專利名稱：基因標記的獲取方法
技術領域：
本發明涉及基因標記的獲取方法以及基因標記的分析方法。
背景技術：
通過比較各種細胞的基因表達狀態可以賦予細胞特征。即，能夠得到通過基因的表達模式表現細胞狀態的細胞目錄。利用該目錄，能夠從基因的表達狀態特定細胞。相反，如果在細胞間比較基因的表達模式則還能夠找出各細胞中的特征基因。例如，如果在正常細胞和施加了人為處理的細胞之間比較基因的表達狀態，則可以發現施加了人為處理時表達水平發生變化的基因。該基因是作為人為處理結果的表達水平發生了變化的基因。同樣，通過在患者的細胞和健康者的細胞之間比較基因的表達狀態，則也能夠發現與疾病相關的基因。
把這樣通過比較基因的表達狀態，網羅式地分析在處于某種狀態的細胞中表達的基因，并在細胞間比較其種類和表達水平的過程稱為基因的表達分析(expression analysis)。用于基因表達分析的方法可以使用各種方法。
例如，以下所示的方法是為了分離在cDNA文庫間表達水平有所變化的基因而開發的方法。
差異顯示法(differencial display)消減文庫法(subtraction library)這些方法是很早以前就已經實用化的方法。任何一個都是用來在來源不同的cDNA文庫間發現表達水平有所不同的基因的分析方法。在膨大的基因堿基序列信息得到積累的這幾年，利用了該堿基序列信息的更有效的基因表達分析得以實現。即DNA陣列法。在DNA陣列中高密度地配置有多達數萬個的基因探針。通過使用1個DNA陣列，通過一次的實驗操作即可了解數萬個基因的表達狀態。人的基因種類推測有3萬～4萬，因此DNA陣列作為強力推進人的基因表達分析的工具正在廣泛普及。并且，DNA陣列被評價為在治療目標的探索、藥劑候選化合物的開發中是有用的(Nature Genetics volume 32 supplement pp 547-552，2002)。
但是，通常構成DNA陣列的探針是根據已知的堿基序列信息設計的。因此，是不適于獲取未知基因的工具。并且，目前商業上所提供的DNA陣列限于基因序列信息充分積累的生物物種。例如，Affymetrics公司提供下述生物物種的DNA陣列。
擬南芥(Arabidopsis ATH1 Genome Array)線蟲(C.elegans Genome Array)果蠅(Drosophila Genome Array)大腸桿菌(E.coli Antisense Genome Array)人(Human Genome Focus Array、其它)小鼠(Mouse Expression Set 430、其它)綠膿桿菌(P.aeruginosa Genome Array)大鼠(Rat Expression Set 230、其它)酵母(Yeast Genome S98 Array)為了利用DNA陣列進行其它生物物種的基因表達分析，使用者必須利用測位儀等制作DNA陣列。或者必須利用定做陣列的制作服務。然而，對于基因序列表的積累不充分的生物物種，準備以基因序列信息為基礎的DNA陣列還是困難的。
作為能夠獲得未知的基因、而且能夠進行高度有效的基因表達分析的方法，提出了SAGE(基因表達的連續分析，Serial analysis of geneexpression)(SCIENCE，Vol.270，484-487，Oct.20，1995)。SAGE是獲取基因中固有的標記并網羅式地分析標記的堿基序列的方法。所謂的基因標記是指可作為該基因的名片使用的基因的片斷。通常，10～20個堿基左右的連續堿基序列在不同基因之間完全一致的可能性不是那么高。例如由9個堿基構成的片斷，理論上可以識別262144種類(49)的基因。因此，該程度長度的片斷作為基因標記是有用的。
在人基因組序列中，由18～21個堿基構成的標記序列的出現頻率和該標記序列為基因中固有堿基序列的可能性如下計算。
18每268,435,456個堿基出現1次，89.43％19每1,073,741,824個堿基出現1次，97.24％20每4,294,967,296個堿基出現1次，99.3％21每17,179,869,184個堿基出現1次，99.83％即，理論上可以認為18個堿基的標記序列中以約90％或以上、20個堿基的標記序列中以約99％或以上的概率是基因中固有的堿基序列。某基因中固有的堿基序列被稱為基因中獨特的堿基序列。另外，在基因組中其出現頻率被認為是1的堿基序列被稱為基因組中的獨特的堿基序列。
在SAGE中，利用IIs型限制性酶(IIs型核酸內切酶)的作用，生成基因標記。在SAGE中生成標記的IIs型限制性酶被稱為標記酶。II型的限制性酶切割DNA識別序列的中部，與此相對，IIs型限制性酶切割遠離識別序列的位置。識別序列和切割位置之間的距離根據酶不同，基本是一定的。例如，Bsm FI或FokI在距離識別序列9～10個堿基的位置處切割DNA，殘留粘性末端(sticky end)。作為其它也具有同樣作用的IIs型限制性酶，已知有如下的酶(Szybalski，Gene 40169，1985)。
BbvI，BbvII，BinI，FokI，HgaI，HphIMboII，MnlI，SfaNI，TaqII，TthlllII另外，被稱為Mme I的IIs型限制性酶將距離識別序列(5’-TCCRAC-3’)20個堿基的位置切割(Tucholski et al，Gene Vol.157，pp.87-92，1995)。將Mme I作為標記酶進行利用，能夠得到20個堿基長的標記的表達分析方法也是公知的(美國專利6498013)。利用Mme I的SAGE特別也被稱為long SAGE。以下簡單地歸納一般的SAGE的原理。
首先使用II型限制性酶切割cDNA并回收其片斷。II型限制性酶的識別序列為4個堿基時，理論上被切割成256個堿基(44)的片斷。例如，Nla III的識別序列為4個堿基。將cDNA的5’末端或者3’末端先捕獲在固相中，就能夠容易地分別回收被切割的cDNA的5’端或者3’端的片斷。回收的cDNA分為2個反應體系，對各反應體系分別進行以下的操作。
在回收的cDNA切割位置上，連接物(adapter)被連接。連接物的末端配置有PCR擴增用的引物堿基序列、中間配置有錨定酶的識別序列、在與cDNA連接的末端配置有IIs型限制性酶(標記酶)的識別序列。在分為2個不同庫的cDNA中，含有不同堿基序列的引物的堿基序列的連接物分別與其連接。連接物連接后使IIs型的限制性酶發揮作用，IIs型限制性酶識別cDNA的末端，并切割遠離此處的位置。這樣就生成了從被II型限制性酶切割的部分到被IIs型限制性酶切割的部分的片斷所構成的標記。所生成的標記具有被連接的連接物。
通過IIs型限制性酶的切割而形成的標記的粘性末端(sticky end)通過T4DNA聚合酶變成平滑末端。其后，分為上述2個反應體系的標記分別在平滑末端被連接。其結果是將不同引物序列配置在末端，2個標記相向連接。2個標記被連接的產物稱為雙標記。雙標記通過PCR被擴增，被錨定酶切割。其結果是從PCR的擴增產物中除去其兩端的引物序列。另外，除去了引物序列的雙標記成為相互連接的雙標記的連環體(concatemer)。如此得到的連環體被插入在測序載體中。
如果分析連環體的堿基序列，則能夠同時了解來自于多個基因的基因標記的堿基序列。如果積累從某個cDNA文庫中得到的連環體的堿基序列信息，則在理論上就可得到構成該文庫的cDNA的全部基因的標記信息。將如此得到的標記信息在細胞間進行比較，能夠容易地進行表達分析。
在利用DNA陣列進行的表達分析中，堿基序列信息的積累是不可缺少的。因此，目前商業上可獲得的DNA陣列限定于人、小鼠或酵母等一部分生物物種。即，對于其它多數生物物種而言，為了進行使用DNA陣列的基因表達分析，必須重新制作DNA陣列。另外，DNA陣列將根據已知堿基序列信息合成的探針或者克隆的cDNA作為探針使用。其結果是通常來說發現未知的基因是困難的。與此相對，SAGE方法中，基因的堿基序列信息的積累不充分并不會成為分析的障礙。并且，可以說不需要探針的SAGE是對于未知基因的分離有用的技術。
但是，在目前實用化的SAGE規程中，利用限制性酶切割cDNA，在所得切割位置連接含有IIs型限制性酶識別序列的接頭。因此，在用于SAGE的限制性酶中，要求識別序列短。在識別序列長的限制性酶(rare cutter)中，未切割的cDNA變多。就已知的SAGE而言，不能被限制性酶切割的cDNA不生成標記。
例如，作為識別4個堿基的限制性酶的NlaIII等限制性酶優選用于SAGE中。理論上，如果cDNA具有44(＝256)或以上的長度，則可以說其含有至少一個NlaIII的識別序列。確切地說，256個堿基或以下的轉錄產物存在的可能性可能很低。但是，并非構成文庫的所有cDNA通常都含有NlaIII的識別序列。即，即便是具有256個堿基或以上長度的cDNA，也有不生成標記的可能性。實際上，在將線蟲的基因作為模型的SAGE評價中，報告有由于不帶有NlaIII識別序列，因此存在不生成標記的基因(Genome Res.2003 Jun.13/6A1203-15)。
另外，經過該工序可獲得的標記是與構成cDNA的堿基序列中的限制性酶識別部位鄰接的堿基序列。就未知的基因而言，無法提前預測cDNA中哪里存在限制性酶識別序列。即。通過公知的SAGE所獲得的標記序列信息并不能預測來自于cDNA的何處。
美國專利6498013中公開了通過捕獲cDNA的5’端或3’端，可分別得到5’端或3’端的標記。但是通過該工序生成的標記由鄰接于位于cDNA的5’端或3’端的限制性酶(NlaIII)的堿基序列構成。換而言之，該標記在cDNA中所含有的限制性酶識別位點中，是與位于cDNA的5’端或3’端的限制性酶(NlaIII)鄰接的堿基序列。也就是說，還不了解是占據cDNA的堿基序列何處的堿基序列。
就基因表達分析而言，構成標記的堿基序列來自于cDNA中的何處并不是大問題。但是，如果能夠明確標記的堿基序列是構成cDNA哪個部分的堿基序列，則標記的有用性會進一步提高。
非專利文獻1Nature Genetics volume 32 supplement pp 547-552，2002非專利文獻2SCIENCE，Vol.270，484-487，Oct.20，1995非專利文獻3Szybalski，Gene 40169，1985非專利文獻4Tucholski et al，Gene Vol.157，pp.87-92，1995非專利文獻5Genome Res.2003 Jun.13/6A1203-15專利文獻1美國專利649801
發明內容本發明的目的在于提供以新型原理為基礎的基因標記的獲取方法以及基因標記的分析方法。
如前所述，就目前實用化的SAGE而言，鄰接于限制性酶的識別序列的堿基序列作為標記而生成。這使得難以理解標記的堿基序列和cDNA全長序列的關系。另外，關于不含限制性酶識別序列的cDNA還留有不生成標記的問題。
本發明人等認為如果能夠不依賴于限制性酶的識別序列而生成標記的話，則能夠解決這些問題。例如，如果利用mRNA的5’末端生成標記，則標記的堿基序列應該能夠期待各種有用性。因此，著眼于作為cDNA合成方法所利用的CAP結構，嘗試將其用于基因標記的獲取中。結果發現，可將mRNA的5’末端堿基序列信息作為標記獲得，從而完成了本發明。即，本發明涉及以下的標記獲取方法以及利用該方法獲得的標記的用途。
一種真核細胞的基因標記的制造方法，其含有以下工序
(1)在RNA的CAP部位上連接含有IIs型限制性酶的識別序列的RNA接頭的工序、(2)將(1)的RNA作為模板合成cDNA的工序、(3)使識別RNA接頭中所含識別序列的IIs型限制性酶作用于(2)的cDNA，從而生成基因標記的工序。
[1]中記載的方法，其中通過以下工序合成cDNA，i)通過對RNA的任意區域退火的引物合成cDNA的第1鏈的工序、和ii)通過對以第1鏈的RNA接頭作為模板合成的區域退火的引物，合成cDNA的第2鏈，從而制成雙鏈cDNA的工序。
[2]中記載的方法，其中，對以第1鏈的RNA接頭作為模板合成的區域退火的引物具有可結合于固相的標識、或者被固定在固相上，另外，所述方法含有通過回收所述固相來回收雙鏈cDNA的工序。
[3]中記載的方法，其中在使IIs型限制性酶作用之前或之后將固相回收。
[1]中記載的方法，其中RNA接頭含有II型限制性酶的識別序列。
[1]中記載的方法，該方法包括使基因標記的IIs型限制性酶的切割部位與其它基因標記的IIs型限制性酶的切割部位連接，從而生成雙標記的工序。
[6]中記載的方法，該方法包括通過對RNA接頭退火的引物來擴增雙標記的工序。
[1]中記載的方法，該方法包括在基因標記的IIs型限制性酶的切割部位上連接具有任意堿基序列的連接物，通過對RNA接頭和所述連接物退火的引物來擴增基因標記的工序。
一種基因標記的連環體的制造方法，該方法包括連接多個通過[1]所記載的方法生成的基因標記的工序。
一種基因標記的連環體的制造方法，該方法包括連接多個通過[6]所記載的方法生成的雙標記的工序。
一種基因標記的堿基序列的確定方法，該方法含有確定通過[9]或[10]中所述的連環體的堿基序列的工序。
一種基因標記的制造用試劑盒，該試劑盒含有以下要素(a)由含有IIs型限制性酶的識別序列的寡核苷酸構成的RNA接頭、(b)用于將RNA接頭連接于RNA的CAP部位的試劑、(c)由對以RNA接頭為模板合成的cDNA退火的寡核苷酸構成的cDNA第2鏈合成用的引物、(d)cDNA第1鏈合成用引物。
[12]中記載的試劑盒，其中cDNA第1鏈合成用引物是選自以下i)～iii)中的任一個引物，i)隨機引物、ii)寡dT引物、和iii)含有與特定mRNA互補的堿基序列的引物。
一種真核細胞中基因表達譜的獲取方法，該方法含有以下工序(1)通過[1]所記載的方法制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序、和(3)通過對應所確定的堿基序列及其出現頻率來得到表達譜的工序。
一種基因表達譜的數據庫，其中積累了通過[14]所述的方法獲得的基因表達譜信息。
一種基因表達譜的分析方法，該方法含有通過[14]所述方法獲得不同種類細胞的基因表達譜、比較基因表達譜、并選擇在細胞間表達頻率不同的基因標記的工序。
一種基因的轉錄起始點的確定方法，該方法含有以下工序(1)通過[1]所述的方法制造基因標記的工序、
(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序、和(3)將所確定的堿基序列定位于基因組的堿基序列上，并將堿基序列一致的區域作為該基因的轉錄起始點來鑒定的工序。
[17]所記載的方法，其特征在于，用于合成cDNA第一鏈的引物是由從特定基因的堿基序列中選擇的堿基序列構成的，并確定該基因的轉錄起始點。
一種cDNA合成用引物組，該引物組包含用于合成含有通過以下工序確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和對cDNA的任意部位退火的3’端引物，(1)通過[1]所述的方法制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序。
[19]所記載的引物組，其中3’端引物是選自下述引物中的任一個，i)寡dT引物、ii)cDNA的片斷序列信息、和iii)由與cDNA的II型限制性酶識別鄰接的基因標記的堿基序列或其互補序列構成的引物。
一種全長cDNA的合成方法，該方法含有以下工序a)使用用于合成含有通過以下(1)～(2)的工序確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和由寡dT引物構成的3’端引物，以RNA或cDNA為模板進行互補鏈合成反應的工序、(1)通過[1]所述的方法制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序；b)將合成的DNA作為全長cDNA回收的工序。
一種通過[21]所述的方法能夠得到的全長cDNA。
一種含有由[22]所述的全長cDNA編碼的氨基酸序列的多肽。
一種識別[23]所述的多肽的抗體。
一種將[22]所述的全長cDNA的編碼區域以可表達的方式保持的載體。
一種將[25]所述的載體以可表達的方式保持的轉化體。
一種[23]所述的多肽的制造方法，該方法含有培養[26]所述的轉化體，并回收表達產物的工序。
一種[23]所述的多肽的制造方法，該方法含有以下工序i)將含有功能性地連接于啟動子的[22]所述的全長cDNA的編碼區域的DNA構成物與支持生物體外翻譯的要素相接觸的工序、和ii)回收表達產物的工序。
一種含有mRNA的5’末端堿基序列的cDNA的合成方法，該方法含有以下工序a)使用用于合成含有通過以下工序(1)～(2)確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和由與目標mRNA任意區域互補的堿基序列構成的3’端引物，以RNA或cDNA為模板進行互補鏈合成反應的工序、(1)通過[1]所述的方法制造基因標記的工序、和(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序；b)將合成的DNA作為含有mRNA的5’末端堿基序列的cDNA回收的工序。
一種確定mRNA的5’端堿基序列的方法，該方法含有確定通過[29]所述的方法回收的cDNA的堿基序列的工序。
本發明提供將mRNA的5’末端堿基序列作為基因標記獲取的方法。mRNA的5’末端是所有真核細胞的mRNA所具有的結構。因此，無論是什么mRNA的堿基序列，在原理上可從所有的基因中獲得標記。另一方面，以公知的原理為基礎的SAGE將與限制性酶識別位點鄰接的區域作為標記生成。其結果是如果構成mRNA的堿基序列中不含限制性酶識別位點，則不能獲得該基因的標記。因此，在提供能夠獲取所有基因的標記的原理方面，本發明的意義重大。
另外，根據本發明的標記的方法，有可能也可以從mRNA的片段中獲得基因的標記。生物試樣中含有的RNA由于各種原因常常有分解的危險。因此，cDNA的獲得、或者以所得cDNA為基礎的各種分析結果很大程度上被mRNA的保存條件所左右。SAGE法在不能完整維持mRNA的結構時，也有不能獲得基因標記或者標記重現性消失的可能性。
但是根據本發明的方法，通過將mRNA的5’末端作為標記獲得，即便mRNA被片斷化，只要維持了5’末端的結構，就能正確地獲得標記。因此，很難受到mRNA的保存狀態的影響。該特征提高了基因表達分析的可靠性。
另外，通過本發明可以得到的標記的堿基序列由mRNA的5’末端的堿基序列構成。其結果是通過本發明得到的標記的堿基序列信息可應用于各種領域。例如，以下的用途是通過本發明的標記首次實現的用途基因組中轉錄起始點的鑒定、全長cDNA的合成用引物的提供、cDNA文庫的全長率評價。
通過以已知原理為基礎的SAGE得到的標記是mRNA的何處的堿基序列還不清楚。因此，不能用于這種用途。
本發明涉及含有以下工序的真核細胞的基因標記的制造方法，(1)在RNA的CAP部位連接含有IIs型限制性酶的識別序列的RNA接頭的工序、(2)將(1)的RNA作為模板合成cDNA的工序、(3)使識別RNA接頭中所含識別序列的IIs型限制性酶作用于(2)的cDNA，從而生成由RNA的5’末端序列構成的基因標記的工序。
CAP結構是存在于真核細胞或感染真核細胞的病毒的mRNA的5’末端的結構。具體地說，7-甲基鳥苷介由5’-5’-3磷酸交聯而結合于mRNA的5’末端的核苷酸上，構成CAP結構。mRNA由CAP結構保護，避免被5’-3’核酸外切酶的活性所分解。在細胞內，完成作用的mRNA的CAP結構由脫帽酶(decapping enzyme)除去。其結果是失去CAP結構的mRNA被5’-3’核酸外切酶所分解(LaGradeur et al.，EMBO J，171487-1496，1998)。CAP結構在通過RNA聚合酶II進行的轉錄反應的初期階段加成在RNA的5’末端上。
本發明的方法包括在該RNA的CAP結構上連接RNA接頭的工序。本發明中，RNA可以使用來自于真核細胞的所有RNA。更具體地說，可以使用polyA(+)RNA或全部RNA。詳細言之，可以利用來自于動物、植物、酵母或粘菌等所有在mRNA中具有CAP結構的生物物種的細胞。
另外，來自于感染這些真核細胞的病毒的RNA也具有CAP結構。因此，本發明中來自于真核細胞、感染真核細胞或轉錄了被導入的基因信息的RNA也包含在來自于真核細胞的RNA中。所謂感染真核細胞的基因的信息包括例如病毒、類病毒或者支原體之類的細胞內寄生物的基因信息。這些基因信息可以是天然的，也可以是人工合成的。另一方面，導入在真核細胞中的基因的信息是指通過載體等人為導入的基因信息。例如，即便是原本不帶有CAP結構的原核細胞的基因，通過以能夠轉錄的形式導入至真核細胞中，也能獲得CAP結構。這樣轉錄的RNA也包含在本發明的來自于真核細胞的RNA中。
從這些細胞中提取RNA用于本發明的方法中。RNA的提取方法眾所周知。利用市售的RNA提取用試劑盒則很便利。例如，利用RNAeasy(QIAGEN)等市售試劑盒，能夠容易地獲得高純度的RNA。提取RNA時，在必須破壞細胞時可以通過公知的方法進行破壞。
本發明中，連接于CAP結構的RNA接頭由至少含有IIs型限制性酶識別序列的寡核苷酸構成。作為RNA接頭使用的寡核苷酸可以是DNA也可以是RNA。優選的RNA接頭為RNA。構成RNA接頭的堿基序列可以是含有IIs型限制性酶識別序列的任意堿基序列。但優選IIs型限制性酶的識別序列配置在RNA接頭的3’末端。
IIs型限制性酶將其識別序列作為基準，將僅距離一定堿基數的位置切割。本發明的目的在于將mRNA的5’末端作為標記獲得。因此，優選在盡量接近于mRNA的5’末端的位置上配置識別序列。構成RNA接頭的IIs型限制性酶的識別序列可以按照分析用的IIs型限制性酶進行設計。例如，已經敘述過MmeI的識別序列為5’-TCCRAC-3’(R＝G或A)。因此，RNA接頭優選在其3’末端上配置該堿基序列。另外，IIs型限制性酶的識別序列按照IIs型限制性酶將其3’端切割的方式進行配置。
作為本發明的RNA接頭有用的堿基序列如下所示。該堿基序列除了具有配置于3’末端的IIs型限制性酶(MmeI)的識別序列(TCCRAC；大寫)，還含有作為II型限制性酶的XhoI的識別序列(cucgag；下劃線)。
5’-oligo 1(序列號1)5’-uuuggauuugcuggugcaguacaacuaggcuuaauacucgagUCCGAC-3’5’-oligo 2(序列號2)5’-uuucugcucgaauucaagcuucuaacgauguacgcucgagUCCGAC-3’所加成的XhoI位點可以用于標記的連接以及向載體中的插入。并且，構成RNA接頭的堿基序列也可作為用于標記擴增的引物進行退火的區域使用。為了引物退火，用于退火的區域優選至少由15個堿基、通常由20～50個堿基、例如由20～30個堿基構成。另外，該構成堿基可以按照引物的熔解溫度(Tm)通常為60～80℃、例如為65～75℃左右的方式進行設計。用于引物退火的堿基序列是任意的。因此，例如可以使用能夠賦予上述Tm的任意堿基序列。
用于引物退火的堿基序列是任意的。而且，構成各種限制性酶識別序列的區域以及用于使引物退火的區域也可在RNA接頭中重復。然而，當使相對于2種RNA接頭不同的引物退火時，通過按照不重復的方式進行設計，則可期待退火的特異性提高。
就本發明而言，RNA接頭連接于RNA的CAP結構上。用于將寡核苷酸連接在CAP結構的方法是任意的。例如寡核苷酸帽法是本發明中用于RNA接頭結合的優選方法。寡核苷酸帽法是為了合成保持了mRNA的5’端堿基序列的cDNA而開發的方法(Maruyama，K andSugano，S.Gene 138171-174，1994)。寡核苷酸帽法中，利用mRNA的3’末端poly(A)序列和連接于5’末端CAP結構的RNA接頭的堿基序列，實現了全長cDNA的獲得。由于5’端的堿基序列不完整的mRNA不保持CAP結構，因此RNA接頭不被連接。所以，就寡核苷酸帽法而言，能夠特異性地獲得全長cDNA。
以下，對于寡核苷酸帽法的反應原理進行簡單說明。首先，利用細菌堿性磷酸酯酶(BAP)處理mRNA，水解不帶CAP結構的RNA的5’末端的磷酸基。在此過程中，不帶CAP結構的RNA失去了5’末端的磷酸基。即，片斷化的RNA或來自于線粒體的RNA等的5’末端上突出的磷酸基被除去。接著，使煙酸性焦磷酸酶(TAP)作用。TAP將CAP結構的三磷酸鍵水解。結果是能夠對具有CAP結構特異性地賦予RNA5’末端的磷酸基。
在BAP和TAP處理過的RNA上連接RNA接頭。RNA接頭的結合如可利用T4RNA連接酶。利用T4RNA連接酶進行的連接需要5’末端的磷酸基。因此，相對于通過TAP獲得了5’末端磷酸基的RNA，RNA接頭被特異性地連接。這樣，能夠將RNA接頭特異性地結合在CAP結構上。另外，就處理RNA的反應而言，優選所有工序在排除了RNase的環境下進行。
在寡核苷酸帽法中報告了幾個變異。例如已知有利用CAP結合蛋白質柱來精制具有CAP結構的RNA的方法(Edery，L.et al.，Mol.CellBiol.153363-3371，1995)。如果利用該方法，則能夠將具有CAP結構的RNA捕獲在固相上。如果洗滌固相將不具有CAP結構的RNA除去后用TAP處理，則能夠回收具有CAP結構的RNA。這樣回收的RNA由于在5’末端具有磷酸基，因此可以直接連接RNA接頭。即、利用CAP結合蛋白質的方法不需要BAP處理。
接著，將連接了RNA接頭的RNA作為模板合成cDNA。用于合成cDNA的方法是任意的。以下記載了用于合成cDNA的代表性方法。
通常，cDNA的合成由第1鏈的合成和第2鏈的合成2個步驟構成。第1鏈的合成是將RNA作為模板進行利用的逆轉錄反應。與此相對，第2鏈是通過將之前合成的第1鏈DNA作為模板的互補鏈合成反應而合成。分別已知有通過引發反應的引物而帶有特征的幾個反應。
本發明中，cDNA的第1鏈可以通過對RNA任意區域退火的引物合成。將RNA作為模板、利用逆轉錄酶活性來合成DNA的方法是公知的。具體地說，利用來自于MMLV的逆轉錄酶(Reversetranscriptase；RT)或其變變體等、通過引物的延長反應合成第1鏈的方法是公知的。作為逆轉錄酶的變變體，市場上售有失去逆轉錄酶所具有的RNaseH活性的變變體(Superscript II，Gibco BRL)等。另外，如Tth DNA聚合酶那樣，在作為DNA合成酶的同時，還作為催化以RNA為模板的互補鏈合成反應的酶也被人們所了解。如果利用這種酶，也能夠用單一的酶合成第1鏈(RNA模板)的第2鏈(DNA模板)。接著，對于用于合成cDNA的引物進行說明。
在之前敘述的寡核苷酸帽法中，通常在第1鏈的合成中利用寡dT引物。由于為了合成cDNA的全長，必須從第1鏈的3’末端開始合成，因此利用具有與占據mRNA的3’末端的poly(A)互補的堿基序列的寡dT引物。本發明中也同樣，通過利用寡dT引物，能夠將全長cDNA的5’末端作為標記序列獲得。
與此相對，就本發明而言，并非必需RNA的全長。本發明中，標記可以從含有RNA的5’末端的微小區域中獲得。因此，如果含有RNA的5’末端的區域能夠作為cDNA合成的話，則能夠獲得本發明所必需的cDNA。因此，例如可以利用能夠從RNA任意部分開始互補鏈的隨機引物合成第1鏈。通過隨機引物的利用，即便是3’端的堿基序列是不完整的片斷，只要是具有CAP結構的RNA，就可獲得標記。從可由更廣范圍的RNA中獲得標記的方面看，隨機引物是在基因表達分析中特別有用的引物。
而且，在第1鏈的合成中，通過利用具有與特定基因堿基序列互補的堿基序列的引物，還能夠選擇性地獲得特定基因的標記。例如，對于僅清楚部分堿基序列、而5’端的堿基序列不清楚的基因，也能夠利用本發明獲得5’末端的標記序列。為此，在第1鏈的合成中，從明確的堿基序列中選擇制成引物的堿基序列。該引物將從mRNA的明確區域至5’末端的區域作為cDNA的第1鏈生成。由于引物是從特定基因的堿基序列中選擇的，因此不能從目標基因以外的RNA生成第1鏈。其結果也不生成標記。
將特定的基因作為對象、通過本發明的方法獲得的基因標記，可期待具有例如下述的有用性。首先，能夠以獲得的基因標記的堿基序列信息為基礎，清楚該基因的轉錄起始點。轉錄起始點是全長cDNA的獲得或啟動子的研究中重要的信息。例如，對于5’端堿基序列不清楚的cDNA，利用本發明的方法，能夠獲得5’端的cDNA。或者，即便是翻譯起始點已被鑒定的基因，也可通過基因標記的信息來評價其5’端非翻譯區域(5’UTR)是否完整。
而且，在編碼同一氨基酸序列的同時，明確了賦予轉錄起始點不同的多個轉錄產物的基因。將某種基因作為對象、對于各種mRNA來源，只要獲得本發明的基因標記，則能夠容易地收集該基因所有轉錄產物的轉錄起始點的信息。如果獲得多種基因標記，則在該基因中有存在轉錄起始點不同的多個轉錄產物的可能性。即，本發明提供含有以下工序的轉錄起始點不同的多個轉錄產物的檢測方法，(1)以本發明為基礎獲得基因標記的工序，其中使用對要分析的基因特異的引物作為cDNA的第1鏈合成用引物、(2)比較(1)中所得基因標記的堿基序列的工序、和(3)多種基因標記被檢測出時，檢測轉錄起始點不同的多個轉錄產物的工序。
利用本發明中檢測出的多種基因標記和所述基因特異的引物信息，能夠確定各轉錄產物的轉錄起始點的堿基序列。并且，以本發明為基礎，還可以比較各轉錄產物的表達水平。即，本發明提供含有以下工序的比較轉錄起始點不同的多個轉錄產物的表達水平的方法，(1)以本發明為基礎獲得基因標記的工序，其中使用對要分析的基因特異的引物作為cDNA的第1鏈合成用引物、
(2)比較(1)中所得基因標記的堿基序列的工序、和(3)以各基因標記的出現頻率為基礎，作為轉錄起始點不同的多個轉錄產物的表達水平獲得的工序。
除此之外，也可以有意地將具有共同堿基序列的RNA作為cDNA合成。例如，對于構成保存性高的蛋白質的功能域的氨基酸序列，將其進行編碼，則能夠以預測的堿基序列為基礎設計第1鏈合成用的引物。使用該引物合成的cDNA是編碼特定功能域的基因的cDNA的可能性很高。其結果是能夠有意地收集含有特定功能域的基因標記。通過比較如此得到的基因標記的表達水平，能夠比較具有特定功能的基因組的表達水平。
無論怎樣，本發明中所合成的cDNA的第1鏈在其3’末端具有與RNA接頭互補的堿基序列。因此，如果利用能夠對該區域退火的寡核苷酸，則能夠容易地合成cDNA的第2鏈。在合成第2鏈之前，可以通過堿水解將作為第1鏈模板的RNA除去。本發明中，第2鏈至少應該按照含有RNA接頭中所含的IIs型限制性酶的識別序列的方式進行合成。為此，例如可以利用能夠在比與配置于RNA接頭3’末端的IIs型限制性酶識別序列相當的區域更靠近3’端處開始互補鏈合成的引物。或者，還可以利用含有IIs型限制性酶識別序列的引物。
將DNA作為模板，通過引物延長反應合成互補鏈的方法是公知的。即，已知有利用模板依賴性的DNA聚合酶合成互補鏈的方法。作為DNA聚合酶，可以使用T4DNA聚合酶或者Taq聚合酶等。
用于cDNA合成的引物可以含有任意的堿基序列。例如可以利用在其5’末端側加成有限制性酶識別序列的引物。目前普遍進行的是在引物的5’末端上加成用于賦予克隆位點的堿基序列。
本發明中，cDNA的第2鏈可以通過具有可結合于固相的標識、或者被固定在固相上的引物來合成。通過將引物結合在固相上，能夠將cDNA的第2鏈捕獲在固相上。捕獲于固相上的cDNA可以容易地回收。
用于將作為引物使用的寡核苷酸結合在固相上的方法是任意的。例如，使用交聯劑使寡核苷酸的5’末端與探針共價結合的方法等是公知的(美國專利5656462)。或者，可以在構成寡核苷酸的堿基中導入生物素之類的具有結合親和性的分子。通過使生物素結合于固相化了的抗生物素蛋白，寡核苷酸被間接地捕獲于固相上。寡核苷酸中結合親和性分子的導入位置沒有限制。
通過第2鏈的合成而成為雙鏈的cDNA經過IIs型限制性酶處理，生成本發明的基因標記。該階段中，基因標記可以在與作為RNA接頭而加成的堿基序列連接的狀態下進行回收。為了基因標記的回收，利用第2鏈合成用的引物所結合的固相。即，將基因標記作為結合了的固相回收。固相可在使IIs型限制性酶作用之后、或者之前進行回收。
并且，通過確定本發明中基因標記的堿基序列，能夠獲得RNA的5’末端的堿基序列信息。確定基因標記的堿基序列的方法是任意的。但是，為了有效地確定大量基因標記的堿基序列，SAGE的原理是有用的。即，使多個基因標記連接，制成連環體，將連環體克隆，能夠一次性地確定多個標記的堿基序列。
可以發現，通過標記生成中使用的IIs型限制性酶的作用，各基因標記的長度是一定的。因此，認為連環體是通過一定長度的基因標記的堿基序列的重復所構成的。因此，可以從連環體的堿基序列中獲得各標記的堿基序列信息。
作為用于連接標記而獲得連環體的方法可以舉出幾個變異。以下闡述其例子。首先對應用了普遍已知的SAGE原理的方法進行說明。在此方法中，首先將2個基因標記相向連接獲得雙標記(di-tag)。此時，如果IIs型限制性酶導致的切割部分為粘性末端(sticky end)時，則預先使其平滑化。為了形成平滑末端，可以使T4 DNA聚合酶發揮作用。
接著，連接多個雙標記生成連環體。為了得到雙標記，將同一cDNA文庫分為2庫，對每組實施相同操作，由此生成基因標記。然后，將來自于2庫的基因標記之間相互連接，制成雙標記。此時，基因標記在被IIs型限制性酶切割的切割部分處連接。基因標記可通過T4 DNA連接酶等進行酶連接。
在此得到的雙標記具有以下結構。
PCR→(固相)-[RNA接頭]-[標記]-[標記]-[RNA接頭]-(固相)←PCR該階段中，雙標記可以通過PCR等擴增方法進行擴增。如果使得2庫間RNA接頭的堿基序列不同，則在不同庫的標記間連接的雙標記被特異性地擴增，因此能夠防止標記間的多個失衡。本發明中雙標記的擴增是任意的。
接著連接多個雙標記得到連環體。為此，例如可預先在RNA接頭內配置限制性酶的識別序列。利用限制性酶將雙標記消化后，如果將限制性酶的切割部位連接，則能夠連接多個雙標記。這樣得到的連環體的結構可如下所示。
..../[Tag][Tag]/[Tag][Tag]/[Tag][Tag]/[Tag][Tag]/....
即，其是將連接2個標記的雙標記“[Tag][Tag]”作為1個單位、且中間夾有限制性酶(錨定酶)導致的切割部位“/”的雙標記連續的結構。
并且，可以在與克隆用載體相同的限制性酶位點上插入連環體。這樣能夠得到將連環體作為嵌入段而包含的克隆載體。通過確定克隆載體的嵌入段的堿基序列，能夠明確其中所含標記的堿基序列。另外，連環體的長度優選為能夠以1次的序列反應確定堿基序列的長度。例如可以舉出小于等于500bp、例如20～400bp、通常50～300bp范圍的連環體。
另外，還可以得到不是通過雙標記、而是通過標記單元連接的連環體。例如，在使IIs型限制性酶作用后，可在其切割部位上結合連接物。此時，標記具有以下結構。
PCR→(固相)-[RNA接頭]-[標記]-[連接物]←PCR
如果在連接物上配置限制性酶識別序列，則與消化雙標記的RNA接頭同樣，可以利用限制性酶將標記的兩端切割。而且，在擴增標記時，也可利用RNA接頭和連接物的堿基序列通過PCR進行擴增。無論如何都可以連接經限制性酶處理過的標記而制成連環體。連環體進一步插入在克隆載體中，能夠明確其堿基序列。
通過IIs型限制性酶切割出的標記長度基本一定。但是，如果萬一其長度有所偏差，則在構成雙標記時，往往不能鑒定正確的標記堿基序列。如果不經過雙標記構成連環體的話，則即便萬一標記的長度不均一，也能夠正確地確定標記的堿基序列。
本發明的基因標記的獲取方法、以及所獲標記的堿基序列的確定方法中所必需的各種試劑類，可以預先組合作為試劑盒來提供。
即，本發明涉及含有以下要素的基因標記的制造用試劑盒，(a)由含有IIs型限制性酶的識別序列的寡核苷酸構成的RNA接頭、(b)用于將RNA接頭連接于RNA的CAP部位的試劑、(c)由對以RNA接頭作為模板合成的cDNA退火的寡核苷酸所構成的cDNA第2鏈合成用引物、(d)cDNA第1鏈合成用引物。
本發明的試劑盒可以附加地含有雙標記或連環體制備所必需的試劑類。另外，這些構成要素的具體構成如上所述。
本發明的試劑盒中，作為(d)cDNA第1鏈合成用引物，可以使用例如以下i)～iii)任一個所記載的引物，i)隨機引物、ii)寡dT引物、和iii)含有與特定mRNA互補的堿基序列的引物。
將試樣中所含的全部mRNA作為對象制造基因標記時，利用隨機引物或寡dT引物。隨機引物是本發明中特別優選的引物。隨機引物是指由具有數十個堿基長度的不特定的堿基序列構成的寡核苷酸的集合體。例如利用5～20、通常8～15個堿基左右長度的寡核苷酸。通過將4種堿基混合物依次連接成必要的長度進行合成。理論上來說，可以認為隨機引物含有對所有堿基序列互補的堿基序列。
或者，通過含有與特定mRNA互補的堿基序列的引物，也能夠構成本發明的試劑盒。通過利用對特定的mRNA特異的引物，能夠特異地制造某個基因的5’標記。比較這樣得到的標記的堿基序列信息，如果在該堿基序列中檢測出變異時，則說明在該基因的轉錄產物中存在有5’末端長度不同的多個變體(variant)。因此，通過含有與特定mRNA互補的堿基序列的引物所構成的本發明的試劑盒，作為用于檢測特定基因的轉錄產物的變體的試劑盒是有用的。
例如，通過以下所述要素，能夠構成用于實施本發明的方法的試劑盒。在各要素中還可添加對使用了各要素的反應所優選的緩沖液。并且，在本發明的試劑盒中還可組合用于分析基因標記的堿基序列的軟件。
用于連接RNA接頭的要素·BAP·TAP·T4RNA連接酶·RNA接頭用于cDNA合成和分離的要素·逆轉錄酶·DNA聚合酶·dXTP·cDNA第1鏈合成用隨機引物·cDNA第2鏈合成用5’生物素化cDNA合成用引物·抗生物素蛋白結合磁珠用于生成基因標記的要素·IIs型限制性酶用于雙標記的生成和分析的要素
·T4DNA連接酶·基因標記擴增用引物·DNA聚合酶·II型限制性酶·測序用載體·用于轉化載體的宿主·用于培養宿主的培養基在分析通過本發明生成的連環體的堿基序列信息中，利用計算機軟件是有利的。例如可以將能夠實施以下步驟的軟件用于連環體的堿基序列信息的分析中，讀取測序儀的分析數據的步驟、識別讀取的堿基序列數據的標記以外的堿基序列信息的步驟、積累標記的堿基序列信息的步驟。
這里，作為標記以外的堿基序列信息，可以舉出在標記形成過程中連接的RNA接頭、連接物等的堿基序列信息。或者，有時也有可能可以讀取來自于克隆載體的堿基序列。無論怎樣，這些堿基序列信息是預先明確的信息。并且，這些附加的堿基序列信息和標記的堿基序列信息規則地配置在連環體上。因此，能夠機械地識別這些堿基序列和標記的堿基序列。
接著，積累標記的堿基序列和所識別的堿基序列信息。形成雙標記時，由于有時也讀取了反義鏈的堿基序列，因此也能合并記錄互補序列的信息。使用連接物不經過雙標記制作連環體時，如果按照使連接物和RNA接頭的克隆位點成為不同序列的方式進行設計的話，則能夠在單一方向上克隆。此時，不需要互補序列的積累。
在該程序中還可帶有附加的功能。例如可以實施比較所得標記的堿基序列、將相同堿基序列歸納為1個、并記錄其出現頻率的步驟。另外，還可以實施比較不同RNA來源的標記信息、將出現頻率不同的標記提取的步驟。
作為標記信息的比較對象，還可以利用預先積累的數據庫的信息。例如，對于標準的組織或細胞株，根據本發明的方法預先積累基因標記的信息。該信息可以在計算機互聯網上共用。或者，也可以添加于上述試劑盒中，在商業上游通。還可以比較這樣得到的基因標記信息和自己實驗獲得的基因標記信息。
通過本發明，能夠獲得作為轉錄產物的mRNA的5’末端堿基序列信息。5’末端堿基序列信息在基因分析中具有特別重要的意義。例如，可以將通過本發明能夠獲得的5’末端堿基序列信息用于下述用途中。
首先，本發明可以用于基因表達譜的獲得中。即，本發明涉及含有以下工序的、獲取真核細胞中基因表達譜的方法，(1)以本發明為基礎制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序、和(3)通過對應所確定的堿基序列及其出現頻率，獲得表達譜的工序。
本發明中(1)制造基因標記的工序可以含有以下工序。沒有特別聲明的情況下，以下的記載也同樣，所述的“以本發明為基礎制造基因標記的工序”含有以下工序(A)在RNA的CAP部位連接含有IIs型限制性酶的識別序列的RNA接頭的工序、(B)將(A)的RNA作為模板合成eDNA的工序、(C)使識別RNA接頭中所含識別序列的IIs型限制性酶作用于(B)的eDNA，從而生成基因標記的工序。
一般來說，表達譜是指伴隨表達信息的基因信息的列表。表達信息是指顯示表達水平的量化參數。基因信息通常是指用于特定基因的信息。具體地說，基因的堿基序列、基因的名稱、基因的ID號等構成基因信息。構成列表的基因數是任意的。并且其對象也沒有限定。根據分析的目的，積累必要基因的信息構成表達譜。
根據本發明，能夠從具有CAP結構的RNA中將其5’末端的堿基序列信息作為標記信息獲得。并且，通過對照其堿基序列信息，計算相同堿基序列的數量，能夠使堿基序列信息及其出現頻率對應。這樣能夠得到表達譜。
作為RNA，如果將所有RNA作為對象的話，能夠獲得將全部基因作為對象的表達譜。本發明中，將特定基因或者結構上具有共性的一組基因作為對象，也能夠生成基因標記。這種情況下，生成了特定基因或者一組基因的表達譜。
如果假定具有CAP結構的mRNA是指細胞中所表達的全部mRNA，則可以說通過本發明可得到的表達譜更加正確地反映著細胞內的基因表達狀態。本發明中，計算堿基序列的出現頻率時，優選積累占據成為分析對象的堿基序列信息總數的某序列出現頻率的相對數。特別是在通過PCR等擴增后的出現頻率信息的定量意義小。如果作為相對于總數的比進行比較的話，可以期待更加客觀的評價。
通過本發明得到的表達譜能夠制成數據庫。數據庫是指將構成表達譜的信息作為機械可讀式的數據而積累的電子數據。本發明的數據庫至少含有標記的堿基序列信息和與其相關的出現頻率信息。并且，本發明的數據庫可以合并記錄各堿基序列信息的ID號、得到堿基序列信息的RNA來源。而且，還可附加與已知基因的堿基序列信息的關系、對基因組上的定位結果等信息。
本發明的表達譜的數據庫可以保存在電子媒介中。作為電子媒介，可以舉出各種光盤裝置、磁帶媒介或者閃存器等。這些電子媒介可在因互聯網上共用。例如，可以在互聯網上共有本發明的數據庫。并且，還可以介由互聯網，在用于分析上述標記序列的軟件中追加用于參照本發明數據庫信息的功能。或者，相反地也可以介由互聯網將根據本發明生成的新型表達譜信息追加在數據庫中。
利用本發明的表達譜可以實施表達譜分析。即，本發明涉及一種基因表達譜的分析方法，該方法含有以本發明為基礎獲得不同種類細胞的基因表達譜、比較基因表達譜、并選擇細胞間表達頻率有所不同的基因標記的工序。獲得不同細胞間表達水平有所不同的基因的分析方法被稱為表達譜分析。通過這種分析，例如可以獲得數量眾多的與疾病等相關的基因。本發明的表達譜也可利用在這種表達譜分析中。
本發明的表達譜分析中，成為分析對象的不同細胞是指其來源不同的所有細胞。即便是來自于同一組織的細胞，在有無疾病、人種、年齡、性別等一些條件有所不同時，也是來源不同的細胞。如果根據分析目的要考慮的條件有所不同的話，則是來源不同的細胞。另一方面，當僅發現相對于分析目的可忽略的條件有所不同時，視為同一細胞。例如，通過比較不同器官、不同組織、或來源和培養條件等有所不同的細胞間的表達譜，能夠選擇器官、組織或細胞間表達水平高(或者低)的基因。能夠應用本發明的分析對象的組合示例如下。
不同組織成人的組織和胎兒的組織患者的組織和健康人的組織男性的組織和女性的組織人種不同的人的組織生長環境不同的同一生物物種的組織不同細胞同一細胞、培養條件不同的細胞同樣培養條件、培養時間不同的細胞施加了特定處理的細胞和未施加特定處理的細胞更具體地說，通過在癌組織和正常組織之間比較表達譜，能夠獲得對癌特征性的基因標記。或者，特別是通過比較惡性度高的癌和惡性度低的癌，能夠特定與惡性度相關的基因標記。
通過本發明得到的基因標記包括mRNA的5’末端的堿基序列信息。因此，能夠將作為編碼相同蛋白質的基因、且5’UTR結構不同的變體作為不同轉錄產物反應在表達譜中。與通過公知的SAGE能夠得到的標記相比較，該特征是本發明的標記所具有的一大優點。另外，本發明的基因標記的堿基序列信息本身作為全長cDNA的5’端引物的堿基序列信息是有用的。因此，如果利用以通過表達譜分析所選出的標記的堿基序列信息為基礎設計的引物和寡dT引物，則能夠直接合成全長cDNA。或者，如果組合具有與mRNA任意區域互補的堿基序列的引物，則能夠得到含有mRNA的5’端堿基序列的cDNA。這也是本發明的一大特征。
通過本發明能夠獲得的基因標記含有作為轉錄產物的mRNA的5’末端堿基序列。因此，通過將該堿基序列定位在基因組的堿基序列上，能夠鑒定基因的轉錄起始點。即，本發明涉及含有以下工序的基因轉錄起始點的確定方法，(1)以本發明的方法為基礎制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序、和(3)將所確定的基因序列定位在基因組的堿基序列上，并將堿基序列一致的區域作為該基因的轉錄起始點來鑒定的工序。
2003年4月，國際人類基因組序列協會公布了人類基因組的破譯完成。其結果是能夠得到以99.99％的精確度覆蓋全基因組99％(28億3000萬堿基對)的人類基因組精密序列。另一方面，本發明將在細胞內轉錄的所有mRNA的5’末端作為標記產生。因此，從原理上，可以將在某細胞中轉錄的基因的幾乎所有的轉錄起始點定位于基因組上。被定位在基因組上的轉錄起始點在轉錄調節區域的獲得中是重要的信息。
例如，可以克隆轉錄起始點的上游1～2kb的范圍，并用于轉錄調節因子的篩選。或者通過分析該區域的堿基序列，還能夠預測轉錄調節區域。更具體地說，通過研究已知轉錄因子的識別序列所被保存的區域，能夠預測轉錄因子的結合區域。
另外，轉錄起始點的定位無非是基因本身的定位。也就是說，以本發明標記的堿基序列信息的定位結果為基礎，能夠把握基因在基因組上的物理位置關系。目前，基因的轉錄起始點如果不依賴于質量高的全長cDNA的堿基序列信息，則不能定位。然而如果利用通過本發明能夠得到的標記信息，則能夠容易地定位轉錄起始點。這樣，可以說通過本發明能夠得到的標記信息具有與全長cDNA的成果相匹敵的價值。
而且，通過本發明能夠得到的基因標記的堿基序列信息可以利用在cDNA的全長率評價中。與基因組的堿基序列被搞清楚相對，為了在蛋白質水平上明確細胞的作用，繼續了各種嘗試。作為其方法之一，有全長cDNA的網絡式分析。在全長cDNA的網絡式分析中，網羅地獲得在某細胞中表達的基因的全長，確定其結構。此時，所得cDNA的全長性高成為了重要的條件。
首先，第1為了至少特定ORF，必須明確mRNA的5’端堿基序列。另外，為了鑒定轉錄起始點，獲取直至5’末端的堿基序列是重要的。為了確認滿足這些條件，常常評價得到的cDNA的全長性。cDNA的全長性是表示含有mRNA的5’末端堿基序列的cDNA占所得cDNA整體的何種程度的參數。
本發明的基因標記提供mRNA的5’末端的堿基序列信息。因此，通過對照網羅式獲得的cDNA的堿基序列和從同一文庫中獲得的本發明的基因標記的堿基序列，能夠明確各cDNA的5’末端是否含有mRNA的5’末端的堿基序列。如果基因標記的堿基序列多數能在cDNA的堿基序列上定位時，所獲cDNA的多數為全長的可能性較高。相反，與基因標記一致的堿基序列在所得cDNA中看不到時，推測cDNA的全長性較低。
本發明中基因標記的堿基序列信息可以利用于含有mRNA的5’末端堿基序列的cDNA的獲得中。即，本發明涉及cDNA合成用引物組，其包含用于合成含有通過以下工序確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和對cDNA的任意部位退火的3’端引物、(1)以本發明為基礎制造基因標記的工序、和(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序。
構成本發明的引物組的5’端引物的堿基序列含有作為標記獲得的堿基序列或其互補序列。標記作為mRNA的有義序列或反義序列而得到。因此，其互補序列或者標記的堿基序列本身作為cDNA合成用的5’端引物的堿基序列被使用。由于5’端引物在5’末端開始互補鏈合成，因此通過本發明的引物組合成的cDNA通常含有5’末端的堿基序列。另外，標記序列由于是從DNA中獲得的，因此含有堿基t。與此相對，RNA的5’末端序列與t相當的堿基當然是u。
另一方面，在構成本發明的引物組的3’端引物中，可以利用對cDNA可退火的任意引物。通過選擇3’端引物，能夠合成各種cDNA。作為能夠利用于本發明引物組的3’端引物，例如可以舉出以下所示的引物，i)寡dT引物、ii)cDNA的片段序列信息、和iii)由與cDNA的II型限制性酶識別鄰接的基因標記的堿基序列或其互補序列構成的引物。
首先，與寡dT引物的組合在全長cDNA的合成中是有用的。然后，以cDNA的片段序列信息為基礎設計的3’端引物作為用于獲得該cDNA的5’端區域的引物被利用。為了這種目的，可以盡量以該cDNA的5’端堿基序列為基礎設計3’端引物。在cDNA的片段信息中含有EST。另外，通過各種基因分析，能夠獲得cDNA的片段信息。而且嘗試了常常以片段信息為基礎確定全長的堿基序列。例如，當必須獲得作為DNA陣列的探針使用的EST的5’端堿基序列時，利用本發明的引物組，能夠合成目標區域。或者，有時嘗試從通過PCR克隆等獲得的cDNA片斷中獲得其全長。本發明中，cDNA的片段序列信息可以定義為含有與特定mRNA互補的堿基序列的引物。
并且，還可以將由與cDNA的II型限制性酶識別鄰接的基因標記的堿基序列或其互補序列所構成的引物作為3’端引物利用。目前實用的SAGE(SCIENCE，Vol.270，484-487，Oct.20，1995)將與cDNA中所含特定限制性酶位點鄰接的區域作為基因標記生成。以該標記的堿基序列信息為基礎，能夠分析基因表達譜。對于同一分析對象，如果將根據已知分析方法選擇的基因標記的堿基序列信息作為3’端的引物使用，則有可能可以合成含有相當一部分目標基因的cDNA。
這些引物組中，特別優選與寡dT引物的組合作為用于合成全長cDNA的引物組。全長cDNA在轉錄起始點的定位中有用。另外，為了鑒定5’UTR結構不同的轉錄產物，必須確定至少含有5’末端區域的堿基序列。而且，全長cDNA通常是難以獲得的。由該背景出發，利用根據本發明得到的基因標記信息來合成全長cDNA的有用性特別大。即，本發明涉及含有以下工序的全長cDNA的合成方法，(a)使用用于合成含有通過以下工序確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和由寡dT引物構成的3’端引物，以RNA或cDNA為模板進行互補鏈合成反應的工序、(1)根據本發明的方法制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序；(b)將合成的DNA作為全長cDNA回收的工序。
將從含有目標mRNA可能性高的細胞中獲得的RNA作為模板，使用上述本發明的引物組合成cDNA。或者也可將從該細胞中獲得的cDNA文庫作為模板進行利用。本領域技術人員可以根據所提供的引物的堿基序列信息合成cDNA。具體地說，利用RT-PCR等公知的方法，能夠由RNA合成目標cDNA。RNA優選使用mRNA。或者使用cDNA文庫作為模板時，能夠通過PCR合成目標cDNA。cDNA文庫也可以使用市售的文庫。
本發明涉及這樣合成的全長cDNA。本發明中，全長cDNA是指包括含有mRNA的CAP結構部分的堿基序列信息和poly(A)的cDNA。本發明還涉及由根據本發明合成的全長cDNA編碼的多肽。分析全長cDNA的堿基序列，能夠鑒定ORF。根據所鑒定的ORF，能夠將編碼區域導入至表達載體。本發明含有能夠如此得到的表達載體。可以將該表達載體導入至適當的表達體系，將由cDNA編碼的多肽作為重組體使其表達，再進行回收。
另外，本發明的全長cDNA的編碼區域所編碼的多肽可通過生物體外翻譯(in vitro translation)作為重組體表達并回收。生物體外翻譯的方法是公知的。生物體外翻譯也稱為無細胞蛋白質翻譯。即，通過使將編碼目標氨基酸序列的DNA功能性地連接于啟動子的構成物(construct)接觸于支持生物體外翻譯的要素，能夠翻譯成氨基酸序列。構成物中還可配置終止子等轉錄調控區域。支持生物體外翻譯的要素是含有RNA聚合酶、核糖核苷酸基質、氨基酸、核糖體以及tRNA等的混合物。如果存在這些蛋白質翻譯所必需的成分，則可不利用細胞功能，也能將DNA翻譯成蛋白質。RNA聚合酶識別上述啟動子，在其控制下將DNA作為模板轉錄成mRNA。轉錄中使用核糖核苷酸基質ATP、GTP、CTP和UTP。被轉錄的mRNA在核糖體中被翻譯成多肽。
作為支持生物體外翻譯的要素，可以使用市售的體外翻譯用的試劑盒。利用了兔子網狀紅血球的溶解產物(Rabbit Reticulocyte Lysate；RRL)、小麥胚芽提取物(Wheat Germ Extract；WGE)或者大腸桿菌的溶菌產物等的用于無細胞蛋白質翻譯的試劑盒在市場有售。或者，也可以分別以高純度精制轉錄、翻譯和能量再生中所必需的約30個酶類后，實現再構成的體外轉錄和翻譯系統(Shimizu et al.(2001)NatureBiotechnology.Vol.19，p.751-755)，作為試劑盒在商業上提供。
而且，本發明涉及識別該多肽的抗體。抗體例如可以通過用上述重組體、或者由選自翻譯氨基酸序列的氨基酸序列構成的域肽對免疫動物進行免疫而得到。能夠從免疫動物中回收多克隆抗體。并且，克隆免疫動物的抗體產生細胞，可以得到單克隆抗體。使抗體產生細胞與骨髓瘤之類的細胞株融合而制成雜交瘤、用于篩選產生具有目標反應性的抗體的克隆的方法是公知的。
圖1為表示根據本發明的基因標記的獲取方法的例子的圖。將mRNA分成兩半，將mRNA的Cap結構酶置換成含有作為IIs型限制核酸內切酶的MmeI和Xhol限制性酶部位的兩種合成寡核苷酸。接著，通過dT連接物引物將寡核苷酸帽mRNA變換成cDNA的第1鏈。使用PCR利用生物素結合5’引物和dT連接物引物合成第2鏈。使用在距離識別部位20bp的位置處進行切割的MmeI，將雙鏈cDNA切割。通過使其結合于鏈霉抗生物素蛋白微珠而將5’cDNA分離后，相互連接標記的兩庫。
圖2為與UniGene和DBTSS序列中mRNA起始部位進行比較的5’SAGE標記的距離的圖。距離以上游(-)和下游(+)的核苷酸(x-軸)的數目來表示。UniGene中的mRNA起始部位表示為0。5’SAGE標記的頻率顯示于y-軸。配置每個5’SAGE標記及其對應基因的位置的距離越短，則表示5’標記與已知5’轉錄起始部位基本一致。本發明人等為了研究轉錄起始部位的范圍的差，分別使用了UniGene和DBTSS數據庫。
圖3為5’SAGE標記和3’SAGE標記的頻率的散點圖。如實施例2的材料和方法的章節中所述，由5’SAGE和3’SAGE分析擊中(hit)基因組中的一個基因座的標記。該圖中，兩個軸用對數表示。
具體實施例方式
以下根據實施例，更加具體地說明本發明。
根據本發明，通過以下實驗確認能夠獲得含有mRNA的5’末端堿基序列的基因標記。以下操作大致示于圖1。
寡核苷酸帽法寡核苷酸帽法是改變了Maruyama和Sugano(1994)的方法進行的(Maruyama，K.，Sugano，S.，1994.Oligo-cappinga simple method toreplace the cap structure of eucaryotic mRNAs with oligoribo-nucleotides.Gene 138，171-174.)。在添加了100單位的RNasin(Promega)的總液量為100μl的100mM Tris-HCl(pH為8.0)和5mM 2-巰基乙醇的混合液中，利用1.2單位來自于細菌的堿性磷酸酯酶(BAP；TaKaRa)在37℃下將5～10μg的poly(A)+RNA處理40分鐘。進行2次苯酚∶氯仿(1∶1)提取處理，進行乙醇沉淀處理。在添加了100單位的RNasin的總液量為100μl的50mM乙酸鈉(pH為5.5)、1mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇的混合液中，利用20單位的煙酸性焦磷酸酶(TAP)在37℃下將所得該poly(A)+RNA處理45分鐘。
在苯酚∶氯仿提取處理和乙醇沉淀處理后，將2～4μg的BAP-TAP處理poly(A)+RNA分為2庫，使各庫分別與RNA接頭(5’-oligo 1和5’-oligo2)連接。5’-oligo 1和5’-oligo 2分別為具有以下堿基序列的RNA。任何一個RNA接頭都含有XhoI和MmeI識別序列。
5’-oligo 1/序列號15’-UUU GGA UUU GCU GGU GCA GUA CAA CUA GGC UUAAUA CUC GAG UCC GAC-3’5’-oligo 2/序列號25’-UUU CUG CUC GAA UUC AAG CUU CUA ACG AUG UACGCU CGA GUC CGA C-3’將250單位的RNA連接酶(TaKaRa)和100單位的Rnasin用下述組成的反應混合液達到總液量100μl，在20℃下反應3～16小時，連接RNA接頭。
50mM Tris-HCl(pH為7.5)5mM MgCl25mM 2-巰基乙醇0.5mM ATP25％PEG8000cDNA的合成cDNA的合成時，合成全長cDNA富集文庫和5’末端cDNA富集文庫的2種文庫。全長cDNA富集文庫由使用寡dT連接物引物以poly(A)+mRNA為模板合成的cDNA構成，是全長cDNA富集的文庫。另一方面，5’末端cDNA富集文庫由在cDNA的合成中使用隨機連接物引物合成的cDNA構成。通過隨機連接物引物的使用，從沒有poly(A)的片段也能合成cDNA。對于這2種cDNA分別嘗試獲得基因標記。
將未連接的RNA接頭除去后，通過無RNaseH的逆轉錄酶(Superscript II，Gibco BRL)合成cDNA。為了得到全長cDNA富集文庫，將10pmol的dT連接物引物(序列號3)加入到含有2～4μg寡核苷酸帽poly(A)+RNA的50μl溶液中，合成cDNA。
DT連接物引物(序列號3)5’-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTTTTT TTT-3’反應條件按照廠家推薦的方法(42℃下培養1小時)。
進而，為了得到5’末端cDNA富集文庫，使用10pmol的隨機連接物引物(序列號4)，在12℃下培養1小時，進而在42℃下培養1小時。
隨機連接物引物(序列號4)5’-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CNN NNN NC-3’cDNA的擴增合成第1鏈cDNA后，通過使用15mM NaOH在65℃下處理1小時，將RNA分解。使用100μl中含有16pmol的5’PCR引物和3’PCR引物(5’-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT-3’/序列號7)的XL PCR試劑盒(Perkin-Elmer)來擴增以1μg的寡核苷酸帽poly(A)+RNA作為模板合成的cDNA。5’PCR引物在作為RNA接頭連接了5’oligo-1的庫中使用序列號5的引物，連接了5’oligo-2的庫中使用序列號6的引物。
5’oligo 1用5’PCR引物/序列號55’生物素-GGA TTT GCT GGT GCA GTA CAA CTA GGC TTAATA-3’
5’oligo 2用5’PCR引物/序列號65’生物素-CTG CTC GAATTC AAG CTT CTAACG ATG TAG G-3’3’PCR引物(序列號7)5’-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT-3’在第1鏈的合成中使用dT-連接物引物作為引物時，將94℃下1分鐘、58℃下1分鐘和72℃下10分鐘的循環重復5～10次，進行cDNA的擴增。另外，在第1鏈的合成中使用隨機連接物引物作為引物時，將94℃下1分鐘、58℃下1分鐘和72℃下2分鐘的循環重復10次，進行cDNA的擴增。
PCR產物在1次的苯酚∶氯仿(1∶1)處理后，經過乙醇沉淀處理，利用MmeI型IIs限制性酶(University of Gdansk Center of TechnologyTransfer，Gdansk，Poland)進行處理。限制性酶處理是在總液量為300μl的10mM HEPES、pH為8.0、2.5mM醋酸鉀、5mM醋酸鎂、2mM DTT和40μM S-腺苷基蛋氨酸混合液中使用40單位的MmeI，在37℃下進行2.5小時。使經限制性酶處理過的5’末端cDNA片斷與由鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynal，Oslo，Norway)結合。在16℃下、在16μl含有添加了4單位T4 DNA連接酶的供給緩沖液的反應溶液中反應2.5小時，使結合于磁珠的cDNA片斷相互直接結合，得到雙標記。
生成的雙標記使用引物5’-GGA TTT GCT GGT GCA GTA CAACTA GGC-3’(序列號8)和5’-CTG CTC GAA TTC AAG CTT CTA ACGATG-3’(序列號9)，通過PCR擴增。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)確認PCR產物，通過XhoI進行處理。將含有雙標記的條帶切出，使其自身連接形成長的連環體。將該連環體插入到pZero 1.0(Invitrogen)的XhoI部位。
通過使用了M13正向引物和M13反向引物的PCR進行群體的篩選。含有600bp或以上嵌入段的PCR產物使用Big Dye terminator ver.3、利用3730ABI自動DNA測序儀(Applied Biosystems，CA)確定序列。相對于所有的電泳圖，為了確認有無不明確的堿基以及修改錯讀，通過目測進行再分析。
使用為此制作的軟件測定各標記的出現頻率。將分析的結果得到的標記的堿基序列作為搜索項，檢索BLAST search(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和人類基因組數據庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)的數據。
將從通過隨機連接物引物合成的5’末端cDNA富集文庫中得到的3000或以上的基因標記的堿基序列進行分析的部分結果匯總于下。以下的結果中，接著記載了基因標記的堿基序列的序列號，用“/”將接下來的信息劃分記載。另外，在這些信息后另起一行記載有擊中已知基因的信息(GenBank Accession No.和注釋)。
基因標記的堿基序列所得基因標記總數中的該基因標記的出現頻率基因標記的堿基序列擊中的已知序列的位置(○擊中5’末端的序列、×并非5’末端的堿基序列)(序列號10)/ACATCTGACCTCATGGAG/27/○gi|33694637|tpg|BK000408.1|TPA人類腺病毒5型，全基因組(序列號11)/CTCTTTCCTTGCCTAACG/22/○gi|17981705|ref|NM_001007.2|人類核糖體蛋白質S4，X-連接(RPS4X)，mRNA(序列號12)/TACCTGGTTGATCCTGCC/21/×(序列號13)/CTTTTCCTGTGGCAGCAG/20/○＜gi|16579884|ref|NM_000968.2|人類核糖體蛋白質L4(RPL4)，mRNA(序列號14)/CTCTTCCGCCGTCGTCGC/16/○人類真核翻譯延長因子2(EEF2)，mRNA的上游(序列號15)/CTCATTGAACTCGCCTGC/11/○gi|28338|emb|X04098.1|HSACTCGR人類細胞骨架γ-肌動蛋白(ACTG1基因)的mRNA(序列號16)/CTGGTTGATCCTGCCAGT/11/×(序列號17)/CTCAGTCGCCGCTGCCAG/10/○gi|28338|emb|X04098.1|HSACTCGR人類細胞骨架γ-肌動蛋白(ACTG1基因)的mRNA(序列號18)/CTTTCACTGCAAGGCGGC/10/○gi|18314626|gb|BC021993.1|鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)，β-多肽2-樣1(序列號19)/ACGCTGTGACAGCCACAC/9/○NM 005382的上游(序列號20)/GTGACAGCCACACGCCCC/9/×gi|35045|emb|Y00067.1|HSNFM人神經絲蛋白亞單位M(NF-M)的基因(序列號21)/AACGGCTAGCCTGAGGAG/8/×gi|188487|gb|M59828.1|HUMMHHSP人MHC III類HSP70-1基因(HLA)，全編碼序列(序列號22)/AGTAGCAGCAGCGCCGGG/8/○gi|14043071|ref|NM_031243.1|人類核內不均一核糖核蛋白A2/B1(序列號23)/ATTCCTAGTTAAGGCGGC/8/○gi|5020073|gb|AF146651.1|AF146651人類乙二醛酶-I基因，全編碼序列(序列號24)/AATTGTGTTCGCAGCCGC/7/○gi|22027640|ref|NM_002107.2|人類H3組蛋白，家族3A(H3F3A)，mRNA(序列號25)/ATATTTCTTACTCTCTCG/7/×gi|37704377|ref|NR_001564.1|X染色體上的人類染色體X失活特異性轉錄產物(XIST)
(序列號26)/CTCAGTCGCCGCTGCCAA/7/○gi|28338|emb|X04098.1|HSACTCGR人類細胞骨架γ-肌動蛋白的mRNA(序列號27)/AAAACGGCCAGCCTGAGG/6/×gi|188489|gb|M59830.1|HUMMHHSP2人MHC III類HSP70-2基因(HLA)，全編碼序列(序列號28)/CTCTCTTTCACTGCAAGG/6/○gi|12652914|gb|BC000214.1|鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)，β-多肽2-樣1(序列號29)/AATTTCTACGCGCACCGG/5/○gi|402305|gb|L24369.1|HUMRPS4A人類核糖體蛋白質S4基因(序列號30)/ACCGCCGAGACCGCGTCC/5/○gi|1043878|dbj|AK025375.1|人類突變的β-肌動蛋白的ACTB mRNA(序列號31)/AGACGCAGAGTAGATTGT/5/○gi|2315183|emb|Z82216.1|HS75N13來自于人染色體Xq21.1的克隆RP1-75N13的DNA序列(序列號32)/AGTTCGATCGGTAGCGGG/5/×gi|37540535|ref|XM_294582.2|與DNA-結合蛋白B類似的人類基因(LOC347295)，mRNA(序列號33)/AGTTCTCGGGCGTACGGC/5/○gi|30581134|ref|NM_006306.2|人類染色體1-樣1的結構維持SMCl(序列號34)/AGTTGCTTCAGCGTCCCG/5/○gi|32487|emb|X15183.1|HSHSP90R人90-kDa熱休克蛋白的mRNA(序列號35)/ATTAAACGGTTGCAGGCG/5/×gi|33239450|ref|NM_182649.1|人類增殖細胞核抗原(PCNA)轉錄變體2，mRNA(序列號36)/CCGGCCGGGGGGCGGGCG/5/○gi|55583|gb|U13369.1|HSU13369人核糖體DNA全重復單位
(序列號37)/CCTTTTGGCTCTCTGACC/5/○gi|15718688|ref|NM_001006.2|人類核糖體蛋白質S3A(RPS3A)，mRNA(序列號38)/CTCAGTACAGCTCCGGCC/5/○gi|21217408|gb|AC015849.5|人類染色體17，克隆RP11-362K1，全序列(序列號39)/CTCTTTCGGCCGCGCTGG/5/○gi|461248|dbj|D28421.1|HUMRPL80人類核糖體蛋白質L8同源物的mRNA，5’UTR所得標記中30個堿基序列的分析結果為73％或以上(22/30)的標記實際上是cDNA的5’末端的堿基序列。這正驗證了根據本發明能夠以較高概率將mRNA的5’末端堿基序列作為標記獲得。
將利用了根據本發明的含有mRNA的5’末端堿基序列的基因標記的基因表達分析(以下記為5’SAGE)的結果與公知的SAGE法(以下記為3’SAGE)進行比較。
材料和方法3’-Long SAGE文庫的制作從HEK293中分離全RNA，如上所述選擇mRNA(Hashimoto，S.-i.，Suzuki，T.，Dong，H.-Y.，Yamazaki，N.& Matsushima，K.Serial analysisof gene expression in human monocytes and macrophages.Blood 94，837-844，1999)。將標準的SAGE順序如下變更進行使用，用3μg mRNA進行Long SAGE法(Saha，S.et al.Using the transcriptome to annotate thegenome.Nat Biotechnol 20，508-512，2002)。
即，NlaIII切割后，將接頭1A(5’-TTT GGA TTT GCT GGT GCAGTA CAA CTA GGC TTA ATA TCC GAC ATG-3’/序列號40)和接頭1B(5’-TCG GAT ATT AAG CCT AGT TGT ACT GCA CCA GCA AAT CCC7氨基修飾-3’/序列號41)相互退火，連接于全cDNA的一半，將接頭2A(5’-TTT CTG CTC GAA TTC AAG CTT CTA ACG ATG TAC GTCCGA CAT G-3’/序列號42)和接頭2B(5’-TCG GAC GTA CAT CGT TAGAAG CTT GAA TTC GAG CAG C7氨基修飾-3’/序列號43)相互退火，連接于cDNA的剩余一半，并將含有MmeI識別部位的接頭連接于3’cDNA末端。使用MmeI型IIs限制性酶(Gdansk大學技術轉讓中心(University of Gdansk Center for Technology Transfer)、Poland、Gdansk)，使接頭標記分子從cDNA中游離出來。切割是在300μl的10mMHEPES、pH為8.0、2.5mM醋酸鉀、5mM醋酸鎂、2mM DTT和40μMS-腺苷基蛋氨酸中使用40單位的MmeI在37℃下進行2.5小時。在16μl的供給緩沖液中含有4單位T4 DNA連接酶的反應液中，使接頭1標記分子和接頭標記2分子在16℃下反應2.5小時，使它們相互直接連接。
使游離的標記相互連接成鏈，在pZero 1.0(Invitrogen)的SphI部位克隆。使用M13正向和M13反向引物，通過聚合酶鏈式反應法(PCR)篩選群體。對含有超過600bp插入片斷的PCR產物使用Big Dyeterminator ver.2進行測序，利用3730ABI自動DNA測序儀(AppliedBiosystems、加里福尼亞州)進行分析。電泳圖全部通過目測進行再次分析，研究不清楚的堿基，更正錯讀。使用SAGE 2000軟件(version4.12)，定量各標記的存在量。除去接頭序列、其它可能的人工產物和重復的雙標記后，分析各標記。
5’-SAGE文庫的制作加入幾個變更點(Suzuki，Y.，Yoshitomo-Nakagawa，K.，Maruyama，K.，Suyama，A.& Sugano，S.Construction and characterization of a fulllength-enriched and a 5’-end-enriched cDNA library.Gene 200，149-156，1997)，按照Maruyama和Sugano(Maruyama，K.& Sugano，S.Oligo-cappinga simple method to replace the cap structure of eukaryoticmRNAs with oligoribonucleotides.Gene 138，171-174，1994)所記載的那樣，進行寡核苷酸帽法。
也就是說，在含有100單位RNasin(Promega)的100μl的100mMTris-HCl(pH為8.0)、5mM 2-巰基乙醇中，使用1.2單位的來自于細菌的堿性磷酸酯酶(BAP；TaKaRa)在37℃下將5～10μg的poly(A)+RNA處理40分鐘。利用苯酚∶氯仿(1∶1)提取2次并乙醇沉淀后，在含有100單位RNasin的100μl的50mM醋酸鈉(pH為5.5)、1mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇中，使用20單位的煙酸性焦磷酸酶(TAP)在37℃下將poly(A)+RNA處理45分鐘。在苯酚∶氯仿提取并乙醇沉淀后，將2～4μg BAP-TAP處理過的poly(A)+RNA分為2庫，將含有XhoI/MmeI識別部位的以下RNA接頭中的一個連接于各庫在含有100單位的RNasin的100ml的50mM Tris-HCl(pH為7.5)、5mM MgCl2、5mM 2-巰基乙醇、0.5mM ATP、25％PEG8000中，使用250單位的RNA連接酶(TaKaRa)，在20℃下連接5’-oligo 1(5’-UUU GGA UUU GCU GGUGCA GUA CAA CUA GGC UUA AUA CUC GAG UCC GAC-3’/序列號1)、5’-oligo 2(5’-UUU CUG CUC GAA UUC AAG CUU CUA ACG AUGUAC GCU CGA GUC CGA C-3’/序列號2)，進行3～16小時。
除去未連接的5’-寡核苷酸后，使用無RNaseH的逆轉錄酶(Superscript II、Gibco BRL)合成cDNA。為了制作5’末端濃縮cRNA文庫，使用10pmol隨機連接物引物(5’-GCG GCT GAA GAC GGC CTATGT GGC CNN NNN NC-3’/序列號4)在12℃下培養1小時，再在42℃下培養1小時。
合成第1鏈后，在15mM NaOH中在65℃下培養1小時，由此分解RNA。使用XL PCR試劑盒(Perkin-Elmer)，利用16pmol的5’(5’生物素-GGA TTT GCT GGT GCA GTA CAA CTA GGC TTA ATA-3’/序列號5、或5’生物素-CTG CTC GAA TTC AAG CTT CTA ACG ATG TACG-3’/序列號6)和3’(5’-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT-3’/序列號7)PCR引物，以100μl的量將由1mg寡核苷酸帽poly(A)+RNA制作的cDNA擴增。對于通過隨機連接物引物延伸了的cDNA，將擴增循環變為94℃下1分鐘、58℃下1分鐘、72℃下2分鐘的10個循環。將PCR產物使用苯酚∶氯仿(1∶1)提取一次，并進行乙醇沉淀，利用MmeI型IIs限制性酶(Gdansk大學技術轉讓中心、Poland、Gdansk)切割。切割是在300μl的10mM HEPES、pH為8.0、2.5mM醋酸鉀、5mM醋酸鎂、2mM DTT和40μM S-腺苷基蛋氨酸中使用40單位的MmeI、在37℃下進行2.5小時。
使切割的5’-末端cDNA片斷結合于鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynal、Norway、Oslo)。使結合于磁珠的cDNA片斷在16μl的供給緩沖液中含有4單位的T4DNA連接酶的反應液中、在16℃下互相直接結合2.5小時。使用引物-5’-GGA TTT GCT GGT GCA GTA CAA CTAGGC-3’/序列號8和5’-CTG CTC GAA TTC AAG CTT CTA ACGATG-3’/序列號9進行PCR，擴增雙標記。PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行分析，并用XhoI切割。將含有雙標記的條帶切出使其自身連接，制作長的連環體。在pZero1.0(Invitrogen)的XhoI部位克隆該連環體。使用M13正向和M13反向引物，使用PCR篩選群體。對含有超過600bp插入片斷的PCR產物使用Big Dye terminator ver.3測序，利用3730ABI自動DNA測序儀(Applied Biosystems、加里福尼亞州)進行分析。電泳圖全部通過目測檢查進行再次分析，研究不清楚的堿基，更正錯讀。使用SAGE 2000軟件(version 4.12)，定量各標記的存在量。
5’SAGE標記與對應基因的關聯性為了評價轉錄起始點的鑒定中5’SAGE標記的有效性，需要避免5’SAGE標記與目前cDNA/EST數據庫的比對。原因在于其序列一般并不限定于從轉錄起始點開始讀取。取而代之，使用http//alps.gi.k.u-tokyo.ac.jp/中公開的比對程序ALPS，嘗試將我們的5’-標記與可在http//genome.ucsc.edu/中利用的人類基因組序列、NCBI build 34進行比對。在該分析中僅考慮在有義方向上一致的標記。
接著，利用Gene Resource Locator數據庫(Honkura，T.，Ogasawara，J.，Yamada，T.& Morishita，S.The Gene Resource Locatorgene locusmaps for transcriptome analysis.Nucleic Acids Res.30，221-225，2002URLhttp//grl.gi.k.u-tokyo.ac.jp/)、UniGene(Build 162)(Wheeler，D.L.Database Resources of the National Center for Biotechnology.NucleicAcids Res.31，28-33，2003 URL ftp//ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/)等各種資源的序列的比對的數據庫，檢索各5’-標記的比對位置附近，找出對應的轉錄物。主要的問題點是，由于逆轉錄轉座和基因組重復，因此導致1個5’-標記與作為多個非標碼區域的多個位置比對。該問題通過選擇在UniGene數據庫中加有注釋的基因編碼部位而解決。3’-標記多集中于3’-末端外顯子(exon)，但5’-標記不需要與第1＝外顯子相當。因此，在距離各5’-標記的比對位置500bp距離的范圍內進行檢索。
與已知的5’轉錄起始點的一致由于各5’SAGE標記比對的位置與其對應的基因間的距離短，因此說明5’-標記與已知5’轉錄起始點基本一致。但是，為了求出距離，必須留意在5’-標記附近由于選擇性的剪接而導致的多個cDNA/EST序列比對頻繁出現。為了解決該狀況并對距離分派固有的值，選擇了距離5’-標記最近的比對。5’-標記位于對應的cDNA上游區域時，定義距離為負。如果不是這樣，值為正或零。特別是，距離零表示完全一致。為了觀察整體距離的分布，求出了mRNA起始點的-500～+200nt的5’SAGE標記出現率的總數。分別使用RefSeq、UniGene(GRL)和DBTSS數據庫，觀察到了覆蓋轉錄起始點的范圍的差異。
結果5’SAGE法為了得到關于轉錄起始部位的全面信息，本發明人等使用寡核苷酸帽法開發了5’SAGE。5’SAGE法能夠生成來自于轉錄物5’末端的19～20bp的標記，將其迅速分析，并匹配于基因組序列數據。圖1顯示了5’SAGE法的策略。
基因組的定位使用該方法，本發明人等研究了在試驗細胞株HEK293細胞中表達的25,684個轉錄物的特征，并將它們與人類基因組序列相比較。整體中的19,893個標記與表示13,404個不同標記的基因組序列完全匹配(表1)。
13,404個不同標記的80％(10,706個標記)定位于唯一的位置。在基因組中匹配于多個部位的標記中，定位于2個基因座(loci)的標記位為11.1％(1483個標記)、定位于3～99個基因座(loci)的標記為8.1％(1090個標記)、定位于100個或以上基因座(loci)的標記為0.9％(125個標記)。定位于多個基因組座的標記大部分對應于逆轉錄轉座子要素、反復序列或假基因。
表1 SAGE標記和基因組的實驗對照
#使用18bp 5’SAGE標記擊中基因組的標記的數。定位按照材料和方法的章節所記載的那樣實施。未擊中基因組的標記在測序了的25,684個標記中有5,791個。相對表達水平通過用在文庫中觀察到的轉錄物標記的總數除以不同標記的數來確定。
##使用20bp 3’SAGE標記擊中基因組的標記的數。定位按照材料和方法的章節所記載的那樣實施。未擊中基因組的標記在測序了的81,211個標記中有27,162個。
對mRNA起始部位的定位接著，本發明人等推測5’SAGE標記是否匹配于mRNA起始部位。本發明人等使用了包括參考序列數據庫(RefSeq)、構建含有涉及調節區域的順式要素和選擇性剪接轉錄物信息的基因圖的GeneResource Locator(GRL)、和含有人的全長cDNAs的系統5’末端序列的DataBase of Transcriptional Start Site(DBTSS)(Suzuki，Y.et al.DBTSSDataBase of human Transcriptional Start Sites and full-lengthcDNAs.Nucleic Acids Res 30，328-331，2002)的3個數據庫。圖2表示距離的分布，表2表示距離短的標記的發生比例，顯示了本發明人等的5’SAGE標記與每個數據庫的起始部位信息充分一致。定位于每個數據庫的標記的85.8％～98.2％定位于mRNA起始部位的-500核苷酸～+200核苷酸。
特別是，5’SAGE標記的23.5～49.3％擊中這些數據庫中定義的轉錄起始部位(TSS)的上游區域。而且，本發明人等研究了5’SAGE標記導致的TSS處的核苷酸選擇性(nucleotide preference)。據報告，TSS的核苷酸是使用276個人基因中的5880個mRNA的A(47％)、G(28％)、C(14％)和T(12％)(Suzuki，Y.et al.Diverse transcriptionalinitiation revealed by fine，large-scale mapping of mRNA start sites.EMBO Rep 2，388-393，2001)。另外，本發明人等的數據對于最初的核苷酸使用顯示了非常類似的百分率A(41％)、G(32％)、C(17％)和T(10％)。綜合考慮，本發明人等的5’SAGE標記法能夠正確鑒定TSS。數據不僅為本發明人等提供了正確的轉錄起始部位信息，而且提供了用于分析啟動子利用的資源。意味深長的是，未匹配于基因組的標記在本研究中占5’SAGE的全測序標記的33％。其中，未匹配于基因組的5’SAGE標記的第一核苷酸的39％也為A。能夠看到未匹配于基因組的幾個標記擊中基因組中具有單一的核苷酸變異或缺失的區域。
表2 各數據庫中mRNA起始部位和對應的5’SAGE標記的距離
如圖2所示，分析對各數據庫的基因的5’末端的定位中一致的標記。
新型基因或未被注釋的基因的鑒定為了鑒定特征不清楚的基因，將5’SAGE標記與基因組序列、RefSeq和EST數據庫進行比較。在基因組中具有單一座的10,706個獨特標記中，能夠使9,376個標記與其對應的UniGene EST相關聯(表3)。而且，6,418個5’SAGE的獨特標記與DBTSS中的已知基因關聯。剩余的標記(12.4％)匹配于已知基因的內含子內的區域(5.4％)或特征不清楚的區域(6.6％)。匹配于特征不清楚的區域的標記主要擊中2個部位(1)所有特征均不清楚的區域、(2)特征不清楚的EST區域只要有關于這種基因表達的證據，則應該對用于通過把3’SAGE作為參考從而發現全長的新型基因有用。
表3 特征不清楚的候補基因和外顯子的鑒定
10,706個定位于獨特的位置，9,376個與對應的UniGene EST關聯。
SAGE是可用于得到根據轉錄物量的定量信息的非常有力的方法。表4顯示了HEK293細胞中轉錄物剖面的5’末端。表達量最多的基因作為神經絲蛋白3(NEF3)被鑒定，其出現頻率為1.43％，接下來是擊中多個基因座的基因和延長因子2。NEF3、70kDa熱休克蛋白1A(70kDa熱休克蛋白1A)、calreticulin(鈣網蛋白)和heterogeneousnuclear Ribonucleoprotein H1(核內不均一核糖核蛋白H1)之類的幾個基因顯示了不同的標記。幾個基因顯示了是從不同TSS轉錄來的。例如，70kDa熱休克蛋白1A是從8個不同轉錄起始部位轉錄而來的。鈣網蛋白是從7個不同轉錄起始部位轉錄而來的。這些結果顯示每個轉錄起始部位可能與基因表達相關。另外，表4所示堿基序列的一部分也記載在之前給出的實施例1的結果中。在表4中還含有對照所得基因標記序列和基因組序列的結果，與此相對，實施例1中未將基因標記序列與基因組序列對照。因此，即便基因標記的堿基序列相同，在表4的基因列中所記載的內容有時也與實施例1所記載的注釋不同。
表4 HEK293細胞中轉錄物剖面的5’末端
將在HEK293細胞中表達的上游50的5’末端轉錄物列表。標記序列顯示18-bp的SAGE標記。顯示標記及與其對應的Unigene/EST。
5’和3’SAGE標記表達的一致本發明人等為了確認5’SAGE的精度，嘗試了同一細胞中mRNA的3’-Long SAGE。在3’-Long SAGE中，本發明人等研究了在HEK293細胞株中被表達的81,212個轉錄物標記的特征。全部中54,050個標記匹配于表示15,423個不同標記的基因組序列(表1)。15,423個不同標記的75％(11,613個標記)在基因組中匹配于一個部位。而且，8,359個3’SAGE標記與UniGene EST中已知的基因相關聯(表3)。匹配于基因組中多個部位的標記中，匹配于2個基因座的標記為9％(1395個標記)、匹配于3～99個基因座的標記為13.2％(2,039個標記)、匹配于100個或以上基因座的標記為2.4％(376個標記)。匹配于基因組中多個部位的標記的比例在5’SAGE和3’SAGE之間非常相近(表2)。另一方面，5’SAGE標記與3’SAGE標記相比，非常的不均勻。
Seha等也同樣指出，每個基因組顯示多于10個拷貝的標記與每個基因組僅顯示1個拷貝的標記相比，平均地被高度表達(Saha，S.etal.Nat Biotechnol 20，508-512，2002)。本發明人等的數據還證明了在3～99基因座/基因組中，與5’SAGE和3’SAGE文庫中的其它部分相比，相對表達水平更高。這是由于通過逆轉錄轉座的基因表達和基因復制的相關的機理。為了推測2個文庫之間的類似性程度，比較了在5’SAGE和3’-Long SAGE之間表達的基因。
5’和3’標記由于是從5’末端和3’末端開始隨機采取，因此預測5’標記與特定的全長cDNA序列的相關概率與3’標記匹配于cDNA的概率一致。但是，由于全長的cDNA序列或者選擇性剪接轉錄物的采集不完全，因此即便這些標記來自于同一編碼區域，也不能簡單地確定5’標記和3’標記之間的正確的一致。一個有希望的途徑可能是綜合共有外顯子的EST比對作為基因編碼座的簇進行處理，并將5’和3’SAGE標記定位于這些簇及其上游的區域，發現5’和3’SAGE標記表達之間的一致。這樣，本發明人等計算與每個基因編碼區域相關的3’(橫軸)和5’標記(縱軸)對的產生數，并且在圖3的二維平面上表示所有的對。通過比較表達模式，發現大多數的基因在雙方的文庫中以類似的水平表達。但是，幾個轉錄物以顯著不同的水平表達，5’SAGE和3’SAGE文庫的皮爾森相關系數為0.36，顯示了中等程度的類似性。
相關為中等程度的理由是由于5’SAGE和3’SAGE文庫中的頻率分散。如以下來源的序列那樣，關于這些標記的出現有幾個可能性。
(1)5’SAGE和3’SAGE中PCR擴增的誤差(2)推測可能在3’SAGE中占據NlaIII限制部位的少數基因(3)推測可能在5’SAGE中占據XhoI限制部位的少數基因(4)5’SAGE和3’SAGE中的mRNA的未知的剪接變異(5)與標記擊中多個基因組座相關的注釋誤差，或者對基因組的EST注釋誤差本研究作為例子僅鑒定了HEK293細胞中被表達的基因的部分。為了詳細記述被表達的基因的概要，需要來自多種不同細胞類型和環境條件的相當多的標記。如果積累數據，則有可能可以解決與5’和3’SAGE標記的表達一致相關的問題。
考察幾個研究小組報告了mRNA起始部位(Suzuki，Y.et al.Diversetranscriptional initiation revealed by fine，large-scale mapping of mRNAstart sites.EMBO Rep 2，388-393，2001)和多腺苷酸化切割部位(Pauws，E.van Kampen，A.H.，van de Graaf，S.A.，de Vijlder，J.J.&Ris-Stalpers，C.Heterogeneity in polyadenylation cleavage sites inmammalian mRNA sequencesimplications for SAGE analysis.NucleicAcids Res 29，1690-1694，2001)顯示不均一性。Shiraki等人報告了構建時特定基因的TSS的差別(Shiraki，T.et al.Cap analysis geneexpression for high-throughput analysis of transcriptional starting pointand identification of promoter usage.Proc Natl Acad Sci USA 100，15776-15781，2003)，但本發明人等的數據顯示TSS的多樣性在細胞中已經存在。而且，本發明人等的數據通過5’SAGE和3’SAGE法而提供了關于TSS和3’末端區域的不均一性的直接證據。
例如，PPAR結合蛋白具有1個TSS和2個3’SAGE標記部位，核糖體蛋白質S4具有16個TSS和1個3’SAGE標記部位，鈣網蛋白具有7個TSS和1個3’SAGE標記部位。而且，選擇性的mRNA剪接與人類蛋白質組的復雜性極為重要地相關。最近的基因組研究表明人類基因的46～60％被選擇性剪接(Modrek，B.& Lee，C.Agenomic view of alternative splicing.Nature Genetics 30，13-19，2002)。推測點突變的15％是由于mRNA剪接缺損而引起人類遺傳疾病(Krawczak，M.，Reiss，J.& Cooper，D.N.The mutational spectrum ofsingle base-pair substitutions in mRNA splice junctions of human genescauses and consequences.Hum Genet 90，41-54，1992)。
Zavolan等人報告了多數具有剪接型的轉錄單位，其49％含有在使用選擇性轉錄開始時伴隨的最初外顯子的選擇性剪接的轉錄物(Zavolan，M.et al.Impact of alternative initiation，splicing andtermination on the diversity of the mRNA transcripts encoded by themouse transcriptome，Genome Res 13，1290-1300，2003)。本發明人等還發現，過氧化物酶4(NM 006406)之類的幾個基因的各自mRNA起始部位不僅顯示了mRNA的不同的剪接變體，而且顯示了基因表達的不同的量。這說明選擇性轉錄有經常誘導選擇性剪接的可能。
最近報告了使用Cap-trapper系統鑒定轉錄起始點的新型方法(Shiraki，T.et al.Proc Natl Acad Sci USA 100，15776-1578l，2003)。但是，mRNA起始部位的定位的鑒定效率在這些方法中并不顯著。通過本發明人等的研究中記載的5’SAGE法，能夠正確定位TSS，同樣能夠確立基因表達的頻率。
綜上所述，如果利用5’SAGE法，有可能在很大程度上促進基因組的注釋。由于5’SAGE是不依賴于基因序列的經驗知識的少數的高生產量的發現途徑之一，因此通過該種數據，能夠立刻進行in silico基因預測的獨立確認和未注釋區域的鑒定。而且，5’SAGE法對于在5’UTR/啟動子區域中發現SNP也是有用的。如果全面地鑒定從不同類型的特異mRNA起始部位轉錄而來的基因，則不僅能夠得到對人類基因組的功能復雜性的說明，而且，能夠獲得對于癌、免疫和神經疾病之類的各種障礙的診斷基礎的新的見解。
最后，如果考慮5’末端的多樣性，則為了確定基因表達的頻率，進行5’SAGE比進行3’SAGE更為恰當。
綜上所述，本發明對于基因標記的獲取是有用的。基因標記是基因所固有的堿基序列信息。因此，在某個基因文庫中標記的出現頻率反映著構成該文庫的所有基因的表達狀態。為此，基因標記對于基因表達分析是有用的。特別是通過本發明能夠得到的基因標記是根據所有mRNA所具有的5’末端的結構而生成的。因此，以通過本發明所生成的標記為基礎的基因表達分析結果的可靠性更高。
另外，本發明的標記含有mRNA的5’末端區域的堿基序列信息。因此，以通過本發明生成的標記的堿基序列信息為基礎，能夠鑒定基因組的轉錄起始點。另外，以本發明標記的堿基序列信息為基礎設計的寡核苷酸可作為全長cDNA的合成用引物利用。
另外，本說明書中所引用的所有現有技術文獻都是作為參考納入本說明書的。
序列表<110>株式會社后基因組研究所<120>基因標記的獲取方法<130>PGI-A0301YlP<150>JP 2003-402306<151>2003-12-01<150>JP 2004-6630<151>2004-01-14<160>69<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>48<212>RNA<213>Artificial<220>
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<220>
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<212>DNA<213>Homo sapiens<400>69atatagaggc tgggggtg 18
權利要求
1.一種真核細胞的基因標記的制造方法，其含有以下工序(1)在RNA的CAP部位連接含有IIs型限制性酶的識別序列的RNA接頭的工序、(2)以(1)的RNA為模板合成cDNA的工序、(3)使識別RNA接頭中所含有的識別序列的IIs型限制性酶作用于(2)的cDNA，從而生成基因標記的工序。
2.如權利要求1所述的方法，其中工序(2)含有通過以下工序合成cDNA的工序(i)通過對RNA的任意區域退火的引物來合成cDNA的第1鏈的工序、和(ii)通過對以第1鏈的RNA接頭為模板合成的區域退火的引物合成cDNA的第2鏈，從而制成雙鏈cDNA的工序。
3.如權利要求2所述的方法，其中，對以第1鏈的RNA接頭為模板合成的區域退火的引物具有能夠結合于固相的標識、或者被固定在固相上，另外，所述方法還進一步含有通過回收所述固相來回收雙鏈cDNA的工序。
4.如權利要求3所述的方法，其中在使IIs型限制性酶作用之前或之后回收固相。
5.如權利要求1所述的方法，其中RNA接頭進一步含有II型限制性酶的識別序列。
6.如權利要求1所述的方法，該方法進一步含有使基因標記的IIs型限制性酶的切割部位與其它基因標記的IIs型限制性酶的切割部位連接，從而生成雙標記的工序。
7.如權利要求6所述的方法，該方法進一步含有通過對RNA接頭退火的引物來擴增雙標記的工序。
8.如權利要求1所述的方法，該方法進一步含有在基因標記的IIs型限制性酶的切割部位上連接具有任意堿基序列的連接物，通過對RNA接頭和所述連接物退火的引物來擴增基因標記的工序。
9.一種基因標記的連環體的制造方法，該方法含有將多個通過權利要求1所述的方法生成的基因標記進行連接的工序。
10.一種基因標記的連環體的制造方法，該方法含有將多個通過權利要求6所述的方法生成的基因標記進行連接的工序。
11.一種基因標記的堿基序列的確定方法，該方法含有確定通過權利要求9或權利要求10所述的方法制造的連環體的堿基序列的工序。
12.一種基因標記的制造用試劑盒，該試劑盒含有以下要素(a)由含有IIs型限制性酶的識別序列的寡核苷酸構成的RNA接頭、(b)用于將RNA接頭與RNA的CAP部位連接的試劑、(c)由對以RNA接頭為模板合成的cDNA退火的寡核苷酸構成的cDNA第2鏈合成用的引物、(d)cDNA第1鏈合成用引物。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其中cDNA第1鏈合成用引物是選自以下i)～iii)中的任一個，i)隨機引物、ii)寡dT引物、和iii)含有與特定mRNA互補的堿基序列的引物。
14.一種真核細胞中基因表達譜的獲取方法，該方法含有以下工序(1)通過權利要求1所述的方法制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序、和(3)通過對應所確定的堿基序列及其出現頻率而得到表達譜的工序。
15.一種基因表達譜的數據庫，其中積累了通過權利要求14所述的方法所獲得的基因表達譜信息。
16.一種基因表達譜的分析方法，該方法含有下述工序通過權利要求14所述的方法獲得不同種類細胞的基因表達譜，比較基因表達譜并選擇在細胞間表達頻率不同的基因標記。
17.一種基因的轉錄起始點的確定方法，該方法含有以下工序(1)通過權利要求1所述的方法制造基因標記的工序、(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序、和(3)將所確定的堿基序列定位于基因組的堿基序列上，并將堿基序列一致的區域作為該基因的轉錄起始點來鑒定的工序。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，其中用于合成cDNA第1鏈的引物是由從特定基因的堿基序列中選擇的堿基序列構成的，另外，所述方法包含確定該基因的轉錄起始點。
19.一種cDNA合成用引物組，其包含用于合成含有通過以下工序確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、以及對cDNA的任意部位退火的3’端引物，(1)通過權利要求1所述的方法制造基因標記的工序、和(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序。
20.如權利要求19所述的引物組，其中3’端引物是選自下述引物中的任一個，i)寡dT引物、ii)cDNA的片斷序列信息、和iii)由與cDNA的II型限制性酶識別鄰接的基因標記的堿基序列或其互補序列構成的引物。
21.一種全長cDNA的合成方法，該方法含有以下工序a)使用用于合成含有通過以下(1)～(2)工序確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和由寡dT引物構成的3’端引物，以RNA或cDNA為模板進行互補鏈合成反應的工序，(1)通過權利要求1所述的方法制造基因標記的工序、和(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序；b)將合成的DNA作為全長cDNA回收的工序。
22.一種可通過權利要求21所述的方法得到的全長cDNA。
23.一種含有由權利要求22所述的全長cDNA編碼的氨基酸序列的多肽。
24.一種識別權利要求23所述的多肽的抗體。
25.一種將權利要求22所述的全長cDNA的編碼區域以可表達的方式保持的載體。
26.一種將權利要求25所述的載體以可表達的方式保持的轉化體。
27.一種權利要求23所述的多肽的制造方法，該方法含有培養權利要求26所述的轉化體、并回收表達產物的工序。
28.一種權利要求23所述的多肽的制造方法，該方法含有以下工序i)將含有功能性地連接于啟動子的權利要求22所述的全長cDNA的編碼區域的DNA構成物與支持生物體外翻譯的要素相接觸的工序、和ii)回收表達產物的工序。
29.含有mRNA的5’末端堿基序列的cDNA的合成方法，該方法含有以下工序a)使用用于合成含有通過以下工序(1)～(2)所確定的堿基序列或其互補序列的cDNA的5’端引物、和由與目標mRNA的任意區域互補的堿基序列構成的3’側引物，以RNA或cDNA為模板進行互補鏈合成反應的工序，(1)通過權利要求1所述的方法制造基因標記的工序、和(2)確定(1)的基因標記的堿基序列的工序；b)將合成的DNA作為含有mRNA的5’末端堿基序列的cDNA回收的工序。
30.一種確定mRNA的5’側堿基序列的方法，該方法含有確定通過權利要求29所述的方法回收的cDNA的堿基序列的工序。
全文摘要
本發明提供一種用于將mRNA的5’末端堿基序列作為標記生成的方法。本發明的方法包括以將含有IIs型限制性酶識別序列的IIs接頭連接在CAP結構上的mRNA作為模板合成cDNA的工序。通過使IIs型限制性酶作用于該cDNA，生成由mRNA的5’末端堿基序列構成的標記。本方法能夠不依賴于堿基序列而從所有mRNA中生成標記。根據本發明的標記的堿基序列信息，提供轉錄起始點的鑒定方法和全長cDNA合成用引物。
文檔編號C12N1/19GK1914318SQ200480041239
公開日2007年2月14日 申請日期2004年6月4日 優先權日2003年12月1日
發明者橋本真一, 松島綱治, 菅野純夫 申請人:株式會社后基因組研究所