段，該片段將PstI位點(因此，氨基酸亮氨酸，后面是谷氨酸)插入到突變M2序列的殘基D24后(得到的片段是353bp)。用上文所述模板M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)產生C-末端片段，該片段將PstI位點插入突變M2序列的S2的N-末端，從而除去了甲硫氨酸(得到的片段是613bp)。
用BamHI和PstI消化制備的N-末端片段，用PstI和HindIII消化C-末端片段。然后在共有的PstI突出端將片段對連接在一起。然后將得到的BamHI-HindIII片段連接到pKK223-3N載體中，該載體已經通過用BamHI和HindIII消化而進行了制備。
M2(1-24)/V54.M2(2-24)；M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)pKK-BamHI-F5’-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG SEQ ID NO88M2-D24/XhoI-R5’-GCGCTCGAGATCACTTGAATCGTT SEQ ID NO89M2-XhoI/S2-F5’-GCGCTCGAGAGCTTATTGACCGAAGTTGAAACCSEQ ID NO90HRc149+C/HindIII-R
5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO55M2(1-24/C17S，C19S)/M2(2-24/C17S，C19S)/V54.M2(2-24)pKK-BamHI-F5’-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG SEQ ID NO57M2-D24/PstI-R5’-GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT SEQ ID NO91M2-PstI/S2-F5’-GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAGSEQ ID NO92HBc149+C/HindIII-R5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO55E.構建天然M2-HBc的截短形式將含有183個殘基的全長HBc序列的初始M2-HBc構建體[Neirynck et al.，(October 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163WO99/07839]截短到V149，將整個基因轉移到pKK223-3表達載體中。為此，將Gent大學提供的質粒3453用作PCR反應的模板，該反應產生523bp的產物。用限制酶AflIII和HindIII消化該產物，然后連接到pKK223-3N載體中，該載體已經通過用NcoI和HindIII消化而進行了制備。
AflIII-M2-F5’-CGCGACATGTCTCTGCTGACCG SEQ ID NO93HBc149-HindIII-R5’-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO54

實施例3測定程序A.抗原性1.顆粒ELISA用包被緩沖液(50mM碳酸氫鈉，pH9.6)將純化的顆粒稀釋到10μg/mL的濃度，并且包被到ELISA條或板的孔中(50μL/孔)。在室溫下將所述ELISA條溫育過夜(大約18小時)。第二天上午用ELISA洗滌緩沖液[磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)，pH7.4，0.05％Tween-20]洗滌所述孔，并且用溶解在PBS中的3％BSA封閉1小時(75μL/孔)。干燥ELISA條，并且在-20℃下保存待用。
為了測定顆粒的抗原性，用溶解在PBS中的1％BSA稀釋抗血清，并且以50微升/孔的用量添加到抗原包被的ELISA孔中。溫育血清1小時，用ELISA洗滌緩沖液(上文所述)洗滌，并且用抗小鼠(IgG)-HRP(The Binding Site，San Diego，CA；HRP＝辣根過氧化物酶)綴合物(50μL/孔)或其他合適的第二抗體探測30分鐘。在用ELISA洗滌緩沖液洗滌之后，通過添加TM藍底物(50μL/孔)觀察所述反應。10分鐘之后，通過添加1N H2SO4(100μL/孔)終止該反應，并且在設定為450nm的波長下在ELISA平板讀數器上讀數。
2.合成肽ELISA用包被緩沖液(50mM碳酸氫鈉，pH9.6)將具有24個氨基酸殘基的合成肽M2稀釋到2微克/毫升的濃度，并且包被到ELISA條的孔中(50μL/孔)。通過在通風廚排風狀態下溫育過夜(大約18小時)，將肽干燥在所述孔上。第二天上午，用ELISA洗滌緩沖液(磷酸緩沖的鹽溶液，pH7.4，0.05％Tween-20)洗滌所述孔，并且用溶解在PBS中的3％BSA封閉(75μL/孔)1小時。干燥ELISA條，并且在-20℃下保存待用。
為了測定顆粒的抗體結合，用溶解在PBS中的1％BSA稀釋抗血清(單克隆或多克隆抗血清)，并且以50μL/孔的用量添加到抗原包被的ELISA孔中。溫育血清1小時，用ELISA洗滌緩沖液洗滌，并且用抗小鼠(IgG)-HRP綴合物或其他合適的第二抗體(與前面相同，用量為50μL/孔)探測30分鐘，再次用ELISA洗滌緩沖液洗滌，然后通過添加TM藍底物(50μL/孔)觀察。10分鐘之后，通過添加1N H2SO4(100μL/孔)終止該反應，并且在設定為450nm的波長下用ELISA平板讀數器讀數。
B.顆粒的免疫原性為了測定顆粒的免疫原性，用選擇的佐劑中的10微克顆粒對小鼠進行IP免疫，并且以3周的間隔用相同佐劑中的10微克顆粒進行一次或兩次加強。每次免疫后2、4、6和8周時對小鼠取血。
實施例4確定280∶260吸光度比值為了確定純化顆粒的280∶260吸光度比值，在20nM磷酸鈉緩沖液，pH6.8中將顆粒稀釋到大約0.2mg/mL的濃度，并且在260nm和280nm的波長下測定吸光度值。用在280nm波長下測定的吸光度值除以在260nm波長下測定的吸光度值，以確定280∶260比值。下面的表1中示出了用若干種樣品，包括天然顆粒(HBc183)、在149號殘基位置之后截短的HBc顆粒(HBc149)、以及在本文的其他部分鑒定的若干種HBc嵌合體獲得的比值。全長顆粒ICC-1559是首先在Neirynck et al.，(Oct 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163和專利申請WO9907839中報道的顆粒制備物，而全長顆粒ICC-1607是相似的顆粒，其中M2多肽第17和19位的半胱氨酸(SEQ ID NO9的X17和X19)突變為絲氨酸殘基。
表1

NT，未檢測。*CV-1159與Neirynck，1999描述的IM2-HBc相同實施例5熱穩定性方案用50mM NaPO4，pH6.8將純化的顆粒稀釋到1mg/mL的濃度，并且添加最終濃度為0.02％的疊氮化鈉，以便抑制細菌生長。將樣品SDS-PAGE樣品緩沖液(還原性)混合，并且在15％SDS-PAGE凝膠上電泳。用考馬斯亮藍對凝膠進行染色，然后分析。
實施例6雜合顆粒的分析凝膠過濾分析用25mL Superose 6 HR 10/30層析柱(Amersham Pharmacia #17-0537-01)和BioCADTMSPRINT Perfusion層析系統對純化的雜合HBc顆粒進行分析凝膠過濾分析。將UV檢測儀設定為監測280nm的波長。用3倍柱體積(CV；大約75mL)的緩沖液(50mM NaPO4，pH6.8)以0.75mL/分鐘的流速平衡該柱。
用50mM NaPO4，pH6.8將待分析的顆粒稀釋到濃度為1mg/mL。然后將200微升(μL)樣品加樣到200μL的環上，并且注射到所述柱上。用50mM NaPO4，pH6.8以0.75mL/分鐘的流速將所述樣品從該柱上洗脫。
用上述程序分析若干種含有C-末端半胱氨酸殘基的顆粒或不合所述半胱氨酸的類似顆粒。用BioCADTM軟件(PerSeptiveTM)整合280nm軌跡，以便提供結果。
實施例7流感M2構建體最近，Neirynck et al.，(Oct 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163和WO 99/07839報道了M2的24個氨基酸的細胞外結構域與缺乏1-4號氨基酸殘基的全長HBc顆粒(HBc183)的融合。這里稱作IM2HBc的該構建體的示意圖示于下文，其中24聚體與HBc的N-末端連接。
IM2HBcMSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)SEQ ID NO94在一種說明性的制備物中，將M2表位插入乙型肝炎核心的免疫優勢環，用前面對插入和純化討論的技術成功表達和純化了稱作ICC-1475的顆粒。也在免疫優勢環中表達了突變形式的M2表位，其中M2天然位置17和19的兩個半胱氨酸殘基被丙氨酸殘基取代(ICC-1473顆粒)，并且純化得到的顆粒。下文示意地說明了這兩種顆粒。
ICC-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149)SEQ ID NO95ICC-1473HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-CSEQ ID NO96ICC-1473顆粒構建體產生了比天然序列(ICC-1475)多大約7倍的純化的顆粒。仍然需要確定半胱氨酸殘基的突變是否改變了顆粒的保護潛能。但是，在HBc的免疫優勢環上送遞的表位通常比它們與其它區域(包括N-末端)融合時顯著更具有免疫原性，并且得到的顆粒表現出減少的抗HBc免疫原性。
已經制備了這樣的顆粒，其中M2N-末端24聚體序列與C-末端截短的乙型肝炎核心顆粒的N-末端融合。該構建體(ICC-1438)也包含N-末端前核心序列(SEQ ID NO66)。制備了相似的構建體，其在雜合蛋白(ICC-1492)的末端含有單個半胱氨酸殘基，在此情況下，位于HBc基因的Val-149后面。這些構建體示意地示于下文。
ICC-1438MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)SEQ ID NO97ICC-1492MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-CSEQ ID NO98應當注意，為了防止從天然HBc起始甲硫氨酸起始翻譯，對該殘基的密碼子進行突變，以編碼異亮氨酸殘基。由EcoRI(GI)和SacI(EL)限制位點貢獻的殘基用下劃線表示。前核心序列位于加下劃線的EL殘基和″-HBc(2-149)″之間。
通過本文中其它地方討論的SDS-PAGE進行分析，在圖10中顯示了在制備后，與ICC-1492(泳道3)相比，ICC-1438單體構建體是不穩定的(泳道2)，其中采用HBc-149(泳道1)，ICC-1475(泳道4)和ICC-1473(泳道5)作為SDS-PAGE凝膠上的額外分子量對照。采用顆粒的分析凝膠過濾時，ICC-1438單體的不穩定性不明顯。
預期ICC-1475(圖10，泳道4)和ICC-1473(圖10，泳道5)都比ICC-1438和ICC-1492具有略低的分子量，因為前兩者含有直接插入免疫優勢環中的M2序列，因此缺乏ICC-1438和ICC-1498中存在的前核心序列(SEQ ID NO66)。正如所預期的，ICC-1492比ICC-1475和ICC-1473大；但是，除C-末端殘基之外與ICC-1492相同的ICC-1438，由于明顯的切割，明確地不大于ICC-1475和ICC-1473。
也涉及了這樣的構建體，其含有與HBc N-末端(結構域I)或環(結構域II)連接的如上文所討論的M2 N-末端細胞外結構域，并且也含有位于HBc的C-末端(結構域IV)的半胱氨酸殘基。
為了修飾含有免疫優勢環融合體的雜合HBc顆粒的氨基末端以摻入半胱氨酸殘基和最小的來源于M2的序列，合成了一系列的合成寡核苷酸。為了制備V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S)，將寡核苷酸M2(17-24/C17S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R用于擴增來自載體V2.Pf1的雜合HBc基因。用NcoI和HindI II切割得到的546bp片段并且插入已經用相同的兩種酶切割的pKK-223-3N中。
為了制備V2.Pf1(N-M2(17-24/C19S)，將寡核苷酸M2(17-24/C19S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R用于擴增載體V2.Pf1中的雜合HBc基因。用NcoI和HindI II切割得到的540bp片段并且插入已經用相同的兩種酶切割的pKK-223-3N中。
M2(17-24/C17S)-NcoI-FM G S RCN D S S D I D P Y K E F GGGCGCCATGGGGTCTAGATGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTCGSEQ ID NO99SEQ ID NO100M2(17-24/C19S)-NcoI-FM GCN D S S D I D P Y K E F GSEQ ID NO101GCGCCATGGGGTGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGSEQ ID NO102
實施例8具有和不具有N-和-末端半胱氨酸殘基的HBc嵌合體分子制備了一系列含有HBc嵌合體分子的顆粒，其含有通過肽鍵連接在C-末端在149號殘基截短的HBc的N-末端或該N-末端附近的甲型流感M2蛋白的1-24號殘基。作為組成成分的嵌合體蛋白分子含有不同的N-末端序列，其包含M2序列或變體，一些包含C-末端半胱氨酸殘基。
通過分析大小排阻層析，分析下文表2中列出的所有純化顆粒，以評估在純化后顆粒狀結構的保留。不含N-末端半胱氨酸殘基的稱作ICC-1603的顆粒，表現出分散回到亞顆粒狀結構的跡象(圖3)，因為在1500秒范圍洗脫蛋白(正確形成的顆粒在大約1000秒洗脫)。
顆粒ICC-1590的相似分析表明，該構建體在純化后保持了顆粒狀，在大約1000秒發生洗脫，這是雜合顆粒的典型表現(圖4)，所述ICC-1590與ICC-1603 ICC-顆粒相似，但N-末端M2序列中的兩個絲氨酸殘基突變為半胱氨酸殘基。ICC-1590沒有分散的跡象。
ICC-1560顆粒的分析表明，盡管表現出了一定程度的分散(圖5)，但該顆粒在純化后也是顆粒狀，表明穩定化不如ICC-1590顆粒那么強，所述ICC-1560顆粒的嵌合蛋白也具有兩個N-末端半胱氨酸殘基。比較ICC-1590和ICC-1560的N-末端構型(下文表2)，表明ICC-1560顆粒中兩個半胱氨酸殘基的相對位置通過缺失3個氨基酸殘基(DEL)相對于ICC-1590顆粒移動了3個氨基酸殘基，表明半胱氨酸殘基可能需要距離核心基因的起始處距離最小，以進行最優化的交聯。
實施例9具有M2或M2變體序列和C-末端半胱氨酸殘基的顆粒在圖3中示出了在純化后迅速分散的ICC-1603顆粒。包含ICC-1605顆粒的HBc嵌合體分子與包含ICC-1603顆粒的那些相似，只是1605成分嵌合體分子具有單個C-末端穩定性半胱氨酸。制備了質粒以指導ICC-1605顆粒的表達，以便研究將C-末端半胱氨酸殘基加入ICC-1603顆粒是否能夠給顆粒賦予更強的穩定性。在純化后，用分析大小排阻層析分析ICC-1605顆粒(圖6)。
該研究的結果證明了顆粒穩定化比ICC-1603顆粒更完全，但與含有兩個氨基末端半胱氨酸殘基并且不含C-末端穩定性半胱氨酸的ICC-1590相比是不完全的。盡管顯著量的ICC-1605保持為顆粒狀，存在在寬范圍洗脫的亞顆粒狀結構的異質混合物的跡象。這些觀察結果表明，對于該雜合顆粒(ICC-1603)，在ICC-1605顆粒中發現的C-末端穩定化沒有在ICC-1590顆粒中發現的N-末端穩定化完全。
為了研究雜合顆粒的組合氨基和羧基末端半胱氨酸穩定化的相容性，構建了表達質粒以指導ICC-1604顆粒的表達。ICC-1604顆粒的成分嵌合體分子含有天然M2多肽序列中存在的兩個氨基末端穩定性半胱氨酸殘基(如同在ICC-1590中)和C-末端穩定性半胱氨酸(如同在ICC-1605顆粒中)。ICC-1604顆粒的分析表明它們在純化后保留了均質顆粒狀態(圖7)，表明兩種穩定方法是互補的，并且可以彼此協同使用。
用顆粒ICC-1438和ICC-1492研究了HBc N-末端和N-末端半胱氨酸殘基之間的其它接頭序列。這些顆粒都含有M2融合體和HBc的氨基酸D4之間的氨基酸序列ELLGWLWGIDI(SEQ ID NO103)。氨基酸殘基LGWLWGIDI來源于前核心的-6位氨基酸到HBc的氨基酸I3，HBc的起始密碼子突變為異亮氨酸，以防止從該位置起始翻譯(其將破壞研究)。HB前核心序列包含-7位的半胱氨酸。
這些顆粒的差異僅僅在于以下事實，即ICC-1438成分嵌合體分子終止于HBc的149位，而ICC-1492成分嵌合體分子終止于HBc的149位，并且含有相對于SEQ ID NO1的HBc的150位的末端半胱氨酸。當采用替代的但與上文討論的相似的方法，通過分析凝膠過濾進行分析，從而在大約10分鐘時洗脫顆粒時，表明在純化后兩種構建體都是顆粒狀的(圖8中的ICC-1438和圖10中的ICC-1492)。該研究證明了截短的顆粒的氨基和羧基末端半胱氨酸穩定化的相容性，以及氨基酸序列中的顯著變化性和N-末端半胱氨酸殘基和HBc基因起始處之間的距離的耐受性。來自一些研究的數據示于下文表2A、2B和2C。
表2A


表2B

表2C

下文表3顯示了說明HbeAg的N-末端的構型的比對以及具有N-末端融合的顆粒。根據所有構建體都共有的從SEQ ID NO1的HBc的N-末端開始的第4位氨基酸殘基進行序列比對。當存在N-末端半胱氨酸殘基時，用下劃線表示。
表3構建體名稱 序列SEQ ID NOHBeAgSKLCLGWLWGMDID 103ICC-1438/ICC-1492MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIDID 104ICC-1560MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 105ICC-1590/ICC-1604/ICC-1606MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD 106ICC-1603/ICC-1605/ICC-1607MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDELD 107ICC-1671MSLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSDELD 108ICC-1672MSLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSDELD 109ICC-1816MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDLESLLTEVET-PIRNEWGCRCNDSSDELD 110ICC-1817MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLESLLTEVETPIRN-EWGCRCNDSSDELD 111ICC-1818MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLQSLLTEVETPIRN-EWGSRSNDSSDLESLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD 112
下文表4提供了評估含有N-末端甲型流感M2序列或此處涉及的變體的顆粒的穩定性的結果列表。如此處所顯示的，從含有位于相對于SEQ ID NO1的HBc序列的N-末端的負14(-14)位到大約N-末端本身的半胱氨酸殘基的HBc嵌合體分子制備了穩定的顆粒。
表4

*從第二個N-末端M2拷貝實施例10含M2的顆粒的產率和核酸結合產率表示為從500mL培養物純化的顆粒的毫克數。通過測量純化顆粒的A280∶A260比值確定結合的核酸的存在。超過1.0的比值表明沒有結合的核酸，小于1.0的比值表明結合的核酸的存在。Fiers和同事描述的最初的全長IM2HBc與ICC-1559相同[Neirynck et al.，(1999)Nat.Med.，5(10)1157-1163和專利申請WO9907839]。

實施例11多種含M2顆粒的抗原性用ELISA檢驗多種顆粒對單克隆抗體14C2的抗原性。為了確保顆粒保持它們的天然構象，首先用多克隆抗體(兔)包被ELISA板以捕獲顆粒，然后用14C2單克隆抗體或對HBc顆粒的免疫優勢環區具有特異性的兩種抗HBc單克隆抗體的多種稀釋液對其進行探測。下文表中提供的數據，證明了相對于在N-末端的呈遞，M2e在HBc的免疫優勢環中的呈遞不顯著改變M2e表位對14C2單克隆抗體的可接近性(IM2HBc/ICC-1559和ICC-1604)。這些觀察結果并不出乎意料，因為它已經證明了142C與M2e的內部區域結合(與N末端相對的M2的氨基酸8、10、11和14[Zebedee et al.，(1988)J.Virol.，62(8)2762-2772])。
此外，除ICC-1569以外，所有顆粒都保持對抗HBc單克隆抗體3120和3105的抗原性。3105的識別喪失是以前對具有插入到免疫優勢環中的序列的顆粒觀察到的現象，這通常翻譯為免疫后這些顆粒的抗HBc應答降低。單克隆抗體3105和3120是從日本的Tokyo Institute ofImmunology購買的。

實施例12多種含M2顆粒的免疫原性在小鼠中研究ICC-1604和ICC-1569顆粒的免疫原性。兩種顆粒之間的抗M2e滴度差異很小，而在兩種顆粒之間觀察到了抗HBc滴度的差異。具有天然免疫優勢環的ICC-1604顆粒，類似于IM2HBc，引發了比ICC-1569顆粒高大約100倍的抗HBc滴度。這些數據再次強調了以下事實，即通過導致HBc單克隆抗體3105的識別喪失的表位插入，破壞了HBc的免疫優勢環，從而顯著減少了抗HBc抗體應答。相反，兩種顆粒引發了相似的抗M2抗體應答，并且與以前對IM2HBc/ICC-1559觀察到的結果相似，終點滴度是大約1∶100,000。
在AlhydrogelTM上對顆粒制劑化，在第0(零)天和28天用2劑10μg制劑化的顆粒免疫幾組小鼠，每組10只。在第二次注射后2周用ELISA測定法分析合并的血清中的抗HBc和抗M2e抗體應答。在ELISAs中分析來自加強后兩周的10只小鼠的合并血清，用M2e(2-24)合成肽和重組HBc(ICC-1123)作為捕獲抗原。
小鼠致死攻擊模型中ICC-1569和ICC-1604顆粒的直接比較，發現在AlhydrogelTM上制劑化時，兩種顆粒都對致死攻擊劑量提供了完全的防護。因此這些結果與以下結果一致，即，兩種顆粒都引發了相似的抗M2e抗體滴度。
由Ghent大學的Fiers及其合作者采用不同顆粒和佐劑的陣列進行的多個小鼠研究的數據編輯，揭示了IgG2a亞類的抗M2e滴度和保護效果之間直接可能的關聯。表現出高于104的抗M2e IgG2a滴度的小鼠很容易受到保護以免受致死攻擊，而表現出低于104的抗M2e IgG2a滴度的小鼠通常表現出較不完全的保護。這些數據與保護的潛在機制相關，因為它們表明，抗M2e抗體不是簡單阻斷M2的功能，否則保護作用將不依賴于IgG亞類偏倚。實際上，由于小鼠IgG2a(和IgG2b)是用于固定補體和結合NK細胞表達的FcγRIII受體的最有效亞類[Ravetch et al.，(1991)Annu.Rev.Immunol.，9457-492]，所述數據表明了免疫機制涉及CDC和/或ADCC。
實施例13抗體亞類和保護概括了一些研究，其中測定了多種M2e-Hbc構建體(10μg/小鼠)和多種佐劑。大約一半是i.p.施用，大約一半是i.n.施用。對于每一組(14只小鼠)，合并血清，確定抗M2e IgG亞類抗體的滴度。結果來自在第二次加強后一周采集的血清。對于IgG2a滴度超過104的小鼠，IgG1滴度是104(*)。

越來越多地研究了佐劑增強對疫苗的免疫應答的強度和持續時間，以及調節免疫應答的Th1/Th2偏倚的能力。盡管正在研究很多實驗佐劑，在美國，明礬仍然是唯一作為FDA批準的疫苗的成分的佐劑。通常，明礬使免疫應答向Th2型偏倚，這是通過小鼠中高水平IgG1抗體的產生而表現的。
已經發現用明礬制劑化的M2e-HBc顆粒確實引發了顯著的IgG1應答；但是，也引發了作為Th1指示物的IgG2a和IgG2b抗體。在嘗試增強Th1型IgG亞類的產生的嘗試中，在小鼠中檢測了補充了RC-529的AlhydrogelTM制劑化的顆粒的免疫原性，所述RC-529是一種與Corixa公司開發的MPL結構上相似的化合物。這些研究表明，在AlhydrogelTM制劑中引入RC-529，導致了抗M2e IgG2a滴度的顯著增強，使抗M2e IgG2a∶IgG1比例增加了大約10倍。兩組中的所有小鼠完全受到保護而免受致死攻擊；但是，用AlhydrogelTM+RC-529制劑化的ICC-1569，相對于單獨的AlhydrogelTM制劑化的ICC-1569，減少了發病率(體溫降低和體重減輕)。
實施例14部分截短的HBc顆粒合成用于表達部分截短的顆粒的表達載體為了制備用于表達部分截短的HBc顆粒的表達質粒，與獨特的C-末端引物一起使用單個氨基末端寡核苷酸PCR引物(HBc149/NcoI-F)。例如，為了制備HBc156(E.Cr；ICC-1600顆粒)表達質粒，使用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156(E.cR)-H3-R。使用引物HBc149/NcoI-F和HBc156C(E.cR)-H3-R制備HBc156(E.cR)+C(ICC-1601顆粒)表達質粒。下文示出了所有引物的序列。
除了截短顆粒，以及在某些情況下摻入C-末端半胱氨酸殘基，也使用了對于在大腸桿菌中表達最優的密碼子。已知一些精氨酸密碼子，特別是AGA和AGG是大腸桿菌很少使用的，并且認為對于在大腸桿菌中有效表達蛋白是有問題的，因為會導致翻譯過程中的多肽合成停滯，導致提前終止。在HBc的150和183之間的16個精氨酸密碼子中，7個是由罕見的AGA密碼子編碼，2個是由非常罕見的AGG密碼子編碼。因此，在該研究中，所有的AGA和AGG密碼子都被大腸桿菌更常用的密碼子替代。
為了能夠進行罕見精氨酸密碼子的順序替代，首先合成HBc156基因(ICC-1600和HBc156+C ICC-1601顆粒)，然后用作HBc163構建體(ICC-1634和HBc163+C ICC-1632顆粒)的模板；此后，將HBc163構建體用作HBc171構建體(ICC-1642和HBC171+C ICC-1643顆粒)的模板；最后，將HBc 171構建體用作精氨酸密碼子優化的HBc182和HBc183構建體的模板。為了對照目的，也制備了非優化的HBc182構建體(ICC-1575)。用限制酶NcoI和HindIII切割所有PCR構建體，如上文所討論，克隆到用相同酶切割過的表達載體pKK223-3N中。
氨基末端引物序列(NcoI加下劃線)
HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO51羧基末端引物序列(HindIII限制位點加下劃線)HBc156(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGGSEQ ID NO64HBc156C(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGT-CTCCGG SEQ ID NO65HBc163(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCGSEQ ID NO66HBc163C(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCGSEQ ID NO67HBc171(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGTSEQ ID NO68HBc171C(E.cR)-H3-R
5’-GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGTSEQ ID NO69HBc183(E.cR)-H3-R5’-GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGG-CGATTGAGAGCGTC SEQ ID NO113HBc182-H3-R5’-GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGASEQ ID NO114HBc183-H3-R5’-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGSEQ ID NO115HBc149/HindIII-R5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO54HBc149+C/HindIII-R5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO55下文表5顯示的比對說明了全長HBcAg(HBc183)的C-末端和所有攜帶C-末端截短的顆粒的構型。根據所有構建體共有的SEQ ID NO1的HBc的N-末端開始的149位的氨基酸殘基進行序列比對。當存在C-末端半胱氨酸殘基時，用下劃線表示。
表5構建體名稱序列SEQ ID NOHBc183VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC116HBc182VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ 117HBc171(E.cR)+CVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPC118HBc171(E.cR)VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP 119HBc163(E.cR)+CVRRRGRSPRRRTPSPC120HBc163(E.cR)VRRRGRSPRRRTPSP 121HBc156(E.cR)+CVRRRGRSPC122HBc156(E.cR)VRRRGRSP 123實施例15用具有和不具有N-末端半胱氨酸殘基的HBc嵌合體形成顆粒和穩定性制備了一系列四種嵌合體蛋白，其含有與在149位截短的乙型肝炎核心的氨基酸D4的短N-末端融合，所述嵌合體蛋白含有0個(顆粒1891)、1個(顆粒1892和1893)或2個(顆粒1890)半胱氨酸殘基。純化后，用分析大小排阻層析(SEC)評估顆粒完整性。這些N-末端融合的序列和分離的產率示于下文表6。
表6

以1.9-6.8mg/500mL細胞培養物的產率成功純化了含有1個或多個半胱氨酸的三種嵌合體蛋白。含有相對于起始甲硫氨酸的第3和5位的兩個半胱氨酸的嵌合體(顆粒1890)或含有第3位的單個半胱氨酸的顆粒(顆粒1893)以比在第5位具有單個半胱氨酸的嵌合體(顆粒1892)更高的產率純化。既不含第3位的半胱氨酸也不含第5位的半胱氨酸的嵌合體顆粒不能作為顆粒純化，表明該嵌合體分子不能形成穩定的顆粒。
當通過分析SEC進行分析時，所有三種蛋白都表現出大約5-8mL處的優勢峰，其代表顆粒。該發現與作為顆粒的混合物和較無序結構(非顆粒狀材料)存在的、缺乏N-末端半胱氨酸的嵌合體蛋白分子顆粒，如嵌合體顆粒ICC-1048相反。SEC曲線的更詳細分析發現，嵌合體蛋白分子1890形成了優質的顆粒，沒有檢測到較無序的結構，而嵌合體1892顯示少量非顆粒狀材料，嵌合體1893顯示了更多的非顆粒狀材料。
為了檢驗N-末端半胱氨酸殘基穩定展示異源表位的顆粒的能力，構建了與嵌合體1890含有相同N-末端構型的嵌合體蛋白分子，其具有插入氨基酸78和79之間的免疫優勢環中的來自惡性瘧原蟲的CS重復(NANPNVDPNANPNANPNANP；SEQ ID NO128)。純化后，將得到的嵌合體(1894)的顆粒完整性與缺乏N-末端融合的相似嵌合體蛋白(1045)的顆粒進行比較。
這些構建體的SEC分析表明，嵌合體1045表現出了顆粒和較無序的結構的峰。來自嵌合體1894的數據的相似分析顯示了無法解釋的顆粒形成缺乏，目前正在對其進行研究。
實施例16具有順序連接的N-末端M2肽的顆粒的免疫原性在兔中測定了通常經過工程化以含有與N-末端融合的可變拷貝M2[1，1604(實施例12)；2，1817(實施例9)；或3，1818(實施例9)]的顆粒的免疫原性。按照上文和下一個實施例的討論，在制備這些顆粒后將其冷凍，以使認為存在的蛋白酶的作用最小。通過肌內途徑，采用3劑用AlhydrogelTM(500μg鋁/劑)/RC-529-AF(25μg/劑)制劑化的顆粒(25μg/劑)免疫了幾組兔，每組4只。在第0、28和56天免疫兔，在第0(預取血)、14、28、56和60天取血。用ELISA測試抗M2抗體的水平。
用包被了M2e(2-24/C17S，C19S)肽(2μg/mL，進行大約18小時)的微量滴定板進行ELISA，并且用3％BSA封閉。將血清以雙份加入板中，開始是1∶100稀釋，然后是2倍稀釋，預取血除外，其進行三份分析。為了檢測固定的抗體，在生色底物TM藍之后，加入抗兔IgG HRP綴合物。采用該預取血數據，計算了每個血清稀釋度下每只兔的“截止值”，方法是確定第0天時預取血血清樣品的背景+3倍標準差。通過鑒定產生比特定血清稀釋度的截止值高的吸光度值的最后一個血清稀釋度，確定終點滴度。如果各個兔在組中是無反應者(即，滴度為0)，而其它兔產生可檢測的滴度(即，＞0)，則給無反應者賦予滴度值10，從而能夠計算組中的幾何平均滴度(GMT)。
出乎意料的是，僅僅具有單個拷貝的與N-末端融合的M2e的顆粒(1604)不能產生可檢測的抗M2e應答(表11)；但是，在最初注射后14天，顆粒1817和1818產生了可檢測的抗M2e免疫應答(表7)。在第70天觀察到1817顆粒的峰值滴度是14,030，而在第56天觀察到1818的峰值滴度是24,300。在使用1、2或3劑后，在任何用1604免疫的兔中都沒有檢測到抗M2e滴度。
表7用多種含M2e的顆粒免疫的兔的GMTs

實施例17避免內源性蛋白酶活性持續的工作發現，似乎是金屬蛋白酶的未知蛋白酶對含M2的顆粒進行了切割，因為通過在用于分離和儲存顆粒的緩沖液中加入10mMEDTA，可以防止這些顆粒的蛋白水解。為了確定更低濃度的EDTA是否也是有效的，用實施例9制備和上文討論的ICC-1818顆粒進行了穩定性研究。將這些顆粒置于含有pH7.2的20mM磷酸鈉，并且也含有0、1、2、5或10mM EDTA的儲存緩沖液中。圖11中示出的結果明確顯示1mM EDTA在防止蛋白水解方面與10mM EDTA同樣有戲。實際上，低于1mM的濃度也是有效的。
出乎意料的是，不存在EDTA時，在37℃下的蛋白水解比在室溫溫育條件下的蛋白水解少。該觀察結果提示，蛋白酶可能是高度不穩定的，因此，在相對低的溫度下(40-60℃)就可以滅活。因此，開始了一項研究，以確定通過熱處理是否可以破壞蛋白水解活性，同時保持顆粒的完整性。
為了評估采用熱步驟滅活蛋白酶的可能性，將顆粒加熱到40、50、60或70℃，持續加熱1.5或3小時。用SDS-PAGE評估單體的完整性(圖12A)，數據表明，所有單體在熱處理后似乎是相似的。圖12B中顯示的凝膠明確表明在室溫(RT)下一周后，未處理的顆粒被完全切割，而在40℃下熱處理的顆粒表現出切割減少，在50℃下熱處理的顆粒表現出極少的切割，在60或70℃溫育的那些似乎與未溫育的對照無法區分。
為了評估熱處理對顆粒完整性的影響，用分析SEC對熱處理過的顆粒進行分析。圖13A示出的數據表明，在60°和70℃進行的熱處理對顆粒完整性具有很小的影響，這是通過單體/二聚體峰的輕微增加而證實的，所述峰在主顆粒峰之后洗脫。在50℃和50℃以下進行的熱處理對SEC洗脫曲線沒有明顯影響，表明顆粒承受了熱步驟，沒有不良影響。
RT溫育1周后熱處理過的顆粒的SEC分析明確顯示了未進行熱處理的對照的蛋白水解，這是由顆粒峰的洗脫時間增加而證明的(圖13B，RT樣品)。這與用SDS-PAGE觀察到的蛋白水解一致(圖12B)，并且表明從顆粒切割M2e，導致了顆粒大小減小。熱處理過的樣品都表現出優勢的、完整顆粒的峰，再次與SDS-PAGE發現的不存在切割的結果一致(圖12)。
這些數據提示，用于滅活負責切割含M2顆粒的蛋白水解活性的熱處理可以是限制蛋白水解的有效選擇。初步研究表明，在55-60℃溫育3小時，對于達到蛋白水解滅活同時保持顆粒完整性是最優的。此外，在制備過程方面，優選在SepharoseCL-4B步驟之前進行熱滅活，以便由于熱步驟而釋放的單體和二聚體能有效被去除。該方法的使用可以使得顆粒能在缺乏EDTA的條件下儲存。
實施例18用EDTA和熱步驟純化，得到穩定顆粒根據上文提供的數據，用CV-1906顆粒檢驗了摻入EDTA和對切割M2e的蛋白酶活性進行熱滅活的原型純化過程，所述CV-1906顆粒如ICC-1818顆粒那樣，含有3個N-末端M2e拷貝，其連接于HBc序列，所述HBc序列以4號殘基(天冬氨酸)起始，并且其中第48和107位的半胱氨酸被絲氨酸殘基替代，所述HBc序列被截短，以除去位于149位N-末端的殘基，并且在第150位添加半胱氨酸殘基(HBc149C48S/C107S，C150)。在3個拷貝的M2e中可以存在的6個半胱氨酸中，實際上只有M2e序列中最靠近HBc序列的兩個半胱氨酸存在，另外四個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。
純化過程涉及在所有緩沖液中使用10mM EDTA，直到通過熱處理對蛋白酶滅活，此時在SepharoseCL-4B層析過程中除去EDTA。比較了含有或缺乏熱滅活步驟的程序。下面詳細列出了使用的過程·用微流化器在Tris/EDTA緩沖液中裂解·離心·20％硫酸銨沉淀
·離心·將沉淀重懸于1M NaCl/10mM EDTA中·EDTA存在下，苯基HIC(以大約300mM NaCl洗脫)·+/-熱滅活(60℃，3小時)·不存在EDTA的條件下進行SepharoseCL-4B層析·陶瓷HA層析比較研究發現，如所預期的，未經過熱步驟的CV-1906顆粒在除去EDTA后，即，在SepharoseCL-4B后立即開始切割(圖14，泳道2)。相反，用包括熱步驟的過程純化的CV-1906顆粒保持完整(圖14，泳道1)。
實施例19用含1、2或3個串聯的M2肽的嵌合體進行的大小研究在大腸桿菌中表達具有與HBc的N-末端融合的0、1、2或3個串聯的M2e拷貝的雜合HBc-M2e顆粒，并且純化(表8)。如前面所討論，在制備后也對這些顆粒進行冷凍，并且在要使用時融解。用還原SDS-PAGE比較多個單體的大小(圖15)。M2e-HBc雜合體的相對遷移性與它們預期的分子量一致(表8)表8M2e-HBc雜合顆粒的詳情

實施例20用含1、2或3個串聯的M2肽的嵌合體進行的免疫原性研究采用致死攻擊模型，在BALB/小鼠中將經過基因工程化以含有與N-末端融合的可變拷貝的M2[1，1604；2，1817；或3，1818]的顆粒的免疫原性和保護效力進行比較。從Charles River(德國)獲得無病原體的雌性BALB/c小鼠，并且用于在8周齡時免疫。將動物飼養在控制溫度的環境中，采用12小時的亮/暗周期，隨意接受食物和水。
采用以下免疫方案對所有小鼠(每組14只)腹膜內接種100μl疫苗以三周的間隔，用AlhydrogelTM(100μg/劑)和RC-539-AF(10μg/劑)制劑化的10μg M2e-HBc顆粒進行第一次接種、第一加強和第二次加強。在制備后也對這些顆粒進行了冷凍，并且在要使用時融解，以使蛋白酶的作用最小。在每次免疫之前和免疫后兩周，通過針刺腹側尾靜脈而采集血樣。最后一次取血是通過心臟穿刺進行的。37℃下使血液凝集30分鐘，隨后兩次離心，取出上清液以采集血清。通過ELISA確定M2e特異性IgG的滴度。
用1817或1818顆粒免疫的小鼠在致死攻擊后表現出完全存活，而用1604顆粒免疫的小鼠表現出一定的死亡率(參見圖16)。用不含M2e的顆粒(1123)或PBS免疫的小鼠表現出100％的死亡率(圖16)，強調了攻擊的高嚴苛性。用1817和1818顆粒免疫的小鼠中的保護增強，也表現在相對于1604顆粒，發病率(體重減輕和體溫降低)減少，表明與僅表達1個拷貝的M2e的顆粒(1604)相比，在用表達2或3個拷貝的M2e的顆粒(1817和1818)免疫的小鼠中保護作用最強(圖17和圖18)。
用ELISA確定抗M2e滴度。在37℃下用50μl溶于50mM碳酸氫鈉緩沖液，pH9.7的2μg/ml M2e肽溶液包被ELISA板過夜(大約18小時)。采用微量滴定板(II型F96 MaxiSorpTM)。清洗板后，將200μl PBS+2％BSA溶液用于封閉。溫育1小時后，將1/50稀釋開始的不同血清樣品的一系列1/3稀釋液加樣到包被肽的孔中。用在PBS+1％BSA+0.05％Tween-20中1/6000稀釋的分別針對小鼠IgG1和IgG2a的辣根過氧化物酶標記的抗體(Southern BiotechnologyAssociates，Inc.)檢測結合的抗體。清洗后，在RMB底物存在下，將微量滴定板溫育5分鐘。通過加入1M H3PO4終止反應，測量450nm處的吸光度。為了獲得與M2e的特異性結合的值，從在相應稀釋度的條件下獲得的免疫血清的吸光度扣除從免疫前血清獲得的吸光度。
ELISA數據表明，顆粒1817和1818引發的抗M2e IgG1滴度分別比1604顆粒引發的滴度高10.4和8.4倍。相似地，顆粒1817和1818引發的抗M2e IgG2a滴度分別比1604顆粒引發的滴度高5.5和7.6倍(表9)。
表9顆粒1604、1817和1818的抗M2e滴度的比較*(IgG1和IgG2a亞類)

*測定了來自各個小鼠的血清樣品。標準差示于括號中。
對于抗HBc測定，用100μL針對HBc的多克隆兔抗體(DAKO)的10μg/ml溶液包被ELISA板(II型F96 MaxiSorpTM)。清洗板后，將PBS+3％BSA溶液用于封閉。清洗后，捕獲HBc抗原(10μg/ml，溶于碳酸氫鹽緩沖液中)1小時。清洗后，將1/1000稀釋開始的不同血清樣品的一系列1/3稀釋液加樣到孔中。用1/10,000稀釋于PBS+1％BSA中的針對小鼠IgG(Sigma)的堿性磷酸酶標記的抗體檢測結合的抗體。進一步清洗后，使微量滴定板與底物一起溫育30分鐘。測量415nm處的吸光度。
為了獲得與乙型肝炎核心抗原的特異性反應性的值，從在相應稀釋度的條件下獲得的免疫血清的吸光度扣除從免疫前血清獲得的吸光度。為了確定各個樣品的IgG1抗HBc滴度，用在PBS+0.5％BSA+0.05％Tween-20中1/6000稀釋的針對小鼠IgG1的辣根過氧化物酶標記的抗體(Southern Biotechnology Associates，Inc.)檢測結合的抗體。清洗后，在RMB底物存在下，將微量滴定板溫育5分鐘。通過加入1MH3PO4終止反應，測量450nm處的吸光度。
ELISA數據表明，顆粒1817和1818引發的抗HBc IgG1滴度分別比1604顆粒引發的滴度高2.4和10.1倍(表10)。這些數據表明，HBc顆粒表面M2e密度的增加，活躍地抑制了對HBc載體的抗體應答。因此，與1604顆粒相比，1818顆粒的抗M2e∶抗HBc比值(IgG1)高75倍，1817顆粒高23倍(表10)。因此，接種的宿主中抗流感M2e的免疫應答甚至比抗HBc載體顆粒的免疫應答更高，已知HBc載體顆粒是高度免疫原性的。
表10抗M2e和抗HBc滴度的比較*(IgG1亞類)

*檢測了來自各個小鼠的血清樣品。
*在括號中示出了標準差。
在此引入本文中引用的每篇專利和文章作為參考。“一個”或“一種”意欲包括一種或多種。
前面的說明書和實施例是說明性的，不應該認為是限制性的。本發明精神和范圍內的其它變化也是可能的，并且容易被本領域技術人員理解。
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<223>修飾的質粒pkk223<400>7ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t51<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質粒pkk223<400>8ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt 38<210>9<211>24<212>PRT<213>甲型流感病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，則第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>第4位的Xaa是蘇氨酸或脯氨酸或不存在。如果是蘇氨酸或脯氨酸，則第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>第7位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>第8位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>第11位的Xaa是異亮氨酸或蘇氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>第12位的Xaa是精氨酸或賴氨酸。
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<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是天冬酰胺或絲氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>第14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，則第16位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第17位的Xaa，則第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是精氨酸、賴氨酸或不存在。如果是精氨酸或賴氨酸，則第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第19位的Xaa，則第15-18位存在。
<220>
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<220>
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<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(68)..(68)<223>第68位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第61-67位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(69)..(69)<223>第69位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第61-68位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(70)..(70)
<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第61-69位的Xaa存在。
<400>37Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70<210>38<211>17<212>PRT<213>乙型流感病毒<400>38Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile1 5 10 15Arg<210>39<211>24<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>39Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg1 5 10 15Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys20<210>40<211>22<212>PRT<213>甲型流感病毒
<400>40Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly1 5 10 15Lys Leu Ser Thr Arg Gly20<210>41<211>22<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>41Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val1 5 10 15Tyr Ser Leu Ile Arg Pro20<210>42<211>24<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>42Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile1 5 10 15Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn20<210>43<211>549<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>43atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa120gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt180tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg240tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc300ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta420tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact480ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa540tctcaatgt549<210>44<211>555<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>44atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa120gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc180tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca240tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta300ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc360tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta420tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga480agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct540cgggaatctc aatgt 555<210>45<211>555<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>45atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa120gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc180tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca240tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta300ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc360tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta420tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct540cgggaatctc aatgt 555<210>46<211>549<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>46atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat120gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt180tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca240tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta300ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg360tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta420tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact480ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa540tctcaatgt549<210>47<211>549<212>DNA<213>土撥鼠<400>47atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt 60gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc120cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag180acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat240aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa300ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca360agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa420tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag480agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc540gcgtcgcag549
<210>48<211>651<212>DNA<213>地松鼠<400>48atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc 60tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt120tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg180gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct240catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca300tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat360acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga420caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct480tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga540agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga600aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c 651<210>49<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>49ggtgcatgca aggagatg 18<210>50<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質粒pkk223<400>50gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc 55<210>51<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51ttgggccatg gacatcgacc ctta 24<210>52<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c 31<210>53<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag 39<210>54<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31<210>55<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>55cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct ccggaag 37<210>56
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>56ggaaagctta ctaacattga gattcccg 28<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>57gcgggatccg gagcttatcg a 21<210>58<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>58gcggagctct ttttgaattc ccatggtttt ttcctcctta t41<210>59<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>59gcggagctcc ttgggtggct ttggggcatt gacatcgacc cttataaag49<210>60<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物.
<400>60gcataattcg tgtcgctc 18
<210>61<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物.
<400>61gcggaattcc gatgtccatg gttttttcct 30<210>62<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物.
<400>62gcggaattca aaaagagctc gacccttata aagaatttgg a41<210>63<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>63cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg 42<210>64<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>64gcgaagctta ctaaggggag cggcctcgtc gacgaacaac agtagtctcc gg52<210>65<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>65
gcgaagctta ctaacaaggg gagcggcctc gtcgacgaac aacagtagtc tccgg 55<210>66<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>66gcgaagctta ctaaggcgag ggagtgcgcc gacgagggga gcggcctcg49<210>67<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>67gcgaagctta ctaacaaggc gagggagtgc gccgacgagg ggagcggcct cg52<210>68<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>68gcgaagctta ctacggcgat tgagagcgtc gacggcgagg cgagggagt49<210>69<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>69gcgaagctta ctaacacggc gattgagagc gtcgacggcg aggcgaggga gt52<210>70<211>25<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>70
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu20 25<210>71<211>78<212>DNA<213>甲型流感病毒<400>71aattagcctg ttaaccgaag tggagacgcc gatccgtaac gaatggggct gccgctgtaa60tgattcttcc gacgagct 78<210>72<211>70<212>DNA<213>甲型流感病毒<400>72cgtcggaaga atcattacag cggcagcccc attcgttacg gatcggcgtc tccacttcgg60ttaacaggct 70<210>73<211>26<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>73Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu20 25<210>74<211>78<212>DNA<213>甲型流感病毒<400>74catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatgtaa60cgattcaagt gatgagct 78<210>75<211>70
<212>DNA<213>甲型流感病毒<400>75catcacttga atcgttacat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg60tcagcagaga 70<210>76<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒突變體<400>76Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu20 25<210>77<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>77catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatgtaa60cgattcaagt gatgagct 78<210>78<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>78catcacttga atcgttacat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg60tcagcagaga 70<210>79<211>26<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒突變體<400>79Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu20 25<210>80<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>80catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatcgaa60cgattcaagt gatgagct 78<210>81<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>81catcacttga atcgttcgat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg60tcagcagaga 70<210>82<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒突變體<400>82Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
20 25<210>83<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>83aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa60tgatagctct gacgagct 78<210>84<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>84cgtcagagct atcattagag cggctacccc attcgttacg aatcggcgtc tccacttcgg60ttaacagaga 70<210>85<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒突變體<400>85Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu20 25<210>86<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>86
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatcgaa60cgattcaagt gatgagct 78<210>87<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物.
<400>87catcacttga atcgttcgat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg60tcagcagaga 70<210>88<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pkk-BamHI-F-2<400>88cgtagaggat ccggagctta tcgactgcac gg 32<210>89<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>89gcgctcgaga tcacttgaat cgtt 24<210>90<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>90gcgctcgaga gcttattgac cgaagttgaa acc 33<210>91<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>91gcgctgcaga tcacttgaat cgtt 24<210>92<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>92gcgctgcagt ctctgctgac cgaag 25<210>93<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>93cgcgacatgt ctctgctgac cg 22<210>94<211>203<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>94Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr20 25 30Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg35 40 45Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser50 55 60Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu65 70 75 80
Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu85 90 95Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg180 185 190Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys195 200<210>95<211>176<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>95Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65 70 75 80Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys85 90 95Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val100 105 110Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu115 120 125Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu130 135 140Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg145 150 155 160Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val165 170 175<210>96<211>177<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>96Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala85 90 95
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val100 105 110Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu115 120 125Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu130 135 140Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg145 150 155 160Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val165 170 175Cys<210>97<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>97Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu1 5 10 15Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu20 25 30Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu35 40 45Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu50 55 60Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu65 70 75 80His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp85 90 95Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp100 105 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly115 120 125Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe130 135 140Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile145 150 155 160Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr165 170 175Leu Pro Glu Thr Thr Val Val180<210>98<211>184<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>98Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu1 5 10 15Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu20 25 30Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu35 40 45Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu50 55 60Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu65 70 75 80His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp85 90 95Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp100 105 110Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly115 120 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe130 135 140Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile145 150 155 160Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr165 170 175Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys180<210>99<211>18<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>99Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu1 5 10 15Phe Gly<210>100<211>59<212>DNA<213>甲型流感病毒<400>100ggcgccatgg ggtctagatg taacgattca agtgacatcg acccttataa agaatttcg 59<210>101<211>16<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>101Met Gly Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly1 5 10 15<210>102<211>52<212>DNA<213>甲型流感病毒
<400>102gcgccatggg gtgtaacgat tcaagtgaca tcgaccctta taaagaattt gg52<210>103<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>xxx<400>103Glu Leu Leu Gly Trp Leu Trp Gly Ile Asp Ile1 5 10<210>104<211>14<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>104Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp1 5 10<210>105<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合體<400>105Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu1 5 10 15Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu20 25 30Trp Gly Ile Asp Ile Asp35<210>106<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合體
<400>106Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20<210>107<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合體<400>107Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp20 25<210>108<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合體<400>108Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp20 25<210>109<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合體<400>109Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp20 25<210>110<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合體<400>110Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp20 25<210>111<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合體<400>111Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val20 25 30Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser35 40 45Asp Glu Leu Asp50<210>112<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合體
<400>112Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val20 25 30Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser35 40 45Asp Glu Leu Asp50<210>113<211>77<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合體<400>113Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly1 5 10 15Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Gln Ser Leu Leu Thr Glu Val20 25 30Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser35 40 45Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu50 55 60Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp65 70 75<210>114<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>114
gcgaagctta ctaacattga gattcccgag attgagatcg ccggcgacgc ggcgattgag60agcgtc 66<210>115<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>115gcgaagctta ctattgagat tcccgagatt ga 32<210>116<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性內切核酸酶位點的擴增引物<400>116ggaaagctta ctaacattga gattcccg 28<210>117<211>35<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>117Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg1 5 10 15Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu20 25 30Ser Gln Cys35<210>118<211>34<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>118Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg1 5 10 15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu20 25 30Ser Gln<210>119<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎的突變體<400>119Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg1 5 10 15Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Cys20<210>120<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎突變體<400>120Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg1 5 10 15Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro20<210>121<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎突變體<400>121Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Cys1 5 10 15
<210>122<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎突變體<400>122Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro1 5 10 15<210>123<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎突變體<400>123Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Cys1 5<210>124<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎突變體<400>124Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro1 5<210>125<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合蛋白N-末端融合體<400>125Met Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser1 5<210>126
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端融合蛋白<400>126Met Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser1 5<210>127<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端融合蛋白<400>127Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser1 5<210>128<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端融合蛋白<400>128Met Gly Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser1 5<210>129<211>20<212>PRT<213>惡性瘧原蟲<400>129Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15Asn Ala Asn Pro20<210>130<211>92
<212>PRT<213>流感病毒<400>130Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser1 5 10 15Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro20 25 30Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu35 40 45Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser50 55 60Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg65 70 75 80Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp85 90<210>131<211>115<212>PRT<213>流感病毒<400>131Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser1 5 10 15Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro20 25 30Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu35 40 45Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser50 55 60Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg65 70 75 80Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr85 90 95
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp100 105 110Ser Ser Asp115<210>132<211>93<212>PRT<213>流感病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，則第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是蘇氨酸或脯氨酸或不存在。如果是蘇氨酸或脯氨酸，則第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>第7位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>第8位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>第11位的Xaa是異亮氨酸或蘇氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>第12位的Xaa是精氨酸或賴氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是天冬酰胺或絲氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>第14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，則第16位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第17位的Xaa，則第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是精氨酸、賴氨酸或不存在。如果是精氨酸或賴氨酸，則第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第19位的Xaa，則第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是天冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或絲氨酸或甘氨酸，則第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，則第15-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>第22位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>第23位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(25)..(25)<223>第25位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(26)..(26)<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是蘇氨酸、脯氨酸或不存在。如果是蘇氨酸或脯氨酸，則第29-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>第33位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>第34位的Xaa是異亮氨酸或蘇氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>第35位的Xaa是精氨酸或賴氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>第36位的Xaa是天冬酰胺或絲氨酸。
<220>
<221>misc_feature<222>(37)..(37)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>第38位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>第39位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，則第38位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第40位的Xaa，則第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>第41位的Xaa是精氨酸、賴氨酸或不存在。如果是精氨酸或賴氨酸，則第38-40位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第42位的Xaa，則第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>第43位的Xaa是天冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、絲氨酸或甘氨酸，則第38-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>第44位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，則第38-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(45)..(45)<223>第45位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(46)..(46)<223>第46位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(47)..(47)<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第38-46位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(48)..(48)<223>第48位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第49-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(49)..(49)<223>第49位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第50-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(50)..(50)<223>第50位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第51-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(51)..(51)<223>第51位的Xaa是蘇氨酸、脯氨酸或不存在。如果是蘇氨酸或脯氨酸，則第52-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(52)..(52)<223>第52位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第53-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(53)..(53)<223>第53位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(54)..(54)<223>第54位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(56)..(56)<223>第56位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(57)..(57)<223>第57位的Xaa是異亮氨酸或蘇氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(58)..(58)<223>第58位的Xaa是精氨酸或賴氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(59)..(59)<223>第59位的Xaa是天冬酰胺或絲氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(60)..(60)<223>第60位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(61)..(61)<223>第61位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(62)..(62)<223>第62位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，則第61位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(63)..(63)<223>第63位的Xaa不存在或存在，如果存在，第63位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第63位的Xaa，則第61-62位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(64)..(64)<223>第64位的Xaa是精氨酸、賴氨酸或不存在。如果是精氨酸或賴氨酸，則第61-63位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(65)..(65)<223>第65位的Xaa不存在或存在，如果存在，第65位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第65位的Xaa，則第61-64位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(66)..(66)<223>第66位的Xaa是天冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、絲氨酸或甘氨酸，則第61-65位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(67)..(67)<223>第67位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，則第61-66位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(68)..(68)<223>第68位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第61-67位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(69)..(69)<223>第69位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第61-68位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(70)..(70)<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第61-69位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(71)..(71)<223>第71位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第72-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(72)..(72)<223>第72位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第73-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(73)..(73)<223>第73位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第74-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(74)..(74)<223>第74位的Xaa是蘇氨酸、脯氨酸或不存在。如果是蘇氨酸或脯氨酸，則第75-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(75)..(75)<223>第75位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第76-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(76)..(76)
<223>第76位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(77)..(77)<223>第77位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(79)..(79)<223>第79位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或組氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(80)..(80)<223>第80位的Xaa是異亮氨酸或蘇氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(81)..(81)<223>第81位的Xaa是精氨酸或賴氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(82)..(82)<223>第82位的Xaa是天冬酰胺或賴氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(83)..(83)<223>第83位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(84)..(84)<223>第84位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(85)..(85)<223>第85位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，則第84位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(86)..(86)<223>第86位的Xaa不存在或存在，如果存在，第86位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第86位的Xaa，則第84-85位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(87)..(87)<223>第87位的Xaa是精氨酸、賴氨酸或不存在。如果是精氨酸或賴氨酸，則第84-86位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(88)..(88)
<223>第88位的Xaa不存在或存在，如果存在，第88位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第88位的Xaa，則第84-87位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(89)..(89)<223>第89位的Xaa是天冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、絲氨酸或甘氨酸，則第84-88位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(90)..(90)<223>第90位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，則第84-89位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(91)..(91)<223>第91位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第84-90位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(92)..(92)<223>第92位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第84-91位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(93)..(93)<223>第93位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第84-92位的Xaa存在。
<400>132Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa65 70 75 80Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa85 90<210>133<211>93
<212>PRT<213>流感病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，則第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是蘇氨酸或不存在。如果是蘇氨酸，則第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>第7位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，則第15位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第17位的Xaa，則第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，則第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第19位的Xaa，則第15-18位存在。
<220>
<221>MISCvFEATURE<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，則第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第15-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>第22位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>第23位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(25)..(25)<223>第25位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(26)..(26)<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是蘇氨酸或不存在。如果是蘇氨酸，則第29-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>第38位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>第39位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，則第38位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第40位的Xaa，則第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>第41位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，則第38-40位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第42位的Xaa，則第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>第43位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，則第38-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>第44位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第38-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(45)..(45)<223>第45位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(46)..(46)<223>第46位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(47)..(47)<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第38-46位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(48)..(48)<223>第48位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第49-54位的Xaa存在。
<220>
<221>misc_feature<222>(49)..(49)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(50)..(50)<223>第50位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第51-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(51)..(51)<223>第51位的Xaa是蘇氨酸或不存在。如果是蘇氨酸，則第52-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(52)..(52)<223>第52位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第53-54位的Xaa存在。
<220>
<221>misc_feature<222>(53)..(53)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(54)..(54)<223>第54位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(61)..(61)<223>第61位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(62)..(62)
<223>第62位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，則第61位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(63)..(63)<223>第63位的Xaa不存在或存在，如果存在，第63位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第63位的Xaa，則第61-62位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(64)..(64)<223>第64位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，則第61-63位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(65)..(65)<223>第65位的Xaa不存在或存在，如果存在，第65位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第65位的Xaa，則第61-64位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(66)..(66)<223>第66位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，則第61-65位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(67)..(67)<223>第67位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第61-66位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(68)..(68)<223>第68位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第61-67位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(69)..(69)<223>第69位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第61-68位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(70)..(70)<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第61-69位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(71)..(71)<223>第71位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第72-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(72)..(72)<223>第72位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第73-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(73)..(73)<223>第73位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，則第74-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(74)..(74)<223>第74位的Xaa是蘇氨酸或不存在。如果是蘇氨酸，則第75-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(75)..(75)<223>第75位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，則第76-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(76)..(76)<223>第76位的Xaa是纈氨酸或不存在。如果是纈氨酸，則第77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(77)..(77)<223>第77位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(84)..(84)<223>第84位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(85)..(85)<223>第85位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，則第84位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(86)..(86)<223>第86位的Xaa不存在或存在，如果存在，第86位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第86位的Xaa，則第84-85位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(87)..(87)<223>第87位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，則第84-86位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(88)..(88)<223>第88位的Xaa不存在或存在，如果存在，第88位的Xaa是半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸。如果存在第88位的Xaa，則第84-87位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(89)..(89)<223>第89位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，則第84-88位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(90)..(90)<223>第90位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第84-89位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(91)..(91)<223>第91位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第84-90位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(92)..(92)<223>第92位的Xaa是絲氨酸或不存在。如果是絲氨酸，則第84-91位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(93)..(93)<223>第93位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，則第84-92位的Xaa存在。
<400>133Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr20 25 30Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile65 70 75 80Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa85 90<210>134<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>134Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20<210>135<211>23
<212>PRT<213>流感病毒<400>135Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys1 5 10 15Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20<210>136<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>136Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys1 5 10 15Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp20<210>137<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>137Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys1 5 10 15Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20<210>138<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>138Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys1 5 10 15Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp20
<210>139<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>139Ser Leu Leu Thr Glu Val Asp Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys1 5 10 15Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp20<210>140<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>140Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys1 5 10 15Lys Cys Arg Asp Ser Ser Asp20
權利要求
1.長度為大約150-大約375個氨基酸殘基的重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子，包括4個通過肽鍵連接的氨基酸殘基序列結構域，從N-末端開始命名為結構域I、II、III和IV，其中(a)結構域I包含(i)大約75-大約160個氨基酸殘基，其序列至少包含HBc的第4位到大約75位的殘基的序列，(ii)在嵌合體分子中相對于SEQ ID NO1的HBc的N-末端的大約1-大約-55的位置上存在的1-3個半胱氨酸殘基[N-半胱氨酸殘基]，所述一個或多個N-半胱氨酸殘基存在于除HBc的前核心序列的序列之外的序列中，和(iii)包含SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的大約6-大約24個殘基的2-4個序列，所述多肽與HBc序列的N-末端的大約15個殘基通過肽鍵連接，或通過肽鍵連接在HBc序列的N-末端的大約15個殘基內；(b)結構域II包含通過肽鍵與大約75號殘基連接的大約0-大約60個氨基酸殘基，其中包含(i)HBc的76-85位的序列中的0-所有殘基，和(ii)具有大約6-大約48個殘基的任選序列，其構成SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的一個或多個具有大約6-大約24個殘基的重復序列；(c)結構域III是通過肽鍵連接于大約85號殘基的HBc序列的大約86位到大約135位；和d)結構域IV包含(i)通過肽鍵連接于結構域III的大約135位殘基的大約136-140位殘基加上HBc氨基酸殘基序列從141-156位的最多16個殘基，(ii)0-3個半胱氨酸殘基，和(iii)與HBc的156位到C-末端異源的序列中的最多約100個氨基酸殘基；所述嵌合體分子(i)HBc序列中包含不超過10％的保守取代的氨基酸殘基，(ii)自組裝為基本不與宿主細胞上表達的核酸結合的顆粒，這些顆粒比由缺乏所述N-末端半胱氨酸殘基或嵌合體分子中存在的N-末端半胱氨酸被其它殘基替代的其它方面相同的HBc嵌合體形成的顆粒在形成時更穩定。
2.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽之一的所述殘基X17和X19之一是半胱氨酸。
3.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽之一的所述殘基X17和X19之一是絲氨酸或丙氨酸。
4.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽包括殘基X2-X24。
5.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽之一的所述殘基X17和X19都是半胱氨酸。
6.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I基本由HBc序列的第2位-第75位組成。
7.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域IV包括0個半胱氨酸殘基。
8.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域IV不含所述與HBc的第156位-C-末端異源的序列。
9.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域IV包括通過肽鍵與140號殘基連接的HBc序列的141位-大約149位殘基的具有大約9個氨基殘基的序列。
10.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I包括一個N-末端半胱氨酸殘基。
11.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域IV包括一個C-末端半胱氨酸殘基。
12.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I包括3個所述M2多肽序列。
13.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I包括2個所述M2多肽序列。
14.權利要求1的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域II包含HBc序列的76-85位的氨基酸殘基。
15.權利要求9的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽之一的所述殘基X17和X19之一是半胱氨酸。
16.權利要求9的重組HBc嵌合體蛋白分子，其長度是大約170-大約215個殘基。
17.序列中具有大約150-大約235個氨基酸殘基的重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子，包括4個通過肽鍵連接的結構域，從N-末端開始命名為結構域I、II、III和IV，其中(a)結構域I包含(i)大約95-大約140個氨基酸殘基，其序列至少包含HBc的第4位到大約75位的殘基的序列，(ii)在嵌合體分子中相對于SEQ ID NO1的HBc的N-末端的大約1-大約-55的位置上存在的1-3個半胱氨酸殘基[N-半胱氨酸殘基]，所述一個或多個N-半胱氨酸殘基存在于除HBc的前核心序列的序列之外的序列中，和(iii)包含SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的大約6-大約24個殘基的2-4個序列，所述多肽與HBc序列的N-末端的大約15個殘基通過肽鍵連接，或通過肽鍵連接在HBc序列的N-末端的大約15個殘基內；(b)結構域II包含通過肽鍵與大約75號殘基連接的大約0-大約60個氨基酸殘基，其中包含(i)HBc的76-85位的序列中的0-所有殘基，和(ii)具有大約6-大約48個殘基的任選序列，其構成SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的一個或多個具有大約6-大約24個殘基的重復序列；(c)結構域III基本由HBc序列的大約86位到大約135位組成；和d)結構域IV包含(i)通過肽鍵連接于結構域III的大約135位殘基的大約136-140位殘基加上HBc氨基酸殘基序列從141-156位的最多16個殘基，(ii)0或1個半胱氨酸殘基，和(iii)與HBc的156位到HBcC-末端異源的序列中的最多約50個氨基酸殘基；所述嵌合體分子(i)HBc序列中包含不超過10％的保守取代的氨基酸殘基，(ii)自組裝為基本不與宿主細胞上表達的核酸結合的顆粒，這些顆粒比由缺乏所述N-末端半胱氨酸殘基或嵌合體分子中存在的N-末端半胱氨酸被其它殘基替代的其它方面相同的HBc嵌合體形成的顆粒在形成時更穩定。
18.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域IV包括通過肽鍵與140號殘基連接的HBc的141位-大約149位殘基的具有大約9個氨基殘基的序列。
19.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I包括一個N-末端半胱氨酸殘基。
20.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域IV包括一個C-末端半胱氨酸殘基。
21.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I包括3個所述M2多肽序列。
22.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域I包括2個所述M2多肽序列。
23.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽包括殘基X6-X24。
24.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域II包含HBc序列的76-85位的氨基酸殘基。
25.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中結構域II包含HBc序列的76-85位的氨基酸殘基，其進一步包含SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的6-大約23個殘基。
26.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其中SEQ ID NO9的所述M2多肽的所述殘基X17和X19之一是半胱氨酸。
27.權利要求17的重組HBc嵌合體蛋白分子，其長度是大約170-大約215個殘基。
28.包含權利要求1的重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子的顆粒。
29.包含權利要求28的重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子的顆粒，所述嵌合體分子包括SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的C-末端19個殘基。
30.包含權利要求17的重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子的顆粒。
31.包含權利要求30的重組乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合體分子的顆粒，所述嵌合體分子包括SEQ ID NO9的甲型流感M2多肽的C-末端19個殘基。
32.一種疫苗或接種物，包含溶解或分散于藥學可接受稀釋劑中的免疫原性有效量的權利要求28的免疫原性顆粒。
33.一種疫苗或接種物，包含溶解或分散于藥學可接受稀釋劑中的免疫原性有效量的權利要求30的免疫原性顆粒。
34.權利要求33的疫苗或接種物，其中所述重組嵌合HBc蛋白分子顆粒存在于植物組織中。
35.權利要求33的疫苗或接種物，進一步包含佐劑。
36.權利要求35的疫苗或接種物，其中所述佐劑是明礬。
37.權利要求35的疫苗或接種物，其中所述佐劑是選自胞壁酰二肽、7-取代的8-氧-或8-硫-鳥苷衍生物7、單磷脂酰脂質A、鋁或鈣鹽的小分子。
38.權利要求35的疫苗或接種物，其中所述佐劑是用所述免疫原性顆粒和所述藥學可接受稀釋劑乳化的油。
39.權利要求38的疫苗或接種物，其中所述乳液是具有水相和油相的油包水乳液。
40.權利要求38的疫苗或接種物，其中所述乳液是具有水相和油相的水包油乳液。
41.權利要求40的疫苗或接種物，其中所述乳液的油相包含角鯊烯。
42.權利要求38的疫苗或接種物，其中所述乳液的油相包含角鯊烷。
43.權利要求38的疫苗或接種物，其中所述乳液的水相和油相是由乳化劑乳化的，所述乳化劑是山梨聚糖或二縮甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
44.權利要求38的疫苗或接種物，其中所述乳化劑是二縮甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
45.權利要求44的疫苗或接種物，其中所述二縮甘露醇C12-C24脂肪酸酯的C12-C24脂肪酸是油酸。
46.編碼權利要求1的重組HBc蛋白分子的核酸，或其變體、類似物或互補序列。
47.編碼權利要求17的重組HBc蛋白分子的核酸，或其變體、類似物或互補序列。
48.一種重組核酸分子，包含操作性連接于限定編碼權利要求1的重組HBc蛋白分子的基因或其變體、類似物或互補序列的核酸片段和適于在相容的宿主生物中驅動基因表達的啟動子。
49.一種重組核酸分子，包含操作性連接于限定編碼權利要求17的重組HBc蛋白分子的基因或其變體、類似物或互補序列的核酸片段和適于在相容的宿主生物中驅動基因表達的啟動子。
50.用權利要求49的重組核酸分子轉化的宿主細胞。
51.權利要求50的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌-大腸桿菌雜交體。
52.用權利要求48的重組核酸分子轉化的宿主細胞。
53.權利要求52的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌-大腸桿菌雜交體。
全文摘要
公開了嵌合的、羧基末端截短的乙型肝炎核殼(HBc)蛋白，其含有用于誘導流感M2蛋白的抗體生成的免疫原。2－4個拷貝的免疫原性流感序列優選在N－末端上或N－末端附近，或在HBc免疫原性環序列中表達。HBc嵌合體優選含有流感特異性T細胞表位，并且優選經過工程化以便增強自組裝顆粒的穩定性并且增強所述嵌合顆粒的產率。也公開了制備和使用所述嵌合體的方法。
文檔編號C12N7/04GK1913920SQ200480041451
公開日2007年2月14日 申請日期2004年12月9日 優先權日2003年12月10日
發明者A·比爾克特, W·費爾斯 申請人:阿波維亞公司, 弗拉姆斯大學校際生物科技研究所