專利名稱：一種解旋高分子量全基因組超螺旋結構的方法
技術領域：
一種解旋高分子量全基因組超螺旋結構的方法，屬于生物基因技術領域，特別涉及高分子量全基因組超螺旋結構的解旋方法。
背景技術：
生物遺傳信息儲存在基因組DNA分子中。除簡單生物外，絕大多數生物基因組DNA分子分子量巨大，這使所期望的全基因組排序工作工程浩大，費力費時。例如，6國科學家共同努力完成的人類基因組計劃(HGP)所耗用時間就超達10年。基因組測序計劃中，工作量最大、耗時最長的任務是測序前需要繪制待測序生物全基因組圖譜(包括遺傳圖、物理圖、STS圖、EST圖等)，其工作幾乎占據整個基因組計劃的一半時間(人類基因組計劃計劃的前6年主要用于繪制基因組圖譜)。因此，探索一種一次性解旋高分子量全基因組超螺旋結構的方法，為構建全基因組各標記位點圖譜提供更加簡便易行的基礎方法，對于生物全基因組測序與研究具有重要實用價值和理論意義。
目前，解旋小分子量核酸或者核酸片段已有較多文獻報道，常用方法有CytoC(細胞色素C)鋪展法、BAC(芐甲基烷基氯化胺)鋪展法、溴乙錠鋪展法、SLS-CytoC(月桂酰肌苷酸鈉-細胞色素C)鋪展法等。其中以CytoC鋪展法使用較多。然而，將這些方法用于鋪展高分子量基因組并要達到完全解旋超螺旋結構，其效果均不理想，主要表現在①基因組解旋不完全，所獲圖像超螺旋紐節多，且數目難以分辨。②解旋后的基因組分子常出現斷裂，難能得到完整基因組分子。③常規CytoC鋪展法需加入較高濃度的CytoC才能將DNA分子展開，較高濃度的CytoC本身可遮蓋核酸-蛋白質復合體顯現，這難能觀察研究核酸-蛋白質相互作用，且該方法完全解旋高分子量基因組仍然困難。④BAC和溴乙錠鋪展法在一定程度上雖能鋪展小分子量基因組并可用于觀察到核酸-蛋白質復合體(因無CytoC存在)，但鋪展單鏈基因組分子時常出現紐節；而且，BAC方法制樣時，銅網上的樣品易被污染，圖像反差低，背景欠干凈而不易區別，碳膜需新鮮制作且需活化，鋪展的基因組分子對醋酸氧鈾和酸性磷鎢酸染料親和力低。⑤Zollinger等人在總結前人工作的基礎上，提出了SLS-CytoC鋪展法(見Zollinger M，Gaertin M，Mamet-Bratley MD.Anal Biochem，1977，82196-203)，該方法雖能克服BAC和溴乙錠鋪展法的一些不足，相對也可觀察到核酸-蛋白質復合體，但圖像背景仍差，核酸-蛋白質復合體顯示不夠清楚(因所用細胞色素C濃度仍未能有效克服對核酸-蛋白質復合體的遮暗效應)，且僅適合于小分子基因組及其片段觀察。
發明內容
本發明對Zollinger等人的SLS-CytoC鋪展法方法進行改進，提出一種解旋高分子量基因組超螺旋結構的方法。通過本發明可簡單、方便地獲得解旋后的高分子量完整基因組，并為基因組各相關標記位點圖譜(如全基因組特異蛋白結合位點圖譜、酶切物理圖譜、STS圖譜、EST圖譜、變性圖譜、異源雙鏈圖譜等)的繪制提供信息，從而大大加速高分子量基因組生物(尤其是真核生物)基因組測序進程。
本發明詳細技術方案為一種解旋高分子量全基因組超螺旋結構的方法，其特征是，它包括以下步驟1、生物完整基因組制備。按常規方法制備并提純生物基因組DNA分子，并在-20℃溫度條件下保存備用。
2、支持膜制備。1)、利用火棉膠和醋酸異戊酯制成2％火棉膠醋酸異戊酯溶液，備用；2)、潔凈培養皿中鋪放適當大小干凈濾紙一張，盛雙蒸水達3/4左右體積，用鑷子放潔凈銅網于濾紙上，待水面平靜后，于水面輕輕滴入一滴2％火棉膠醋酸異戊酯液，靜置5分鐘使其成膜，用洗耳球從皿邊緣吸去雙蒸水，50-60℃條件下烘干備用。
3、電子顯微學樣品制備，1)、按下表配制鋪展液(上相液)
畢后，用微量進樣器針頭輕微拌動約100圈。
2)、按下表配制下相液
3)、基因組鋪展取潔凈載玻片一張，斜放于Teflon皿中(如圖1所示)，傾下相液于Teflon皿內。用Teflon棒于下相液液面趨趕污物，之后，輕輕抖下少量滑石粉，待滑石粉散開后，用微量進樣器吸取適量上相液于載玻片斜面上小心均勻排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的邊緣呈現出光亮單層膜區約10秒鐘后用鑷子夾住覆有火棉膠膜的銅網撈片，得到未經染色的電子顯微學樣品。
4)、樣品染色將未經染色的電子顯微學樣品用90％乙醇脫水約10秒鐘后轉入5×10-5％摩爾/升濃度的醋酸雙氧鈾(UAc)中染色30分鐘左右，之后轉入90％乙醇中清洗約1秒鐘，吸干濾紙后得到最終的電子顯微學樣品。
本發明的實質是對Zollinger等人的SLS-CytoC的電鏡核酸方法進行了如下改進①將鋪展液中的SLS濃度提高5倍；②將CytoC濃度降至50mg/mL；③操作中并輔之以適當的流體切力拌動，結果獲得了較之Zollinger原方法效果更佳、且能獲得一次性充分解旋全基因組超螺旋結構的完整基因組分子。本方法能較好用于生物基因組(尤其是高分子量真核基因組)測序所需的各種定位標記圖譜構建、核酸-蛋白質相互作用研究、基因組結構研究等領域。
最終的電子顯微學樣品制作好后，可借助透射電鏡觀察并拍攝生物基因組DNA分子的解旋結果。
與同類技術比，本發明所述方法有如下特點(1)一次性完全解旋高分子量全基因組超螺旋結構，電鏡觀察證明交叉點＝0，所獲基因組分子圖像背景清晰、反差好、光滑、柔韌、無纏結與斷裂、且無縱向伸長。(2)電鏡觀察證明，特異結合于基因組分子上的互作蛋白質(酶)分子顯示十分清楚。(3)利用電鏡能直接觀察并測定到基因組解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等。
需要說明的是高分子量基因組超螺旋結構的解旋是一個非常“微妙”的過程，影響因素較多，有時一個因子未能滿足，可能會影響整個鋪展效果。操作時應同時注意考慮如下因素①通常認為基因組體外解旋可能是通過流體切力先使基因組的一條鏈斷裂，讓其周繞另一鏈旋轉而達到解旋超螺旋。但也有實驗證明，流體切力是隨機的，不能完全破壞基因組所有超螺旋紐節。因此，完全開環DNA分子的獲得除了流體切力的隨機作用外，可能還與SLS的鋪展性能有重要關系。
②基因組樣品純度可能會影響鋪展效果和重復率，樣品越純，效果越佳。在進行病毒基因組鋪展中，為保證鋪展后基因組分子完整而不斷裂，建議最好用離心純化的病毒粒子按本方法進行直接釋放鋪展。
③器具清潔度會影響鋪展液面的推開程度，進而可能會直接影響DNA的分散度。操作時，尤其應是用潔凈的載玻片、Teflon棒和Teflon皿。
④制樣過程中，因拌動而產生的流體切力強度應適當，過強可能會造成基因組分子斷裂。而且這在觀察核酸-蛋白質相互作用時可能會導致基因組上特異結合的互作蛋白數量減少；但強度不足，基因組解旋超螺旋可能會不完全。具體操作過程中可使用微量進樣器針頭輕微拌動鋪展液約100圈，不僅必要，而且效果好。
⑤下相液表面性質可影響基因組分散度。建議下相液表面單層膜形成后約10秒鐘后再開始撈片。經驗表明，該時間少于10秒鐘或大于20分鐘，基因組分散度均有所降低。而且，時間過長，觀察核酸-蛋白質相互作用時基因組上特異結合的互作蛋白數量減少。
本發明有益效果1、技術上①樣品用量少，僅需毫微克基因組材料就能滿足制樣需要；②制樣過程迅速，數小時即能得到結果；③方法簡便，直觀，易掌握。
2、適于生物全基因組各種物理圖譜繪制。
利用本發明所述方法可一次性簡易繪制全基因組各相關標記位點圖譜(如基因組特異蛋白結合位點圖譜、酶切物理圖譜等)，從而大大加速高分子量基因組生物(尤其是真核生物)基因組測序進程。
3、可為從全基因組角度直觀研究生物遺傳結構提供技術支撐。
電鏡能直接觀察到每一基因組分子，所獲結果能在電鏡圖片上真實反映并一一檢測出來。電鏡顯示的是基因組的單分子行為，可很好克服生化凝膠電泳分析方法只能反映基因組分子集合行為的眾多不足。利用本發明所述方法能解旋高分子量基因組并獲得完整分子，從而為從全基因組角度直觀研究生物遺傳結構提供了較好技術支撐。
4、可直接用于蛋白質--核酸相互作用研究。
蛋白質--核酸相互作用是分子生物學領域有關基因識別、切割、復制、重組、表達、調控等過程的一個基本問題。本技術解決了核酸-蛋白質相互作用領域所涉及的兩個最基本問題①高分子量全基因組超螺旋結構體外解旋；②基因組互作蛋白(酶)在解旋基因組上的清晰顯現。例如，用本技術研究基因組與限制性酶結合關系，限制酶一定時限內在基因組各位點上結合的先后快慢、單酶或多酶結合、各限制酶片段長短、切割先后等，都可在電鏡圖片上一一反映出來，并能一次性繪制成物理圖譜供全基因組測序作定位標記參考。這些工作毋需DNA重組技術、酶切探針標記、片段雜交等繁瑣操作，較之生化方法快捷且容易得多(尤其當基因組存在若干限制酶位點時)。
圖1為基因組鋪展示意圖。
圖2-4所示為PbGv(大菜粉蝶顆粒體病毒)基因組經本發明所述方法解旋后，JEM-100CX電鏡下拍攝到的完整開環PbGv-DNA分子。照片顯示，解旋后的PbGv-DNA分子光滑、舒展、分散性良好，顯示出天然柔性，金屬投影后直徑為6-8nm(24000X)。
圖5-圖10為PbGv-DNA分子經本發明所述方法解旋后，PbGv-DNA開環分子上結合的EcoRI示意圖。電鏡顯示EcoRI顯示清楚，它們并不被本技術條件下的細胞色素C所遮蓋；EcoRI可分為大、小顆粒，大顆粒直徑20-27nm，小顆粒16-18nm；Mg2+存在時，結合在PbGv-DNA分子的EcoRI主要為大顆粒。
其中圖5-6顯示解旋后PbGv-DNA開環分子上有兩個EcoRI酶點，JEM-100CX拍攝，24000X；圖7顯示解旋后PbGv-DNA開環分子上有五個EcoRI酶點，JEM-100CX拍攝，24000X；圖8顯示同一視野下可見到三個開環PbGv-DNA分子，其中一個PbGv-DNA分子上有兩個EcoRI，另兩個PbGv-DNA分子上各有一個EcoRI。JEM-100CX拍攝，12500X；圖9顯示PbGv-DNA上結合有一個大顆粒EcoRI(直徑26.7nm)，有一個小顆粒EcoRI(直徑17.8nm)游離于環境中，DNA直徑8nm。JEM-100CX拍攝，22500X；圖10PbGv-DNA上的大顆粒EcoRI進一步放大。JEM-100CX拍攝。
圖11采用本技術一次性構建的PbGv-DNA-EcoRI相互作用結合位點物理圖譜。
圖12所示經本發明所述方法隨機測定的74個PbGv-DNA分子量分布。表明PbGv-DNA基因組分子長度存在多態性，即個體遺傳結構有明顯差異。其中，PbGv-DNA的最大分子長度為124.1Kb，最小分子長度為95.8Kb，群體分子模態長度為109.7±7Kb(群體分子量分布中該分子量分子表現為最大峰)，此與凝膠電泳分離得到的分子量(108.2Kb)十分吻合。
具體實施例方式
按照本發明所述的方法，對大菜粉蝶顆粒體病毒(PbGv)基因組進行解旋，所制得的解旋樣品經JEM-100CX電鏡觀察并拍攝結果，如圖2至圖10所示。照片顯示，解旋后的PbGv-DNA分子光滑、舒展、分散性良好，顯示出天然柔性，金屬投影后直徑為6-8nm(24000X)。另外，EcoRI顯示清楚，它們并不被本技術條件下的細胞色素C所遮蓋；EcoRI可分為大、小顆粒，大顆粒直徑20-27nm，小顆粒16-18nm；Mg2+存在時，結合在PbGv-DNA分子的EcoRI主要為大顆粒。用本技術研究PbGv-DNA，除發現群體模態分子的平均分子量(109.7±7Kb)與凝膠電泳分離得到的分子量(108.2Kb)十分吻合外，也發現部分PbGv-DNA分子存在“個體差異”。利用本技術于電鏡下一次性初步繪制的高分子量PbGv-DNA-EcoRI相互作用結合位點物理圖譜如圖11所示。用本技術隨機測定的74個PbGv-DNA(大菜粉蝶顆粒體病毒DNA)分子，其模態分子長度(109.7±7Kb)與生化凝膠電泳方法得到的分子量(108.2Kb)十分吻合。
權利要求
1.一種解旋高分子量全基因組超螺旋結構的方法，其特征是，它包括以下步驟1)、生物完整基因組制備，按常規方法制備并提純生物基因組DNA分子，并在-20℃溫度條件下保存備用；2)、支持膜制備，包括(1)、利用火棉膠和醋酸異戊酯制成2％火棉膠醋酸異戊酯溶液，備用；(2)、潔凈培養皿中鋪放適當大小干凈濾紙一張，盛雙蒸水達3/4左右體積，用鑷子放潔凈銅網于濾紙上，待水面平靜后，于水面輕輕滴入一滴2％火棉膠醋酸異戊酯液，靜置5分鐘使其成膜，用洗耳球從皿邊緣吸去雙蒸水，50-60℃條件下烘干備用；3)、電子顯微學樣品制備，包括(1)、按下表配制鋪展液(上相液)
畢后，用微量進樣器針頭輕微拌動約100圈；(2)、按下表配制下相液
(3)、基因組鋪展取潔凈載玻片一張，斜放于Teflon皿中，傾下相液于Teflon皿內。用Teflon棒于下相液液面趨趕污物，之后，輕輕抖下少量滑石粉，待滑石粉散開后，用微量進樣器吸取適量上相液于載玻片斜面上小心均勻排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的邊緣呈現出光亮單層膜區約10秒鐘后用鑷子夾住覆有火棉膠膜的銅網撈片，得到未經染色的電子顯微學樣品；(4)、樣品染色將未經染色的電子顯微學樣品用90％乙醇脫水約10秒鐘后轉入5×10-5％摩爾/升濃度的醋酸雙氧鈾(UAc)中染色30分鐘左右，之后轉入90％乙醇中清洗約1秒鐘，吸干濾紙后得到最終的電子顯微學樣品。
全文摘要
一種解旋高分子量全基因組超螺旋結構的方法，屬于生物基因技術領域，特別涉及高分子量全基因組超螺旋結構的解旋方法。本發明實質上是對Zollinger等人報道的核酸電鏡鋪展技術進行了改進①將鋪展液中的SLS濃度提高5倍；②將細胞色素C濃度降至50mg/mL；③操作中輔之以適當的流體切力拌動。本發明可一次性獲得充分解旋全基因組超螺旋結構的完整基因組分子；結合于基因組分子上的特異互作蛋白質(酶)分子顯示清楚；能直接觀察并測定到基因組解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等；所獲基因組分子圖像背景清晰、反差好、光滑、柔韌、無纏結與斷裂、且無縱向伸長。本技術能較好用于生物基因組測序所需的各種定位標記圖譜構建、核酸－蛋白質相互作用研究、基因組結構研究等領域。
文檔編號C12N15/00GK1807615SQ20051002243
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者馬義才 申請人:電子科技大學